JPH04187697A - 動物細胞培養用培地 - Google Patents
動物細胞培養用培地Info
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- JPH04187697A JPH04187697A JP2315235A JP31523590A JPH04187697A JP H04187697 A JPH04187697 A JP H04187697A JP 2315235 A JP2315235 A JP 2315235A JP 31523590 A JP31523590 A JP 31523590A JP H04187697 A JPH04187697 A JP H04187697A
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- JP
- Japan
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- peptide
- arginine
- medium
- glutamine
- cells
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ペプチドおよび該ペプチドを含有する動物細
胞を培養するための培地に関する。動物細胞を培養する
ことにより生産される物質の多くは、医薬品、化粧品、
食品などに有用であることが知られている。そのため、
動物細胞を培養するために優れた培地を供給することは
産業上有用である。
胞を培養するための培地に関する。動物細胞を培養する
ことにより生産される物質の多くは、医薬品、化粧品、
食品などに有用であることが知られている。そのため、
動物細胞を培養するために優れた培地を供給することは
産業上有用である。
従来の技術および発明が解決しようとする課題動物細胞
を培養して、その培養土清液もしく：ま細胞から、有用
生理活性物質を得ることが実用化されている。多くの場
合、有用生理活性物質の生産には、血清培地、無血清培
地などが用いられている。しかしながら、細胞培養土清
液から生理活性物質を安定にかつ大量に得、それを精製
して利用するためには技術的に大きな問題がある。
を培養して、その培養土清液もしく：ま細胞から、有用
生理活性物質を得ることが実用化されている。多くの場
合、有用生理活性物質の生産には、血清培地、無血清培
地などが用いられている。しかしながら、細胞培養土清
液から生理活性物質を安定にかつ大量に得、それを精製
して利用するためには技術的に大きな問題がある。
たとえば、生理活性物質の生産において外来遺伝子導入
発現用宿主細胞として多用されているチャイニーズ・ハ
ムスターの卵巣細胞（ＣＨ○細胞）などは、培地中に蛋
白分解酵素を分泌している。
発現用宿主細胞として多用されているチャイニーズ・ハ
ムスターの卵巣細胞（ＣＨ○細胞）などは、培地中に蛋
白分解酵素を分泌している。
（日本農芸化学会誌 ６３巻１９２頁１９８９年）。蛋
白分解酵素は目的生産物質を分解し、ＣＨＯ細胞自身の
増殖に悪影響を与えることがある。通常、血清を含んだ
培地中には多くのプロテアーゼインヒビターが含まれて
いるためこの点について問題はないが、無血清培地を用
いて培養した場合には大きな問題となる。この問題を解
決するたｔには、蛋白分解酵素の阻害剤を含む培地で培
養すればよい。これまでに蛋白分解酵素の阻害剤として
アプロチニン（分子量６５００ ）やソイビーントリブ
ンンインヒビター（分子、！２０１００）などを含んだ
培地での有用生理活性物質の生産が報告されて′、）る
（特開昭６０−１５８１１６号公報）。しかじながろ、
これるの蛋白分解酵素阻害剤は加熱滅菌することができ
ず一過滅菌して加える必要があるが、一過滅菌によれば
動物細胞の培養において障害をもたちすことが知られて
いるマイコプラズマやウイルスプ；どを完全に除去する
ことが困難である。また、目的生産物質の精製の際これ
ら阻害剤を除く必要があり、阻害剤が蛋白性の高分子の
場合にはその除去は容易ではない。また、これらの物質
は高価であり生産コストを高める要因となる。
白分解酵素は目的生産物質を分解し、ＣＨＯ細胞自身の
増殖に悪影響を与えることがある。通常、血清を含んだ
培地中には多くのプロテアーゼインヒビターが含まれて
いるためこの点について問題はないが、無血清培地を用
いて培養した場合には大きな問題となる。この問題を解
決するたｔには、蛋白分解酵素の阻害剤を含む培地で培
養すればよい。これまでに蛋白分解酵素の阻害剤として
アプロチニン（分子量６５００ ）やソイビーントリブ
ンンインヒビター（分子、！２０１００）などを含んだ
培地での有用生理活性物質の生産が報告されて′、）る
（特開昭６０−１５８１１６号公報）。しかじながろ、
これるの蛋白分解酵素阻害剤は加熱滅菌することができ
ず一過滅菌して加える必要があるが、一過滅菌によれば
動物細胞の培養において障害をもたちすことが知られて
いるマイコプラズマやウイルスプ；どを完全に除去する
ことが困難である。また、目的生産物質の精製の際これ
ら阻害剤を除く必要があり、阻害剤が蛋白性の高分子の
場合にはその除去は容易ではない。また、これらの物質
は高価であり生産コストを高める要因となる。
もう一つの問題として、細胞増殖に必要であるし一グル
タミンが加熱滅菌できない点があげられる。この場合に
もメンプラン・フィルターなどを用いて培地を一過滅菌
しなければならない。二の沖過滅菌法では通常０．２μ
ｍのポアサイズをもつフィルターを使用するが、マイコ
プラズマやウィルスのようなバクテリアより小さな微生
物を除去することは困難である。また、一過滅菌は加圧
または減圧下でおこなわなければならず、フィルターに
かかる圧力や材質の不均一性のために微量の細菌が通過
することも稀にみられ、フィルターの材質によっては培
地の微量有効成分が吸着して失われたりすることがある
。
タミンが加熱滅菌できない点があげられる。この場合に
もメンプラン・フィルターなどを用いて培地を一過滅菌
しなければならない。二の沖過滅菌法では通常０．２μ
ｍのポアサイズをもつフィルターを使用するが、マイコ
プラズマやウィルスのようなバクテリアより小さな微生
物を除去することは困難である。また、一過滅菌は加圧
または減圧下でおこなわなければならず、フィルターに
かかる圧力や材質の不均一性のために微量の細菌が通過
することも稀にみられ、フィルターの材質によっては培
地の微量有効成分が吸着して失われたりすることがある
。
したがって本発明の目的は、加熱滅菌に対して安定であ
り、ＣＨＯ細胞などの細胞の分泌する蛋白分解酵素を阻
害し、かつ細胞にＬ−グルタミンを供給できるようなし
一グルタミン誘導体を見いだし、これによって加熱殺菌
することが可能な蛋白分解酵素阻害剤を含む動物細胞培
養用培地を提供することにある。
り、ＣＨＯ細胞などの細胞の分泌する蛋白分解酵素を阻
害し、かつ細胞にＬ−グルタミンを供給できるようなし
一グルタミン誘導体を見いだし、これによって加熱殺菌
することが可能な蛋白分解酵素阻害剤を含む動物細胞培
養用培地を提供することにある。
既に、Ｘ−Ｌ−グルタミン（Ｘは前記と同義である。）
で表わされるジペプチドを含有する動物細胞用培地は公
知である（特開昭６１−２７１９８５号公報）が、該ジ
ペプチドが蛋白分解酵素の作用を受けてグルタミンを遊
離し、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を有して
いるという記載はない。
で表わされるジペプチドを含有する動物細胞用培地は公
知である（特開昭６１−２７１９８５号公報）が、該ジ
ペプチドが蛋白分解酵素の作用を受けてグルタミンを遊
離し、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を有して
いるという記載はない。
また、本発明で用いられるようなテトラペプチドおよび
該テトラペプチドを含有させた動物細胞培養用培地は知
ちれていなｌ、 ＮＣ 課題を解決するための手段 本発明者らは、外来遺伝子導入発現用宿主細胞として用
いられている細胞の分泌する蛋白分解酵素の性質を各種
の既知基質を用いて解析した。その結果、これらの細胞
株は、トリジノン様エンド型蛋白分解酵素およびエクソ
型蛋白分解酵素を分泌していることが胡らかとなった。
該テトラペプチドを含有させた動物細胞培養用培地は知
ちれていなｌ、 ＮＣ 課題を解決するための手段 本発明者らは、外来遺伝子導入発現用宿主細胞として用
いられている細胞の分泌する蛋白分解酵素の性質を各種
の既知基質を用いて解析した。その結果、これらの細胞
株は、トリジノン様エンド型蛋白分解酵素およびエクソ
型蛋白分解酵素を分泌していることが胡らかとなった。
エンド型蛋白分解酵素阻害剤として知られているロイペ
プチンによって生産物質の分解が抑えられることから、
生産物質の分解には主にトリジノン様エンド型蛋白分解
酵素が関与していることが胡らかになった。
プチンによって生産物質の分解が抑えられることから、
生産物質の分解には主にトリジノン様エンド型蛋白分解
酵素が関与していることが胡らかになった。
さらに、該トリジノン様エンド型蛋白分解酵素がＬ−ロ
インンーし一アルギニンーＬ−アルギニンーＸ （Ｘは
前記と同義である）配列を有するペプチドにおけるし一
アルギニンーＸ （Ｘは前記と同義である。）を切断す
る作用を触媒する酵素であることがわかった。
インンーし一アルギニンーＬ−アルギニンーＸ （Ｘは
前記と同義である）配列を有するペプチドにおけるし一
アルギニンーＸ （Ｘは前記と同義である。）を切断す
る作用を触媒する酵素であることがわかった。
そこで本発明者らは、蛋白分解酵素、とくにトリプシン
様エンド型蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を有し、
かつグルタミンを供給できるような培地添加物を検討し
、本発明を完成した。
様エンド型蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を有し、
かつグルタミンを供給できるような培地添加物を検討し
、本発明を完成した。
本発ザによれば、蛋白分解酵素の作用を受けてグルタミ
ンを遊離し、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を
有するペプチド、とくにＲ−Ｌ−ロインンーし一アルギ
ニンーＬ−了ルギニンーＬ−グルタミン（Ｒはアミノ酸
残基のＮ末端保護基を表わす。）で表わされるペプチド
を提供することができる。さらに該ペプチドを含有させ
ることにより加熱殺菌することが可能な蛋白分解酵素阻
害剤を含む動物細胞培養用培地も提供することができる
。
ンを遊離し、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を
有するペプチド、とくにＲ−Ｌ−ロインンーし一アルギ
ニンーＬ−了ルギニンーＬ−グルタミン（Ｒはアミノ酸
残基のＮ末端保護基を表わす。）で表わされるペプチド
を提供することができる。さらに該ペプチドを含有させ
ることにより加熱殺菌することが可能な蛋白分解酵素阻
害剤を含む動物細胞培養用培地も提供することができる
。
以下に本発明の詳細な説明する。
本明細書でいう蛋白分解酵素とはトリプシン様エンド型
蛋白分解酵素のことをいい、さらに詳しくは−Ｌ−ロイ
ンンーＬ−アルギニンーＬ−アルけるＬ−アルギニン−
Ｘを切断する作用を触媒すを有していてもよい。
蛋白分解酵素のことをいい、さらに詳しくは−Ｌ−ロイ
ンンーＬ−アルギニンーＬ−アルけるＬ−アルギニン−
Ｘを切断する作用を触媒すを有していてもよい。
本発明の動物細胞培養用の培地は、蛋白分解酵素の作用
を受けて、グルタミンを遊離し、かつ蛋白分解酵素の活
性を阻害する作用を有するペプチド（以下、本物質とい
う。）を含有する。蛋白分解酵素の作用を受けてグルタ
ミンを遊離し、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用
を有するペプチドとしては、Ｒ−Ｌ−ロインンーし一ア
ルギニンーし一アルギニンーＬ−グルタミン（ＲはＮ末
端保護基を表わす。）で表わされるペプチドをあげるこ
とができる。
を受けて、グルタミンを遊離し、かつ蛋白分解酵素の活
性を阻害する作用を有するペプチド（以下、本物質とい
う。）を含有する。蛋白分解酵素の作用を受けてグルタ
ミンを遊離し、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用
を有するペプチドとしては、Ｒ−Ｌ−ロインンーし一ア
ルギニンーし一アルギニンーＬ−グルタミン（ＲはＮ末
端保護基を表わす。）で表わされるペプチドをあげるこ
とができる。
Ｒは、アミノ酸残基のＮ末端保護基を表わす。
本物質が蛋白分解酵素の作用を受けて、グルタミンを遊
離し、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を有して
いれば、Ｒはどのような構造を有していでもよい。たと
えばアセチル基、ターンヤリブトキシカルボニル基、ベ
ンゾキシカルボニル基などがあげられる。とくにアセチ
ル基が好ましい。
離し、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を有して
いれば、Ｒはどのような構造を有していでもよい。たと
えばアセチル基、ターンヤリブトキシカルボニル基、ベ
ンゾキシカルボニル基などがあげられる。とくにアセチ
ル基が好ましい。
本物質の合成は、−船釣に利用されているペプチド合成
機を用いた面相合成法によりおこなう。
機を用いた面相合成法によりおこなう。
本発明に利用できる基礎培地は、弱酸性で加熱滅菌でき
る培地、ハム培地、Ｅａｇｌｅ Ｊ、ＩＥＭ培地、＾１
ｐｈａ ＭＥＭ培地、ウィリアムスＥ培地、ダルベツコ
ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地およびこれらの混
合培地など一般的に細胞の増殖を支持できる培地から重
炭酸す） ＩＪウムおよびＬ−グルタミンを除いた培地
であればいずれでも良い。また、これらの培地を基礎培
地として、血清または血清代替物としての各種増殖因子
を含有させた血清添加培地または無血清培地、あるいは
無蛋白培地であっても細胞を増殖させうるものであれば
いずれでも応用可能である。このような培地に本物質を
含有させる。
る培地、ハム培地、Ｅａｇｌｅ Ｊ、ＩＥＭ培地、＾１
ｐｈａ ＭＥＭ培地、ウィリアムスＥ培地、ダルベツコ
ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地およびこれらの混
合培地など一般的に細胞の増殖を支持できる培地から重
炭酸す） ＩＪウムおよびＬ−グルタミンを除いた培地
であればいずれでも良い。また、これらの培地を基礎培
地として、血清または血清代替物としての各種増殖因子
を含有させた血清添加培地または無血清培地、あるいは
無蛋白培地であっても細胞を増殖させうるものであれば
いずれでも応用可能である。このような培地に本物質を
含有させる。
本物質の使用量は上記の目的に合った添加量であればど
のような濃度でも利用できるが、添加すべきＬ−グルタ
ミンと同モル濃度（１〜４ｍＭ）となるように培地に溶
解させるのが好ましい。その後通常の加熱殺菌（１２０
℃、２０分）をおこなう。また、本物質のみをその添加
濃度の１００倍の水溶液とし、加熱滅菌した後、上記し
たような培地にその１ ／１００を添加して調製するこ
ともできる。このように調製した培地に、１０％の重炭
酸す） ＩＪウム水溶液を加熱滅菌後項地中所定量とな
るように添加する。
のような濃度でも利用できるが、添加すべきＬ−グルタ
ミンと同モル濃度（１〜４ｍＭ）となるように培地に溶
解させるのが好ましい。その後通常の加熱殺菌（１２０
℃、２０分）をおこなう。また、本物質のみをその添加
濃度の１００倍の水溶液とし、加熱滅菌した後、上記し
たような培地にその１ ／１００を添加して調製するこ
ともできる。このように調製した培地に、１０％の重炭
酸す） ＩＪウム水溶液を加熱滅菌後項地中所定量とな
るように添加する。
本発明にかかわる動物細胞培養用培地は、［ＨＯ細胞、
Ｎａｍａ１ｗａ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｃ１２７細胞、ロ
ＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、Ｌ９２９細胞、Ｕ９３７細胞、Ｈ
ｅ１ａ−３３細胞、ＣＯ５細胞などの動物細胞の培養に
有用である。
Ｎａｍａ１ｗａ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｃ１２７細胞、ロ
ＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、Ｌ９２９細胞、Ｕ９３７細胞、Ｈ
ｅ１ａ−３３細胞、ＣＯ５細胞などの動物細胞の培養に
有用である。
以下に本発明の実施例および参考例を示す。
実ｍ例１． Ｒ−Ｌ−ロインンーし一アルギニンーＬ
−アルギニンーＬ−グルタミン（Ｒ−アセチル基：化合
物ａという。） アブライドバイオンステムズ社（＾ｐｐｌｉ＋Ｊ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ。
−アルギニンーＬ−グルタミン（Ｒ−アセチル基：化合
物ａという。） アブライドバイオンステムズ社（＾ｐｐｌｉ＋Ｊ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ。
Ｉｎｃ、、 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ＋ｔｙ、 Ｃａ１ｉｆｏ
ｒｎｉａ、 ＩＩ、Ｓ、＾、；以下、へ８１社という）
のペプチド自動合成機４３０Ａ型機を用い、ＡＢＩ社の
試薬および溶媒を用いてＡＢＩ社の合成プログラムに基
づき化合物ａを合成した。合成にあたり各アミノ酸のα
−アミ７基の保護基としてはターン＋’）−ブトキシカ
ルボニル（以下ｔ−Ｂｏｃと略す）を、側鎖の保護基と
してはＬ−アルギニンに対してトンル基（以下Ｔｏｓと
略す）を用いた。また、縮合反応はＬ−アルギニンを１
−ヒドロキンベンゾトリアゾールを用′、）活性エステ
ル体として、Ｌ−ロイシンを対称酸無水物として標準の
条件でおこなった。
ｒｎｉａ、 ＩＩ、Ｓ、＾、；以下、へ８１社という）
のペプチド自動合成機４３０Ａ型機を用い、ＡＢＩ社の
試薬および溶媒を用いてＡＢＩ社の合成プログラムに基
づき化合物ａを合成した。合成にあたり各アミノ酸のα
−アミ７基の保護基としてはターン＋’）−ブトキシカ
ルボニル（以下ｔ−Ｂｏｃと略す）を、側鎖の保護基と
してはＬ−アルギニンに対してトンル基（以下Ｔｏｓと
略す）を用いた。また、縮合反応はＬ−アルギニンを１
−ヒドロキンベンゾトリアゾールを用′、）活性エステ
ル体として、Ｌ−ロイシンを対称酸無水物として標準の
条件でおこなった。
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン０．５ ミＩＪモルを結合
させた担体樹脂０．６４ ｇを自動合成機の反応容器に
入れた。ＡＢＩ社の合成プログラムに従い、次の処理お
よび洗浄をおこなった。
させた担体樹脂０．６４ ｇを自動合成機の反応容器に
入れた。ＡＢＩ社の合成プログラムに従い、次の処理お
よび洗浄をおこなった。
（１）３３％トリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン溶液
処理（８０秒） （２）５０％トリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン溶液
処理（１８，５分） （３）塩化メチレン洗浄（３回） （４）１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メ
チレン溶液処理（１分、２回） （５） ジメチルホルムアミド洗浄（５回）（６）
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ）の活性エステ
ルに１．０ミリモルを含むジメチルホルムアミド溶液４
ｒｎＩを加え、反応容器を１８分間攪拌した。
処理（８０秒） （２）５０％トリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン溶液
処理（１８，５分） （３）塩化メチレン洗浄（３回） （４）１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メ
チレン溶液処理（１分、２回） （５） ジメチルホルムアミド洗浄（５回）（６）
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ）の活性エステ
ルに１．０ミリモルを含むジメチルホルムアミド溶液４
ｒｎＩを加え、反応容器を１８分間攪拌した。
（７）塩化メチレン洗浄（５回）
このようにして、ｔ−ＢｏＣ−Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ
）−Ｌ−グルタミンが担体樹脂上に合成された。次に再
度（１）〜（７）の工程を繰り返しｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−ア
ルギニン（Ｔｏｓ） −Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ）−
Ｌ−グルタミンを担体樹脂上に合成した。次に上記の（
１）〜（５）の脱保護工程を行った後、（６）の工程に
おいてｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ）の活性エ
ステル体のかわりにｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシンの対称酸
無水物を用いて縮合反応を行い、（７）の洗浄工程を経
てｔ−Ｂｏｃ−Ｌ −ロイシン−し−アルギニン（Ｔｏ
ｓ） −Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ）−Ｌ−グルタミンが
合成された。Ｎ末端のアセチル化は（１）〜（５）の脱
保護工程を行った後（６）の工程においてｔ−Ｂｏｃ−
Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ） の活性エステル体のかわり
に無水酢酸２．０ミリモルを用いて行い、（７）の洗浄
工程を経て保護ペプチドの結合した担体樹脂１．０５ｇ
を得た。
）−Ｌ−グルタミンが担体樹脂上に合成された。次に再
度（１）〜（７）の工程を繰り返しｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−ア
ルギニン（Ｔｏｓ） −Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ）−
Ｌ−グルタミンを担体樹脂上に合成した。次に上記の（
１）〜（５）の脱保護工程を行った後、（６）の工程に
おいてｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ）の活性エ
ステル体のかわりにｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシンの対称酸
無水物を用いて縮合反応を行い、（７）の洗浄工程を経
てｔ−Ｂｏｃ−Ｌ −ロイシン−し−アルギニン（Ｔｏ
ｓ） −Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ）−Ｌ−グルタミンが
合成された。Ｎ末端のアセチル化は（１）〜（５）の脱
保護工程を行った後（６）の工程においてｔ−Ｂｏｃ−
Ｌ−アルギニン（Ｔｏｓ） の活性エステル体のかわり
に無水酢酸２．０ミリモルを用いて行い、（７）の洗浄
工程を経て保護ペプチドの結合した担体樹脂１．０５ｇ
を得た。
合成反応終了後、得られた樹脂全量にアニソール１．５
祿を加え室温で２時間放置した。この反応器をドライア
イス−エタノール浴で一７０℃に保ち、フッ化水素１０
祿を加えた後、０℃で１時間攪拌した。次いでフッ化水
素を減圧除去し、担体樹脂に酢酸エチル２５−１２Ｍ酢
酸２５祿を加えて室温で１時間攪拌し２時間放置した。
祿を加え室温で２時間放置した。この反応器をドライア
イス−エタノール浴で一７０℃に保ち、フッ化水素１０
祿を加えた後、０℃で１時間攪拌した。次いでフッ化水
素を減圧除去し、担体樹脂に酢酸エチル２５−１２Ｍ酢
酸２５祿を加えて室温で１時間攪拌し２時間放置した。
沖過後、分液して得られた水層を酢酸エチルで洗浄した
。
。
この水層を減圧濃縮し、約１０−としてゲル濾過カラム
（＾ｓａｈ＋Ｐａｋ Ｇ５２２０Ｐ ；φ）を用いたＨ
ＰＬｃで精製した。０．１％酢酸水溶液を溶離液として
用い、２２０ｎｍで分析し化合物ａを含む両分を得た。
（＾ｓａｈ＋Ｐａｋ Ｇ５２２０Ｐ ；φ）を用いたＨ
ＰＬｃで精製した。０．１％酢酸水溶液を溶離液として
用い、２２０ｎｍで分析し化合物ａを含む両分を得た。
この両分を凍結乾燥して化合物ａの白色粉末２２０■を
得た。
得た。
化合物ａを塩酸加水分解した後、自動アミノ酸分析装置
を用いアミノ酸分析をおこなった結果を第１表に示す。
を用いアミノ酸分析をおこなった結果を第１表に示す。
第１表
アミノ酸 化合物ａの組成比０Ａｓｘ
（アスパラギンまたは アスパラギン酸）ＯＧｌｘ（グ
ルタミンまたはグルタミン 酸）１１Ｓｅｒ （セリ
ン） ０Ｇｌｙ （クリンン）
０Ｈｉｓ（ヒスチ／））Ｏ Ａｒｇ （アルギニン）１９ Ｔｈｒ（スレオニン） ０Ａｈａ（アラ
ニン） ０ｐｒｏ （プロリン）
０Ｔｙｒ （チロノン）
０Ｖａｔ（バリン）
ＯＭｅｔ （メチオニン） ０ＣｙｓＨ
（／スティン） ０１１ｅ（インロイノン
） ０Ｌｅｕ （ロインン）１．０ Ｐｈｅ（フェニルアラニン） ０Ｌｙｓ （
リジン） ０＊ Ｌｅｕの含量を
１．０とした場合の相対値実施例２ 化合物ａが加熱滅
菌可能であることの証明 化合物ａを１．Ｏｍｇ／ｉｆの濃度に調整した水溶液を
高圧蒸気滅菌装置を用いて１２１℃、２０分、１気圧で
加熱滅菌した後、逆相カラムμｍＢｏｎｄａｐａｋＣ１
Ｂを用いて１％〜７５％のアセトニトリルの直線濃度勾
配による）ＩＰＬＣで化合物ａを同定し、ペプチドの２
１２ｎｍにおける吸光度に基づ咥で定量し、加熱滅菌に
対する化合物ａの安定性を調べた。
（アスパラギンまたは アスパラギン酸）ＯＧｌｘ（グ
ルタミンまたはグルタミン 酸）１１Ｓｅｒ （セリ
ン） ０Ｇｌｙ （クリンン）
０Ｈｉｓ（ヒスチ／））Ｏ Ａｒｇ （アルギニン）１９ Ｔｈｒ（スレオニン） ０Ａｈａ（アラ
ニン） ０ｐｒｏ （プロリン）
０Ｔｙｒ （チロノン）
０Ｖａｔ（バリン）
ＯＭｅｔ （メチオニン） ０ＣｙｓＨ
（／スティン） ０１１ｅ（インロイノン
） ０Ｌｅｕ （ロインン）１．０ Ｐｈｅ（フェニルアラニン） ０Ｌｙｓ （
リジン） ０＊ Ｌｅｕの含量を
１．０とした場合の相対値実施例２ 化合物ａが加熱滅
菌可能であることの証明 化合物ａを１．Ｏｍｇ／ｉｆの濃度に調整した水溶液を
高圧蒸気滅菌装置を用いて１２１℃、２０分、１気圧で
加熱滅菌した後、逆相カラムμｍＢｏｎｄａｐａｋＣ１
Ｂを用いて１％〜７５％のアセトニトリルの直線濃度勾
配による）ＩＰＬＣで化合物ａを同定し、ペプチドの２
１２ｎｍにおける吸光度に基づ咥で定量し、加熱滅菌に
対する化合物ａの安定性を調べた。
比較として、高圧蒸気滅菌処理を施こさずに２１２ｎｍ
における吸光度を測定した。結果を第２表に示す。
における吸光度を測定した。結果を第２表に示す。
第 ２ 表
〔１）高圧蒸気滅菌処理 １１２８実施例３
化合物ａを含む培地の作製 Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地〔サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ
）、１３０巻４３２頁（１９５９年）二組成から重炭酸
ナトリウムとＬ−グルタミンを除いた組成の培地を調整
し、基礎培地として用いた。
化合物ａを含む培地の作製 Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地〔サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ
）、１３０巻４３２頁（１９５９年）二組成から重炭酸
ナトリウムとＬ−グルタミンを除いた組成の培地を調整
し、基礎培地として用いた。
調製した基礎培地に化合物ａを２ｍＭとなるように添加
し、高圧蒸気滅菌装置を用いて１２１℃、２０分、１気
圧で加熱滅菌した。別に同様の条件で加熱滅菌した１０
％重炭酸ナトリウム水溶液を０．１５％になるように添
加して、本発明の培地を作製した。
し、高圧蒸気滅菌装置を用いて１２１℃、２０分、１気
圧で加熱滅菌した。別に同様の条件で加熱滅菌した１０
％重炭酸ナトリウム水溶液を０．１５％になるように添
加して、本発明の培地を作製した。
巳ａｇｕｅ ＭＥＭ培地の代わりにＡｌｐｈａ ＭＩＪ
Ｃネイチャー、ニュー・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２３０巻、５２頁、１９
７１年〕、ダルベツコＭＥＭ培地〔ヴイロロジイー（Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ）、８巻、３９６頁、１９５９年〕、ハ
ム培地〔エクスペリメンタル・セル−リサーチ（巳ｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅ１ｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、
２９巻、５１５頁、１９６３年：ｌ 、ＲＰＭ Ｉ １
６４０培地〔イン・ビト１：ｌ （Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）
、５巻８９頁１９７０年〕、ウィリアムスＥ培地（エ
クスペリメンタル・セル・リサーチ ６９巻、１０６頁
、１９７１年）あるいはこれらの混合培地などを用いる
以外は同様におこなうことにより本発明の培地を作成す
ることができる。
Ｃネイチャー、ニュー・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２３０巻、５２頁、１９
７１年〕、ダルベツコＭＥＭ培地〔ヴイロロジイー（Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ）、８巻、３９６頁、１９５９年〕、ハ
ム培地〔エクスペリメンタル・セル−リサーチ（巳ｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅ１ｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、
２９巻、５１５頁、１９６３年：ｌ 、ＲＰＭ Ｉ １
６４０培地〔イン・ビト１：ｌ （Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）
、５巻８９頁１９７０年〕、ウィリアムスＥ培地（エ
クスペリメンタル・セル・リサーチ ６９巻、１０６頁
、１９７１年）あるいはこれらの混合培地などを用いる
以外は同様におこなうことにより本発明の培地を作成す
ることができる。
実施例４． 細胞上清を用いたグルタミンの遊離のＳ圧
切 ＣＨ○細胞をファルコン社製Ｆ７５フラスコに１×１０
５個／社の濃度で植え込み、１０％のラン胎児血清を含
むＭＥＭ培地２５ｍ１を用い、３７℃、５％炭酸ガスを
含む空気中でコンフルエントになるまで増殖させた後、
Ｆ１２を基礎培地として用い第３表に示した添加物を加
えた無血清培地２５ｄに置き換えた。さらに３７℃で３
日間培養した後、培養上清を無菌的に回収した。この培
養上清４５０度に、高圧蒸気滅菌装置を用いて滅菌処理
（１２１℃、２０分、１気圧）した化合物ａのリン酸緩
衝生理的食塩溶液（１０■／−）を５０４加え、３７℃
で２４時間反応させた。ついで１００℃、５分間熱処理
することにより反応を停止させ、逆相カラムμｍＢｏｎ
ｃｌａｐａｋ Ｃ１８を用い、アセトニトリルの直線濃
度勾配によるＨＰＬＣで化合物ａの分解によるグルタミ
ンの遊離を調べた。その結果を第４表に示す。
切 ＣＨ○細胞をファルコン社製Ｆ７５フラスコに１×１０
５個／社の濃度で植え込み、１０％のラン胎児血清を含
むＭＥＭ培地２５ｍ１を用い、３７℃、５％炭酸ガスを
含む空気中でコンフルエントになるまで増殖させた後、
Ｆ１２を基礎培地として用い第３表に示した添加物を加
えた無血清培地２５ｄに置き換えた。さらに３７℃で３
日間培養した後、培養上清を無菌的に回収した。この培
養上清４５０度に、高圧蒸気滅菌装置を用いて滅菌処理
（１２１℃、２０分、１気圧）した化合物ａのリン酸緩
衝生理的食塩溶液（１０■／−）を５０４加え、３７℃
で２４時間反応させた。ついで１００℃、５分間熱処理
することにより反応を停止させ、逆相カラムμｍＢｏｎ
ｃｌａｐａｋ Ｃ１８を用い、アセトニトリルの直線濃
度勾配によるＨＰＬＣで化合物ａの分解によるグルタミ
ンの遊離を調べた。その結果を第４表に示す。
第 ３ 表
添加物 終濃度
トランスフェリン １０ ■／−インンユリ
ン １０ 、／ｍｌ’亜セレン酸ナト
リウム １２．５ ｍＭＨＥＰＥＳ”
７．５ ｍＭグルタミン
２ ｍＭ重曹 ０．１５％ 葉酸 １０ ■／ｍｌ 硫酸第一鉄 １０ μＭプルロニック
Ｆ６８ ０．１ ％ＭＥＭ＃ＪＮ Ｅ Ａ
Ａ” １．０ ％＊１：Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ′ −２−ユタンスルネン 酸
＊ ２ ： Ｎ０Ｎ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ
ＡＣＩＤ （７ミ／酸増強剤） 第 ４ 表 ０．６８７ ０．５６６ ２３．６ 実施例５． 化合物ａの蛋白分解酵素活性阻害の証明 実施例４と同様に調製したＣＨ○細胞無血清培養土ａ６
２．５ｔｄｌに、化合物ａを第５表に示す各濃度添加さ
せた２０ｍＭの３−（Ｎ−モノホリノ）フロパンスルホ
ン酸−（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７，０グツド社製）３
７５ｍを加えた。さらに基質として４００μＭのＺ−フ
ェニルアラニン−アルギニン−ＭＣＡ Ｃ以下 Ｚ −
Ｐｈｅ −Ａｒｇ−ＭＣＡと略す。
ン １０ 、／ｍｌ’亜セレン酸ナト
リウム １２．５ ｍＭＨＥＰＥＳ”
７．５ ｍＭグルタミン
２ ｍＭ重曹 ０．１５％ 葉酸 １０ ■／ｍｌ 硫酸第一鉄 １０ μＭプルロニック
Ｆ６８ ０．１ ％ＭＥＭ＃ＪＮ Ｅ Ａ
Ａ” １．０ ％＊１：Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ′ −２−ユタンスルネン 酸
＊ ２ ： Ｎ０Ｎ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ
ＡＣＩＤ （７ミ／酸増強剤） 第 ４ 表 ０．６８７ ０．５６６ ２３．６ 実施例５． 化合物ａの蛋白分解酵素活性阻害の証明 実施例４と同様に調製したＣＨ○細胞無血清培養土ａ６
２．５ｔｄｌに、化合物ａを第５表に示す各濃度添加さ
せた２０ｍＭの３−（Ｎ−モノホリノ）フロパンスルホ
ン酸−（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７，０グツド社製）３
７５ｍを加えた。さらに基質として４００μＭのＺ−フ
ェニルアラニン−アルギニン−ＭＣＡ Ｃ以下 Ｚ −
Ｐｈｅ −Ａｒｇ−ＭＣＡと略す。
Ｚはペンジルオキン力ルボニルを表わし、ＭＣＡはペプ
チジル−４−メチルーコーマリルー７−アミド（ｐｅｐ
ｔｉｄｙｌ −４−ｍｅｔｈｙｌ −ｃｏｕｍａｒｙｌ
−７−ａｍｉｄｅ）を表わす：ペプチド研究新製〕あ
るいはｔ−ＢＯＣ−ロイシン−アルギニン−アルギニン
−ＭＣＡ Ｃ以下ｔ −Ｂｏｃ −Ｌｅｕ−八ｒｇ−＾
ｒｇ−ＭＣＡと略す。ＭＣＡは前記と同様である。 ペ
プチド研究新製１６２．５４を加え、３７℃で４時間反
応させた。ついで１００℃、５分間熱処理することによ
り反応を停止させた。この反応溶液中に住じたアミノク
マリンの蛍光を、励起波長３８０ｎｍ、スリット幅２η
ｍ、蛍光波長４６Ｑｎｍ、スリット幅２Ｔ′Ｉｍで測定
し、培養上清中の酵素活性を求め、化合物ａの酵素阻害
活性を調べた。その結果を第５表に示す。
チジル−４−メチルーコーマリルー７−アミド（ｐｅｐ
ｔｉｄｙｌ −４−ｍｅｔｈｙｌ −ｃｏｕｍａｒｙｌ
−７−ａｍｉｄｅ）を表わす：ペプチド研究新製〕あ
るいはｔ−ＢＯＣ−ロイシン−アルギニン−アルギニン
−ＭＣＡ Ｃ以下ｔ −Ｂｏｃ −Ｌｅｕ−八ｒｇ−＾
ｒｇ−ＭＣＡと略す。ＭＣＡは前記と同様である。 ペ
プチド研究新製１６２．５４を加え、３７℃で４時間反
応させた。ついで１００℃、５分間熱処理することによ
り反応を停止させた。この反応溶液中に住じたアミノク
マリンの蛍光を、励起波長３８０ｎｍ、スリット幅２η
ｍ、蛍光波長４６Ｑｎｍ、スリット幅２Ｔ′Ｉｍで測定
し、培養上清中の酵素活性を求め、化合物ａの酵素阻害
活性を調べた。その結果を第５表に示す。
化合物ａの代わりに蛋白分解酵素阻害剤であるロイペプ
チン０．１ｍＭを用いる以外は上記と同様におこなった
結果も第５表に示す。
チン０．１ｍＭを用いる以外は上記と同様におこなった
結果も第５表に示す。
第５表
−−２，１０３，２８
０イベブチン０．ｂｎＭ Ｏ，２１０，２
８化合物ａ Ｏ，Ｉｍｇ／ｍｌ Ｏ，８１
１，２４化合物ａ １．Ｏｍｇ／ｍｌ ０
．２５ ０．３２実施例６．細胞の生存率改善
の証明 ＣＨＯ細胞をファルコン社１ｕＦ７５フラスコにｌＸｌ
０’個／−の濃度で植え込み、１０％のウシ胎児血清を
含むＭＥＭ培地２５ｒｎＩ！を用い、３７℃で５％炭酸
ガスを含む空気中でコンフルエントになるまで増殖させ
た。Ｆ１２を基礎培地として用い第３表に示した添加物
を加え、さらに高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、２０分、
１気圧）した化合物ａを第６表に示す各濃度添加した無
血清培地２５−に置き換えた。３７℃で７０時間培養し
た後、０．２５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡ
を用いて細胞を剥し、エリスロマイシンＢ染色法と血球
計算盤にて細胞数と生育率を計測した。結果を第６表に
示す。
８化合物ａ Ｏ，Ｉｍｇ／ｍｌ Ｏ，８１
１，２４化合物ａ １．Ｏｍｇ／ｍｌ ０
．２５ ０．３２実施例６．細胞の生存率改善
の証明 ＣＨＯ細胞をファルコン社１ｕＦ７５フラスコにｌＸｌ
０’個／−の濃度で植え込み、１０％のウシ胎児血清を
含むＭＥＭ培地２５ｒｎＩ！を用い、３７℃で５％炭酸
ガスを含む空気中でコンフルエントになるまで増殖させ
た。Ｆ１２を基礎培地として用い第３表に示した添加物
を加え、さらに高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、２０分、
１気圧）した化合物ａを第６表に示す各濃度添加した無
血清培地２５−に置き換えた。３７℃で７０時間培養し
た後、０．２５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡ
を用いて細胞を剥し、エリスロマイシンＢ染色法と血球
計算盤にて細胞数と生育率を計測した。結果を第６表に
示す。
化合物ａのかわりにグルタミン３ｍＭを含む無血清培地
を用いる以外は同様におこなった結果も第６表に示す。
を用いる以外は同様におこなった結果も第６表に示す。
第６表
０８ ８．２５ ４２０、
５ １０．０５ ７２１．０
９．０ ７５参考例
各種細胞への汎用性の確認 第７表に記載した各種細胞を実施例４と同様に調製し、
得られた無血清培養上清６２．５ｍに２０ｍＭのＭＯＰ
Ｓ緩衝液３７５ρを加えた。さらに基質として４００．
ＩＪＭのＺ−Ｐ、ｈ ｅ−Ａ ｒ ｇ −ＭＣＡあるい
はｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−＾ｒｇ−ＭＣＡ ６２
．５．ｕを加え、３７℃で４時間反応させた。ついで１
００℃、５分間熱処理することにより反応を停止させた
。この反応溶液中に生じたアミノクマリンの蛍光を、励
起波長３８０ｎｍ、スリット幅２ｎｍ。
５ １０．０５ ７２１．０
９．０ ７５参考例
各種細胞への汎用性の確認 第７表に記載した各種細胞を実施例４と同様に調製し、
得られた無血清培養上清６２．５ｍに２０ｍＭのＭＯＰ
Ｓ緩衝液３７５ρを加えた。さらに基質として４００．
ＩＪＭのＺ−Ｐ、ｈ ｅ−Ａ ｒ ｇ −ＭＣＡあるい
はｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−＾ｒｇ−ＭＣＡ ６２
．５．ｕを加え、３７℃で４時間反応させた。ついで１
００℃、５分間熱処理することにより反応を停止させた
。この反応溶液中に生じたアミノクマリンの蛍光を、励
起波長３８０ｎｍ、スリット幅２ｎｍ。
蛍光波長４６０ｎｍ、スリット幅２ｎｍで測定し、培養
上清中の酵素活性を求めた。その結果を第７表に示す。
上清中の酵素活性を求めた。その結果を第７表に示す。
各種細胞の無血清培養上清の代わりにリン酸緩衝液を用
いる以外は上記と同様におこなった結果も第７表に示す
。
いる以外は上記と同様におこなった結果も第７表に示す
。
第７表
−” ０．０３ ０．０１Ｃ）１
０ ２．１０ ３．２８Ｎａｍａ
１ｗａ Ｏ，２８０，３２に５６２
０．５２ ０．７１Ｃ１２７０，２４０，２
６ ＣＣＲＦ−叶Ｍ Ｏ，４４０，２４Ｌ９２９
０．３２ ０．４６［１９３７２，４
５０，５５ Ｈｅｌａ−５３０，３２３，８７ ＣＯ３Ｏ，３２０，７７ ＊リン酸緩衝液 発明の効果 本発明によれば、加熱滅菌に対して安定であり、ＣＨＯ
ｉＢｌａなどの細胞の分泌する蛋白分解酵素を阻害し、
かつ細胞にＬ−グルタミンを供給できるようなペプチド
を提供することができる。さらに該ペプチドを用いるこ
とにより、動物細胞培養に有用な培地を提供することが
できる。
０ ２．１０ ３．２８Ｎａｍａ
１ｗａ Ｏ，２８０，３２に５６２
０．５２ ０．７１Ｃ１２７０，２４０，２
６ ＣＣＲＦ−叶Ｍ Ｏ，４４０，２４Ｌ９２９
０．３２ ０．４６［１９３７２，４
５０，５５ Ｈｅｌａ−５３０，３２３，８７ ＣＯ３Ｏ，３２０，７７ ＊リン酸緩衝液 発明の効果 本発明によれば、加熱滅菌に対して安定であり、ＣＨＯ
ｉＢｌａなどの細胞の分泌する蛋白分解酵素を阻害し、
かつ細胞にＬ−グルタミンを供給できるようなペプチド
を提供することができる。さらに該ペプチドを用いるこ
とにより、動物細胞培養に有用な培地を提供することが
できる。
Claims (7)
- （１）蛋白分解酵素の作用を受けてグルタミンを遊離し
、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を有するペプ
チド。 - （２）蛋白分解酵素が、−Ｌ−ロイシン−Ｌ−アルギニ
ン−Ｌ−アルギニン−Ｘ（ＸはＬ−アミノ酸である）の
Ｃ末端配列を有するペプチドにおけるＬ−アルギニン−
Ｘを切断する作用を触媒する酵素である請求項（１）記
載のペプチド。 - （３）式、Ｒ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−アルギニン−Ｌ−ア
ルギニン−Ｌ−グルタミン（式中、Ｒはアミノ酸残基の
Ｎ末端保護基を表わす。）で表わされるペプチド。 - （４）Ｒが、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基お
よびベンゾキシカルボニル基から選ばれるＮ末端保護基
である請求項（３）記載のペプチド。 - （５）蛋白分解酵素の作用を受けてグルタミンを遊離し
、かつ蛋白分解酵素の活性を阻害する作用を有するペプ
チドを含有する動物細胞培養用培地。 - （６）該ペプチドが、式、Ｒ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−アル
ギニン−Ｌ−アルギニン−Ｌ−グルタミン（式中、Ｒは
アミノ酸残基のＮ末端保護基を表わす。）で表わされる
ペプチドである請求項（５）記載の動物細胞培養用培地
。 - （７）Ｒが、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基お
よびベンゾキシカルボニル基から選ばれるＮ末端保護基
である請求項（６）記載の動物細胞培養用培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2315235A JPH04187697A (ja) | 1990-11-20 | 1990-11-20 | 動物細胞培養用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2315235A JPH04187697A (ja) | 1990-11-20 | 1990-11-20 | 動物細胞培養用培地 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04187697A true JPH04187697A (ja) | 1992-07-06 |
Family
ID=18063010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2315235A Pending JPH04187697A (ja) | 1990-11-20 | 1990-11-20 | 動物細胞培養用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04187697A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020508688A (ja) * | 2017-03-09 | 2020-03-26 | エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー | Ｎ−アシル−ｘ−グルタミンジペプチドを含む培地 |
-
1990
- 1990-11-20 JP JP2315235A patent/JPH04187697A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020508688A (ja) * | 2017-03-09 | 2020-03-26 | エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー | Ｎ−アシル−ｘ−グルタミンジペプチドを含む培地 |
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