JPH03501610A - 立体配座的に安定化された細胞付着ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般的に言うとペプチド類、さらに詳しくは細胞付着系に関与してい るペプチド類に関する。

発明の背景 ある細胞の他の細胞への、または細胞外物質への付着は、生物における細胞の秩 序ある発育および機能発揮に重要である。細胞付着は、ある種の付着配位子およ びそれに対応する受容体によって媒介されている。このような付着配位子には糖 タンパク質であるフィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲンが含まれ る。これら３種の全てはトリペプチド配列アルギニン−グリシン−アスパラギン 酸（Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐまたはＲ−Ｇ　−Ｄ　）を含んでおり、これ がこれら分子に結合する細胞表面の受容体の１次認識部位として機能しているよ うである。Ａ　ｒｚ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列を含有する合成ペプチドが、ペプ チド被覆された表面として細胞に供されると、該Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｐ配 列を含有する合成ペプチドは天然のフィブロネクチンまたはビトロネクチンと同 様に細胞付着を促進する。溶液では、そのようなペプチドは、フィブロネクチン 、ビトロネクチン、コラーゲン、本ペプチドそれ自体またはＡ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ −Ａ　ｓｐ細胞付着部位を有するいくつかの他の付着タンパク質で被覆された表 面への細胞付着を阻害することができる。

現在では、いくつかの受容体（それらのそれぞれの配位子のＡ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ −Ａ　ｓｐ配列を認識する）が同定されている。特異的な配位子にだけ親和性を 有している受容体もあるが、一方、程度は異なるが上記のトリペプチドを含有す る２またはそれ以上の配位子と相互作用するものもある。従って、Ａ　ｒｇ−Ｇ 　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列が受容体認識および結合に十分ではあるが、一方では、こ のペプチドの残りのアミノ酸配列が配位子−受容体相互作用の特異性に重要であ ることもあるようである。この残りの配列が結合に影響を与える正確な機序は今 までわかっていなかった。

当分野の一部の研究者が持っている１つの見解は、ある付着タンパク質のその受 容体に対する特異性は、その付着タンパク質中の、Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓ ｐ部位以外の１またはそれ以上の受容体結合部位の存在に依存しているというも のである。この見解に従えば、Ａ　ｒｇ−０１ｙ−Ａ　ｓｐ部位は共通の結合部 位であり、別の部位または部位群が特異性の原因である［例えば、ヤマダ等（Ｙ ａｍａｄａ　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９８７）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、１４４　：　３５）　；ライ ト等Ｑｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８７）、　ＰＮＡＳ　８４　：　１９ ６５）を参照］。別の可能性は、Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列が受容体結 合の実質的に全ての情報を与え、付着タンパク質に受容体特異性を付与するのは この配列の立体配座であるというものである。

種々のペプチドホルモン類の結合部位は小さいことが知られており［ローズ等（ Ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８５）、Ａｄｖ、　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　３７　：　１）］、通常、これらのペプチド類は全部で約１０１のアミノ酸 を含有しているにすぎない。対照的に、２つのフィブロネクチンポリペプチド鎖 は、それぞれ２０００を越えるアミノ酸を含有している。ただ１つのアミノ酸ト リブレットの立体配座が、それを保持している多数の異なったタンパク質の機能 に重要であるかもしれないという考えは新規である。

Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列を含有する合成ペプチドは、細胞付着を促進 も阻害もすることができるという点で有用である。１またはそれ以上の種々の付 着タンパク質中のＡ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列を認識することが知られて いるか、または認識すると推測されている、少なくとも１０種類の異なる付着受 容体が存在する。十分な正確さでもってそのような付着タンパク質の機能を再現 するか、またはそのような機能を特異的に阻害するペプチドは、重要な生理学的 現象、例えば血栓、転移、炎症、傷治癒、および補欠移植の拒絶などの操作に大 きな可能性を与える。

従って、目的の受容体にとって最適の特異性を与えるアミノ酸構造を何するペプ チドが必要とされている。本発明はこの要求を満たすものであり、また、それに 関連したその他の利点をも与えるもの本発明は、立体化学的な配座が制限されて いるために、受容体に対して高い親和性および特異性を有している新規合成ペプ チドに関する。このような制限、あるいは安定化は、例えば環化によって、螺旋 などの制約立体配座構造中に包含させることによって、天然アミノ酸のエナンチ オマーもしくはアミドなどの別の化学構造を付与することによって、またはその 他の方法によって得ることができる。

このようなペプチドは、あらゆる数の残基範囲であってよいが、好ましくは３〜 ｌＯＯの範囲であり、さらに好ましくは７〜３０の範囲である。特に、直線形の Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ金含有合成ペプチドを凌ぐ、増強されたビトロネ クチン受容体に対する親和性および選択性を有する環状ペプチドか提供される。

この環状ペプチドの親和性および選択性は天然ビトロネクチンのそれに匹敵する 。

ある態様では、本発明は、Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列の周囲のアミノ酸 の間で架橋が形成された約１０アミノ酸を有するペプチドからなる。

その構造は次のようである： このペプチドは、Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｙ−、Ａ　ｓｐ配列と架橋を形成する残基の 間に約１〜４個のアミノ酸を有していてよい。架橋残基は、例えばペニシラミン およびシスティン、またはジスルフィド架橋などの架橋を形成することができる その他のアミノ酸であってよい。

別の適当な構造は次のようである： あるいは、ペプチドはアミノ酸残基の間のペプチド結合によって環化されていて もよい。その構造は次のようである：本発明は、付着配位子の特異性がＡ　ｒｇ −Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ部位の外側の別の結合部位に帰するものではなく、そのよ うな特異性は残りのペプチドの構造によってＡ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列 に付課された立体配座構造に起因することの証拠を与えるものである。実際的に は、本発明は、立体配座が制限されたＡ、　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ金含有ペ プチドが、制限を受けていないその対応物に比べて一層高い結合親和性および異 なる受容体特異性を有することがある、ということを示すものである。これは種 々の受容体特異性および親和性を有する他のＡ、　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ、　ｓｐ 立体配座の合成を可能にするものである。

本発明の安定化されたペプチドはその細胞付着の性質に関連した種々の応用分野 を有している。例えば、ペプチドの構造が、Ｇ　ｌｙ−Ｐ　ｅｎ−Ｇ　１ｙ−Ａ 　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｃｙｓ−Ａ　１ａＬ８　８」 である１つの態様では、このペプチドは直線形の合成Ａ、　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ ｓｐ含有ペプチドに比べ、ビトロネクチン受容体に対する親和性の増加およびフ ィブロネクチン受容体に対する親和性の減少を有１−でおり、従って、このペプ チドを用いてビトロネクチン受容体含有細胞が細胞培養用の基質に結合するのを 効率的に阻害することができる。また、この安定化ペプチドは、例えば細胞培養 基質を被覆することによって、ビトロネクチン受容体を発現している細胞の付着 を促進するために用いるのにも有用である。さらに、この安定化ペプチドを用い て、細胞付着が望ましい人工補欠物などのインビトロ移植用材料を被覆するのに 用いることができる。

図面の簡単な説明 本発明を、本明細書に添付した図面を参考にしながら説明する。

第１図は、環状ペプチドの粗調製物（ａ）；および精製した環状ペプチド（ｂ） のＨＰＬＣ分析のグラフである。

第２図は、同じアミノ酸配列を有する環状および直線状ペプチドの存在下での、 正常ラット腎細胞のフィブロネクチンおよびビトロネクチンへの付着を示すグラ フである。

第３図は、実施例３のペプチドの配列および自動エドマン分解によって回収した その分解産物の回収を示すものである。

第４図は、第３図のペプチドの溶液によって得られる旋光度の変化を温度上昇の 関数として記録するものであり、比較的低温でのその制限された立体配座を示す ものである。

第５図は、実施例４のペプチドの軸投影図である。破線より上の残基は親油性で あり、破線より下の残基は親水性である。

第６図は、実施例６の環状ペプチドの合成をを反応式によって示すものである。

発明の詳細な説明 本明細書で用いる「立体配座的に安定化された」または「立体配座的に制約され た」なる用語は、あるペプチドがとりうる可能性のある立体化学構造の数に制限 か課された状聾を意味する。本発明に関しては、そのような制限は、Ａ　ｒｇ− Ｃ１ｙ−Ａ　ｓｐ結合部位の立体配座に課されるものであり、その制限は、該結 合部位の可能性ある構造的立体配座を、トリペプチド配列単独の場合に仮定され る数よりも少ないものに制限する該結合部位の周囲の化学構造の存在に起因して いる。このような立体配座的に安定化されたＡ　ｒｇ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　ｓｐ含有 ペプチドは、それでもなお、少なくとも１つの受容体との結合活性を示す。「周 囲の化学構造」は、アミノ酸またはその他の化学的部分を指し、結合部位にすぐ 隣接して存在する部分、ならびに介在アミノ酸の存在によって結合部位それ自体 から離れている部分の両方を指す。ｒ　Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列の周 囲のアミノ酸」なる用語は、Ａｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓ＋）配列に隣接する残基 ならびに介在残基によってＡｒｇ−Ｇｌｙ−Δｓｐ配列から離れている残基の両 方を指す。

本明細書において、ｒ　Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ含有ペプチド」なる用語 は、ｒ　Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ族の受容体」、即ちＡ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ −Ａ　ｓｐ配列を認識し、これに結合する受容体のうちのある受容体のための結 合部位として機能することができる１またはそれ以上のＡ　ｒｇ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ 　ｓｐ含有結合部位を有するペプチドを意味するものとする。Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ ｙ−Ａ　ｓｐ配列は結合活性を保持するために不変であることが必須であること がわかっているが、残りのペプチドの組成ならびにペプチドと結合して存在する 他のあらゆる化学的部分は、結合部位の活性に必ずしも影響することなく変化さ せることができる。Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列以外に特異的な化学構造 または配列が提供されている場合、結合部位の機能を破壊しない種々の修飾は当 該ペプチドの定義から逸脱することなく包含されるという意図の範囲内にある。

本明細書で用いる「架橋」なる用語は、ペプチド骨格を形成しているアミド結合 以外のペプチド中の２つのアミノ酸の間の化学結合を意味する。

本明細書で用いる「ペプチド結合」または「ペプチド連結」なる用語は、あるア ミノ酸のカルボキシ基と別のアミノ酸のα−アミ７基の間のアミド結合を意味す る。

本明細書で用いるアミノ酸の短縮形を以下に挙げる：Ａｌａ　アラニン α−ＡＢＡ　α−アミノイソ酪酸 Ａｒｇ　アルギニン Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　システィン Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｓ　ｕｃｃＡ　ｌａ　スクシニル−アラニン本発明は、立体配座的に安定化され た形態の配列Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐを含有する新規合成ペプチドを提供 するものである。ある態様では、このペプチドは以下の配列からなる： Ｘ　−Ｒ、−Ｒｙ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ−Ｒ、−Ｒ、−ＹＥ配列中、 Ｒ１およびＲ４はペプチド結合、またはジスルフィド架橋などの架橋を形成する か、または形成することができるアミノ酸であり、Ｒ７およびＲｏはそれぞれ０ 〜５アミノ酸の配列であり、Ｘは１またはそれ以上のアミノ酸またはＨであり、 Ｙは１またはそれ以上のアミノ酸またはＯＨまたはＮ　Ｈ、であり、そしてＸと Ｙの合計数はＯ〜約１００アミノ酸であるのが好ましく、より長い配列が有用で あることもある］。好ましい態様では、Ｒ１はペニシラミンであり、Ｒ４はシス ティンであり、Ｒ１はグリシンであり、そしてＲ３はＳ　ｅｒ−Ｐ　ｒｏである 。ＸおよびＹで示されているように、付加的なアミノ酸がＮＨ，およびＣ０ＯＨ 末端にそれぞれ存在することができる。

このようなペプチドは、周知の化学合成法を含むあらゆる適当な方法によって合 成することができる。直線形の配列は、市販の回動ペプチド合成機を用いて合成 するのが好ましい。このようにして合成した物質を沈澱させ、例えば高速液体ク ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製することができる。９５％以 上の純度の合成ペプチドが好ましいが、それより低い純度であってもよい。

細胞付着系に関連する特定の細胞表面受容体に対して高い特異性および親和性を 有する本発明の安定化ペプチドの１つを得るために、合成されたペプチドを当分 野で周知の方法を用いて環化する。例えば、残基がスルフヒドリルを含有してい るときには、ペプチドの冷水溶液をＫ　３［Ｆ　ｅ（ＣＮ　）ｅ］で酸化するこ とによってジスルフィド架橋を得ることができる。当分野で既知の他の環化方法 も用いることができる。

また、本発明の安定化された環化ペプチドは、隣接していないアミノ酸残基の間 のペプチド結合を形成させることによっても製造することができる。そのような ペプチド結合の形成方法は、シラー等［５ｃｈｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉ ｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、２５　：　１７１（ １９８５）］（この文献の記載は本明細書の一部を構成する）が記載している。

簡単に言うと、Ｎ　”−Ｆ　ｍｏｃ−アミノ酸およびＢｏａおよび３級−ブチル タンパク賃を用いてペプチド鎖を組み立てることにより、メリフィールド樹脂上 で環状ペプチドを合成することができる。

・また、安定化されたペプチドを、当分野で周知の方法に従い、アルファ（α） 螺旋またはトリプル螺旋などの螺旋を形成するように設計または処理することに よって製造することもできる。

本明細書に記載の安定化されたペプチドは、例えばビトロネクチンを含む付着タ ンパク質の類似物として用いることができる。好ましい配列を持った環状ペプチ ドのビトロネクチン受容体に対する親和性は、類似の直線形配列のそれよりも高 いので、この環状ペプチドを用いて、フィブロネクチン受容体などの他の受容体 の機能に影響を及ぼすことなくビトロネクチンの結合を阻害することができる。

まだ、この環状ペプチドを用いて、細胞培養の基質を被覆するなどの処置によっ てビトロネクチン受容体を発現している細胞の付着を促進することができる。

Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｓｐ配列を含有するある種の特別の構造が、結合部位 に特定の特異性またはその池の特性を付与することがわかった。そのような構造 には、配列−Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ−Ｎ　Ｈ！、−Ｄ　−Ａ　ｒｇ−Ｇ 　１ｙ−Ａｓｐ−および−Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ−Ｄ　−３ｅｒ−が含 まれる。立体配座的に安定化された後者の配列は、フィブロネクチン受容体に対 して有用な親和性を示すが、ビトロネクチン受容体にはかかる親和性を示さない 。天然のアミノ酸のエナンチオマー形か存在すると、Ｄ−Ａｒｇの場合において 、トリプシンなどの分解酵素に対して耐性が付与されることがわかっている。そ の池の有用なペプチドには、配列Ｐｈｅ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　５ｐ−８ｅ ｒ−Ｐ　ｒｏＳＧ　１ｙ−Ａ、　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ、　５ｐ−８ｅｒ−Ｐ　ｈ ｅおよびＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｌｙ−Ａ、５ｐ−８ｅｒ−Ｐｈｅが含まれる。

本発明のペプチドを人工補欠物または移植物（例えば、血管移植物）を含む医学 装置の被覆などのインビボ用途に工業的に用いて、それらに対する細胞の付着を 容易にすることができる。さらに、本ペプチドは、細胞付着を促進するための基 質（細胞培養基質など）の被覆など、インビトロでの用途も有している。

本発明の他の特徴および利点は、以下に挙げるさらに詳細な実施例によって明ら かとなろう。これらの実施例は本発明の詳細な説明するものであるが、これらは 例示に過ぎない。

実施例１　ペプチド合成 自動ペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ　；　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ、　ＦｏｓｔｅｒＣ１ｔｙ、　Ｃａｌ　１ｆｏｒｎｉａ）を用い、製 造元の指示に従って、ペプチドＧ　１ｙ−Ｐ　ｅｎ−Ｇｌｙ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ ｙ−Ａ　５ｐ−３ｅｔ−Ｐ　ｒｏ−Ｃｙｓ−Ａ　Ｉａを合成した。フッ化水素を 用いて樹脂から切断した後、ペプチドを冷エチルエーテルで洗浄し、水冷エーテ ルでトリフルオロアセテート溶液から沈Ｈさせた。次いで、このペプチドを蒸留 水に再溶解し、凍結乾燥した。

このペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ　ＢｏｎｄａｐａｋＴＭＣ＋ｅ（３ｘ　３０ｃｔ ：　１０ｔｒｘバツキング、Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ、　、　Ｍｉｌｆｏｒｄ 、　ＭＡ）を用いるＨＰＬＣでさらに精実施例１記載のようにして合成したペプ チド（６１１９）を、予め煮沸して冷却しておいた水（４１りに溶解した。ペプ チドの添加直前の４５分間、窒素を水中に吹き込んだ。ペプチドを溶解した後、 フェロシアン化カリウムＫ　ｓ　［Ｆ　ｅ（ＣＮ　）　６］の０．１μ９／村の 水溶液を、黄色が５分間持続するようになるまで（約５　ｘ（２）、撹拌ペプチ ド溶液に滴下した。この操作の間はＮＨ，ＯＨの添加によって溶液のｐＨを７゜ ０に維持した。この溶液を弱い真空下で２０時間放置し、次いで凍結乾燥した。

環化された物質をＳ　ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−１：５カラム（１，８ｘ１２０ｃ ｍ）にかけることによって過剰のＫ　３［Ｆ　ｅ（ＣＮ　）Ｊを除去した。

このペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ　ＢｏｎｄａｐａｋＴ′Ｃ＋ｅカラム（３ｘ３０ ｃｘ；１０μ次バッキング）（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ、　＋　Ｍｉｌｆｏｒ ｄ、　ＭＡ）を用いる逆相ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドを、緩衝液Ａ（ ２０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７，５）を用いてカラムにかけ、４０％緩衝液 Ａおよび６０％アセトニトリルからなる緩衝液Ｂの勾配液で溶離した。第１図は 、逆相ＨＰＬＣによる環化ペプチドの精製結果を示すものである。トレースａは ＣＩ８カラムでのペプチドの精製を示すものである。

細胞のフィブロネクチンまたはビトロネクチンへの付着を阻害する能力を試験す るために分画１．２および３をプールした。環状ペプチドを含有する分画２を同 じ方法でＣ１８カラムのクロマトグラフィーにもう一度かけ、単一のピークを得 た（トレースｂ）。

Ｃｔａカラムによって得られた主ピーク（第１図の分画２）は９０％の回収ペプ チドからなっており、単量体の環状ペプチドであると推定されたが、この理由は 、それが該配列に予想される時間、カラムに保持されたこと、ならびに環化して いない物質および多量体の形態が主ピークから十分に離れていたためである。

実施例３　トリプル螺旋構造の形成 実施例１のようにして得た直線形ペプチドの細胞付着促進Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ− Ａ　ｓｐ配列を、デノダー等［Ｄｅｄｈａｒ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８７）ｊ、 ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ。

ｒｏ、ａ　：　５８５］（この文献の記載は本明細書の一部を構成する）の方法 に従い、このペプチドに螺旋構造をとらせることによって立体配座的に制約を加 えた。簡単に説明すると、配列（Ｐ　ｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇ　１ｙ）４−Ａ　ｌａ− Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ−Ｔ　ｈｒ−Ｇ 　１ｙ−（Ｐ　ｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇ　１ｙ）４を有する３３アミノ酸のペプチドを 、自動ペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ　；　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を用いて合成した。この配 列を、第３図に示すように、気相シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａ　；　 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）を用 い、自動エドマン分解によって確認した。この直線形のペプチドを、必要最少限 の量の０゜０５％酢酸中、４°Ｃで一晩、溶解させた。ローデス等［Ｒｈｏｄｅ ｓ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１７　：　 ３４４２］（この文献の記載は本明細書の一部を構成する）の方法に従い、偏光 分析を用いて螺旋構造をとっていることを確認した。このペプチドは、第４図に 示すように、３０°Ｃの変曲点（二次導関数がＯに等しい；Ｔｍ）を有する「融 解」曲線を与え、湯度の上昇につれて顕著に変化する高い度数の負の旋光度によ って判断されるように、低温ではトリプル螺旋として存在し適当な条件のもとで α螺旋の立体配置をとるアミノ酸配列を有す本明細書の一部を構成する）が示し たように、交互のα−アミノイソ酪酸（α−ＡＢＡ）およびアラニン（Ａｌａ） 残基を含有するペプチドは構造形成有機溶媒中で螺旋立体配座をとる。さらに、 アミノ末端に負に荷電した基およびカルボキシ末端に正に荷電した基が存在する と、そのような螺旋を安定化するように働く双極子が得られる［シエマーカー等 （Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　、　（１９８７）、　Ｎａｔｕｒｅ　３ ２６　：　５６３）］（この文献の記載は本明細書の一部を構成する）。また、 親水性残基が螺旋の一方の側に存在し、親油性残基が他方の側に存在する両親媒 性の２次構造が得られるようにアミノ酸の配列を選択した［カイザー等（Ｋａｉ ｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　＋　（１９８４）＋　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３　：　２ ４９）］（この文献の記載は本明細書の一部を構成する）。

自動ベブチドシークエンサ−（Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ　＋　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）によって次の直線形配列を調製した：　Ｓ　ｕ ｃｃＡ　１ａ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｕ−ＣＡ　Ｂ　Ａ　−Ａ　１ａ−Ｌ 　ｙｓ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ−Ｓ　ｅｒ−Ｌ　ｅｕ−ａ　Ａ　Ｂ　Ａ −Ｇ　１ｙ−Ｌｙｓ−ＣＡ　Ｂ　Ａ−Ａ　１ａ−Ｌｙｓ　。

実施例１の方法に従ってペプチドを合成し、精製した。このペプチドのα螺旋の 立体配座を第５図に図示する。

献の記載は本明細書の一部を構成する）の方法に従って、それぞれフィブロネク チンおよびビトロネクチンをヒト血漿から精製した。

フィブロネクチンおよびビトロネクチンに対する正常ラット腎細胞の付着をルオ スラチ等（上記）の記載のようにして検定した。簡単に言うと、０．ＩＭ　ＰＢ Ｓ中、１２μ９／πＱの濃度のフィブロネクチンまたはビトロネクチンの溶液（ ０，１ｆｆ□を９６ウエルのプラスチック製微量滴定プレートのそれぞれのウェ ルに入れ、室温で２時間放置した。未結合のタンパク質をＰＢＳによる３回の洗 浄で除去した。

検定の１日前に、正常ラット腎細胞の全面培養物を通常の組織培養トリプシンを 用いてｌ：２に分けた。この細胞をＰＢＳ（ｐＨ７，２）で３回洗浄した。ＰＢ Ｓ中、○　ｌ巧／ｙ＋（２の２ｘ結晶化トリプシン（Ｓｉｇｍａ　；タイプＴＩ ［）（１０仄ρ）を加え、細胞が分離するまで３７°Ｃでインキュベートした。

次いて、分離した細胞を遠心して集め、ＰＢＳ中の０　、５　ｍ９／　ｘＱ大豆 トリプシンインヒビターの溶液で３回洗浄して、トリプシンの中和を確実なもの にした。最後の遠心の前に、試料を取り、トリパン・ブルー排除によって細胞数 および生存性を測定した。この細胞を１０６細胞／ＩＣの濃度で最少必須培地（ ＭＥＭ）に懸濁し、単個−細胞の懸濁液が得られるまでピペッティングによって 分散させた。

微量滴定ウェル中に細胞を均等に分散させるために、ＭＥＭ（０゜１村）をそれ ぞれのウェルに加え、次に細胞懸濁液（ｏ、ｉＭｃｌ）を加えた。このプレート を３７°Ｃで１時間インキュベートした。

結合していない細胞は、単に培地を除き、ウェルを洗浄することによって除去し た。このプレートをＰＢＳに浸漬し、洗液を除去した。次いで、この細胞をＰＢ Ｓ中の３％バラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の１％トルイジン・ブルー 、バラホルムアルデヒドで染色し、付着した細胞を数えた。表面に付着した細胞 を数えることができる細胞カウンター（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、　Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＭＡ）を用いてそれらの数を測定した。

ＭＥＭ中に溶解したペプチドの保存溶液を加えてＯ〜１０．０ｍＭのウェル中の 最終濃度にすることによって、基質に対する細胞の付着を阻害する本発明の環状 化ペプチドの能力を検定した。検定に加える前に、保存溶液を炭酸水素すＩ−１ ）ラムで中和した。ラット腎細胞を加え、既述のようにしてウェルをインキュベ ートし、そして検定した。

フィブロネクチンおよびビトロネクチン基質への正常ラット腎細胞の付着を阻害 する環状化ペプチドの能力をさらに詳しく測定するために、配列Ｇ　ｌｙ−Ｐ　 ｅｎ−Ｇ　１ｙ−Ａ、　ｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ、　５ｐ−３ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｃｙ ｓを有する非環状化、即ち直線形のペプチドの結合を検定した。第２図に示した ように、本発明の環状ペプチドは直線形ペプチドよりも１０倍低いモル濃度でビ トロネクチンへの付着を阻害したが、フィブロネクチンへの付着を阻害するのに は有効ではなかった。対照的に、直線形のペプチドは比較的類似した濃度で側基 質への細胞の付着を阻害した。

本説明に拘束されることを望むものではないが、本発明の環状ペプチドはフィブ ロネクチンおよびビトロネクチン受容体の結合部位に対して異なる親和性を有し ているようである。このことは、本検定に用いたラット腎細胞がフィブロネクチ ンおよびビトロネクチンに対して別個の受容体を有することが知られていること に合致するものである。

実施例６ペプチド結合による環状化 シラー等［５ｃｈｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉ ｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　２５　：　１７１（１９８５）］（この文献 の記載は本明細書の一部を構成する）の方法の改良法を用いて、ペプチドシクロ −（１−７）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　５ｐ− Ｇ　ｌｙを合成した。

ＰＡＭ樹脂−Ｔ　Ｆ　Ａ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ 、　＋　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ　；０．８０ｇモル／９の置換率で樹 脂に結合したｔ−Ｂｏｃ　Ｇｌｙを有する）を用いて合成を行った（第６図を参 照）。全てのアミノ酸をＢ　ａｃｈｅｍＢ　１ｏｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｉ　ｎｃ、 　（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ）から入手した。樹脂（１，２５９；　 １．　Ｏｘ−Ｅ：　ル）ヲジクｏｏメタ７（ＤＣＭ）（２０ＦＣ）とともに１５ 分間振盪して膨潤させ、Ｎ２圧をかけてＤＣＭを除去し、この操作を繰返した。

ｔ−Ｂｏｃ保護基を２ｏ％Ｔ　Ｆ　Ａ　［Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ＋　Ｉｎｃ、　。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ　；　Ｄ　ＣＭ　（Ｐｆ　１ｚｅｒ、　Ｇｒｏ ｔｏｎ、　ＣＮ）中、１５分間］（２Ｍ）で切断した。この反応を繰返した（こ の間、３０分間振盪した）。これら反応の間には、樹脂をＤＣＭ（２０ｆｆＩ２ ）で１回、２分間洗浄した。

第２の反応の後には、樹脂をＤＣＭ（２０ｄ）で６回、それぞれ２分間づつ洗浄 し、続いて、ＤＣＭ中の１ｏ％トリエチルアミン（ＴＥＡ）（２０πｇ）で２回 、それぞれ３分間づつ中和した。この樹脂をＤＣＭ（２０ｇので６回、それぞれ ２分間づつ洗浄し、次の反応に備えた。

撹拌棒を装着した５０＋（の丸底フラスコ中で、Ｆ　ｍｏｃ−Ａ　５ｐ−ｔ−７ ”チルエステル［（ＯｔＢｕ）ＯＨＩ（１，０３ｇ；　２．５モル）をＤＣＭ（ １５ｍＱ）に溶解し、次いでＤＣＭ中のＩ　Ｍ　Ｄ　Ｉ　Ｃ（Ａｌｄｒｉｃｈ　 Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、　、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　１１）（２，５ｍρ）を加え た。この混合ジイソプロピルカルボジイミドを５分間撹拌し、次いでｏ’ｃでＤ 　Ｍ　Ｆ　（Ｐｆ　１ｚｅｒ）中の２．０Ｍヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｈ ＯＢ　Ｔ　；　ＡｌｄｒｉｃｈＸ　１　、２５　ｘＱ）を加え、さらに１０−１ ５分間撹拌した。この混合物を樹脂に加え、１〜２時間振盪した。この反応をも う１回繰返しく２回結合）、結合の間には樹脂をＤＣＭ（２０ＭＱ）で２回洗浄 した。第２の結合が完了した後に、樹脂をＤＣＭ（２０ｘＣ）で３回洗浄した。

Ｆ　ｍｏｃ基の切断はＤＣＭ中の２０％ピペリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ）（新たに 調製、２Ｍ）で行い、１５分間振盪した。この反応をさらに３０分間繰返した。

次いで、この樹脂をＤＭＦで１回およびＤＣＭで５回、それぞれ２．０分間づつ 洗浄した。この樹脂を次の結合に備えた。

撹拌棒を装着した５０ｎ（！の丸底フラスコ中で、Ｆ　ｍｏｃ−Ｐ　ｒｏ−○Ｈ （０，８４９：　２．５ｍモル）をＤＣＭ（１５＊ρ）に溶解し、次いでＤＣＭ 中のＩＭＤＩＣ（２，５ｍのを加えた。この混合物を５．０分間撹拌し、次いで Ｏ′ＣでＤＭＦ中の２Ｍ　ＨＯＢＴ（１，２５，ｚＱ）を加え、さらに１０〜１ ５分間撹拌した。この混合物を樹脂に加え、１〜２時間振盪した。この反応をも う１回繰返しく２回結合）、結合の間には樹脂をＤＣＭ（２０ｘＣ）で２回洗浄 した。第２の結合が完了した後に、樹脂をＤＣＭ（２０ｍので３回洗浄した。上 記と同じ方法を用いてＦｗｏｅを切断し、この物質を次の結合に備えた。

撹拌棒を装着した５０Ｆ１１２の丸底フラスコ中で、Ｆ　ｍｏｃ−Ａ　ｓｐ−ベ ンジルエステル［（ＯＢｚｌ）−０ＨＩ（１，１１ｙ；　２．５ｍモル）をＤＣ Ｍ（１５酎）に溶解し、次いでＤＣＭ中のＩ　Ｍ　Ｄ　Ｉ　Ｃ（２，５ｘｆ２） を加えた。

この混合物を５．０分間撹拌し、次いでＯｏＣでＤＭＦ中の２．ＯＭＨＯＢＴ（ １，２５ｇｇ）を加え、１０〜１５分間撹拌した。この混合物を樹脂に加え、１ 〜２時間振盪した。この反応をもう１回繰返しく２回結合）、結合の間には樹脂 をＤＣＭ（２Ｍ）で２回洗浄した。

第２の結合か完了した後に、樹脂をＤＣＭ（２０ｘｆｆ）で３回洗浄した。

上記と同じ方法を用いてＦ　ｍｏｃを切断し、この物質を次の結合に備えた。

撹拌棒を装着した５０ｘＱの丸底フラスコ中で、Ｆ　ｍｏｃ−Ｇ　１ｙ−ＯＨ（ ０，７４９：　２．５ｍモル）をＤＭＦ（１５ｚｆｆ）に溶解し、次いでＤＣＭ 中のＩ　Ｍ　Ｄ　Ｉ　Ｃ（２，５＋７りを加えた。この混合物を５．０分間撹拌 し、次いでｏ’ｃでＤＭＦ中の２．０Ｍ　ＨＯＢＴ（１，２５ｘ（りを加え、さ らに１０〜１５分間撹拌した。この混合物を樹脂に加え、１〜２時間振盪した。

この反応を２回行い（２回結合）、結合の間には樹脂をＤＣＭ（２０ｘｆ２）で ２回洗浄した。第２の結合が完了した後に、樹脂をＤＣＭ（２０ｘｆｆ）で３回 洗浄した。上記の方法と同じ方法を用いてＦ　ｍｏｃを切断し、この物質を次の 結合に備えた。

撹拌棒を装着した５０吋の丸底フラスコ中で、Ｆ　ｍｏｃ−Ａ　ｒｇ　トシレし 、次いでＤＣＭ中のＩＭＤＩＣ（２，５πで）を加えた。この混合物を５．０分 間撹拌し、次いで０℃でＤＭＦ中の２．０Ｍ　ＨＯＢＴ（１゜２５ｍ１２）を加 え、さらに１０〜１５分間撹拌した。この混合物を樹脂に加え、１〜２時間振盪 した。この反応をもう一度繰返しく２団結合）、結合の間には樹脂をＤＣＭ（２ ０ｘＣ）で２回洗浄した。第２の結合を行った後に、樹脂をＤＣＭ（２０ｘｆｆ ）で３回洗浄した。上記の方法と同じ方法でＦ　ｍｏｃの脱保護を行い、この物 質を次の結合に備えた。

撹拌棒を装着した５０ｘρの丸底フラスコ中で、ｔ−Ｂ　ｏｃ−Ｇ　１ｙ−ＯＨ （０，４４９；　２．５次モル）をＤＣＭ（１５ｆｆ（２）に溶解し、次いでＤ ＣＭ中のＩ　Ｍ　Ｄ　Ｉ　Ｃ（２，５１１１のを加えた。この混合物を５，０分 間撹拌し、次いで０°ＣでＤＭＦ中の２Ｍ　ＨＯＢＴ（１，２５次１２）を加え 、さらに１０〜１５分間撹拌した。この混合物を樹脂に加え、１〜２時間振盪し た。この反応を繰返しく２団結合）、結合の間には樹脂をＤＣＭ（２０ｘＱ＞で ２回、それぞれ２分間づつ洗浄した。第２の結合を行った後に、樹脂をＤＣＭ（ ２０ｉので３回、それぞれ２分間づつ洗浄した。

Ｇｌｙｌのｔ−Ｂｏａ基およびＡｓｐ７のｔ−ブチルエステル側鎖の脱保護は、 ＤＣＭ中の２０％ＴＦＡ（２０πρ）を加えることによって同時に行った（１５ 分間）。この反応をもう一度繰返した（３０分間）。反応の間には、樹脂をＤＣ Ｍで１回、２分間洗浄した。第２の反応の後に、樹脂をＤＣＭ（２０ＭＱ）で６ 回、それぞれ２分間づつ洗浄し、次いでＤＣＭ中の１０％Ｔ　Ｅ　Ａ　（２０ｍ Ｑ’）で２回、それぞれ３分間づつ中和した。この樹脂をＤ　ＣＭ　（２０ｘＱ ’）で６回、それぞれ２，０分間づつ洗浄した。

ＧｌｙｌのＮ−末端をＡ、ｓｐ７の側鎖カルボキシ基に環化させた。この環化は Ｄ　Ｍ　Ｆ中の２Ｍ　ＨＯＢＴ（５ｘｇ）およびＩＭ　ＤＩＣ溶液（１０ｘＩ２ ）を加えることによって行い、４日間振盪した。それぞれの日に古い試薬を抜き 取り、樹脂をＤ　Ｍ　Ｆ　（２０ｘ１２）で１回、Ｄ　ＣＭで３回、それぞれ２ 分間づつ洗浄した。次いて、新しい試薬（Ｄ　Ｉ　ＣおよびＨＯＢＴ）を加えた 。

この樹脂を、当分野で周知の方法を用い、フッ化水素で切断した。

切断の後、ペプチド含有の樹脂を冷エチルエーテルで洗浄し、次いで１０％酢酸 で溶解して、樹脂からペプチドを除去した。この濾液を凍結乾燥した。回収され た粗生成物は５０８＋ｆＪであった。この粗生成物を、Ｃｌ８（ＩＸ２０Ｃ膚； １０−μ屑バッキング）カラムのＨＰＬＣによる精製にかけた。ペプチドを緩衝 液Ａ（１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６，０）中でこのカラムにかけ、６０％ アセトニトリルおよび４０％緩衝液Ａからなる緩衝液Ｂの勾配で溶離した。精製 後の収量は２１０ｕであった。

ＤＭＳＯ−ｄ６を溶媒とするプロトンＮＭＲによって、この化合物が目的の環状 ペプチド構造を有していることを確かめた。この化合物のＩＤおよび２Ｄ（ＣＯ ３ＹＳＣＯ３Ｙ−Ｒｅｌａｙ、およびＮ０ＥＳＹ）スペクトルを、カリフォルニ ア大学、サンジエゴＮＭＲ施設で、Ｎ　１ｃｏｌｅｔソフトウエアを装備した３ ６０ＭＨｚ　ＦＴ−ＮＭＲによって得た［「タンパク質および核酸のＮ　Ｍ　Ｒ Ｊ　（Ｙｕｔｈｒｉｃｈ、　Ｋ、　、　Ｊｏｈｎ　Ｎｉ１ｅｙ　＆　Ｓｏｎ、　 ＮＹ（１９８６））を参照；この文献は本明細書の一部を構成する］。

現時点で好ましい態様を参考にして本発明を説明したが、本発明から逸脱するこ となく当業者が種々の修飾を加えうろことは理解されよう。従って、本発明は以 下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

Ｆ／Ｇ、３　）−リブ１し蝙尤趙ハぐフ笠ド′セーＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＮ Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ　（ＯｔＢｕ）　＜ｌｙ−ＰＡＭＦｍｏｃ−ｓａｒ（Ｂｚｉ） −Ｐｒｏ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＰＡＭ国際調査報告 屍、−Ｍｎ２．、ｅａ、６Ｍｌ１ｈａ＋ＮＬ　Ｐ（−Ｔ／１．’５８８１０４４ ０３１１１″″′ＩＩ′ｌ　Ａ＃Ｉ′ｊａ１１１１　ｘｓ、　ｐｃＴ／υり８Ｂ １０４４０３

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−受容体族の構成員に対するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓ ｐ含有配位子の合成方法であって、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を付加的な化学 構造と結合させることによって該Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列の立体化学的構造 を立体配座的に制限するように合成することを特徴とする方法。
2. ２．立体配座の制限が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列の周囲のアミノ酸の間の架 橋による環状ペプチドの形成によって行われる請求項１記載の方法。
3. ３．架橋がジスルフィド架橋である請求項２記載の方法。
4. ４．架橋がペプチド結合である請求項２記載の方法。
5. ５．立体配座の制限が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドを螺旋構造中に挿 入することによって行われる請求項１記載の方法。
6. ６．螺旋構造がトリプル螺旋である請求項５記載の方法。
7. ７．螺旋構造がα螺旋である請求項５記載の方法。
8. ８．立体配座の制限が、Ｄ型のＡｒｇ残基を供することによって行われる請求項 １記載の方法。
9. ９．立体配座の制限が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドを付加的な化学的 部分結合させることによって行われる請求項１記載の方法。
10. １０．付加的な化学的部分が、該Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列のカルボキシ末端 のＤ−セリンである請求項９記載の方法。
11. １１．付加的な化学的部分が、該Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列のアミノ末端のフ ェニルアラニンである請求項９記載の方法。
12. １２．付加的な化学的部分がペプチドである請求項９記載の方法。
13. １３．請求項１記載の方法によって製造される産物。
14. １４．Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ受容体族の構成員に対するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓ ｐ含有配位子の特異性を増大させる方法であって、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列 を付加的な化学構造と結合させることによって該Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列の 立体化学的構造を立体配座的に制限し、特定の受容体に対するＡｒｇ−Ｇｌｙ− Ａｓｐ結合部位配列の親和性を増強することを特徴とする方法。
15. １５．立体配座の制限が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列の周囲のアミノ酸の間の 架橋による環状ペプチドの形成によって行われる請求項１４記載の方法。
16. １６．架橋がジスルフィド架橋である請求項１５記載の方法。
17. １７．架橋がペプチド結合である請求項１５記載の方法。
18. １８．立体配座の制限が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドを螺旋構造中に 挿入することによって行われる請求項１４記載の方法。
19. １９．螺旋構造がα螺旋である請求項１８記載の方法。
20. ２０．螺旋構造がα螺旋である請求項１８記載の方法。
21. ２１．立体配座の制限が、Ｄ型のＡｒｇ残基を供することによって行われる請求 項１４記載の方法。
22. ２２．立体配座の制限が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドを付加的な化学 的部分と結合させることによって行われる請求項１４記載の方法。
23. ２３．付加的な化学的部分が、該Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列のカルボキシ末端 のＤ−セリンである請求項２２記載の方法。
24. ２４．付加的な化学的部分が、該Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列のアミノ末端のフ ェニルアラニン残基である請求項２２記載の方法。
25. ２５．Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列の立体化学的構造を制限するように結合され たＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドと付加的な化学的構造からなる組成物。
26. ２６．次の配列を含有するペプチド −Ｒ１−Ｒ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｒ３−Ｒ４−［配列中、Ｒ２は約０〜 ５アミノ酸からなり、Ｒ３は約０〜５アミノ酸からなり、Ｒ１およびＲ４は架橋 によって結合しているアミノ酸である］。
27. ２７．Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列が立体配座的に制限されている細胞付着促進 配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有する安定化ペプチド。
28. ２８．細胞付着促進Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配 列の周囲のアミノ酸の間の架橋による環状ペプチドの形成によって立体配座的に 制限されている請求項２記載の安定化ペプチド。
29. ２９．架橋がジスルフィド架橋である請求項２８記載の安定化ペプチド。
30. ３０．架橋がペプチド結合である請求項２８記載の安定化ペプチド。
31. ３１．立体配座の制限が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドを螺旋構造中に 挿入することによって行われる請求項２７記載の安定化ペプチド。
32. ３２．螺旋構造がトリプル螺旋である請求項３１記載の安定化ペプチド。
33. ３３．螺旋構造がα螺旋である請求項３１記載の安定化ペプチド。
34. ３４．立体配座の制限が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチドを付加的な化学 的部分と結合させることによって行われる請求項２記載の安定化ペプチド。
35. ３５．付加的な化学的部分が、該Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列のカルボキシ末端 のＤ−セリンである請求項３４記載の安定化ペプチド。
36. ３６．付加的な化学的部分が、該Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列のアミノ末端のフ ェニルアラニン残基である請求項３４記載の安定化ペプチド。
37. ３７．付加的な化学的部分がペプチドである請求項３４記載の安定化ペプチド。
38. ３８．基質に対する培養細胞の付着を阻害する方法であって、（ａ）請求項２７ 記載の安定化ペプチドを溶液とし；そして（ｂ）該培養細胞を該安定化ペプチド 溶液と接触させること；を特徴とする方法。
39. ３９．基質に対する細胞の付着を促進する方法であって、（ａ）請求項２７記載 のペプチドを基質上に固定化して安定化ペプチド結合基質を得；そして （ｂ）遊離の培養細胞を該安定化ペプチド結合基質に暴露すること；を特徴とす る方法。
40. ４０．次の配列からなる環化ペプチド：【配列があります】
41. ４１．１またはそれ以上の以下の配列を含有する細胞結合活性を有するペプチド 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】または 【配列があります】
42. ４２．次の配列からなる環化ペプチド：【配列があります】。
43. ４３．次の配列からなる環化ペプチド：【配列があります】。
44. ４４．次の配列からなる環化ペプチド：【配列があります】。