JPH04188068A - ビリルビン検出用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、体液中のビリルビン測定用診断剤に関するも
のである。更に詳しくは体液、特に尿中のビリルビンを
検出するための改良された試験片を提供するものである
。

［従来の技術］ 尿中のビリルビンを検出することは、肝および腸疾患の
診断において重要とされている。

牌臓などの細胞内系で破壊された赤血球は血色素を放出
し、この血色素はヘムを遊離しビリルビンとなり、流血
中でアルブミンと結合し間接ビリルビンの形で肝臓に運
ばれる。

肝臓では、グルクロニルトランスフェラーゼという酵素
の作用によりグルクロン酸抱合を受け、直接ビリルビン
に変わる。

腸管内でビリルビンは腸内細菌の酵素作用により還元さ
れてウロビリン体になり、大部分は糞便中に排泄される
が、一部は腸管で吸収され肝臓に戻るものと、尿中に出
るものとに別れる。

ビリルビン代謝の障害により、血中のどリルビン濃度が
上昇している現象を臨床上、黄痘といいこの黄痘には、
血中に非抱合型の増量する場合と抱合型の増量する場合
とがあり、後者の黄痘においては抱合型ビリルビンが水
溶性であるため、尿中へ排泄される。尿中にビリルビン
が検出されることは、肝細胞障害、あるいは胆路疾患な
どにより血中に抱合型ビリルビンが増加しているときの
一つの指標となる。

従って、尿中ビリルビン検査は肝疾患などのスクリーニ
ング検査として大変有効である。

尿中ビリルビン検査法としては、ビリルビンを酸化して
生じるビリベルジンの緑色を観察する方法（ロジン法、
ダメリン法など）と、ビリルビンとジアゾニウム塩との
カップリング反応により生じたアゾ色素を観察する方法
（アゾカップリング法）とに大別される。

今日では、後者の方法を試験紙に適用させた試験紙法が
、ビリルビンを測定するもっとも簡単な半定量法として
普及し、その重要性も益々高まっている。

アゾカップリング法においては、スルファニル酸、２，
４−ジクロロアニリン、２，５−ジクロロアニリン、２
，６−ジクロロアニリン、４−ニトロアニリンなどのア
ミンから誘導されたジアゾニウム塩が用いられる。しか
しながら、これらのジアゾニウム塩とビリルビンとの反
応は、反応速度および感度に問題があり、低濃度のビリ
ルビン検出は困難であった。

［発明が解決しようとする課題］ 上記問題を解決すべく種々の反応促進剤が検討されてき
た。例えば、特公昭５３−２８１１９号には、ビリルビ
ンとの反応を促進するために、ある種のリン酸ジエステ
ルを含有する試験用組成物が開示されている。また、特
公昭５２−４３４９３号には、促進剤としてウレイド化
合物とスルホン酸との付加化合物が開示されている。

しかし、これらの方法によれば、ビリルビンとジアゾニ
ウム塩の反応はある程度促進されるが、尿中に共存する
５−ヒドロキシインドール酢酸、インジカン、あるいは
ウロビリノーゲンなどとジアゾニウム塩との妨害反応に
影響され、低濃度のビリルビンの検出が困難であった。

それ故、これらの共存物質との反応色を弱め、しかもビ
リルビンとジアゾニウム塩の反応色を強める手段が必要
となり、本発明者らは先に、共存物質の影響を著しく軽
減し、かつビリルビンとの反応性を高める促進剤に関し
て特許８願した（特公昭６３−５６９５０号）。しかし
ながら、この促進剤を含有したビリルビン測定用試験片
を用いて尿中のビリルビンを検出する際、尿中に共存す
るウロビリノーゲンは低濃度の場合は影響を与えないが
、高濃度共存した場合には黄褐色を呈するため、ビリル
ビンの検出を妨害することがある。

また、促進剤の分子内に活性メチレン基を有することよ
り、ジアゾニウム塩との副反応を押さえるために、系の
ｐＨを可能な限り酸性側に維持する必要があるなどの問
題を有していた。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、上記の問題点について検討を重ねた結果
、ビリルビンとジアゾニウム塩との反応において、促進
剤として下記一般式、 （式中、Ｒ２は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、
アミノ基、またはハロゲン原子を表わしＲｚ、Ｒｉは各
々水素原子、アルキル基、アリール基、水酸基、ハロゲ
ン原子、またはアルコキシカルボニル基を表わす。）で
示される化合物を含有すると、５−ヒドロキシインドー
ル酢酸、インジカン、ウロビリノーゲンの影響を受けに
くく、しかもビリルビンとの反応を著しく高めることを
見いだし、本発明を完成した。

一般式［Ｉ］の化合物は、ジャーナル　オブジ　アメリ
カン　ケミカル　ソサイテイ−［Ｊ。

Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、］　７４．５９４３　（１９
５２）において、下記式［ＩＩ］のように共鳴構造を取
ることが報告されている。

例えば、２Ｈ−ピリド（１，２−ａ）ピリミジン−２−
オンは、無色の固体、融点は２５０℃、熱に安定であり
、１００ｍ１の水に８０ｇ以上溶は溶解性に優れている
。

本発明に使用される化合物は、一部を除き公知であり、
その合成法は一般に知られている方法、例えば、ジー　
アール　ラッピン、ジャーナル才ブ　オルガニック　ケ
ミストリー［Ｇ、　Ｒ，Ｌａｐｐｉｎ。

Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、］　２６．２３５０　（１９６
１）、エッチ　ェヌ　アルシャロー、アイ　ニー　アル
ビアティー、ジャーナル　オン　ヘテロサイクリック　
ケミストリー［Ｈ，Ｎ、Ａｌ−Ｊａｌｌｏ　ａｎｄ　ｒ
、Ａ、ＡＩ−Ｂｉａｔｙｊ、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ
、Ｃｈｅｍ、］　　１５．８０１　（１９７８）、など
の文献に記載されている方法により容易に合成すること
ができる。

以下に、本発明に使用される化合物の例と、その合成例
を示すが、本発明ｔまこれに限定されるものではない。

合成例［Ｉａ　］ ５０ｍ１のエーテルに溶かした、９．４ｇの２−アミノ
ピリジンと、１０ｍ１のエーテルに溶がした８、４ｇの
プロピオール酸メチルを室温で４８時間撹拌する。反応
後、生成物を濾過し、集めた結晶をソックスヒー抽出器
を用いて抽出すると、無色結晶の［Ｉａｌ　３．１ｇが
得られた。

融点は２４８℃〜２５０℃であった。

合成例［Ｉｂ　］ １１．８ｇのフェニルプロピオル酸エチルと７．１ｇの
２−アミノピリジンを３０ｍ１のエタノールに溶かし、
オイルバス中１３０℃〜１４０℃で加熱する。２０時間
後、エバポレーターでエタノールを除去し、残った結晶
をエーテルで洗い濾過する。

得られた黄色結晶をアセトンで再結晶すると、無色針状
結晶の［Ｉｂ　］　　１１．３ｇが得られた。

融点は２２０℃〜２２１℃であった。

本発明による一般式［Ｉ］の化合物が存在するときのビ
リルビンとジアゾニウム塩の反応における促進作用が何
に基づくかは明らかではないが、ジアゾニウム塩の他に
酸のみを含有し、一般式〔■〕の化合物を含有しない試
験片は、ビリルビンと著しく緩慢に反応することから、
本発明によってもたらされる良好な結果は正に驚くべき
ことである。しかも、尿中に共存する５−ヒドロキシイ
ンドール酢酸、インジカン、ウロビリノーゲンの如き妨
害物質の影響を受けにくいということは、本発明の大き
な特徴である。

意外なことに、一般式’［Ｉ　］の化合物が存在すると
き、ビリルビンとジアゾニウム塩との発色色調は、一般
式［Ｉ］の化合物が存在しないときよりも浅色副側に移
動する。また、尿中に共存するウロビリノーゲンとジア
ゾニウム塩との発色色調も浅色副側に移動するため、ウ
ロビリノーゲンとジアゾニウム塩との反応色を見かけ上
剥めることとなり、このことは同時にビリルビンとの反
応色を著しく強める結果をもたらすということも木登含
浸液中１〜１５％の濃度で使用され、一種または数種を
組み合わせて用いることもできる。

試験片に含有されるジアゾニウム化合物としては、周知
のジアゾニウム化合物を用いることができるが、特に分
子内にハロゲンおよびニトロ基を含有するアリールジア
ゾニウムが好ましく、例えば２．４−ジクロロベンゼン
ジアゾニウム、２゜４−ジブロモベンゼンジアゾニウム
、４−ニトロベンゼンジアゾニウム、２．５−ジクロロ
ベンゼンジアゾニウム、２，４．５−１リクロロペンゼ
ンジアゾニウム、などが挙げられる。

また、ジアゾニウム化合物を安定化するため公知の塩と
することが有利であり、例えばサルフェート、テトラフ
ルオロポレート、アリールスルホネートなどが挙げられ
る。特にテトラフルオロボレート、アリールスルホネー
トは熱的に安定であるため、保有性に優れ最適である。

！、本発明におＧ゛ては・ジアゾ０ウム塩Ｃま・０・Ｏ
ｖ２〜２％の範囲で用いることができ、好ましくは０．
０５〜１％の濃度である。

また、ビリルビンとジアゾニウム塩とが反応するには酸
成分を添加して強酸性のｐＨ領域、殊にｐＨ１〜３に維
持することが有利であり、このｐＨを維持できる固体の
酸が使用される。例＾ば、シュウ酸、マレイン酸、クエ
ン酸、スルホサルチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メ
タリン酸などが挙げられ、５〜２５％の濃度が好ましい
。

組成物を安定化させるために、ジアゾ化学から公知の安
定剤の添加も考慮され、例久ばホウフッ化物塩、アリー
ルスルホン酸塩、メタリン酸ナトリウムなどが挙げられ
、０〜５％の濃度で使用される。

試験片に湿潤性を付与するために、表面活性剤を使用す
ることも可能であり、陽イオン性、陰イオン性、非イオ
ン性のいずれの表面活性剤を用いても良いが、殊に陰イ
オン表面活性剤は、本発明における、一般式［Ｉ］で表
される化合物の作用を増強せしめるため、有利に使用さ
れる。

陰イオン表面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム
、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジオクチル
スルホコハク酸ナトリウムなどが挙げられる。表面活性
剤は、０．１〜２％、好ましくは０．２〜０．８％の濃
度で使用される。

本発明に用いられる担体としては、濾紙、綿、木片、あ
るいは不織布などが挙げられるが、濾紙が特に好ましい
。

本発明の試験片は、例えば次のようして製造される。

一般式［Ｉ］で表される化合物および酸を精製水に溶解
し、必要ならばこれに水、または水と混和し得る溶媒に
溶解した表面活性剤および安定剤を加え、次いでジアゾ
ニウム塩を溶解して浸漬液とする。

このようにして得られた溶液に濾紙などの担体を含浸さ
せ、４０〜６０℃で熱風乾燥する。得られた担体を適当
な大きさに裁断し、両面接着テープを用いてポリスチレ
ンなどの支持体に張りつけて使用する。

この試験片を用いて体液、殊に尿中のビリルビンを検出
する場合、例えば次のようにして実施される。

被検尿に試験片を浸して直ちに引き上げ、一定時間後に
生じた色を、あらかじめ作成した種々濃度での標準色（
色調表）と対比して、その濃度を推定する。また、一定
時間後に得られた色から、分光反射計を用いて反射強度
を測定し、検量線から濃度を求めることも可能である。

［実施例］ 次に本発明の詳細な説明するために、以下の実施例を示
すが、これにより本発明が限定されるものではない。

実施例１゜ 本発明のビリルビン検出用試験片の製造下記処方の成分
を溶解した浸漬液に、濾紙（東洋濾紙■製Ｎｏ、　５２
５　）を含浸し、５０℃で３０分間乾燥した。

処方 ２．４−ジクロロベンゼン ８７゛ジアゾニウムテトラフルオロボレート０．０８ｇ
１′［′つ、ウヤ　　　　　　　　　　　　１゜　　　
８２Ｈ−ピリド（１，２−ａ） ピリミジン−２−オン　　　　　　　４．０１ｇドデシ
ルベンゼンスルホン酸 ナトリウム　　　　　　　　　　　　　０．３ｇメタノ
ール　　　　　　　　　　１０　　　　ｍｌ精製水　　
　　　　　　　全量１００　　　　ｍｌこのようにして
得られた試験紙を５ｍｍ角に裁断し、両面接着テープを
用いて５ｍｍＸ８０ｍｍのポリスチレンシートの一端に
貼りつけた。この試験片を被検尿に浸したところ、ビリ
ルビンを含有しない尿では淡黄色を示したが、ビリルビ
ンを含有する尿では１０〜２０秒後に赤橙〜赤色を示し
、感度限界は０　、３　ｍｇ／ｄｌであった。

同一の組成で、２Ｈ−ピリド（１，２−ａ）ピリミジン
−２−オンを含有しない試験片では、反応に１〜２分間
を要し、感度限界は１〜２　ｍｇ／ｄｉであった。

実施例２゜ ウロビリノーゲンの影響の比較 実施例１で得られた本発明のビリルビン検出用試験片、
ならびに比較のために従来の促進剤を用いて製造した試
験片とを使用して、各々１，４゜８、　１２ｍｇ／ｄｉ
の濃度のウロビリノーゲン含有圧に試験片を浸して直ち
に引き上げ、一定時間後に生じた反応色を調べた結果を
第１表に示した。

なお、比較のための試験片は、実施例１の処方中の２Ｈ
−ピリド（１，２−ａ）ピリミジン−２−オンに代えて
、３．４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド（１，２−ａ）ピリ
ミジン−２−オン、〔東京化成工業■製：商品名「アシ
ッドキャブターＨ」］を等モル使用する他は、実施例１
と同様にして製造した。

第１表の結果より、本発明による試験片は従来の促進剤
を用いた試験片に比べ、ウロビリノーゲンの影響を受け
にくいことが、確認された。

実施例３゜ ５−ヒドロキシインドール酢酸およびインジカンの影響 実施例１で得られた試験片（本発明の試験片）と、対象
として実施例１の処方中の促進剤、すなわち２Ｈ−ピリ
ド（１，２−ａ）ピリミジン−２−オンを除いた処方の
他は実施例１と同様にして製造した試験片とを使用して
、５−ヒドロキシインドール酢酸５　ｆｆ１ｇ／ｄｉの
被検液での反応性を調べた。被検液に試験片を浸して直
ちに引き上げ、１５．３０．６０．１２０秒の各経過時
間における発色の程度を、発色が認められない場合を０
とし、発色が認められた場合にはその発色強度に応じて
割り当てた数字で表した結果を、第２表に示した。

同様にしてインジカン５　ｍｇ／ｄｌの被検液での反応
性を調べた結果を、第３表に示した。

以下余白 第１表 ウロビリノーゲンの影響の比較 ５−ヒドロキシインドール酢酸（５ｍｇ／ｄｉ水溶液）
との反応第３表 インジカン（５ｍｇ／ｄｉ水溶液）との反応実施例４゜ 実施例１の処方中の２Ｈ−ピリド（１，２−ａ）ピリミ
ジン−２−オンに代え、各種の一般式［Ｉ］に示す化合
物を等モル使用した場合の感度限界、ならびに反応時間
を調べた結果を第４表に示した。

以下余白 第４表 ［発明の効果］ 本発明のビリルビン検出用試験片は、被検尿中の共存物
質による妨害反応を受けにくく、かつビリルビンとの反
応が著しく促進されることから、低濃度のビリルビンを
も感度よく検出することを可能とする。

更に、尿中にウロビリノーゲンが高濃度に共存する場合
においても、その影響は著しく軽減され従って、ビリル
ビンとの反応特異性は著しく向上するという優れた効果
を奏するものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）体液中のビリルビンと反応して呈色しうるジアゾ
   ニウム化合物、反応に十分な量の酸成分および一般式、 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕 （式中、Ｒ＿１は水素原子、アルキル基、アルコキシ基
   、アミノ基、またはハロゲン原子を表わし、Ｒ＿２、Ｒ
   ＿３は各々水素原子、アルキル基、アリール基、水酸基
   、ハロゲン原子、またはアルコキシカルボニル基を表わ
   す。）で示される化合物を必須成分として含有すること
   を特徴とする体液中のビリルビン検出用試験片