JPH04190793A - セルラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び組換え微生物によるセルラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、セルラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及
びこのプラスミドを含む組換え微生物ならびに当該組換
え微生物を用いたセルラーゼの製造法に関する。

［従来の技術］ 過去数十年のセルラーゼの研究は、バイオマス資源の有
効利用や醸造業における麦芽の糖化などの観点から行な
われた歴史を有し、セルラーゼは、例えばトリコデルマ （Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｗａ　）属、アスペルギルス（Ａ
ｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅ
ｍｏｎｉｕｍ　）属、フミコーラ（Ｉ（ｕｌｉｃｏｌｌ
ａ　）属、イルペックス（灯Ｐ■）属なとの糸状菌類や
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｗ　）属、シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｗｏｎａｓ　）属、ルミノ
コッカス（Ｒｕ１ｎ　１ｎｏｃｏｃｃｕｓ　）属及びセ
ルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　）属等の細菌
類などニソノ供給源を求めてきた（村尾沢夫ら「セルラ
ーゼ」、講談社（１９８７）　）。また最近、セルラー
ゼの新規産業的用途として、衣料用洗浄剤組成物に関す
るものが開発され、バチルス（１３ａｃｉｌｌｕｓ　）
属、セルロモナス属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
　ｔｏａ＋　ｃｅｓ）属細菌の生産するアルカリセルラ
ーセ°が注目されている（特公昭５０−２８．５１５号
公報、特開昭５８−２２４６８６号公報、特開昭６１−
２８０２７６号公報、特開昭６３−１０９７７１号公報
、特開昭６３−２４０７８５号公報など）。

しかしながら、これらの微生物は、いずれもセルラーゼ
の生産性が乏しく、更に、セルラーゼ生産の為にはセル
ラーゼの誘導物質、例えば、セルロース繊維等が必要で
あり、また、多種多様の類似酵素群を生産することから
、目的とするセルラーゼ成分の分離精製が困難であるこ
と等の問題を有していた。

このため、セルラーゼの工業的利用に適する開発例は極
めて少なく、僅かにバチルス属細菌の一種、バチルスエ
スピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、）　ＫＳＭ−６３５株
による衣料用洗浄剤組成物としてのアルカリラーゼにの
生産（特開昭６３−１０９７７１号公報）に、その例を
見ることができるのみであった。

一方、近年になって、上記の問題点を解決すべく、セル
ラーゼ産生微生物由来のセルラーゼ遺伝子、具体的には
、トリコデルマ属（Ｐｅｎｔｔｊｌａら、Ｇｅｎｅ、　
４５巻、２５３頁、（１９８６）　）、クロストリジウ
ム属（Ｂｅｇｕｉｎら、　Ｊよりａｃｔｅｒｉｏｌ、、
　１６２巻、１０２頁、（１９８５）、Ｊｏｌｉｆｆら
、−犯匹１旦戸り直立ｉｄｓ　Ｒ＋ひ２１４巻、８６０
５頁、（１９８６）及びＧｒｅｐｉｎｅｔら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓむ主、１４巻、１７９１頁、（１９
８６））　、セルロモナス属（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ、
　４４巻、３１５頁、（１９８６）、Ｎａｋａｍｕｒａ
ら、Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　　４巻、２４７頁
、（１９８６））　、バチルス属（ＲｏｂｓｏｎとＣｈ
ａｍｂｌｉｓｓ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅ工上り４１６９巻、２０１７頁、（１
９８７）、Ｆｕｋｕ＋＋ｏｒｉら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、　　１６８巻、４７９頁、（１９８６）、Ｆｕｋ
ｕｍｏｒｉら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

１３２巻、２３２９頁、（１９８６）及び特開平１−２
８１０９０号公報）、ストレプトマイセス属（Ｎａｋａ
ｉら、広釘■１６５巻、２２９頁、（１９８８））及び
ルミノコッカス属（Ｋａｗａｉら、Ａ　ｒｉｃ、　Ｂｉ
ｏｌ、　ｃｈｅａ＋。

５１巻、５９頁、（１９８７）　）等のセルラーゼ産生
微生物の保有するセルラーゼ遺伝子が、遺伝子操作技術
を用いてクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ　）されている
。

こうした試みは、遺伝子工学技術によるセルラーゼの生
産性の向上を目的としており、また、目的のセルラーゼ
のみをコードする遺伝子をクローニングすることによっ
て、セルラーゼの分ａｎ製を簡略化することが期待され
てきた。更に、蛋白工学の手法によってセルラーゼの機
能及び特性の改良等を行うことも可能となるものと考え
られ、極めて意義のある試みである。

しかしながら、これまでのところ、遺伝子のクローニン
グの際の宿主菌として、大部分の場合に大腸菌を用いて
いることから、遺伝子組換え微生物によるセルラーゼの
生産性は低く、また、生産されるセルラーゼが菌体外に
分泌されることなく、ペリプラズム間隙（ｐｅｒｉｐｌ
ａｓｇ＋ｉｃ　ｇａｐ　）に蓄積し、大腸菌の菌体内蛋
白との分離Ｈｔ’Ｂが困難である等の問題点があった。

また、枯草菌（、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）
　Ｉ　Ｆ　０　３０３４株由来の中性セルラーゼ遺伝子
（特開昭６１−２８０２８４号）及び好アルカリ性バチ
ルスエスピーＮ−２株白米のアルカリセルラーゼ遺伝子
（特開昭６２−２９６８７４号）は、枯草菌を宿主とし
てクローニングされたが、これらの組換え枯草菌につい
てもセルラーゼの生産量は低く、組換え微生物によるセ
ルラーゼの経済的工業生産例は、これまでのところ知ら
れていない。

［問題を解決するための手段］ 本発明者は、セルラーゼを大量に分路する組換え微生物
を得、これを用いて有利にセルラーゼを取得すべく鋭意
研究を重ねた結果、バチルス属細菌由来のセルラーゼ遺
伝子を特定のシャトル・ベクター（５ｈｕｔｔｌｅ　ｖ
ｅｃｔｏｒ　）と結合させることにより作製されたプラ
スミドは、これを枯草菌に導入したときに供与体である
バチルス属細菌と比べて、遥かに多量のセルラーゼを培
地中に生産することを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明の目的は、バチルス属細菌由来のセルラ
ーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片と、大ｍ菌および枯草菌で
複製可能なシャトルベクターを結合することにより得ら
れる紐換えプラスミドを提供することである。

また、本発明の他の目的は、このＭ撓えプラスミドを含
む紐換え微生物を提供することである。

更に、本発明の他の目的は上記Ｍ撓え微生物を培養する
ことによるセルラーゼの製造法を提供することである。

本発明のプラスミドは、バチルス属細菌由来のセルラー
ゼ遺伝子を、大腸菌と枯草菌で複製可能なシャトルベク
ターと公知方法に従い結合させることにより調製される
。

本発明のセルラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の供与体と
なる微生物は、セルラーゼ産生能を有するバチルス属微
生物であり、好ましくは、セルラーゼ産生能を有し、ア
ルカリ性ｐＨ領域で良好な生育を示す、所謂、好アルカ
リ性（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　）バチルス属細菌で
ある。このようなセルラーゼ産生能を有する好アルカリ
性バチルス属細菌の例としては、アルカリセルラーゼに
−６４を産生ずるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｐ、　）　Ｋ　Ｓ　Ｍ　−６４（ＦＥＲＭＰ−１
０４８２）等を挙げることができる。このバチルス・エ
スピーＫＳＭ−６４は、本発明者らが菌体外に著量のア
ルカリセルラーゼに−６４を生産する微生物として栃木
県那須郡の土壌より分離したものであり、微工研菌寄第
１０４８２号として寄託されている。ＫＳＭ−６４株の
分類学的特性については、本発明者らによる平成元年６
月２日付けの特許出願明細書（特願平１−１４０６４２
号）に詳述されているが、その要点は以下の通りである
。

尚、本菌株は中性以下のｐＨでは生育てきず、アルカリ
性ｐＨ領域において旺盛に生育する、所謂、好アルカリ
性細菌の一種であることから、通常、分類学的試験に用
いられる培地には１．０％の炭酸ナトリウム （Ｎ　ａ　２　ＣＯ２）を別滅菌徨に添加し、使用した
。

（バチルスエスピーＫＳＭ−６４株の 分類学的特性） （ａ）顕微鏡的観察結果 ■形態：桿状 ■大きさ　二　０．５〜１．２μｍＸ　１．２〜６．６
μｍ ■胞　子　：　準端立内生胞子、円筒形（０，７〜１．
０μｍＸ１．５〜 ２．５μｍ （ｂ）各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板培地　：　生育良好 集落の形状　；　円　形 表　　　　　面　；　　円　　清 周　　　　　縁　；　　円　　滑 色　　　調　；　乳白色 光　　　　　沢　；　　あ　　リ ■肉汁液体培地　：　生育良好 ■肉汁ゼラチン高層培地（穿刺培養）：生育良好、ゼラ
チンを液化する。

■リドマスミルク培地： ミルクの凝固、ペプトン化は認め られない。培地がアルカリ性の為 リドマスの変色は判定不能 （ｃ）生理学的性質 ■硫酸塩の還元　：　陽　性 ■脱窒反応　：　陰性 ■ＭＲテスト　　：　判定不能（培地がアルカリ性の為
） ■ｖｐテスト　　：　陽　性 ■インドールの生ｆ６．．：　　陰　性■硫化水素の生
成　：　陰　性 ■澱粉の加水分解　：　陽　性 ■クエン酸の利用　：　はつきりせず ■無機窒素源の利用：　硝酸塩、アンモニウム塩ともに
利用する。

［相］色素の生成　：　黄色色素を生成。

■ウレアーセ゛　二陰性 ＠オキシダーゼ　　：　陽　性 ■カタラーゼ　：陽性 ０生育温度範囲　　＝　２０〜４０″Ｃ０至適温度は３
０〜３７°Ｃ ■生育のｐＨ範囲　：　　ｐＨ７〜１１０至適ｐＨは１
０，５ ［相］酸禦に対する態度　：　好気的 ■Ｏ−Ｆテスト　：　好気状態でのみ生育、変色は判定
不能（培 地がアルカリ性の為） ［相］糖の利用性 陽性： Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、 ぶとう糖、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラ クトース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、蔗糖、乳糖、ト
レハロース、Ｄ−マン ニット、イノジット、グリセリン、澱 陰　　性　： Ｄ−ソルビット ０食塩含有培地に於ける生育： 食塩７％で生育良好。１０％で生 育せず。

［株］カゼインの分解　：　陽　性 ＠　Ｇ＋Ｃ含量　：約３７．７ｍｏ１％上記微生物によ
って生産されるアルカリセルラーゼに−６４の酵素学的
特性についても前述の特許術出願明細書に詳述されてい
るが、その要点を列記すると以下の通りである。

（アルカリセルラーゼに−６４の酵素学的特性） （１）作用 セルロース繊維に作用し、還元糖を精製する。

（２）基質特異性 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の他、リケナン
に良く作用し、ラミナリンにも作用する。また、濾紙、
ｐ−ニトロフェニルグルコシド及びｐ−ニトロフェニル
セロビオシドに対しても若干の酵素活性を有している。

（３）作用ｐＨ及び至適ｐｎ ＣＭＣに対する作用ｐｎ範囲は、３〜 １３であり、至適作用ｐＨは８．５〜１０である。

（４）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１０．５の範囲内で安定である（３０°Ｃ２１
時間保存）。

（５）作用温度及び至適温度 １０〜７０°Ｃの範囲で作用し、至適温度は５０℃であ
る。

（６）温度安定性 ５０　’Ｃ以下の温度で安定である（ｐＨ９，１０分間
処理）。

（７）分子量 約１８万と約８万の２種類の分子量を与える（バイオゲ
ルＡ−０，５ｍを用いたゲル濾過法）。

（８）金属イオンの影響 Ｈｇ２＋により阻害され、Ｃ○２＋及びＭ　ｎ　２＋に
より活性化される。

（９）界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、
ポリオキシエチレンアルキルスルホン酸塩、α−オレフ
ィンスルホン酸塩、２−スルホ脂肪酸塩、二級アルカン
スルホン酸塩、ドデシルスルホン酸塩、石鹸、ポリオキ
シエチレンセカンダｌノーアルキルエーテルは活性を殆
ど阻害しなＩ、）。

（１０）プロテアーゼの影響 プロテアーゼに耐性を有する。

（１１）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、ト１ノボリリン酸ソー
ダ、ゼオライトは活性を阻害しない。

バチルス属に属する供与菌株力Ｘらセルラーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を得る方法とじては、例えば、マー７−
　（１＋１ａｒｖｕｒ　）法（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　３巻、２０８頁、（１９６１）　）やサ
イトウとミウラの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ａｃｔａ。

７２巻、６１９頁、（１９６３）　）等が挙げられるが
、他の類似な方法を用いることもできる。

斯くして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素で切断するこ
とによって、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製するが
、用いる制限酵素の種類としては、当該遺伝子を分断し
ないものであれば、如何なるものでも使用できる。

例えば、供与微生物としてバチルス・エスピー（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　Ｋ　Ｓ　Ｍ　−６４、制限酵
素としてＨｉｎｄｍを用いれば、当該遺伝子を分断する
ことなく、第３図に示した制限酵素切断地図を有する約
４．４ｋｂの断片を得ることができる。また、当該遺伝
子或いは活性必須領域を切断する制限酵素を用いる場合
においても、部分切断の条件を用いることによって当該
遺伝子の全領域を含むＤＮＡ断片をｔＡ製することが可
能である。

また、セルラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が既に他のベ
クターを用いてクローニングされている場合、これを適
当な制限酵素番こよって切断することによって、当該Ｄ
ＮＡ断片を調製することができる。本発明者ら番よ、染
色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄｍで切断して得られた、
当該遺伝子を含む約４．４ｋｂ（第３図）のＤＮＡを大
腸菌用のプラスミド・ベクター　ｐＢＲ３２２にクロー
ニングし、次いで、これを制限酵素Ｈｉｎｄｍで切断す
ることによって、アルカリセルラーゼ’に一６４遺伝子
を含むＤＮＡ断片を調製した。

本発明に於けるアルカリセルラーゼに一６４遺伝子は、
第３図に示した制限酵素切断地図を有する約４．４ｋｂ
のＤＮＡ断片に含まれており、地図の上部に矢印で示し
た約２．５ｋｂの領域にその構造遺伝子が存在している
。更に、アルカリセルラーゼに一６４遺伝子の近傍は、
第４図に示した塩基配列を有している。本配列中に、Ａ
ＴＧコドン（塩基番号１）から翻訳を開始、塩基配列の
下に示したアミノ酸８２２残基から成る配列をコードす
るオーブン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅ
ａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ、　０ＲＦ）が存在する。○Ｒ
Ｆの１０塩基上流に枯草菌の１６８リボゾームＲＮＡの
３′末端の配列（Ｍｃ−Ｌａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ、　　
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２５６巻、１１２８３頁、（１
９８１）　）と相補性が高いＡＧＧＡＧＧＴ配列が存在
し、更に上流には、σ４３型プロモーターの共通配列（
Ｇｉｔｔら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、。

２６０巻、７１７８頁、（１９８５）等）と相同性の高
い配列が３箇所（塩基番号−１２３〜−９４，−２４６
〜−２１３及び−４０３〜−３７３、塩基配列上部の傍
線部分）に認められる。また、塩基番号２４６７番の翻
訳終止コドンＴＡＡの下流には転写ターミネータ−と思
われる逆向き反復塩基配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐ
ｅａｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）が存在する（塩基番号２４
８７〜２５２８、塩基配列下部の傍線部分）。

一方、本発明に用いる大腸菌および枯草菌で複製可能な
シャトルベクターとしては、例えばプラスミドベクター
ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社製）が挙げられる。

このシャトルベクターは、アンピシリン耐性遺伝子とテ
トラサイクリン耐性遺伝子をコードする約４．９ｋｂの
シャトルベクターである（Ｉｓｈｉｗａと５ｈｉｂａｈ
ａｒａ、　Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｇｅｎｅｔ、、　６０巻、
２３５頁、（１９８５）　）。本ベクターは、大腸菌と
枯草菌の双方に於いて安定に保持され、且つ、複製され
、更に両宿主菌中で、テトラサイクリン耐性遺伝子が発
現することから、本抗生物質に対する耐性を形質転換の
際の指標として利用することができる。また、当該ベク
ターにはポリ・リンカ−（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）が連
結されており、本ポリ・リンカ−上に存在するＨｉｎｄ
Ｉ［Ｉ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｓａｌ　Ｉ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＳｍａＩ及びＥｃ　ｏＲ工の各制限酵素切断点は、
当該ベクター上の他の位置には存在しないことから、こ
れらの制限酵素のうちの一種類によって、当該ベクター
を切断することにより、ベクターＤＮＡを直鎖分子化し
、セルラーゼ遺伝子、例えばアルカリセルラーゼに一６
４遺伝子のクローニングに用いることができる。尚、更
に、直鎖化の際に用いる制限酵素の種類として、セルラ
ーゼ遺伝子、例えばアルカリセルラーゼに一６４遺伝子
を含むＤＮＡ断片を調製する際に用いたものと同種類の
ものを利用すれば、後の両ＤＮＡの結合の際に便利であ
る。

斯くして得られたセルラーゼ遺伝子断片と直鎖状ベクタ
ーＤＮＡ分子を混合し、これにＤＮＡリガーゼを添加し
て結合反応を行なうことによって、Ｍ換えＤＮＡ分子の
混合物を調製することができる。次いで、このようにし
て得られる組換えＤＮＡ分子の混合物で宿主菌となる微
生物を形質転換し、目的の組換えプラスミドを含む宿主
菌を分離し、更に、目的の宿主菌株から、目的の組換え
プラスミドを抽出、精製することができる。この際、組
換えＤＮＡ分子の混合物によって枯草菌を直接、形質転
換することも可能であるが、−般に枯草菌の形質転換に
於いては、枯草菌自体が有する高い遺伝子組換え能等の
為に、目的の紐換えプラスミドが得られるＷＩ半が低く
、場合によっては、目的のプラスミドを取得できないこ
ともある。この為、先ず、結合反応産物によって大腸菌
の形質転換を行ない、目的の組換えプラスミドを大腸菌
中で増幅させた後に、これを抽出、精製し、枯草菌に導
入する方法をとると、より良い結果を得ることがある。

尚、宿主菌の種類としては、目的の組換えプラスミドを
安定に保持し、複製することができ、セルラーゼを生産
することができるものであれば、如何なる菌株も用いる
ことができる。例えば、大腸菌宿主の場合、Ｈ８１０１
株、０６００株或いはＪＭＩ０９株等、また、枯草菌宿
主の場合には、ＢＤ１７０株、１６８株、或いはｌ５Ｗ
１２１４株等を挙げることができる。

組換えＤＮＡ分子による宿主菌株の形質転換の方法は特
に限定されないが、例えば、大ｍＮ宿主株の場合、マン
デル（Ｍａｎｄｅｌ　）とヒガ（）ｆｉｇａ）の方＆　
（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　５３巻、１５９頁（
１９７０）　）やハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法（
Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、、　　１６６巻、５５
７頁（１９８３））等、また枯草菌宿主菌株の場合には
、コンピテント・セル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ
　）法（ＣｏｎｔｅｎｔｅとＤａｂｎａｕ、　Ｍｏ１．
　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、１７７巻、４５９頁（１９
７９）　）やプロトプラスト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　
）法（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、、　１６８巻、１１１頁（１９７８）　’
）等を用いることができる。

組換え微生物のスクリーニング方法についても、特に限
定されるものではないが、例えば、以下の様に行なえば
良い。すなわち、先ず、ベクターＤＮＡ分子上にコード
されているテトラサイクリン耐性の形質を指標として、
ベクター由来のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ分子によって形
質転換されたものを一次選択する。例えば、形質転換処
理を行なった菌懸濁液をテトラサイクリン（１５μｇ／
ｍｌ）を含む寒天培地上に塗抹し、これを適当な温度で
培養して、出現した集落を形質転換体微生物として分離
すれば良い。次に、これを適当な寒天プレートにレプリ
カ法等によって移植し、培養によって集落を出現させた
徨、カルポジキメチルセルロース（ＣＭＣ’）とりゾチ
ーム（枯草菌宿主の場合は必ずしも必要としない）を含
み、適当な緩衝液によってｐＨを９付近に調整した寒天
（４５°Ｃないし５０℃）を重層し、固化後、更に培養
を継続する。この後、例えばコンゴ−・レッド（Ｃｏｎ
ｇｏ　ｒｅｄ）法（７ｅａｔｈｅｒとＷｏｏｄ、　Ａｐ
ｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　４３巻、
７７７頁（１９８２）　’）等によって集落周辺のＣＭ
Ｃの分解が検出された集落を目的の組換え微生物として
分離する。

斯くして得られた組換え微生物が保持する組換えＤＮＡ
分子は、組換え微生物を適当な培地中に生育させること
によって増幅した後、通常のプラスミド調Ｍ１法（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９８２
）等）を用いて抽出できる。更に、各種制限酵素による
切断パターンを電気泳動法（Ｍｅｙｅｒｓ、　　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１２７巻、１５２９頁（１９
７６）　）等によって解析することによって、組換えＤ
ＮＡ分子がシャトルベクター、例えばｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ分子とセルラーゼ遺伝子、例えばアルカリセルラーゼ
に一６４遺伝子を含むＤＮＡ断片が結合したものである
ことを確認できる。

シャトルベクター１）ＨＹ３００ＰＬＫを用いて調製さ
れたアルカリセルラーゼに一６４遺伝子の全領域を含む
組換えプラスミドの好適な例として、プラスミドｐＨＣ
Ｌ６４　（第１図）及びｐＨＣＬ６４Ｒ（第２図）が挙
げられる。本プラスミドはベクタープラスミドｐＨＹ３
００ＰＬＫのＨｉｎｄｍ切断部位にバチルスエスピーＫ
ＳＭ−６４（ＦＥＲＮ　Ｐ−１０４８２）株由来であり
、第３図に示した約４．４ＫｂのＤＮＡ断片を挿入した
ものである。尚、この約４．４ＫｂのＨｉｎｄｍ断片が
Ｋ　Ｓ　Ｍ　−６４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４８２）株由
来であることは、プラスミドから単離した当該ＤＮＡ断
片をプローブとして、サザン・ハイブリダイゼーション
解析を行なうことによって、確認できる。　当該組換え
プラスミドを含有する組換え枯草菌の好適な例としては
、枯草菌Ｉ　ＳＷ　１２１４　（ｐＨｃＬ６４）株が挙
げられる。

本菌株は組換えプラスミドｐＨＣＬ６４を枯草菌ｌ５Ｗ
１２１４株（Ｉｓｈｉｗａと５ｈｉｂａｈａｒａ、　Ｊ
ｐｎ、　Ｊ、Ｇｅｎｅｔ、、　６０巻、２３５頁（１９
８５）　）にプロトプラスト形質転換法を用いて導入し
たものであり、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫに
コードされるテトラサイクリン耐性遺伝子とバチルスエ
スピーＫ　Ｓ　Ｍ　−６４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４８２
）株の染色体ＤＮＡ由来のアルカリセルラーゼに一６４
遺伝子の両方が発現し、テトラサイクリン耐性であり、
且つ、アルカリセルラーゼに−６４の生産能を有する。

本発明の組換え枯草菌によってセルラーゼを生産する場
合、組換え枯草菌を適当な培地を用いて培養し、遠心分
離等の手段によって、菌体を除去した培養液上清から当
該酵素を回収すれば良い。用いる培地の種類としては、
当該組換え枯草菌が生育し、当該酵素を生産することが
できるものであれば良く、特に限定されるものではない
。例えば、炭素源として、ぶどう糖や果糖等の単糖類、
蔗糖、麦芽糖或いはセロビオース等の二糖類または、Ｃ
ＭＣや可溶性澱粉等の多糖類等が挙げられ、また、窒素
源として、硫酸アンモニウムや塩化アンモニウム塩、硝
酸ナトリウム等の硝酸塩、ポリペプトン、酵母エキス、
肉エキス、ファーマメディア、大豆粉、カゼイン、コー
ングルテンミール或いはグルタミン酸等のアミノ酸類等
が挙げられる。これらの窒素源と炭素源を適当な濃度で
適宜組合せ、この他に適当な濃度の無機塩類、例えば、
塩化ナトリウム、溶酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等を
添加すれば良い。また、培地のｐＨに関しては、用いる
組換え枯草菌が生育し得る範囲内のｐＨであれば、特に
限定されないが、ｐＨ６，５〜７．５に調整することが
好適である。更に、培養条件については、１５℃〜５０
℃、好ましくは２５°Ｃ〜３５℃で１〜４日間振盪また
は、通気撹拌培養すれば良い。

［発明の効果］ 本発明のセルラーゼ遺伝子をコードする新規な紐換えプ
ラスミドを宿主微生物に紐み込むことにより、アルカリ
セルラーゼを著量に生産する組換え微生物を取得するこ
とができる。

また、本発明の組換え微生物を適当な培地中で培養する
ことにより、著量のセルラーゼを培地中に生産させるこ
とができる。

［実施例］ 以下、実施例で具体的に本発明を説明する。

なお、セルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は以下の様に測
定した。すなわち、２．５％ＣＭＣ（山陽国策バルブ社
製サンローズＡＯＩＭＣ）０．４ｍｌ、０．５Ｍグリシ
ン緩衝液（ｐＨ９，０）０．２ｍｌ及び脱イオン水０．
３　ｍ　ｌからなる基質溶液に酵素液０．１ｍｌを加え
、４０°Ｃで２０分間反発した後、これによって生成し
た還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（３，５−ｄｉ
ｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ（ＤＮＳ）　）
法（Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

２巻、１２７頁（１９６０）　）によって定量した。酵
素力価は、上記の条件下で１分間に１．ａｍｏｌのグル
コースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とし
た。蛋白定量はバイオ・ラドプロティンアッセイ　キッ
ト（バイオ・ラド社製）を用いて行ない、牛血漿アルブ
ミンを標準蛋白として算出した。

実１Ｍ例　１ アルカリセルラーゼに−６４の生産菌である、バチルス
エスピーＫＳ　Ｍ−６４（ＦＥＲＮＰ　−１０４８２）
をポリペプトン（犬五栄養社ｖり０．５％、酵母エキス
（デイフコ社製）０．５％、ＫＨ２Ｐ○４０．１％、Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％及びＮ　ａ　２　ＣＯ３
０、５％から成る培地１００ｍ１で３０″Ｃで１２時間
振盪培養した。遠心分離によって菌体を集め、サイトウ
とミウラの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７２巻、６１９頁（１
９６３）　）に従って約５０μｇの精製染色体ＤＮＡを
得た。

得られた染色体ＤＮＡ　　１０μｇを常法（！４ａｎｉ
ａｔｆｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｒｙ、（１９８２）等）に従って、制限酵素ＨｉｎｄＩ
［Ｉ　（ベーリンガー・マンハイム社ｒ、りによって切
断した後、同じくＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクタープ
ラスミドｐＥＲ３２２（ベーリンガー・マンハイム社製
）ｌμｇと混合し、Ｔ、Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ（ベーリン
ガー・マンハイム社製）を用いて結合反応を行なった。

結合反応物による大腸菌の形質転換処理をＥ、ｃｏｌｉ
　　ＨＢ１０１コンピテント・セル（宝酒造社製）を用
いて行ない、処理後の菌懸濁液をアンピシリン（シグマ
社製）５０μｇ　／　ｍ　１を含むＬＢ寒天プレート培
地（トリプトン（デイフコ社製）１．０％、酵母エキス
（デイフコ社製）０．５％、ＮａＣ１１，０％、バクト
寒天（デイフコ社ｔＪ）　１．５％）に塗抹し、３７°
Ｃで１２時間培養した。

出現した形質転換体の集落を、２枚のＬＢ寒天プレート
培地（アンピシリンを含む）に移植し、交番こ３７℃で
２４時間培養した。培養後、ＣＭＣ０，５％、ワゾチー
ム（シグマ社製）１ｍｇ／ｍｌを含み、５０ｍＭのグリ
シン緩衝液によって、ｐＨ９に調整した１゜０％寒天を
重層して培養を継続した。この結果、集落周辺のＣＭＣ
を分解した菌株をコンゴ−・レッド法（Ｔｅａｔｈｅｒ
とＷｏｏｄ、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｆｒｏｎ、　Ｍｉｃ
ｒｏ−ｂｉｏｓ、、　４３巻、７７７頁（１９８２＞　
）を用いて選択し、組換え大腸菌５株を分離した。

実＃ｊ、例２ 実施例１で得られた組換え大腸菌５株をアンピリジン（
５０μｇ／ｍｌ）を含む５ｍ１ＱＬＢ培地（トリプトン
　１，０％、酵母エキス　０．５％、ＮａＣ１１，０％
）に接種し、３７°Ｃで一夜静置培養した。これを５０
０ｍ１のＭ９ＣＡ培地（Ｎａ２ＨＰ０，０．６％、ＫＨ
２Ｐ０．０．３％、ＮａＣ１Ｏ，０５％、ＮＨ，Ｃ１０
，１％、カザミノ酸（デイフコ社製）０．２％、Ｍｇ８
０．２ｍＭ、ＣａＣｌ２０．１ｍＭ、グルコース　０．
２％、アンピリジン　５０ＡＩｇ／ｍｌ）に移植して、
３７°Ｃで更に約５時間振盪培養した後、クロラムフェ
ニコール（シグマ社り１７０ｍｇを添加し、３７°Ｃで
１５時間振盪培養した。

得られた培養液から遠心分離によって菌体を集め、アル
カリ溶菌法（ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　７巻、１５
１３頁（１９７９）及びＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８
２））に従つて、各組換えプラスミド約５００μｇを調
製した。アガロースゲル電気泳動法（Ｍｅｙｅｒｓら、
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１２７巻、１５２９頁
（１９７６）　）を用いて、得られた５種顛の紐換えプ
ラスミドの＃Ｊ限酵素切断点の解析を行なった。その結
果、いずれのプラスミドにも第３図に示した約４．４Ｋ
ｂのＨｉｎｄｌＩｌ断片が含まれており、この断片の他
に２〜４個のＨｉｎｄｍ断片が含まれることが判明した
。

そこで、組換えプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに
よって切断後、Ｔ、Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼによる再結合反
応を行なうことにより、約４．４ＫｂのＨｉｎｄＤＩＩ
断片のみを含む組換えプラスミドの作製を試みたところ
、目的の組換えプラスミドを有する組換え大腸菌が得ら
れた。この菌株がセルラーゼを生産することから、セル
ラーゼ遺伝子が第３図に示される約４．４Ｋｂの断片中
に存在することを確認した。取得した組換えプラスミド
（８，８Ｋｂ）をｐＣＬ６４、またｐＣＬ６４を含有す
る大腸菌Ｈ８１０１株をＨＢ１０１（ｐＣＬ６４）株と
命名した。

実施例３ ＬＢ培地で一晩静置培養したＨＢ１０１（ｐＣＬ６４）
株の培養液をＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ　／　ｍ
　１を含む）に接種し、３７°Ｃで２４時間振盪培養し
た。培養後、培養液を遠心分離して得られた菌体を１゜
ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、超音波破
砕を行なった。遠心分離によって不溶物を沈澱として取
り除き、得られた上清液のＣＭＣアーゼ活性の作用ｐＨ
範囲及び最適作用ｐＨを求めたところ、本酵素はｐＨ３
〜１３の範囲で作用し、ｐＨ８，５〜１０に最適作用ｐ
Ｈを有しており、セルラーゼ遺伝子の供与体であるバチ
ルス・エスピーＫＳＭ−６４（ＦＥＲ１４Ｐ−１０４８
２）株が生産するアルカリセルラーゼに−６４の性質と
良く一致し方。

ｐＣＬ６４を制限酵素ＨｉｎｄｌＩＩによって切断後、
アガロース・ゲル電気泳動法を行ない、ゲルから電気溶
出法（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１１０巻、１１９頁（１９７
７）　）によって、約４．４ＫｂのＨｉｎｄｍ断片を単
離した。

このＨｉｎｄｍ断片をＤＮＡラベリング・アンド・デイ
テクション・キット（ベーリンガー・マンハイム社製）
を用いてラベル化することによって、プローブＤＮＡを
調製した。

一方、Ｈｉｎｄｍによって切断したバチルス・エスピー
Ｋ　Ｓ　Ｍ　−６４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４８２）株由
来の染色体ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡ
バンドをエレクトロ・プロッティング装Ｎ（バイオ・ラ
ド社製）を用いてゼータ・プローブ膜（バイオ・ラド社
製）に移し、ＤＮＡラベリング・アンド・デイテクショ
ン・キットを用いてプローブＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションを行なった。ＫＳＭ−６４由来の染色体ＤＮＡ
のＨｉｎｄＩＩＩ切断物中には、用いたプローブＤＮＡ
とハイブリダイズする約４．４ＫｂのＤＮＡ断片が唯一
存在することが認められ、プラスミドｐＣＬ６４に含ま
れる約４．４ＫｂのＨｉｎｄｍ断片が、バチルス・エス
ピーＫＳＭ−６４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４８２）株の染
色体ＤＮＡ由来である事が確認された。

実施例４ 実施例３と同様にして調製したｐＣＬ６４由来の約４．
４ＫｂのＨｉｎｄｍ断片と、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
切断した直鎖分子状のシャトルベクターｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫを混合し、Ｔ、Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼで結合した。こ
の結合ＤＮＡを用いて、大腸菌ＨＢ１０１株の形質転換
を行なった。テトラサイクリン（１５μｇ　／　ｍ　１
、シグマ社製）耐性とセルラーゼ生産性を指標として形
質転換体のスクリーニングを行ない、当該ＤＮＡ断片が
シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＨｉｎｄＩ［［
部位に挿入された組換えプラスミドｐＨＣＬ６４（第１
図）及びｐＨＣＬ６４Ｒ（第２図）を取得した。両組換
えプラスミドはベクターに対する約４．４Ｋｂ断片の挿
入方向が互いに逆向きであった。ｐＨＣＬ６４およびｐ
ＨＣＬ６４Ｒをそれぞれ含む組換え大腸菌ＨＢ１０１株
をそれぞれＨＢ１０１　（ｐＨＣＬ６４）株および）Ｉ
Ｂ１０１　（ｐＨＣＬ６４Ｒ）株と命名した。両組換え
大腸菌株は、いずれも培養液１１当り約１０００Ｕのア
ルカリセルラーゼに−６４を菌体内に生産した。

実施例５ 組換え大腸菌ＨＢ１０１　（ｐＨＣＬ６４）株から、実
施例２と同様にして、組換えプラスミドｐＨＣＬ６４を
抽出、精製した。これらの組換えプラスミドを用いて、
枯草菌ｌ５Ｗ１２１４株（ｌｅｕＡ８．　ＭｅｔＢ５．
　ｈｓｒＭｌ）の形質転換をプロトプラスト法（Ｃｈａ
ｎｇとＣｈｏｅｎ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ
、、　１６８巻、１１１頁（１９７８）　）に従って行
ない、テトラサイクリンを含むプロトプラスト再生培地
（ＤＭ３　；コハク酸ナトリウム（ｐＨ７，３）０．５
Ｍ、カザミノ＃１０．５％、酵母エキス　０．５％、Ｋ
２ＨＰ○４０．３５％、ＫＨ２ＰＯ，０，１５％、グル
コース　０．５％、ＭｇＣｌ２２０ｍＭ、牛血清アルブ
ミン（シグマ社製）０．０１％）を用いて形質転換体を
選択した。

この結果、組換えプラスミドｐＨＣＬ６４を含む組換え
枯草画工ＳＷＩ　２１４　（ｐＨＣＬ６４）株を取得し
た。

実施例６ 組換え枯草菌ｌ５ＷＩ　２１４　（ｐＨＣＬ６４）株を
ポリペプトン　２％、酵母エキス０．１％、ＫＨ２Ｐ０
．　０．１％、ＮａＣ１０，５％、テトラサイクリン　
１５μｇ　／　ｍ　１から成る培地（ＰＹ培地）中で３
０℃、２４時間の振盪培養を行なった後、第１表に示し
た各種の窒素源と麦芽糖　１％、魚肉エキス（和光純薬
社製）０．５％、酵母エキス０．０５％、ＫＨ２Ｐ０．
　０．１　％、Ｍｇ’ＳＯ。

・７Ｈ２００，０２％及びテトラサイクリン１５μｇ　
／　ｍ　１を含む培地に接種し、３０″Ｃ１４日間の振
盪培養を行なった。得られた培養液のアルカリセルラー
ゼ活性を測定したところ、木組換え枯草菌は、何れの窒
素源を用いた場合にも著量のアルカリセルラーゼに−６
４を培地中に分泌生産した（第２表）。

第　　　１　　　表 窒素源　□（％）□（％） （ＮＨ４）ｉｓＯａ　　２１．２１．ｌＮａＮ０．　１
６．５１．５ ＮＨ，Ｃ１２６，２０，９ ポリペプトン（犬五栄養’）　　　　　１３．５　　　
　　１．８ポリペプトンＳ（大孔栄養）　　　　　　８
．５　　　　　２．８ペプトン−ＢＭＹ（ペーリンガー
）　　　１３．５　　　　　１．８肉エキス（オキソイ
ド）　　　　　１２．４　　　　　１．９グルタミ膚ナ
トリウム　　　　　７．５　　　　　３．２（以下余白
） 第　　　２　　　表 窟　　素　　瀝　　　　　　アルカリセルラーゼ（Ｕ／
１）（ＮＨ，）２ＳＯ，１９０Ｏ ＮａＮＯｓ　　　　　　　　　　　　　　２２０ＯＮＩ
（、Ｃ１１４００ ポリペプトン（大五栄簑）　　　　　　　　７４００ポ
リペプトンＳ（大孔栄養）　　　　　　　　６４００ペ
プトン−ＢＭＹ　（ペーリンガー’）　　　　　　　５
３００肉エキス（オキソイド）　　　　　　　　　７９
００グルタミン較ナトリウム　　　　　　　　３５００
実施例７ ＰＹ培地中で３０℃、２４ＦＲ間の振盪培養を行なった
枯Ｘ菌工ＳＷＩ　２１４　（ｐＨＣＬ６４）の培養液を
、各種炭素源を含む各ＰＹ培地に接種し、振盪培養した
。この結果、第３表に示した様に、何れの炭素源を用い
た場合にも著量のアルカリセルラーゼの生産を認めた。

第　　　３　　　表 炭　素　源　　濃度（％）　アルカリセルラーゼ（Ｕ／
ｌ）ぶどうＭ　　　１．０　　　　９１００

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ、組換えプラスミドｐＨ
ＣＬ６４及びｐＨＣＬ６４Ｒの制限酵素切断地図を示す
図面である。図中、太線部分はバチルスエスピーＫＳＭ
−６４（ＦＩＪＭ　Ｐ−１０４８２）株由来のＤＮＡ断
片であり、細線部分はシャトルベクターｐＩ（Ｙ３０Ｏ
ＰＬＫ由来のＤＮＡ断片である。 第３図はバチルスエスピーＫＳＭ−６４（ＦＥＲ？Ｉ　
Ｐ−１０４８２）株由来のアルカリセルラーゼに一６４
遺伝子を含む約４．４ＫｂのＤＮＡ断片の制限酵素切断
地図である。図中、黒塗り部分にアルカリセルラーゼに
一６４遺伝子が含まれる。 第４図はアルカリセルラーゼに一６４遺伝子近傍の塩基
配列を示す図面である。 尚、上記各図中、制限酵素切断点の略号は以下の通りで
ある。 Ｂａ；ＢａｍＨＩ、　　Ｂｇ；Ｂｇｌｌｌ。 Ｅｃ；ＥｃｏＲＩ、　　Ｈｉ；ＨｉｎｄＩｎ。 Ｐｓ　；ＰｓｔＩ、　　　Ｐｖ；Ｐｖｕｌｌ。 Ｓａ；５ａｌＩ、　　　Ｓｃ；５ｃａＩ。 Ｓｍ；ＳｍａＩ、　　　Ｘｂ　；ＸｂａＩ。 Ｘｈ；ＸｈｏＩ 以　　　上 第　　　１　　　図 ：ｌｌ＋ｍ　　　ｓａ　　ｘｂ Ｈｉ　　Ｘｈ Ｈｉ　Ｘｈ　　　Ｓｃ　　　Ｂｇ　Ｂｇ　Ｐｖ　Ｓｃ　
Ｐｖ　　　Ｂｇ　Ｈｉｏ　　　　　１．０　　２．０　
　３．０　　４．０４．４　ｋｂ（０１２Ｎ　　ｌｂ／
）ｂ Ｃ１２Ｒ１：０７） 平成４年２月１７日

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属細菌由来のセルラーゼ遺伝子を含むＤ
   ＮＡ断片と、大腸菌および枯草菌で複製可能なシャトル
   ベクターを結合することにより得られる組換えプラスミ
   ド。
2. （２）第１図または第２図に示される制限酵素切断地図
   を有する請求項第１項記載の組換えプラスミド。
3. （３）特許請求の範囲第１項または第２項に記載の組換
   えプラスミドの一部に塩基の欠失、置換、或いは挿入の
   存在する組換えプラスミド。
4. （４）シャトルベクターがｐＨＹ３００ＰＬＫである請
   求項第１〜３項のいずれかの項記載の組換えプラスミド
   。
5. （５）バチルス属細菌由来のセルラーゼ遺伝子がアルカ
   リセルラーゼＫ−６４をコードする遺伝子である請求項
   第１〜４項のいずれかの項記載の組換えプラスミド。
6. （６）特許請求の範囲第１〜５項のいずれかの項に記載
   の組換えプラスミド含む組換え微生物。
7. （７）宿主微生物が大腸菌または枯草菌である請求項第
   ６項記載の組換え微生物。
8. （８）組換え微生物が大腸菌ＨＢ１０１である請求項第
   ６項または第７項記載の組換え微生物。
9. （９）特許請求の範囲第６〜８項に記載の組換え微生物
   のいずれかを培養することを特徴とするセルラーゼの製
   造法。