JPH04507346A - アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法本発明はアルカリ性タンパク 質分解酵素、遺伝子的に変化させたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の培養によ るその製造、およびバチルス株内のアルカリ性タンパク質分解酵素をコードする 遺伝子配列に関する。

２　関連技術の紹介 タンパク質分解酵素は家庭用洗濯洗浄剤の組成中に、衣服のような物品からタン パク質ベースの汚れを落とすために広（使用されている。これらの酵素はペプチ ド結合を切断するセリンプロテアーゼとして知られるものである。水性洗浄剤溶 液中で有用であるために、これらの酵素は７から１０の範囲のｐＨにおいて活性 でなくてはならない。洗浄剤への適応において有用性を得るためには、また酸化 および酵素的あるいは非酵素的加水分解に対しても安定でなくてはならない。様 々なバチルス株が適当な好気性発酵条件においてセリンプロテアーゼを産生する 。しかしながら、野生株によって産生されるプロテアーゼの量およびそのプロテ アーゼを産生ずる速度は通常、商業的な生産には不充分である。プロテアーゼ収 量を増加させる一つの方法はラジエーションや化学的な突然変異誘発物質によっ て突然変異株を作成することである。しかしながら、古典的な突然変異方法では 要求される突然変異は、統計的な分散量を作成するだけであり、および／または かなりの部分が再び野生種に戻ってしまう。近年、これらの問題を解決する試み が最近の株の遺伝子的な変更に集中してなされている。これはりコンビナンドＤ ＮＡを、宿主細胞がこのリコンビナントＤＮＡの多くのコピーに複写することが 分かっている環境下で導入することにより行われている。加えて、外来ＤＮＡに 担われた遺伝子も発現させることができる。遺伝子的に操作した有機体は古典的 な突然変異細菌にしばしば認められる欠点に病むことがなく、それ故商業的な酵 素製造に有用である。

リコンビナントＤＮＡ技術を使用してプロテアーゼを作成する技術は既知である 。例えば欧州特許第１３０７５６Ａ号はカルボニルバイトラーゼ（プロテアーゼ の１種）を、米国特許第４．７６０．０２５号は天然由来の株から変化させたア ミノ酸ノークエンスを有する株からのサブチリジン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）を 開示している。ドイツ特許第ＤＥ２９２５４２７号は、キレート剤および界面活 性剤に高度ゼを開示している。バチルス・リッシエニフオルミスの培養によるア ルカリ性プロテアーゼ酵素の製造は英国特許第１．２６３．７６５号；ドイツ特 許第１．９４０．４８８；ロシア特許第４００．１１６１米国特許第３．６２３ ．９５６号７同第３．６２３．９５７号に開示本発明の目的のひとつは、ｐＨ７ 〜１０、温度が１０〜６０℃の水溶液中において、増加したプロテアーゼ活性と 酸化に対する安定性を有する、洗浄剤の組成中に使用するためのタンパク質分解 酵素を供給することである。また、洗浄剤の製造に有用なタンノ（り貫分解酵素 の商業的な製造に使用するための、）くチルス属の突然変異株を提供することも 本発明の目的のひとつである。さらに宿主のノくチルス細胞の形質転換のための 望ましいタンパク質分解酵素をコードする配列を有する発現ベクターを供給する ことも本発明の目的である。これらの目的は、実質的にＦ　Ｉ　Ｇ、　１に示さ れたアミノ酸配列を有するマチュアーなタンパク質分解酵素を提供することによ り達成される。マチュアーなタンパク質分解酵素は、およそアミノ酸残基番号１ １２からおよそアミノ酸残基番号３８０まで伸びている。

このタンパク質分解酵素は、バチルス・リッシエニフオルミス　ＡＴＣＣ５３９ ２６株の転写の方向に、バチルス・リツシエニフオルミスＡＴＣＣ５３９２６ア ルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロモータア一部位に操作しやすいようリンクして いる、ブレープロ部位に操作しやすくリンクした開始コドンを有する調節部位を 有するＤＮＡ配列を有するプラスミドによって形質転換されたバチルス・リツン エニフォルミスＡＴＣ０５３９２６株の培養によって製造される。

バチルス　・リッンエニフオルミスＡＴＣＣ５３９２６株はこれ以降、ＡＴＣＣ ５３９２６と呼ぶ。バチルス　・リッシエニフオルミスＤＳＭ６４１株はこれ以 降、ＤＳＭ６４１と呼ぶ。米国特許第４、．６８３１９５．号及び同第４．６８ ３．２０２号に開示されているポリメラーゼ鎖反応はこれ以降、ＰＣＲと呼ぶ。

ＦＩＧ、２７に示したバチルス　・リッシエニフオルミスＡＴＣＣ５３９２６株 のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子は、これ以降、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性 プロテアーゼ遺伝子と呼ぶ。バチルスレンツスのアルカリ性プロテアーゼはこれ 以降、ＢＬＡＰと呼ぶ。バチルス　・リツシエニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６ アルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロモーターはＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プ ロテアーゼ遺伝子からのプロモーターであり、これ以降ＡＴＣＣ５３９２６アル カリ性プロテアーゼ遺伝子プロモーターと呼ぶ。ｋｂの記号は１０００塩基対の 語のかわりに使用する。

Ｆ　Ｉ　Ｇ、　１はＢＬＡＰタンパク質のプレ、プロ、およびマチュアー領域の アミノ酸配列を示す。

Ｆ　Ｉ　Ｇ、　２はＢＬＡＰ遺伝子を含有するバチルス・レンツス株からの３． ４ｋ　ｂＨｉ　ｎ　ｄｌＩＩフラグメントのＤＮＡ配列を示す。

ＦＩＧ、３はプラスミドｐＧＭ１５の制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、４はプラスミドｐｃ８１１ｃの制限酵素地図を示す。

Ｆ　Ｉ　Ｇ、　５はプラスミドｐｃＢＩＮの制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、６はプラスミドｐｃＢ１３ｃの制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、７はプラスミドｐＣ８２Ｎの制限酵素地図を示す。

Ｆ　Ｉ　Ｇ、　８はオリゴヌクレオチド１〜３を示す。位置の表示はＡＴＣＣ５ ３９２，６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子ないのヌクレオチド配列の位置に対応 する。ミスマツチ部位は小文字で表している。制限部位には下線を引いて示して いる。

ＦＩＧ、９はプラスミドｐｃＥ１５ｃの制限酵素地図を示す。

Ｆ　Ｉ　Ｇ、　１０はプラスミドｐＣＢ４Ｎの制限酵素地図を示す。

Ｆ　Ｉ　Ｇ、　１１はプラスミドｐｃＢＩＮの構築の概略図を示す。

ＦＩＧ、１２はプラスミドｐｃ８１１ｃの構築の概略図を示す。

ＦＩＧ、１３はプラスミドｐＣＢ５５ｃの制限酵素地図を示す。

ＦｒＧ、１４はプラスミドｐＣ８５６Ｃの制限酵素地図を示す。

ＦＴＧ、１５はプラスミドｐＣＢ５８Ｃの制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、１６はプラスミドｐＣＢ７５Ｃの制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、１７はプラスミドｐＣＢ７８Ｃの制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、１８はプラスミドｐｃＢ５ＯＮの制限酵素地図を示す。

ＦＩ　Ｇ、　１９はプラスミドｐ　ＣＢ　５１．　Ｎの制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、２０はプラスミドｐＣ８５３Ｎの制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、２１はプラスミドｐｃ８７ＯＮの制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、、２２はプラスミドｐＣＢ７３Ｎの制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、２３は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）およびバチルス内 に旦±ａ！融合プラスミド構築物を構築する方法の概略図を示す。

ＦｒＧ、２４はサビナーゼオリゴヌクレオチドプローブの概略ダイアグラム図で ある。これらのプローブは既知のサビナーゼアミノ酸配列に基づいており、バチ ルス・レンッス遺伝子バンクをプローブし、ＰＣＲ反応におけるプライマーとし て使用提供される。

Ｆ　Ｉ　Ｇ、　２５はオリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーの特定の 配列である。

ＦＩＧ、２６はプラスミドｐＭＧ１０８．２の制限酵素地図を示す。

ＦＩＧ、２７および２７ａはＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子 をコードする遺伝子中への制限部位の導入を示す。

ＦＩＧ、２８はＡＴＣＣ５３９２６作製株中に構築した、異なるＡＴＣＣ５３９ ２６アルカリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰプロテアーゼの収量の比較を示している 。

ＦＩＧ、２９はＡＴＣ：Ｃ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−ＢＬのアミノ酸 配列である。

好ましい具体例の説明 ｐＨ７〜１０、温度が１０〜６０°Ｃの水性溶液中において増加しタブロチアー ゼ活性および酸化安定性を有しているバチルス・レンツスにより産生されるタン パク質分解酵素（ＢＬＡＰ）を供給する。

マチュアーなりＬＡＰ酵素は２６９個のアミノ酸残基を有し、分子量が２６．８ ２３ダルトンであり、計算上の等電点が９７である。

この酵素は土壌試料から分離され、表１に示す性質を有するバチルス・レンツス ＤＳＭ５４８３から最初に得られた。

表１バチルス・レンッスＤＳＭ５４８３の性質分類学上の名前　バチルス・レン ッス（グループＩＩ）形態　栄養細胞６ 憚菌　幅　０．６〜０．８μｍ 長さ１，５〜３．５μｍ 胞子。

長円形 胞子嚢は膨張しない 移動性　運動性あり ダラム反応性　陽性 カタラーゼ　陽性 嫌気性成育　陰性 フォーゲス−ブロスカラエルテスト　陰性フォーゲスープロスカウエルメディウ ムのｐＨ二６．２成育パラメータ一 温度 成育　５０℃ 非成育　５５℃ 最適　３９℃ ｐＨ 成育　ｐＨ７，５〜ｐＨ９，５ 非成育　ｐＨ５，７ 塩トレランス ５％ＮａＣ１中　成育 ７％ＮａＣ１中　成育 １０％Ｎ　ａ　Ｃｌ中　成育 適するメディウム ジャガイモデンプン　１０ｇ／ｌ イースト抽出液　１０　ｇ／　１ ペプトン　５ｇ／ｌ Ｎａ２５２０３−５Ｈ２０２，５ｇ／ｌＫ２ＨＰＯ４２ｇ／ｌ ＮａＭｏ○＜　・２８２０　１　、　２　ｇ／　ｌＮＨ４Ｃｌ　１ｇ／Ｉ Ｆ　ｅ　Ｃｌ　ｓ　・６Ｈ２０５４０ｍｇ／　ｌＭｎＣｌ２・４Ｈ２０１００ｍ ｇ／ｌ ＺｎＯ４０ｍｇ／ｌ ＣｏＣｌ２’　６Ｈ２０２４ｍｇ／ｌ アミノ酸からの酸生成・ グルコースから（弱い） Ｌ−アラビノースから（弱い） キシロースから（弱い） マンニトールから（弱い） グルコースからの気体発生　陰性 酸利用　くえん酸・　陽性 プロピオン酸・　陰性 チロシン消化　陰性 インドール反応　陰性 フェニルアラニン脱アミノ酵素　陰性 アルギニン脱水素酵素　陰性 硝酸塩還元　硝酸塩は亜硝酸に還元されたＦＩＧ、１に示したアミノ酸配列は、 一部分を標準的なアミノ酸配列決定方法により決定し、残りは核酸配列から演鐸 した。

ＢＬＡＰ酵素を作製する為に、転写の方向に調節領域を有し、ＢＬＡＰ酵素をコ ードするＤＮＡ配列を有するハイブリッドプラスミドを含有するバチルス宿主細 胞を培養することを含む方法を提供する。ここで、上記調節領域は転写の順に、 ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロモーター、リポソーム結 合部位、そして、ＢＬＡＰをコードするマチュアー領域に作動出来るようにリン クしているプレープロ領域に、操作出来るようにリンクしている開始コドンを有 している。上記のものはすべて、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺 伝子からのカルボキシ末端（Ｃ−末端）ＤＮＡ配列にリンクしている。Ｃ−末端 ＤＮＡ配列は、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のおよそ５ａ ｌＩおよびおよそ５ｓｔＩ制限部位の間のＤＮＡ配列である。これは、米国特許 出願のなかに開示されているような、染色体でコードされるプロテアーゼを抑制 するのに使用してもよい。どのようなバチルス株でも本発明の方法においてＢＬ ＡＰ酵素を製造するのに使用することができる。バチルス・リッシェニフオルミ スは好ましい株である。ＡＴＣＣ５３９２６は最も好ましい菌株である。ＡＴＣ Ｃ５３９２６は、表２に挙げた性質を有するバチルス・リッシエニフオルミスＤ Ｓ’Ｍ６４１株の古典的突然変異誘発によって得られた株である。

表２：バチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６株の性質 分類学上の名前：　バチルス・リッシエニフオルミスＡＴＣＣ５形態　栄養細胞 ： 憚菌　幅　０７〜０．９μｍ 長さ２．０〜３．０μｍ 胞子： 長円形 胞子嚢は膨張しない 移動性　運動性あり ダラム反応性　陽性 カタラーゼ　陽性 嫌気性成育　陽性 フォーゲス−ブロスカラエルテスト　陽性フォーゲス−プロスカラエルメディウ ムのｐＨ：５．５成育パラメータ一 温度 成育　５０℃ 非成育　５５°Ｃ ｐＨ 非成育　ｐＨ５，７ 塩トレランス ５％ＮａＣ１中　成育 ７％ＮａＣ１中　成育 １０％ＮａＣ１中　成育 アミノ酸からの酸生成ニ ゲルコースから　陽性 Ｌ−アラビノースから　陽性 キシロースから　陽性 マンニトールから　陽性 グルコースからの気体生成　陰性 レンチナーゼ　陰性 加水分解　デンプン：　陽性 ゼラチン・　陽性 カゼイン　陽性 酸利用　くえん酸：　陽性 プロピオン酸、　陰性 チロシン消化　陰性 インドール反応　陰性 フェニルアラニン脱アミン酵素　陰性 アルギニン脱水素酵素　陰性 硝酸塩還元　硝酸塩は亜硝酸に還元されなかったＢＬＡＰＷ素をコードするＤＮ Ａはバチルス・レンツスのＤＳＭ５４８３株から染色体ＤＮＡを単離し、バチル ス・レンツスブロテアーゼをコードしていると推定できるＤＮＡ配列とホモロジ ーを有するＤＮＡプローブを構築し、単離した染色体ＤＮＡからの遺伝子ライブ ラリーを作製し、そしてブローブヘハイブリダイゼーションして興味のある遺伝 子をこのライブラリーからスクリーニングすることによって得られる。遺伝子ラ イブラリーはプラスミドｐＢＲ３２２、バクテリオファージラムダＥＭＢＬ３お よびＥＭＢＬ４、およびコスミドｐｃＰ１３をクローニングベクターとして使用 することによって大腸菌内に構築することができる。好ましくはバチルス・レン ツスＤＳＭ’５４８３株のクロモソームＤＮＡのシーンバンクはコスミドｐｃＰ １３を用いて大腸菌内に構築する。

サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）遺伝子（サビナーゼをコードする遺伝子、Ｎｏ ｖａ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓから発売されている市販のセリンプロテアーゼ ）のＤＮＡ配列と同じＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを、サビ ナーゼ様遺伝子のプローブとして使用することができる。

好ましくは、ＢＬＡＰ配列を使用する。これらのオリゴヌクレオチド類は、制限 酵素で消化した大腸菌ＨＢＩＯＩ株、バチルスバチルス−ズブチリス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）のＤＢ１０４株、バチルス・リッシェニフォルミ ス株およびバチルス・レンッス株からの染色体ＤＮＡのササンプロットのスクリ ーンとして使用してもよい。

ＦＩＧ、２４および２５に示したＮ末端および内部オリゴヌクレオチド類もまた ＰＣＲにおいてバチルス・レンッス染色体ＤＮＡのマチュアーなアルカリ性プロ テアーゼのＮ末端からＣ末端シアノゲンブロミドフラグメントのＮ末端まで伸び ているバチルス・レンッス染色体ＤＮＡ領域を増幅するのに利用することができ る。

アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のマチュアーな領域の一部をより大きなバチルス ・レンツスに特有なダブルストランドＤＮＡをＰＣＲを用いて構築することによ り単離することができる。サビナーゼプロテアーゼからのＣ末端シアノゲンブロ ミドフラグメントのアミノ酸配列に基づいた解析により、この配列は他のサブチ リシンタイプ（ｓｕｂｔｉｌｙｓｉｎ　ｔｙｐｅ）のセリンプロテアーゼ°と同 様、サビナーゼの活性部位セリン周辺のアミ、ノ酸配列とホモロジーを有してい ることがわかった。増幅されたフラグメントはおよそ６５０塩基対（ｂａｓｅｐ ａｉｒｓ　；　ｂｐ）の長さで、他のバチルスアルカリ性プロテアーゼがら得ら れる有効な配列データから予期された大きさと一致する。６５０ｂｐのＰＣＲフ ラグメントはマチュアーなプロテアーゼのＮ末端のすぐあとからはじまり、タン パク質コード領域内まで続いているアルカリ性プロテアーゼをコードする部位を 示す。

６５０ｂｐのフラグメントは遺伝子ライブラリー内のＢＬＡＰ遺伝子を同定する のに使用することができる。精製した後、６５０ｂｐのフラグメントは、例えば ニックトランスレーションによって標識し、バチルス・レンッスＤＳＭ５４８３ 株のＤＮＡのシーンバンクをプローブするために使用してもよい。このシーンバ ンクはコスミドｐｃＰ１３およびＥＭＢＬラムダベクターによって構築してもよ い。６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントおよび選択的オリゴヌクレオチドプローブ とホモロジーを有するＤＮＡを担うコスミドクローンを幾つが同定してもよい。

これらのコスミドのうちのひとつのプラスミドＤＮＡであるｐＨ３Ｈ４４を精製 し。制限酵素分析によって解析した。

ササン分析の結果、バチルス・レンツスのＤＳＭ５４８３株の、約３．４ｋｂの ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、放射性活性にラベルしたプローブである６５０ ｂｐのＰＣＲフラグメントとハイブリダイズすることができることが示された。

ハイブリダイゼーション、制限酵素分析およびＤＮＡ配列（ＦＩＧ、２）により 、６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントとホモロジーを有する３、４ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩフラグメントはＢＬＡＰ遺伝子をコードすることを示した。

ＡＴＣＣ５３９２６アル力リ性プロテアーゼ遺伝子部およびＢＬＡＰ遺伝子部か らなる遺伝子融合に基づいた、発現カセットを含有するＡＴＣＣ５３９２６株の 発酵は、好ましい大量合成ベースのＢＬＡＰ製造方法に使用される。このような カセットは、プロモーター、リポソーム結合部位および関連する遺伝子の効果的 な転写および翻訳にかかわる開始コドンを含有するＡＴＣ，Ｃ５３９２６アルカ リ性プロテアーゼ遺伝子からの調節領域からなる。この調節領域の後にシグナル （ブレ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列が続き、その後にプローペプチドおよ びマチュアーブロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が続（。ＤＮＡ配列の転写の 後、プロモーターから下がってメツセンジャーＲＮＡ　（ｍ−ＲＮＡ）がシグナ ルペプチド、プロペプチドおよびマチュアーなプロテアーゼを形成するプレーブ ローマチュアーブロテアーゼ内へ翻訳される。シグナル配列は細胞質膜内のイン マチュアーなプロテアーゼを支配し、そこでシグナルペプチドはシグナルペプチ ダーゼによって酵素的に切断される。プロ配列は、細胞質膜および細胞壁を通し てのトランスロケーションの間あるいは後に、正しいフォールディングとプロセ シング、マチュアーなプロテアーゼを遊離させることを保証しているようである 。

（Ｐｏｗｅｒ、　Ｓ、Ｄら、ＰＮＡＳＣ米国）第８３巻第３０９６頁（１９８６ 年）；Ｉｋｅｕｒａ、　Ｅ。

ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第２６２巻第７８５９頁（１９８７年））　 ；　Ｉｋｅｕｒａ、　Ｈ，ら、ＪＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第２６３巻第１２９５ ９頁（１９８８年））。

ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子およびＢＬＡＰ遺伝子の異な った部分をつなぐために使用される制限酵素部位によって区別される２種類の融 合タイプは、上記のＡＴＣＣ５３９２６の形質転換をさせるために使用した場合 に、ＢＬＡＰ酵素を商業的規模で生産する発現力セントを作製するのに使用する ことができゼ遺伝子プロモーターと、プロおよびマチュアーなりＬＡＰ配列をコ ードするＤＮＡフラグメントを有するプレ配列とを結合させる。

Ｃ１ａＩ制限部位はＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子内、ＡＴ ＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼのブレおよびプロ配列の結合点から数個 さかのぼったコドン内に導入することができる。ＢＬＡＰ遺伝子は生来この箇所 に９よａＴ部位を有する。

ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプロモーターＢＬＡＰ遺伝 子の、Ｂ　Ｌ　Ａ、　Ｐ遺伝子のプレ領域の一部と全てのプロ合は大腸菌内で作 製され、異なった２つのバチルスベクター内の、ＡｖａＩ／５ｓｔｌのＤＮＡフ ラグメント上にサブクローン化できる。

アーなプロテアーゼのＮ末端から３つ目にスレオニンを有するが同じ位置がＢＬ ＡＰではセリンである（ＦＩＧ、２９）。Ｎｃｏｌ融合はプロモーター、ＡＴＣ Ｃ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のブレおよびプロ配列をＢＬＡＰ遺 伝子のマチュアーな配列と結合させることによって構成される。ＮｃｏＩ制限部 位は、ＡＴＣＣ’５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子内のプロとマチュア ー配列の結合点から数コドン下がったところに導入することができる。

自然のＮｃｏｒ部位がＢＬＡＰ遺伝子には同じ部位にある。こうして、プロモー ター、ブレ、プロ、およびマチュアーなＡＴＣＣ５３なったバチルスベクター内 のΔｖａＩ／Ｓｓ±ｌＤＮＡフラグメント上にサブクローン化することができる 。

より酵素の生産を増加させるため、Ｃ１ａおよびＮｃｏＩ融合体を１６４ｂｐＤ ＮＡフラグメントであるＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼの転写ター ミネータ−カセットかまたは６０８ｂｐのＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテ アーゼ遺伝子のＣ末端フラグメント（以下に詳しく述べる）と共にクローン化し てもよい。

ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ融合遺伝子は大腸菌ベク ターｐＧＭ１５　（ＦＩＧ、３）のＢＬＡＰ遺伝子を含有する３、４ｋｂのＨｉ 　ｎ　ｄＨＩ／Ｋｐ　ｎ　Ｔフラグメントを含有するｐＴＺ１９Ｒ誘導体内に構 築することが出来、その後バチルスベクターのｐｃＢ１６およびｐｃＢ１１０内 にサブクローン化される。バチルス融合遺伝子ベクターｐｃＢＩＮ　（ＦＩＧ、 ５）は、ＦＩ　０．１１に示したようにして構築される。バチルス融合遺伝子ベ クターｐｃＢ１１ｃ　（ＦＩＧ、４）は、ＦＩＧ、１２に示したようにして構築 することができる。上に記載したそれぞれの遺伝子の融合体は、（ａ）より効果 的なりＬＡＰプロテアーゼ遺伝子の発現のためおよび（ｂ）染色体のコードする Ａ、ＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の発現の抑制を完全にする ためにに多様なものが作製される。効果的なりＬＡＰプロテアーゼ遺伝子転写の ターミネーションを得るため、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ転写 のターミネータ−を上記それぞれの融合遺伝子中へ、ＢＬＡＰターミネータ−か ら下がって、１６４ｂｐのＤＮＡフラグメンＩ・とじてクローンすることができ る。ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ転写のターミネータ−カセット を、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ融合遺伝子の転写に 関して同じ方向へプラスミドｐＣＢｌｌＣおよびｐ　ＣＢ　］、、　］内に担う 構築物を、それぞれｐｃＢ１３ｃおよびｐＣＢ２Ｎと呼ぶ。染色体のＡＴＣＣ５ ３９２６アルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子の発現を抑制するため、さ らに２つの、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のＣ末端フラグ メントを有するバチルスＢＬＡＰ融合遺伝子ベクターをプラスミドｐｃＢ１１ｃ およびｐＣＢＩＮ内に、プラスミドｐＣ５１を鋳型として用い、ＰＣＲによって 合成された、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の６０８ｂｐの フラグメントと連結させることによって構築してもよい。

６０８ｂｐのＤＮＡフラグメントはｐｃＢｌｌｃおよびｐｃＢＩＮベクター上に シーシングルのＫｐｎ１部位に連結し、６０８ｂｐのＡＴＣＣ５３９２６のＣ末 端フラグメントを、ｐＣＢＩＩＣおよびｐｃＢＩＮ内のＡＴＣＣ５３９２６アル カリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ融合遺伝子の転写の方向と同じ方向にを有する新 たな構築をし、それぞれｐｃＢ１５ｃおよびｐＣＢ４Ｎと呼ぶ。これらのプラス ミドの制限酵素地図はそれぞれＦＩＧ、９および１０に示した。

上に記載し、以下に挙げた６個のＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ− ＢＬＡＰ融合遺伝子はバチルスベクター内ヘスブクローンを構築してもバチルス ・ズブチリスＤＢ１０４内へ形質転換してもよい。ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ 性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ融合遺伝子はΔｖａＩ／５ｓｔＩＤＮＡフラグメント としてｐＢＣ１６およびｐＵＢｌ、１０誘導体の中へ、ＡＴＣＣ５３９２６アル カリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ融合遺伝子（ｐｃＢＩＮＳｐｃＢＩＩＣ，ｐＣＢ ２Ｎ、ｐｃＢ１３ｃ、ｐＣＢ４Ｎ、およびｐｃＢ１５されているバチルスプラス ミドｐｃ５１およびｐＨ７０と連結させてサブクローン化してもよい。プラスミ ドｐｃ５１およびｐ）ｒ’７０はＡｖａｌ／５ｓｔＩで切断して、必要な複製起 点および抗生物質抵抗性遺伝子（テトラサイクリン抵抗性をｐＣ５１内に、カナ マイシン抵抗性をｐＨ７０内に）を含有する、大きなΔヱエＩ　／　Ｓ　ｓ±Ｉ ベクターフラグメントを得た。５ａｌｌおよびＰｓｔｌは、ｐＣ５１およびｐＨ ７０上にあるＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プラスミド遺伝子の総てを含有する を小さなΔｖａｌ／Ｓｓ’ｔｌフラグメントを３つのより小さなりＮＡフラグメ ントへ制限するのに使用できる。これはＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性遺伝子が バチルスベクター内へ再連結する可能性を減らす。

して構築された、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ遺伝子 融合プラスミド１０個の総てはＡＴＣＣ５３９２６内に実現することができる。

６個の且±ａｌ融合体から得られた５個のバチルスプラスミド構築物はＡＴＣＣ ５３９２６株内へ形質転換することができる。これらのバチルスプラスミドはｐ Ｃ８５５Ｃ。

ｐＣＢ５６Ｃ，ｐＣＢ５８Ｃ，ｐＣＢ７５ＣおよびｐＣＢ７８Ｃである（それぞ れ、ＦＩＧ、１３．１４．１５．１６．１７）。６個のＮｃａｌ融合から得られ た５個のバチルスプラスミド構築物はＡＴＣＣ５３９２６株内へ形質転換するこ とができる。これらのｌくチルスブラスミドはｐｃＢ５ＯＮ、ｐｃＢ５１ＮＳ　 ｐＣＢ５３ＮＳ　ｐＣＢ７ＯＮおよびｐＣＢ７３Ｎである（それぞれＦＩＧ、１ ８．１９．２０．２１および２２）。

大きなプロテアーゼ収量を挙げるためには、ｐｃ５１誘導体内へ挿入された旦１ ａｌ融合構築物（Ｆ　Ｉ　Ｇ、　２３）を担うＡＴＣＣ５３９２６株が好ましい 。ＡＴＣＣ５３９２６株内におけるｐＣＢ５８Ｃ（ＦＩＧ、１５）の構築が最も 高いプロテアーゼ収量を得るのに最も好ましい具体例である。

発酵は、当業者には一般的に知られている複合栄養培地内で行うことができる。

これらの培地は炭素源としてグルコース、シュクロースおよび／またはコーンス ターチを含有してもよい。この培地はまた、窒素源として大豆粉、綿実粉、カゼ インおよびジャガイモ抽出物を含有してもよい。他の成育調節剤には醸造残渣、 コーンステイープリカー（ｃｏｒｎ　５ｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ）および無機リ ン酸のような無機物質を含有する。培地には消泡剤もまた含んでもよい。

ＡＴＣＣ５３９２６製造株内における異なったＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プ ロテアーゼ−ＢＬＡＰ構築物のプロテアーゼ収量の相対値の比較をＦＩＧ、２８ に示した。発酵工程は選択のための抗生物質の存在下で０．　５％の窒素含有複 合製造培地を用いて行った。

ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ構築物のプロテアーゼ収 量はＡ、ＴＣＣ５３９２６含有プラスミドｐＡＭ２．３との相対値にて示した。

このプラスミドはプラスミドＩ）Ｃ５１Ｓｔグメント上に天然のＢＬＡＰプロモ ーターおよび構造遺伝子を有する。

ＡＴＣＣ５３９２６生産株内の異なったＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテア ーゼ−ＢＬＡＰ構築物の培養から得られる発酵液には、通常能のタンパク質分解 酵素が含まれている。しかしながら、ＡＴＣＣ５３９２６生産株内の異なったＡ ＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ構築物の発酵によって得ら れるこの発酵液中のＢＬＡＰプロテアーゼは、この液中の最も多いタンパク質分 解酵素である。これらの、タンパク質分解酵素類を含有する発酵液はバチルス・ レンツスＤＳＭ４５４８３の培養液からは得られないものである。詳しくは、Ａ ＴＣＣ５３９２６生産株内の異なったＡ、ＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテア ーゼ−Ｂ　Ｌ　Ａ、　Ｐ構築物はＢＬＡＰプロテアーゼと、ＡＴＣＣ５３９２６ 株によって生産される他のタンパク質分解酵素を少なくとも１種生産する。好ま しくはＢＬＡＰ酵素はバチルス・レンツスＤＳＭ５４８３からの、ＦＩＧｌに示 したおよそアミノ酸残基１１２位からおよそアミノ酸残基３８０位からなるアミ ノ酸配列を有するマチュアーなアルカリ性タンパク質分解酵素であるＢＬＡＰと 、バチルス・リッンエニフオルミスＡＴＣＣ５３９２６からの他のタンパク質分 解酵素を少なくとも一種含有する組成物として得られる。

さまざまなりコンビナンドプラスミドを含有するＡＴＣＣ５３９２６株の培養に よって生産されるプロテアーゼは特に洗浄剤の構成に有用である。これらは、洗 浄剤および洗濯用組成物、特に洗濯用洗浄剤組成物を製作する当業者には公知で ある方法に沿って、界面活性剤と共に構成される。界面活性剤は水の表面の自由 エネルギーを減少させるものであり、セッケン、非イオン性界面活性剤、陰イオ ン性界面活性剤、および陽イオン性界面活性剤を含有する。洗濯用洗浄剤の構成 の場合には、直鎖アルキルベンゼンスルホネート類、エトキンレート化直鎖アル コール類、エトキシレート化アルキルスルフェート類あるいは硫酸化直鎖アルコ ール類等のような適当な界面活性剤と結合させてもよい。この構成にはまた、ビ ルダー、蛍光光輝剤、漂白剤および当業者の間で通常使用されている他の成分を 配合しても良い。

微生物の寄託 ＡＴＣＣ５３９２６およびＡＴＣＣ番号６８０３２とされたＡＴＣＣ５３９２６ 内のプラスミドｐＣＢ５８Ｃの生培養物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際 的承認に関するブダペスト条約により、アメリカンタイプカルチャーコレクショ ン（（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌ］、ｅｃｔｉｏｎ）１ ２３１　Ｐｅｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２８ ５２）に寄託が受理された。バチルス・レンツスＤＳＭ５４８３の生培養物はド イツサミュルンフォンマイクロオルガニズメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌ ｕｎｇｖａｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）、Ｇｒｉｓｅｂａｃ ｈｓｔｒ、　８．３４００　Ｇ○ｔｔｉｎｇｅｎ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）に、特許 手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約により寄託が受理 された。

以下の実施例は説明のためであり、限定のためではない。

実施例１ バチルス・レンツスＤＳＭ５４８３ジーンノくンクの構築Ａ、コスミドクローニ ングベクターｐｃＰ１３の使用コスミドクローニングベクターｐｃＰ１３はバチ ルス・レンツスＤ　ＳＭ、５４８３　ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを構築する ために選択された。このプラスミドｐＬＡＦＲ１から誘導された広い宿主域のベ クター（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｇｅｎｅ第１８巻、第２８９頁（１９８２年）） はＤｅｐｅｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙのＦ、　 Ａｕ５ｕｂｅ１氏（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔ ａｌ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）から得た。プラスミドｐｃＰ１３は２３ｋｂの 大きさでテトラサイクリン（Ｔ　ｅ　１１）およびカナマイシン（ＫｍＩ＋）の 両方に抵抗性をコードし、多様でユニークなエンドヌクレアーゼ制限部位を有し 、可動性であるが自己伝達性ではない。ｐＣＰ１３のＢａｍ、Ｈ１部位内へのク ローニングはに、ｍ抵抗性決定要素を挿入的不活性に導き、組換体をＴＣｌｌお よびＫｍＲフェノタイプによる同定が可能となる。このベクターにはまた、コス ミドのコンカテマー形状を市販のパッケージングシステムを使用してラムダファ ージ粒子内ヘパツクすることのできるラムダコス部位を有す。１２から３０ｋｂ の大きさの範囲内の挿入物は、ｐｃＰ１３内にクローン化することができるため 、このクローニングベクターをシーンバンクの構築に非常に魅力的なちとなる。

精製したｐｃＢ１３ＤＮＡ（２０ｇｇ）は旦且旦Ｈ１（３ユニツト（Ｕ）／μｇ ）で消化し、続いて再環化を防ぐため脱リン酸化を行った。バチルス・レンツス 株ＤＳＭ５４．８３から得た精製染色体ＤＮＡ（４１０μｇ）は旦旦せだ。連結 反応混合物には１５０μｇ／ｍｌのｐｃＢ１３ベクター、および５０　ｕ　ｇ／ ｍ　ｌのＤＳＭ５４８３染色体ＤＮＡを最終体積３０μｍ中に含有する。連結は １４°Ｃで９時間行った。コンカナマー形のｐＣＢ１３− バチルス・レンツスゲツムＤＮＡフラグメントを含有する連結混合物は、ラムダ ファージの頭部にブロモネガ（ＰｒｏｌＩｌｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓ ｃｏｎｓｉｎ））から購入したバラフラージン・ラムダＤ　Ｎ　Ａ　（Ｐａｃｌ ａｇｅｎｅＬａ［１ｌｂｄａ　ＤＮＡ）バッケージングンステムを用いてパッケ ージした。ファージ粒子内にパッケージされたこの組み替えコスミド分子は大腸 菌ＨＢ１０１を感染させるのに使用した。大腸菌ＨＢＩＯＩは、３０℃で一夜、 １７５ｒｐｍのロータリーシェーカー内で１０ｍ１のトリプトン・ブロス（Ｔｒ ｙｐｔｏｎｅ　Ｂｒｏｔｈ）またはＴＢ　（１リツトルあたり、（１）トリプト ンｌＱｇ、ＮａＣ１を５ｇ、マルトース２ｇおよびＭ　ｇ　２　Ｓ　Ｏ４を２． ４６ｇ、オートクレーブ滅菌）で成育した。細胞をペレットにし、ｌＱｍＭのＭ ｇ、ＳＣ２に再懸濁した。パッケージ混合物および細胞（それぞれ５０μｍと１ ００μｍ）を混合し、３７℃で２０分間培養した。その後１ｍｌのルリア・ブロ ス（Ｌｕｒｊａ　Ｂｒｏｔｈ）培地（１リツトルあたりバクトドリブトンＬｏｇ 、ＮａＣ１を１０ｇ、イースト抽出物５ｇ）を加え、そして試験官を３７℃で６ ０分間、ニュー・ブラウンズウィック（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）　Ｇ２４ ０−タリーシェーカー内で１５０ｒｐｍにて培養した。感染されたＨＢ１０］細 胞は室温で遠心沈降（１３０００ｘ　ｇ）を５分間行ってベレットとし、ルリア ・ブロスに再懸濁して１５ｇｇ／ｍｌのＴｃを含有するルリア寒天培地上に撒い た。１４００個のＴｃＲＫｍ’ＨＢＩＯＩ組み替えクローンが得られた。平均挿 入サイズを決めるため、１４個のランダムに選択したポテンシャルクローンから のプラスミドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで消化させ、アガロース寒天電気泳動 により分析した。１４クロ一ン中１１個が平均挿入サイズ２５．９ｋｂ　（２１ ，７から３２．７ｋｂ）の挿入を含有していた。この大きな挿入サイズおよびバ チルス・レンツスゲツムが大腸菌とほぼＦじ大きさであるという仮定に基づいて 理論的な計算すると、サビナーゼ様遺伝子が７６８のコスミドクローンのスクリ ーニングによって見いだされる確率が９９に予想される。

Ｂ　ファージクローニングベクターＥＭＢＬ３およびＥＭＢＬの使用 大きなゲノムＤＮＡ、（＞１０ｋｂ）片のクローニングの他の方法はバクテリオ ファージラムダクローニングベクターを使用する方法である。これらの挿入ベク ターは、９ｋｂと２３ｋｂの間のへテロローガスなりＮＡを受け入れることが可 能である。このヘテロローガスなりＮＡおよびこのラムダＤＮＡは大腸菌宿主内 において活性化されるために、この１ノコンビナントＤＮＡはファージの頭部に ノくツケージしな（ではならない。ＥＭＢＬ３およびＥＭＢＬ４ファージベクタ ーはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ））か ら購入した。これらのクローニングベクターは複製に必要でない内部サファー（ ｓｕｆｆｅｒ）ＤＮＡの側面を守るポリリンカ一部を有する構成をしている。ラ ムダＤＮＡが適当な酵素で制限されたとき、残った２本の、左腕および右腕と呼 ばれるＤＮＡフラグメントは複製に必要であり、ヘテロローガスなりＮＡに連結 することができる。このリコンビナントなりＮＡがファージの頭部に効果的にパ ッケージされるためには、連結はコンカナマーの形成を助けるよう、高いＤＮ、 ’Ｍ！１度のもとで行うべきであり、ヘテロローガスな挿入断片は９ｋｂと２３ ｋｂの間の大きさでなくてはならない。この後者の条件はパッケージされること のできるＤＮＡの長さは野生種のラムダゲノムの大きさの７０％と１０５％の間 であるという観察結果に基づいている。さらに、両方のＥＭＢＬシステムはＳｐ ｉ選択（バクテリオファージＰ２阻害に対する感受性）に有用である。サフ７　 （ｓｕｆｆｅｒ）フラグメントに連結され、ファージの頭部にパッケージされた ＥＭＢＬ腕は、Ｐ２を含有する溶原性の宿主株上には成育しない。このシステム において、サファーフラグメントとＥＭＢＬ腕が再連結することはほとんどない 。もし、再連結がおこれば、このファージは適当な大腸菌宿主上に撒いた時にも 複製しないであろう。

ＤＳＭ５４８３株のＤＮＡのゲノムライブラリーをＥＭＢＬ３またはＥＭＢＬ４ ベクター内に作成するために、ＤＳＭ５４８３のＤに消化した。それぞれの場合 において、ゲノムＤＮＡはＤＮＡ１マイクログラムあたり１ユニツト以下の酵素 にて６０分間消化した。

最高パンケーン効率はコンカナマー形態のラムダＤＮＡによって得られた。それ ゆえ、連結反応は最終ＤＮＡ濃度が、コンカナマー形成を助ける２００μｇ／ｍ ｌとなるようにセットした。標準的な５μｍ連結反応においては、１ｇｇのベク ター腕を２００から４００ｎｇのゲノムＤＮＡと混合する。連結は、室温で１時 間おいた後、４℃、−夜の培養で行った。連結反応から得たコンカナマー型のＤ ＮＡは、ストラタジーンから購入したギガバックプラス（ＧｉｇａＰａｃｋＰｌ ｕｓ）イン・ビトロパッケージングエクストラクトを用い、このエクストラクト に添付された手法によってファージ頭部内ヘバッケージした。パッケージ後、Ｑ 、５ｍｌのファージ希釈用バッファー（１リツトルあたり、５．０ｇのＮａＣ１ ，２ｇのＭｇＳＯ４，５ＱｍｌのＩＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、５ｍｌ の２％ゼラチン）および２０μｍのクロロホルムをこのパッケージ反応物に添加 した。このパッケージ反応の力価を検定し、ストラタジーン（のプロトコールに 沿って増幅した。それぞれのファージライブラリーから５×１０５のリコンビナ ントファージが得られた。市販のクローニングキットの挿入断片を用いて同様の 実験を行ったとき、３Ｘ１０’のリコンビナントファージが得られた。コントロ ールの挿入断片による５％以下のプラーク形成は、バックグラウンドとなるファ ージからのものである。リコンビナントファージはは平均挿入サイズが１２〜１ ４ｋｂであり、およそ７０％のファージが実際挿入を示した。このファージライ ブラリーは１０８フアージ／ｍ＋の力価となるまで増幅し、クロロホルム内にて ４℃にて保存した。−７０°Ｃで保存する長時間保存のために、他のストックを 作製した。

ＥＭＢＬライブラリーを解析し、サビナーゼ様遺伝子を発見するために、以下の アプローチを行った。プラーク群をＥＭＢＬ３あるいはＥＭＢＬ４のどちらかの ライブラリーから単離し、そのＤＮＡをファーンミニプレバレーンヨン法（マニ アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓら）、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　コールド・スプリング＋ハーバ−・ラボラト リーズ（ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）出版（１９８２年）　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ｌａｒｂｏｒ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ）にて単離した。ＥＭＢＬ３およびＥＭＢＬ４内にある挿入ゲノム ＤＮＡ断片を、５ａｉｌかＥｃｏＲＩのどちらかでそれぞれ消化し、アガロース 寒天電気泳動ののち、ＤＮＡフラグメントはシーンスクリーンプラス（Ｇｅｎｅ 　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ）へトランスファージた。ＤＳＭ５４８３のすべての ゲノムＤＮＡがニックトランスレーションされ、ＥＭＢＬライブラリー中にある 挿入断片が本当にＤＳＭ５４８３のＤＮＡであるかどうを確かめるためのハイブ リダイゼーションプローブとして使用した。予期したように、クローンした挿入 断片は標識を施したＤＳＭ５４８３のＤＮＡとハイブリダイズした。第２のその 後シーンスクリーンにトランスファーした。ＥＭＢＬ３またはＥＭＢＬ４のどち らかのライブラリーから得られたリコンビナントファージの群から単離されたＤ ＳＭ５４８３をニックトランスレーションし、ハイブリダイゼーションプローブ として使用した。予期したごと＜、ＤＳＭ５４８３ゲノムＤＮＡに対するハイブ リダイゼーションは起こったが一方で他のバチルス属から得たＤＮＡに対するハ イブリダイゼーションはほとんどあるいは全く認められなかった。これらの結果 はバチルス・レンツスＤＳＭ５４８３の染色体ＤＮＡのライブラリーがラムダＥ ＭＢＬクローニングベクターを用いて形成されていることを証明するものである 。

実施例２ バチルス・レンッスＤＳＭ５４８３株内にあるサビナーゼ様プロテアーゼに特異 的なりＮＡプローブの構築Ａ、オリゴヌクレオチドプローブ 大腸菌内にコスミドｐｃＰ１３を用いて構築したＤＳＭ５４８３染色体ＤＳＭ５ ４８３のシーンバンクをオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングし た。バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）　Ｄ　Ｎ　Ａ合成機を用いて様々な縮 重を有する一連のプローブを合成した。これらのオリゴヌクレオチド類の配列は 、サビナーゼプロテアーゼのＮ末端、シアノーゲンブロミド切断によって誘導さ れたサビナーゼのＣ末端から得られたアミノ酸配列データから演鐸した。サビナ ーゼプロテアーゼと比較したこれらのプローブの配列およびロヶーンヨンをＦＩ Ｇ、２４および２５に示した。プローブのＮＯ２およびＮ○４シリーズはどちら もＮ末端アミノ酸配列データがらデザインした。ＮＯ２Ｏ２−ズは２３塩基の長 さで、１４塩基のホモロジーおよび１６倍の縮重を有する一方、ＮＯ４Ｏ４−ズ は１７塩基の長さで４８倍の縮重を有する。ＮＯ４のプローブの１〜４ンリーズ はバチルス・ズブチリスに対する最も確率の高いコドン解読を用いてデザインし た。オリゴヌクレオチドのＣＯＳシリーズはすべて１７塩基の長さで３２倍の縮 重を有する。後者のプローブはサビナーゼのＣ−末端ンアノーゲンブロミドフラ グメントから誘導されたアミノ酸配列からデザインされた。精製し、放射性活性 に標識したこれらのプローブを、制限され、アカロース寒天上で電気泳動じたＤ ＳＭ５４８３からの染色体ＤＮＡにハイブリダイズして、ササン法を用いてニト ロセルロース上にプロットした。使用した制限酵素には旦旦旦ＲＩ、旦１旦ｄ　 ＩＩ工、工立ヱ１１影ｌ旦３Ａ、旦王ｔＬＸ、互ａｌおよびｘｈ○１を含む。最 も強いハイブリダイゼーションのシグナルはＮＯ２，２、ＮＯ４，４お、Ｊ：び ｃＯ３，３（ＦＩＧ、２５）のオリゴヌクレオチドで得られた。これら３つの標 識したオリゴヌクレオチドは大腸＠ＨＢ１０１、バチルス・ズブチリスＤＢ１０ ４、バチルス・リッソエニフォルミス、そしてこのバチルス・レンツス株からの 制限された染色体ＤＮＡのササンプロットスクリーンに使用され、バチルス・レ ンツス株由来のＤＮＡフラグメントのみとハイブリダイズすることが分かった。

この結果はこれらの３つのオリゴヌクレオチドがサビナーゼ様プロテアーゼをコ ードするＤＮＡに特有であることを確認する。

Ｂ、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子配列部分の増幅上に記載した３つのオリゴヌ クレオチドプローブがＤＳＭ５４８３染色体ＤＮＡＩこ特有であったが、サビナ ーゼ様アルカリ性プロテアーゼに特有で、より大きい２本鎖ＤＮＡプローブを単 離するために、さらなるアプローチが行われている。上に記載したＮ末端および 内部オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ法の中で、そのＮ末端からマチュアーなアル カリ性プロテアーゼ（Ｆ　Ｉ　Ｇ、　２４）の２２２アミノ酸残基にまで伸びて いる、ＤＳＭ５４８３の染色体ＤＮＡの領域を増幅するためのプライマーとして 使用した。サビナーゼのＣ末端シアノーゲンブロミドフラグメントから得られた アミノ酸配列は他のセリンプロテアーゼの活性部位領域とホモロジーを有してい る。

サビナーゼのＮ末端から活性部位領域の距離が他のセリンプロテアーゼ類と同じ であれば、予想される増幅されたフラグメントのサイズはおよそ６５０ｂｐとな る。

ＰＣＲ法はパーキン・エルマー・セタス・インスツルメンツ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ ｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から購入した市販のシーンア ンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）キットを用いて行った。ＰＣＲ法において、増幅される ＤＮＡ断片の長さは数百ｂｐから５ｋｂ以上の範囲であってよく、プラスミドか 染色体ＤＮＡ鋳型のどちらかの上に含まれる。増幅には２つの、およそ１５から ２５塩基の長さで、ＤＮＡ断片の両端の対向するＤＮＡ鎖とホモロン−を有する ようにデザインされたオリゴヌクレオチドブライマーの合成が必要である。ＤＮ Ａの合成は５′から３′の方向へ行われるので、各プライマーは相当する５゛か ら３°の鎖を模倣するようにデザインされている。最初の実験において、１６の 異なったＰＣＲを、すべての可能なＣＯ３とＮＯ２のプローブシリーズの組み合 わせ、および鋳型としてＤＳＭ５４８３染色体ＤＮＡを用いて行った。鋳型とプ ライマーの濃度はキットに記載の通りにした。ＰＣＲは鋳型、過剰のプライマー 、ｄ　ＮＴ　Ｐ’ｓ１熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび反応バッファーをエッ ペンドルフ管内で混合し、設定した時間、９４℃、３７℃および７２℃のサイク ルを循環させた。各サイクルにおいて、２本鎖ＤＮＡ鋳型は９４°Ｃで加熱する ことによって変性され、プライマーが一本鎖となった鋳型の上の適当なりＮＡ配 列アニーリングできるようにするため、３７℃まで冷却される。管はその後７２ °Ｃに移し、相補的なりＮＡ鎖がアニーリングしたプライマーの伸長にそって、 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｇポリメラーゼ）によって合成される。

このプロセスを２５回繰り返し、増幅されたＤＮＡ量は各サイクルにつき倍とな った。このＰＣＲのひとつ（オリゴヌクレオチドペアーＮＯ２，２とＣＯ３，３ ’）においては、およそ６５０ｂｐの一つのシングルＤ　Ｎ　Ａフラグメントを 増幅した。およそ３μｇの６５０ｂｐがＰＣＲによって作成され、５Ｘ１０’の 増幅を示した。ＰＣＲ法はすべてのＮＯ４およびＣＯＳシリーズのプローブの組 み合わせで行った。さきの結果に基づいて、ＮＯ４，２とＣＯ３，３の組み合わ せが増幅した６５０ｂｐフラグメントを製造すると予期されたが、実際そうであ った。

実施例３ バチルス・レンツス由来のサビナーゼ様アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を担うコ スミドクローンの同定 サビナーゼ様遺伝子をスクリーニングするため、１４００のＴｃＲＫｍ’ＨＢ１ ０１クローンを、各１００〜１５０クローンからなる１３のプールに分けた。各 プールからおよびすべてのシーンバンクを含有する培養物からのプラスミドＤＮ Ａを精製し、ＥｃｏＲＩで消化した。制限フラグメントはアガロースゲル電気泳 動によって分離し、シーンスクリーンプラス（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕ ｓ）ハイブリダイゼーション膜（Ｄｕｐｏｎｔ社製ＩＪｉ１ｍｉｎｇｔｏｎ、　 Ｄｅｌａｗａｒｅ））へ、この製品の方法によりトランスファーした。このコス ミドバンク内のサビナーゼ様遺伝子の検出のため、オリゴヌクレオチドプローブ を合成した。

プローブの予想配列は、さきに得られたサビナーゼプロテアーゼのアミノ酸配列 のデータに基づいている。これらのプローブはまた、ＢＬＡＰ遺伝子の６５０ｂ ｐ部分のＰＣＲ法を用いた合成（上に記載した）のプライマーとしても使用した 。６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントはニックトランスレーション反応において３ ２ｐで標識しくこのプロトコールはエヌイーエヌ（ＮＥＮ　（Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ、　Ｄｅｌａｖａｒｅ）　）から得た）、ハイブリダイゼーションプローブ として用いた。このフラグメントは内部にＥｃｏＲ１部位を有することが示され ている。

それゆえ、完全なバチルス・レンッスサビナーゼ様プロテアーゼ遺伝子がＥｃｏ ＲＩて消化されたコスミドプール内にある時には、ハイブリダイゼーションの２ 本のバンドが現れるであろう。Ｄ　５Ｍ５４８３のＤＮＡ全体のシーンバンクか ら単離されたコスミドＤＮＡが旦且旦Ｒ１で消化されたとき、６．３５ｋｂと２ ．６４ｋｂの２本のフラグメントが標識した６５０ｂｐＰＣＲプローブとハイブ リダイズするのが認められた。６個のりコンビナントコスミドブール（＃３、＃ ４、＃８、＃１１、＃１２および＃１３）において、同様のハイブリダイゼーシ ョンのバンドが認められ、サビナーゼ様遺伝子は６つのそれぞれのプール中に含 有される、少なくとも一つのコスミドクローンに存在することを示した。１５０ 個の大腸菌形質転換体を有するプール＃１３をそれぞれ１２または１３個の形質 転換体を有する１２のサブプールへさらに分配した。各サブプールからのプラス ミドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲｒで消化し、ＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動 にて分離した。シーンスクリーンプラス膜へトランスファーした後、このフィル ターは標識した６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントとハイブリダイズした。２個の サブプール（＃７と＃９）が、最初にプール＃１３で認められたものと同じハイ ブリダイゼーションバンドを含有することが認められた。サブプール＃７と＃９ 内の各形質転換体からプラスミドＤＮＡが単離され、このプラスミドＤＮＡはＥ ｃｏＲＩまたは旦土旦ｄＩＩＩのどちらかで別々に消化した。アガロースゲル電 気泳動およびシーンスクリーンプラスへのトランスファーののち、ハイブリダイ ゼーション操作を繰り返した。サブプール＃９のクローン＃５からのコスミドＤ ＮＡは、同じハイブリダイゼーションのパターンを示し、サビナーゼ様プロテア ーゼ遺伝子を含有するクローンであると考えられる。クローンｄｌＩＩで消化し 、６５０ｂｐＰＣＲフラグメントとプローブしたときに、両方に同じハイブリダ イゼーションのバンドが検出された。

３．４ｋｂのフラグメントサイズは、既知の標準分子量に対するハイブリダイゼ ーションの位置から計算した。サブブール＃９のクローン＃５からのコスミドを ｐＨ３Ｈ４４と名付けた。

大スケールのコスミドｐＨ８Ｈ４４の試料はＣｓＣｌ−エチジウムプロミド勾配 遠心分離によって製造し、透析した後にＨｉｎｄ１１工で制限した。ＨｉｎｄＩ ＩＩフラグメントサイズはアガロースゲル電気泳動によって分離し、６５０ｂｐ ＰＣＲフラグメントとハイブリダイズした３、４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメ ントを精製し、通常制限酵素分析に使用されている大腸菌ベクターであるｐＵ１ ９およびｐＢＲ３２２内へサブクローン化し、さらにバチルスベクター内へもサ ブクローン化した。

実施例４ バチルス・ｌノンラスアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の遺伝的解析 Ａ、バチルス・レンツスアルカリ性プロテアーゼ遺伝的を担う制限フラグメント のサブクローニングと解析精製した後、６５０ｂｐのフラグメントはニックトラ ンスフォーメーションによって標識し、コスミドｐｃＰ１３とＥＭＢＬラムダベ クターを用いて構築したＤＳＭ５４８３ＤＮＡのシーンバンクをプローブするの に用いた。両方の場合において、非常に厳密なハイブリダイゼーション条件を用 いて陽性クローンを単離した。ハイブリダイゼーションデータから、６５０ｂｐ のＰＣＲフラグメントとホモロジーを有するＤＮＡ部と選択的オリゴヌクレオチ ドプローブを有するコスミドクローンを幾つか同定した。これらのコスミドのう ちのひとつのプラスミドＤＮＡであるｐＨ３Ｈ４４を精製し、制限酵素分析によ って解析した。ササンプロットの結果から、およそ３から５ｋｂ（７）０３Ｍ５ ４８３のＨｉｎｄ工Ｉ　Ｉ７ラグメントが６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントから 調製された放射性活性プローブにハイブリダイズした。コスミドｐＨ５Ｈ４４に は、３．４ｋｂ。

４．０ｋｂおよび４．８ｋｂの３つのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントがある。

最初、これらのフラグメントの全てをアガロースゲル電気泳動によって精製し、 ｐＵｃ１９とｐＢＲ３２２の両方へクローン化した。全ての場合、連結反応には １１００ｎの脱リン酸化ベクターＤＮＡと、２０μｌの体積にしたおよそ１１０ ００ｎの相当するＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉフラグメントを含有する。これらの連結混 合物は大腸菌ＤＨ５−（ｐＵＣ１９）または大腸菌ＨＢＩＯＩ　（ｐＢＲ３２２ ）のどちらかのコンピテントセル内へ形質転換した。アビシリン耐性形質転換細 胞を選択し、プラスミド構築を確かめるためにスクリーニングした。全ての旦± ｎｄＩＩＩフラグメントを両方のベクター内へクローンニングした。ｐＵｃ１９ およびｐ　ＢＲ３２２内の正しい構築物をそれぞれｐＭＧ１０２．２およびｐＭ 、Ｇ１０５゜９と名付けた。ハイブリダイゼーションと制限酵素分析の結果から 、３．４ｋｂの）（ｉｎｄｌｌｌフラグメント（プラスミドｐＭＧ１０２２及び ｐＭＧ１０５．９にある）を６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントとホモロジーを有 するものとして同定した。プラスミドｐＭＧ１０２．２は精製し、２６個の異な った酵素での制限酵素分析を行い解析した。この３．４ｋｂの旦±ｎｄＩＩＩフ ラグメントの完全なヌクレオチド配列を得るためには、ｐＴＺ配列決定ベクター 内へこれらのフラグメントの部分をサブクローン化する必要がある。

全てのサブクローンは、低融点のアガロースからゲル電気泳動の後に精製したｐ ＭＧ１０２．２のＤＮＡフラグメントを用いて作成した。摘出したＤＮＡフラグ メントは適当な部位で制限されているベクターＤＮＡと連結させ、その後大腸菌 ＤＨ５Ｌｘ細胞内へ形質転換した。アンピシリン耐性後形質転換細胞を選択し、 制限酵素分析によって同定されるクローンを確かめた。確かめた構造からのプラ スミドＤＮＡをＤＨ５ｃｌ：株から精製し、ＤＮＡシーシーンシングに必要な一 本鎖の鋳型を得るために大腸菌ＮＭ５２２内へトランスフオームした。

Ｂ、バチルス・レンツスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含有する３、４ｋｂ のＨｉｎｄＩＩＪフラグメントの配列決定６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントもま た大腸菌プラスミドＫ）ＵＣｌ３内へクローン化した。ＰＣＲフラグメントは、 さきにＳｍａ　１で消化したｐｃＵ１９と平滑末端連結させ、ベテスダ・リサー チ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ（ＢＲＬ ））から購入した大腸菌ＤＨ５ｃＸ：内に、ＢＲＬによる方により形質転換した 。形質転換細胞は５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＸ−ｇａｌプレート にＸ−ｇａｌプレート上に白いコロニーが形成されることが予想される。Ｘ−ｇ ａ）プレート上の１０００個のコロニーのうちおよそ２００が白かった。この２ ００の形質転換体のうち１２個からプラスミドＤＮＡを調製し、６５０ｂｐのフ ラグメントの存在を調べた。

１２のうちの７個がｐＵＣ１９の同じ方向に組み込まれたＰＣＲフラグメントを 有した。このプラスミドをｐＭＧｌｏｏ、１３と名付けた。ＤＮＡの配列決定の ため、この６５０ｂｐのフラグメントをｐＭＧｌｏｏ、１３から旦且ｍＨＩおよ びに且ユ■の二重消化によって除いた。これらの酵素の認識部位はｐＵｃ１９由 来のポリリンカー配列性には含まれるがこの６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントに はない。このＢａｍＨＩ／にλｎＩＰＣＲフラグメントを、同じ酵素で消化した 市販のンークエンシング用ベクターｐＴＺ１８ＲおよびｐＴ　Ｚ　１９　Ｒ（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）と連結し、大腸菌内へ形質転換した。正しい構築物を有する 形質転換体を、プラスミドＤＮＡの単離と制限酵素分析によって同定した。２つ の新しい構築物がｐＴｚベクターシーあるシークエンジングプライマー部位に関 して両方の方向にＰＣＲフラグメントを示した。ＤＮＡ配列決定はジデオキシ法 および市販のＭ−１３からのシークエンジング用プライマーを用いて行った。ン ークエシンングの初期データは各鎖に対して約２２０塩基からなり、両端から始 まり６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントの内部へ伸びている。初期配列から以下の ことが確認できる：ＰＣＲフラグぐ続＜ＤＮＡ配列はＮＯ２，２プライマーで構 成されていること。

ｐＴ２．１９クローン内（ｐＴＺ１８の反対方向）の互恵ａＩ部位にすぐ続＜１ ８ｂｐのＤＮＡ配列はＣＯ３，３プライマーと一致すること：そしてＮＯ２，２ およびＣＯ３，３の両方のプライマー領域内および領域該のＤＮＡ配列から波線 されるアミノ酸配列はサビナーゼから決定されたＮ末端および内部アミノ酸配列 と一致すること。

上に述べた結果に基づいて、バチルス・レンツスＤＳＭ５４８３株のＤＮＡから 増幅された６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントはこのマチュアーなプロテアーゼの Ｎ末端のすぐ後から開始し、タンパク質コード領域にまで続いているアルカリ性 プロテアーゼをコードする遺伝子部位を有していると結論付けられる。この６５ ０ｂｐのＰＣＲフラグメントの配列決定を完成するため、２つのアプローチを行 った。第１に６５０ｂｐのＰＣＲフラグメントを有するｐＴＺ１９Ｒベクターを 、このＰＣＲフラグメントを除去するために旦ｃｏＲＩで消化し、再連結して大 腸菌内へ形質転換した。このＰＣＲフラグあることが明らかになっている。この 実験によって単離された正しいサブクローンはＤＮＡシーシーンシングのブライ ミング部位に隣トのさらなるＤＮＡ配列の決定が可能である。同時にｐＴＺ１９ ＲのＰＣＲ構築物から単離された小さなＥｃｏＲＩフラグメントをｐＴＺ１８Ｒ の反対の方向に組み込み、旦旦ｏＲＩ部位から反対側のＤＮＡ配列の決定が可能 となった。

Ｃ，バチルス・レンツス５４８３株のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の転写開始 部位の決定 クローンしたＢＬＡＰ遺伝子の遺伝子操作のうえで必要なステップは転写の開始 部位の決定である。プライマー伸長プロトコール（アーノスティーとチャムバー （ＡｒｎｏｓｔｉとＣｈａｍｂｅｒｌａｉｎ）　、ビーエヌエーエス（ＰＮＡＳ （米国））第８６巻第８３０頁（１９８９年））をこの部位を決定するために用 いた。この方法においては、プライマー（長さ２０から３０塩基）を、予想され る転写開始の２００から３００　ｂ　ｐ　３’　に位置する鋳型ＤＮＡとホモロ ジーを有するように合成する。このプライマーをメツセンジャーＲＮＡとハイブ リダイズし、厳密な条件下で転写し、その後このプライマーを逆転写酵素を使用 して伸長した。逆転写体の大きさは変性ポリアクリルアミドゲル内で測定した。

伸長したプライマーはまた、転写開始塩基がノークエンシングケルから正確に読 み取れるよう配列決定を行った。ＤＳＭ５４８３またはバチルス・ズブチリスＤ Ｂ１０４株含有プラスミドｐＪＷ５のトータルのＲＮＡをアーノスティーとチャ ムバー（ｉｂｉｄ）による方法位にクローニングして作成した。ライソザイム処 理に続いて超音波処理にを粉砕したバチルス細胞に施した。ヌクレアーゼ類の混 入からＲＮＡを精製するために、少なくとも４から５回のフェノール抽出を行っ た。ＢＬＡＰ遺伝子転写の大きさは、トーツス（丁ｈｏｍａｓ）著メソッド・イ ン・エンザイモロン−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　第１ ００巻、第２５５頁）のノーサン分析で決定した。この実験においてトータルの バチルスＲＮＡを変性し、その後変性濃度のホルムアルデヒドを含有するアガロ ースゲルによる電気泳動で分析した（ＢＲＬ　Ｆｏｃｕｓ、第９巻第３．１４頁 ）。このＲＮ　Ａはその後ケルからニトロセルロースフィルターへトランスファ ーし、これをその後６０℃で２時間焼いた。プラスミドｐＭＧ１０９．３　（］ ）ＵＣ１９＋３゜４ｋｂのＢＬＡＰ遺伝子を含有する旦±ｎｄｌＩＩフラグメン ト）をニックトランスレートし、ノーサンプロットのプローブとした。

ＢＬＡＰ遺伝子による転写は、およそ１２００から１４００塩基の長さであった 。ＢＬＡＰヌクレオチド配列にもとづいて、２つのオリゴヌクレオチドブライマ ーをデザインした。これらのプライマーはＢＬＡＰとＮｃｏｌおよび旦ｐａＩ部 位の間の配列、および５゛からマチュアーなプロテアーゼタンパク質をコードす るまでの配列とホモロガスである。プライマーＡはＦＩＧ、２に含有されるＢＬ ＡＰヌクレオチドの２０５６〜２０３３塩基の間にまたがり、プライマーＢは２ ２４２〜２２２２塩基の間にある。両方のプライマーおよびバチルス・レンツス ＤＳＭ４５８３またはｐＪＷ５プラスミドを担うバチルス・ズブチリスＤＢ１０ ４から調製したメツセンジャーＲＮＡを用いたプライマー延伸実験の結果も同じ であった。両方の場合において、転写の出発部位はＢＬＡＰ配列内の１９２４位 にあるアデニン残基であると決定される。このアデニンは、ＢＬＡＰシグナルペ プチドの最初にあるＡＴＧ翻訳開始コドンから４２ｂｐさかのぼったところに位 置する。この結果に基づくと、ＢＬＡＰのメツセージの長さは１２１０塩基であ る。

実施例５ バチルス・リッンエニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺 伝子とバチルス・レンツスアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（ＢＬＡＰ）との融合 体の構築 Ａ、アプローチ ＢＬＡＰを大量生産するため、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝 子の断片とＢＬＡＰ遺伝子の断片とを含有する遺伝子の融合に基づいて発現シス テムをデザインした。ＢＬＡＰ遺伝子の本来のプロモーターは、バチルス・ズブ チリスＤＢ１０４内において、ＤＳＭ４５８３内におけるのと同様、効果的にＢ 　Ｌ　Ａ　Ｐを生産するのには不十分なプローブであった。ＡＴＣＣ５３９２６ アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプロモーターはＡＴＣＣ５３９２６内のカール スペルゲタイブ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ−Ｔｙｐｅ）のプロテアーゼの大量生産に 有用であることが発酵の結果から知られている。よって、ＡＴＣＣ５３９２６ア ルカリ性プロテアーゼ遺伝子プロモーターの、ＢＬＡＰ構造遺伝子への融合は市 販のＡＴＣＣ５３９２６内のセリンプロテアーゼと同じプロテアーゼの効果的な 発現システムとなる可能性がある。ＡＴＣＣ５３９２６及びＢＬＡＰのようなア ルカリ性プロテアーゼをコードする遺伝子は典型的にはその酵素のプレープロ形 態をコードする。これらのすべては、プロモーター、リポソーム−結合部位、お よび効果的な転写および相応する遺伝子の翻訳を司る開始コドンを含有する調節 領域からはじまっている。この調節領域に続いてシグナルペプチドをコードする ＤＮＡ配列が続く。

細胞外プロテアーゼの分泌に必要なシグナル配列に続いて、プローペプチドとマ チュアーなプロテアーゼのコード領域がある。プロモーター以下のＤＮＡ配列の 転写ののち、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）は最終的な遺伝子へと翻訳さ れる。プレープローマチュアープロテアーゼは、シグナルペプチド、プロペプチ ドおよびマチュアーなプロテアーゼで構成される。シグナル配列はインマチュア ーなプロテアーゼを細胞質膜を通して支配しており、そこでシグナルペプチドは シグナルペプチダーゼによって酵素的に切断される。プロ配列は、プロープロテ アーゼの、細胞質膜と細胞壁を通りぬける移動の間および後において、正しい折 り畳みとプロセシングに重要であるようである。ＢＬＡＰとＡＴＣＣ５３９２６ アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の間のアミノ酸配列を比較するとプレ領域におい ては４９％のホモロジー、プロ領域では３８％のホモロノーそしてマチュアー領 域においては７５％のホモロジーが認められた。正常な分泌とプロテアーゼの成 熟に必要な、ブレおよびプロ領域の相互作用が完全にはわからないので、ＡＴＣ Ｃ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の断片とＢＬＡＰ遺伝子の断片の２ つの異なった融合体を構築した。この２つの基本的な融合体はＡＴＣＣ５３９２ ６とＢＬＡＰの遺伝子の異なった断片を接続するのに使用した制限酵素部位によ って同定した。

ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−１３ＬＡＰＣ１ａＴ遺伝子融合体 を作成するため、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の３７６位 、ＡＴＣＣ５３９２６のブレとプロ配列の接合点の隣（Ｆ　Ｉ　Ｇ、　２７．２ ７Ａ）に特別にＣ１ａＩ制限部位を導入しなければならない。Ｂ　Ｌ　Ａ、　Ｐ 遺伝子は２０３２塩基対の位アーゼ遺伝子内に誘導した。上に記載したプラスミ ドｐＧＭ１５をｄａｍ＋大腸菌株であるＮＭ、５２２から単離し、ＡｖａＩ、Ｃ １ａＩおよびＹ土旦■で制限し、４３３０ｂｐ、１２９６ｂｐ、３８２ｂｐ、１ ４７ｂｐの４本のＤＮＡフラグメントを得た。ＢＬＡＰ配Ｉフラグメントから３ 本のＤＮＡフラグメントを作り、これらのフ連結あるいは再クローニングしない ために行った。ｐＧＭ１５からΔｖａ　Ｉ／ＣＩ　ａ　Ｉ／Ｍ±ｕｌで消化して 得たＤＮＡのフラグメントを、ＰＣＲ法を使用して合成した、ＡＴＣＣ５３９２ ６アルカリ性プロテアーゼのプロモーターおよびプレ配列を含有するＤＮＡフラ グメントと連結させた。この２９２ｂｐのフラグメントは５゛と３′の端がΔｖ ａ、Ｉおよび９土Ａ１制限部位であり、プラスミドｐＣ５１を鋳型として使用し 、＃１および＃３プライマー（ＦＩＧ８）と共に合成される。ＰＣＲフラグメン トは、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼプロモーターおよびほとんど のＡＴＣＣる、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のＮ末端部の 情報を持つ配列を含有する。上記連結体を大腸菌ＮＭ５２２内へ形質転換し、ア ンピンリン抵抗性の形質転換体を選択した。プラスミドＤＮＡを作成し、制限酵 素分析に供した。正しい構築物を同定し、ｐｃＢｌｏｃ　（ＦＩＧ、１２）と名 付けた。プラスミドｐＣＢ１、　ＯＣはＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテア ーゼプロモーター、およびＢＬＡＰの２９４１位に固有のＣｏａ１部位以下の配 列と融合したＡＴＣＣ５３９２６のプレ配列のほとんどを含有する。プラスミド ｐｃＢ１０ｃは、旦土互工で切断し、Ｂ　Ｌ　Ａ　Ｐ配列の２０３２位と２９４ １位の旦↓１」部位の間の配列を含有するＢＬＡＰ遺伝子からの９０９ｂｐのＣ １，ａ、　Ｔフラグメントを挿入して、最終的２は大腸菌ＧＭ３３　（ｄａｍ− ）から、テトラヌクレオチドＧＡＴＣ認識部位におけるアデニン残基のｄａｍメ チル化を防ぐために単離した。９０９ｂｐのＤＮＡフラグメントは分離用アガロ ースゲルから単離し、さきにＣＩａＩで制限した、細菌性アルカリ性フォスファ ターゼで脱リン酸化したプラスミドｐＣＢＩＯＣ内へ連結した。

連結混合物を大腸菌ＮＭ５２２内へ形質転換した。アンピシリン抵抗性の形質転 換体をスクリーニングし、正しい構築体（ｐｃＢ１０Ｃ）を同定した。ｐｃＢｌ ｏｃの制限酵素地図をＦＩＧ、４に、この構築の概略図をＦ　Ｉ　Ｇ、　１２に 示した。プラスミドｐｃ８１０ｃ内にあるＡＴＣＣ５３９２６とＢ　Ｌ　Ａ、　 Ｐ遺伝子の融合体のＤＮＡ配列の分析から、予期したＤＮＡとアミノ酸配列が確 認できた。

るため、Ａ、ＴＣＣ５３９２６のプロ配列とマチュアー配列（Ｆ　Ｉ　Ｃ７およ び７Ａ）の接合点の近くの、ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性いて導入した。５５ ４ｂｐＯＰＣＲ用ＤＮＡフラグメントをｐＣ５１プラスミドを鋳型として、オリ ゴヌクレオチド＃１および＃２（ＦＩＧ、８）をプライマーとして用いて合成し た。このプライマーのＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼプロモーター、ブ レおよびプロ配列、そしてマチュアーなＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺伝子 の最初の４個のアミノ酸の配列情報を有する。ＡｖａＩ／ＮｃｏＩによる制限の 後、ＰＣＲフラグメントを、プラスミドｐ　ＧＭＩ５から得た４９５８ｂｐのΔ ヱａＩ／Ｎ且旦ｌＤＮＡフラグメントへ連結させた。プラスミドｐＧＭ１５　（ ＦＩＧ、３）をＡｖａＩ、Ｎ至」ノおよび鼠互恵１で制限し、４９５８ｂｐ１６ ６８ｂｐ、３８２ｂｐ、および１４７ｂｐの４本のＤＮＡフラグメントを得た。

Ｍｕ±１は１１９７ｂｐのΔｖａ、Ｉ／Ｎｃｏｌフラグメントを、このフラグメ ントが４９５８ｂｐのΔｖａＩ／ＮｃｏＩフラグメントと再連結することを防止 するため、３本のフラグメントにするために使用した。連結混合物は大腸菌ＮＭ ５２２内へ形質転換した。アンピシリン抵抗性の形質転換体を選出し、正確な構 築体（ｐｃＢＩＮ）を同定した。プラスミドｐｃＢＩＮのＮｃｏ■部位にかかる ＤＮＡ配列の分析により、予期したＤＮＡおよびアミノ酸配列を確か一ター、Ａ ＴＣＣ５３９２６のプレーおよびプロ配列、そして３位のアミノ酸残基のスレオ ニンがセリンに変わっているノングルアミノ酸置換があるマチュアーなり　Ｌ　 Ａ、　Ｐの全ての配列を含む。

実施例６ バチルス・リッンエニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６−ＢＬＡＰ融合遺伝子のバ チルスベクター内へのサブクローニングおよびＡＴＣＣ５３９２６製造株内への 形質転換 ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−バチルス融合遺伝子を大腸菌内へ 上に述べたようにして組み込んだ後、バチルスベクター内へサブクローニングし 、バチルス・ズブチリスＤＢ１０４内へ形質転換した。、ＡＴＣＣ５３９２６ア ルカリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ融合遺伝子はＡｖａ　Ｉ／Ｓｓ　ｔ　ｌＤＮＡ フラグメントとしてｐＢｃ１６とｐＵＢ１１０誘導体内へ、ＡＴＣＣ５３９２６ アルカリ性プロテアーゼ−Ｂ　Ｌ　Ａ　Ｐ誘導体遺伝子（ｐｃＢＩＮＳｐｃＢＩ ＩＣＳｐＣＥ２ＮＳｐｃＢ１３ｃ、ｐＣ８４ＮおよびｐｃＢ１５ｃ）をΔヱユ丁 と旦且工丁で制限し、これらを１．イ＼、二上ニー」？−Ｔ、−５５−ミ；ｔｌ 、Ｐｓｔｌおよび５ａｌＩで先に消化したバチルスプラスミドｐＣ５１およびｐ Ｈ７０と連結することによって、サブクローニングを行った。プラスミドｐｃ５ １およびｐＨ７０はΔｖａ、Ｉ／５ｓｔＩで切断して、複製に必要なオリジンと 選択のための抗生物質抵抗性の遺伝子（ｐｃ５１にはテトラサイクリン抵抗性、 ｐＨ７０にはカナマイノン抵抗性）を含有する大きな、へｖａＩ／５ｓｔＩフラ グメントを得た。旦見士１および２且±Ｉによるによる制限は、ｐＣ５１および ｐＨ７０にある、すべてのＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を 含有する、小さなΔｖａＩ／５ｓｔＩフラグメントをより小さな３本のＤＮＡフ ラグメントに加水分解するために行った。これは、ＡＴＣＣ５３９２６あるプロ テアーゼ遺伝子がバチルスベクター内に再連結する可能性を減少させる。バチル ス内への最初のクローニング実験はバチルス・ズブチリスＤＢ１０４をレシピエ ンドとして用いて行った。ＤＢ１０４はプロテアーゼの少ない株であるため、Ｂ 　Ｌ　Ａ、　Ｐ遺伝子の存在および発現を直接スクリーニングすることができる 。ｐＨ７０およびｐｃ５ｉを大腸菌、上記ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテ アーゼ−ＢＬＡＰ融合プラスミドそれぞれからのΔｖａｌ／５ｓｔＩフラグメン トのレノビエントとして使用すると、１２の活性なバチルスプラスミド構築物が 作製できた。ＦＩＧ、２３には大腸菌プラスミドｐｃＢ１１ｃ、ｐｃＢ１３Ｃお よびｐｃＢ１５ｃに存在する３つの９±！■融合体から由来する６個のＡＴＣＣ ５３９２６−ＢＬＡＰプラスミドを示した。このＡＴＣＣ５３９２６生産株に形 質転換可能なプラスミド、ｐＣＢ５５Ｃ，ｐＣＢ５６Ｃ，ｐＣＢ５８ＣＳｐＣＢ ７５Ｃ，およびｐＣＢ７８Ｃプラスミドの詳細な制限酵素地図は、それぞれＦ　 Ｔ　Ｇ、　１３．１４．１５．１６．１７に示した。これら５つ全ての構築物を バチルス・ズブチリスＤＢ１０４内およびＡＴＣＣ５３９２６生産株内へ形質転 換した。同様にして、Ａ、ＴＣＣ５３９２６アルカリ性ＮおよびｐＣＢ４Ｎから ｐｃ５１とｐＨ７０内へクローニングした。

このクローニングから得られた６個のプラスミドのうちの５８１　（ｐＣＢ５Ｏ Ｎ、ｐｃ８５１Ｎ、ｐＣＢ５３Ｎ、ｐｃＢ７ＯＮおよびｐＣＢ７３Ｎ）を、バチ ルス・ズブチリスＤＢ１０４とＡＴＣＣ５３９２６生産株内へ形質転換した。こ れらの構築物の制限酵素地図をそれぞれＦＩＧ、１８．１９．２０．２１、及び ２２に示した。

実施例７ バチルス・レンツスアルカリ性プロテアーゼ（ＢＬＡＰ）を１．へＴＣＣ５３９ ２６アルカリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰ株のフラスコ振とう培養によって製造す るプロトコール 異なったＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−ＢＬＡＰプラスミドを担 うバチルス・リッン二二フォルミスＡＴＣ０５３９２６の誘導体を比較するため に、３段階フラスコ振とう方法を用いた。これらの実験のうち、抗生物質テトラ サイクリンまたはカナマイシンを常に、希望するプラスミドを選択するために培 地中（以下に示す）へ添加した。最初の前培養フラスコには、凍結保存バイアル を室温で溶かしたものから接種した。３９℃、２０Ｏｒｐｍで７時間培養後、１ ．０％（ｖ　／　ｖ　）のこの培養物を新たな（第２）前培養用フラスコへ移し 、培養を続けた。１３時間から１５時間の間に、この培養物を主培養フラスコへ １％ずつ移したものを２本作成した。

プロテアーゼ活性の測定用の培養標本を２７時間から５０時間の間に主培養フラ スコから過ヨウ素酸化して得た。微生物が吸収することのできる炭素および窒素 源を、その他の有機物質と無機塩類と同様に含有する混合培地を使用してフラス コ振とう実験を行った。主成分には、加水分解したコーンスターチ、ナトリウム カゼイネート、ダイズ粉、醸造残渣およびコーンステイープリカーを含有する。

少量の消泡剤および無機塩類、ビタミンＢｌおよびビタミンＢ６もまた含有して いる。調節したエーレンマイヤーフラスコに分配した後、培地を１５ｐｓｉのも と、１２１℃に加熱して滅菌した。

実施例８ Ｂ　Ｌ　Ａ　Ｐを生産するＡＴＣＣ５３９２６誘導体の小規模発酵のプロトコー ル 発酵は２段階で行い、有機体は最初に内在プラスミドＤＮＡを選択するための抗 生物質を含む混合培地を入れた振とうフラスコ内で成育させた。高い細胞ａ度と なった後、フラスコ培養物の一部をさらに成育させ、プロテアーゼを産生させる ために主発酵槽へ移した。

槽はバチルス・ブラウン・インコーホレイテッド製のバイオスタノ）　（Ｂｉｏ ｓｔａｔ）　ＥまたはＥＳを使用した。全ての発酵は１０リツトル以下の分量で 、ＢＬＩ（生物学的安全性レベル１）封じ込めの予防措置をとり、ナショナルイ ンスティテユートオブヘルスの組み替えＤＮＡ分子の研究に関するガイドライン （Ｎ　Ｉ　ＨＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、１９８６年５月７Ｂ）に特定されている、 グッドラボラトリープラクテイスに則って行った。

振とうフラスコ法と発酵用の培地は、吸収し得る炭素源、吸収し得る窒素源、有 機栄養素および無機塩類を含有する大変に項似した複合培地であり、微生物の活 発な成育をプロテアーゼの生産同様可能にする。培地の主成分には脱イオン水、 醸造残渣およびコーンステイープリカーを含む。微量添加物は（ＮＨ，）　、Ｈ ＦＯ２およびＮａ２ＨＰ○４である。市販の消泡剤も発酵培地に含有する。この 培地は１５ｐｓ　ｉにて１２１℃に加熱して滅菌した。ここに記載した培地はフ ラスコ内に２リットル調節し、培養−グリセロール凍結保存物（保存の章を参照 のこと）を室温で溶かしたものから１．０ｍｌ接種した。テトラサイクリンかカ ナマイノンのどちらかの抗生物質を振とうフラスコ培養に希望のプラスミドを担 っている細胞を選択するために添加した。振とうフラスコは３９℃でゆっくり振 とうさせながら培養物を成育させた。その後に、発酵用培地に、１５％（ｖ／ｖ ）のフラスコ振とう培養物を接種した。抗生物質は発酵用培地にも添加しておい た。撹拌速度および気流はそれぞれ１３００ｒｐｍとｌｖｖｍ（リットル７分） に保った。幾つかの実施例においては、この撹拌および気流速度を、対数増殖期 のしばらくの間、酸素分圧（ｐｏｚ）を培養槽内で２０％以上に保つために増加 させねばならない。

生産株の培養の間、培養ｐＨおよび温度は特定の時間に変化させた。特に、培ｔ ｐＨの調節がプロテアーゼの産生において重要であることが分かった。培養ｐＨ は、０〜１３．５時間の間は６．８に調節し、その後１８から３５時間の間は７ ５に調節した。ＫＯＨとＨ２ＳＯイの滅菌溶液を培地に添加して］）Ｈを調節し た。発酵の開始は、培養温度を３９℃にし、た。１４．５時間の培養後この温度 を３４°Ｃに下げた。

実施例９ バチルス・レンツスアルカリ性プロテアーゼのアッセイフラスコ振とうまたは発 酵からの試料のアッセイのため、プロテアーゼを細胞および培地の残骸から遠心 分離によって分離した。これらの粗試料内のプロテアーゼ量を以下に記載したよ うにして計測した。

カゼインのプロテアーゼ消化物からの酸溶解性フラグメントの遊離の不連続アッ セイに基づいたＨ　Ｐ　Ｅ　（Ｈｅｎｋｅｌ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｅｉｎｈｅｉ ｔ）法を用いた。およそ５０μｌのプロテアーゼ溶液を、ｐＨ８，５のトリポリ ホスフェート−トリス緩衝液内でハンマーステン（Ｈａｍｍａｒｓｔｅｎ）カゼ インを加熱して得たカゼイン溶液と結合させた。２．２ｍｌのエッペンドルフ管 内で５０℃にて１５分の培養をした後、６６０μｍの０．４４Ｍ）リクロロ酢酸 溶液を加えた。混合物は遠心分離により沈殿を分離する前に、氷上で１５分間冷 却した。酸−溶解性ペプチドは２９０ｎｍの分光光度計で測定した。ＨＰＥユニ ットは２９０ｎｍにおける吸光度が０．５０００Ｄ変化する値と決めた。

ＥＰＥ　（ニステロリティック・プロテアーゼ・アインハイト（ｅｓｔｅｒｏｌ ｙｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｅｉｎｈｅｉｔ））法は、ＡＴＣＣ５３９２６生 産株からの活性の最初の探索に有用である。速度論的（ｋｉｎｅｔｉｃ）アッセ イは、１００μｍの試料または既知の市販のプロテアーゼ（マクサシーゼ（Ｍａ ｘａｔａｓｅ）　；Ｎｏｖｏ＾／Ｓ）を、ＣＢＺ−バリン−ｐ　−トＤフェニル エステルを含有するアセトンバッファー内へ混合することで開始した。ｐ−ニト ロフェノールがこのＣＢＺエステルのエステル分解によって遊離する速度を分光 光度計にてＡ３４゜で測定し、直線回帰分析によって決定した。試料のＥＰＥ活 性ユニットはマクサシーゼ標品と試料の反応速度の比較から決定した。

実施例１０ ＢＬＡＰとバチルス・リッシエニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼの ゲル電気泳動法による分離ＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ−Ｂ　Ｌ 　Ａ、　Ｐ融合株により生産されるバチルス・レンツスアルカリ性プロテアーゼ は、ＡＴＣＣ５３９２６に固有の細胞外タンパク質分解酵素と、ホモジーニアス な非−変性（「ネイティブｎａｔｉｖｅＪ　）　１２．　５％ポリアクリルアミ ド（Ｐ　Ａ）ゲルでｐＨ６，０バツフアーを用いて電気泳動法で分離した。発酵 液の遠心分離によって得た粗精製試料を、この方法によってファスト・システム （Ｐｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ）装置（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｉ ｎｃ、））上に再度溶解した。タンパク質の種類はＰＡケルをクーマッシ・ブル ー（Ｃｏｏｍａｓｓｉ　Ｂｌｕｅ）で染色することによって可視化した。

実施例１１ バチルス、リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６の調製バチルス・リッシェ ニフオルミスＤＳＭ６４１株を含有する寒天傾斜培地から細胞物質をループにて 取り、５ｍｌの培地Ａ（培地Ａネーブイリオン（ＮａｈｒｂｏｕｉｌｌｉｏｎＸ ｌｌｅｒｃｋ）製品の指示どおりに調製した）に懸濁した。パイブロックナイ（ Ｖｉｂｒｏｘｎａｉ、）による強い撹拌の後、この懸濁液を３０℃でサーキュラ −シェーカー（１５０ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ；２４時間）で撹拌した。２４時 間後、１ｍＩの懸濁液（６４０ｎｍにおける光学的密度（○Ｄ）＝１）を、５０ ０ｍ１のエーレンマイヤー振とうフラスコ内の１００ｍ１の培地Ａ内でさらに２ ４時間培養した。その後、６５００ｒｐｍにて遠心分離を行った。遠心分離物は 等強性のＮａＣ＋溶液で２度リンスし、細胞数がおよそ１０９／ｍｌとなるよう 、十分な塩水内へ移した。

およそ８ｍ、ｌのこの懸濁液を直径９ｃｍ、Ｕ、Ｖ、ランプ（Ｓｃｈｕｔｔ／Ｇ ○ｔｔｊ、ｎｇｅｎ）から２７ｃｍの距離にあるのベトリ皿へ移し、１０Ｑｒｐ ｍで撹拌しながらＵ■、照射（５〜６０分間）を行った。

細胞が沈殿しないように撹拌は照射の間続けた。先に決めた、好ましくは６分間 の照射時間の終了後、希釈系を作成し、これらの希釈物を、培地Ａの抗生物質を 含有する、含有しない寒天プレート上へ撒いた。突然変異誘発操作の前および後 、抗生物質含有および含有しない培地のＣＦＵ　（コロニーフォーミングユニッ ト）の値から、突然変異形成の指標となる復帰率（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ　ｒａｔ ｅ）ばかりでなく死滅速度もわかる。ＤＳＭ６４１の場合においては、死滅率は 〉９５％であり、特に望ましいと考えられる。

レプリカプレート方を用いてコロニーをＣａ−カゼイネート寒天へ移した。この プレートを３９°Ｃで７２時間培養した。その２４．４８、及び７２時時間−コ ロニーの回りの阻止用を測定した。コロニーと阻止用を測定した後、コロニーの 直径と比べて大きな溶園部を示したコロニーを選んだ。これらのコロニーの個々 の培養物を標準的な微生物的手法（コツホ（Ｋｏｃｈ）の寒天プレート法、リン ドラ−ｋ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））により作成した。フラスコ振とう実験は、こ れらの単離物をプロテアーゼ生産性を測定するために行った。

実施何重２ ＤＳＭ６４１およびＡＴＣＣ５３９２６により生産されるプロテアーゼの比較 これらの株を５００ｍ１のエーレンマイヤーフラスコ内で、５０ｍ１の培地Ｂ（ 表３のフットノート１参照）とともに振とうフラスコ法で３９℃、１５０ｒｐｍ （振幅５ｃｍ）で９６時間培養した。

プロテアーゼ活性は２４時間毎に測定した。プロテアーゼの相対的な生産を表３ にまとめた。

表３ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＜　Ｘ　７　Ｈ２０１、ＯＭ　ｎ　Ｓ　Ｑ　４　Ｘ　２　Ｈ２０ ０５Ｃａ　ＣＩ　２Ｘ　２　Ｈ２Ｏ０，２ 大豆粉末　３．０ カゼイン・ナッハ・ハンマーステン （Ｃａｓｅｉｎ　ｎａｃｈ　Ｆｌａｍｍｅｒｓｔｅｎ）　１５．０じゃがいもデ ンプン　１２０．０ アミラーゼ　０６ 最終体積の１／３に懸濁したじゃがいもデンプンは、酵素的に加水分解した。こ れとは別に、カゼインは７５℃にて水（最終体積の約１／３量）にＫＯＨ溶液を 加えて溶かした。これらの２つの溶液と塩類とを混ぜ合わせ、全体積を水で調整 した。ｐＨは７．２に調節し、溶液は滅菌した。

２．２連の発酵を行った ３、７２と９６は培養時間（時間）を示す表３はＡＴＣＣ株がＤＳＭ６４１株に くらべて３０％以上のプロテアーゼを生産することを示す。

その他の実験操作 １　プラスミドＤＮＡの調製 プラスミド標本（ミニプレバレージョンｍ１ｎｉ−ｐｒｅｐ、　Ｃｓ　Ｃ１／エ チジウムブロミド密度勾配にて精製）、アガロースおよびアクリルアミドゲル電 気泳動、バッファー類（トリスＥＤＴＡ　（ＴＥ）　、トリス酢酸ＥＤＴＡ　（ ＴＡＢ）　、トリスボレートＥＤＴＡ　（ＴＢＥ）および培地の調製は本質的に マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、イビッド（ｉｂｉｄ）による方法で行った 。フェノールｐ、ａ、　はＩＢＩから購入し、使用前にＴＥバッファーで平衡に した。アガロース（シーケムＧＴＧ（ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ））およびゲル化温 度の低いアガロースであるンープラーク（ＳｅａＰｌ、ａｑｕｅ）はエフエムソ ーコーポレイション（ＦＭＣＣｏｒｐ、　、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）９から 購入した。

２、制限フラグメントの精製 制限フラグメントは分離用アガロースゲルに試料を通して単離した。ＤＮＡはエ チジウムプロミドで染色して可視化し、ＤＮＡフラグメントを含有するバンドを 、回収のためにレーザー刃で切り取りた。ＤＮＡはＩＢＩ電気溶出機にて電気的 に溶出し、一度フエノール抽出し、その後エタノールで沈殿させた。

３、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ法） ＰＣＲ法は製造者セータス・コーポレイソヨン（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　Ｃａｋｉｆｏｒｎｉａ）の記載した方法をそ のまま行った。ＰＣＲ法によって生じたＤＮＡを含有する溶液をフェノールで抽 出し、エタノールで沈殿させ、制限酵素による加水分解に適当なバッファーに最 懸濁した。適当な制限酵素による加水分解ののち、溶液はフェノールで抽出し、 エタノールで沈殿させた。この方法で調製したＤＮＡは連結に適している。この レポート注ではすべてのＰＣＲにより作成されたＤＮＡフラグメントの予想され る長さは、適当な制限酵素で制限された後に認められるＤＮＡフラグメントの長 さに対応する。

４、制限酵素分析 制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび細菌性アルカリ性フォスファターゼは、製 造者（ＮＥＢ、ＢＲＬ、ＩＢＩ、Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ）の記載した方法で使用 した。

５、プロトプラスト形質転換 最初にバチルス・ズブチリスに対して最適化したプロトプラスト形質転換方法を 他のバチルス属にも適応した（チャンとコーエン、モル・ジエン・ジェネティッ クス（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎＳＭｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ第１６ ８巻第１１１頁）。バチルス・ズブチリス、バチルス・レンツスまたはバチルス ・リッシエニフォルミスのコロニーを３０ｍ１の４１６培地（４１６倍地：バク トトリプトン２％、イースト抽出物１％、ＮａＣ］１％含有、オートクレーブに て滅菌）に接種し、−夜、３７度でニュー・ブラウンスウィック（Ｎｅｗ　Ｂｒ ｕｎｓｗｉｃｋ）　Ｇ２４卓上ン二一カ一にて２２５ｒｐｍで振とうしながら培 養した。翌朝、各培養物の適当な量を、２５０　ｍ、　］のエーンリッヒフラス コ内の４０ｍ１の４１６培地（予め温める）に接種した。３７℃の培養を振とう しながら、ＯＤ６．。が０．４と０５の間に達するまで続けた。その後細胞を３ ５ｍ１の滅菌ポリプロピレン製オークリッジタイプのチューブで３０００ｒｐｍ 、１０分間、４℃にてベレットにした。

上清を流し、細胞のベレットは穏やかに５ｍｌのＳＭＭＰへチューブを反転させ て再懸濁した。ＳＭＭＰは常に、２×の体積のＳＭＭと４×の体積のＰＡＢ　（ ２ｘＳＭＭに含有するもの：シュークロース１０Ｍ１マレイン酸０．０４Ｍ、Ｍ ｇＣｌ２・６Ｈ２００，０４Ｍ。

ｐＨ６，５（１０％ＮａＯＨて調節）オートクレーブで滅菌、４×ＰＡＢ含有物 　７０ｇのディフコ（Ｄｉｆｃｏ）抗生物質培地＃３をを１リツトルの脱イオン 水に溶かした、オートクレーブで滅菌）を混合して新しく作成したものを使用す る。細胞懸濁液は滅菌した１６×１２５ｍｍの丸底、スクリュー蓋のカルチャー チューブ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）　＃　２５７６０　）に注いで移した 。新たに作成したＳＭＭＰに溶かした１０ｍ、ｇ／ｍｌのライソザイムを２００ μｍ加えた。

チューブをＧ２４ニユー・ブラウンスウィックシェーカーのプラットフォームに 乗せ、３７℃で非常に穏やかに（２５〜３０ｒｐｍ）振とうしながら培養した。

プロトプラストの生成は、一般にバチルス・リッンエニフォルｍｓで４０〜６０ 分、バチルス・レンツスおよびバチルス・ズブチリスで２０〜４０分間で起こる 。プロトプラストの生成度を測定するため、細胞懸濁液の試料を位相差顕微鏡を 使用して試験した。ライソザイムを作用させた後、１０ｍ１の５ＭＰＰをプロト プラストの懸濁液に加え、プロトプラストを室温で１０分間２０ＱＱｒｐｍの遠 心分離によってベレットにした。ＳＭＭＰにプロトプラストのベレットを再懸濁 （最初の細胞懸濁液４０ｍ１につき、３ｍｌのＳＭＭＰ）する前に上清を注意し て除いた。各形質転換反応において、０．５ｍｌのプロトプラスト細胞を滅菌プ ラスチックの１６Ｘ１２５ｍｍの丸底培養チューブ（コーニング＃２５７６０） に移し、その後１から４マイクログラムのＤＮＡを６０μｍあるいはそれ以下の 体積にしたもの、１．５ｍｌの４０％ポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ、シ グマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ。

ｍｐａｎｙ）製造＃ｐ−３６４０）を加えた。チューブを反転させて穏やかに混 合した後、３〜４分間室温でおき、その後ＰＥＧを５ｍｌのＳ　ｒｖｆＭ　Ｐ　 ＋　２％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）で希釈した。反転により混合した後、 プロトプラストは室温で１０分間２００Ｏｒｐｍで遠心分離してペレットとし、 ペレットを１ｍｌのＳＭＭＰ＋ＢＳＡに再懸濁する前に上清を流して除いた。細 胞は３７℃で９０分間振とうしながらにュー・ブラウンスクイツク６２４卓上シ ェーカー、１５０ｒｐｍ、）培養し、遺伝子をコードするプラスミドを発現させ 、部分的に細胞壁を再生させる。ＣＲ５再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ）培地 をすべての、ＫｍＲをコードするプラスミドを含有する形質転換体を選択するの に使用した（バイエル（Ｐｕｙｅｒ）ら、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レシ ーズ（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）第４０巻第１頁 （１，９８７年））。ＤＭ３再生培地は、Ｔｃ″をコードするプラスミドで形質 転換したバチルスの選択にもともと使用されているものである（ＣｈａｎｇとＣ ｏｈｅｎ（ｉｂｉｄ））。しかしながらバチルス・ｔ／ンッスブロトプラストは このサクシネートを基本とする培地上では再生しなかった。

そのため、浸透圧の安定剤にマンニトールを使用した＃４５１再生培地を試用し た（ポーンとダンサ−（ＢｏｕｒｎｅとＤａｎｃｅｒ）、ジェイ・オブジェン・ マイクｏ（Ｊ、　ｏｆ　Ｇｅｎ、　１ｉｉｃｒｏ、）、第１３２巻第２５１頁（ １９８６年）。すべてのバチルス株はマンニトール培地上で良く再生したが、テ トラサイクリン必要量レベルが各株で異なっていた。バチルス・ズブチリス、バ チルス・レンッスおよびＡＴＣＣ５３９２６のテトラサイクリンの選択レベルは それぞれ６５μｇ／ｍｌ　１５μｇ／ｍ１．２５μｇ／ｍｌであった。各形質転 換反応は５つの再生プレート上で１〜２日間３７°Ｃで培養した。強い形質転換 株は、適当な抗生物質を含有し、必要であれば１％のスキムミルクを含有するＬ ｕｒｉａ寒天上へ取り、プロテアーゼ活性を検出した。株の同一性をチェックす るために、スピーチエン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）の最小塩類培地に必要な他の栄養 素の添加をしたものと、していないものとを用いた。

６、細菌株 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）株：１）　大腸菌ＮＭ５２２はｂ ｓｄΔ５、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、［Ｆ゛。

ｐｒｏ”、］ａｃＩ’ＺΔＭ１５コである。ＮＭ５２２は制限酵素陰性、修飾陰 性である（ファルマシアＰｈａｒｍａｃｉａ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ 、））。

２）　大腸菌ＧＭ３３　（ｄａｍ３）はｄａｍ−メチラーゼ陰性（マリナスとモ ーリス（Ｍａｒｉｎｕｓ、　Ｍ、　Ｇ、とＭｏｒｒｉｓ、　Ｎ、　Ｒ，）、ジェ イ・モル・ビオール（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ）第８５巻第３０９頁（１９７ ４年））である。

３）　大腸菌ＤＨ５−は、Ｆ−φ３ＱａｌａｃＺΔＭ１５、Δ（１ａｃＺＹＡ− ａｒｇＦ　）Ｕ　Ｉ　６９．１ｅｃＡ１、ｅｎｄＡｌ、ｈｓｄＲ１７（ｒ、−１ ｍ　ｉ　”　）、５ｕｐＥ４４、ラムダ−１ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡＳ　ｒｅｌＡ ｌ（コンピテント凍結細胞、ＢＲＬ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

ＭＤ））である。

４）　大腸菌ＨＢＩＯＩは、Ｆ−１ｈ　ｓ　ｄ　Ｓ　２０　（ｒ　ａ＼ｍ、ａ− ）、５ｕｐＥ４４．ａｒａ１４、ｇ　１　ａＫ２．１ａｃＹｉ、ｐｒｏＡ２、ｒ ｐＳＬ２０（ｓ　ｔ　ｒＲ）、ｘ　ｙ　Ｊ　１５、Ｊｅｕ、ｍｔｌｌ、ラムダー 、ｒ　ｅ　ｃ　Ａ、　１３である。

７　バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株：１）　バチルス・ズブチリスＤＢ１０４ は、ｈ　ｉ　ｓ、ｎｐｒＲ２、ｎｐｒＥ１８、ａｐｒＡ３の遺伝子型を有する。

この株は、当局の許可をうけて、カリフォルニア大学ディービイス校のＲｏｙ　 Ｄｏｉ博士から譲られ、研究目的にのみ使用した。この株は中性およびアルカリ 性プロテアーゼの産生能を欠いている。

２）　バチルス・リッシエニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６はヘンケル・ケナジ ー（Ｈｅｎｋｅｌ　ＫＧａ＾、９口５ｓｅｌｄｏｒｆ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）が開 発した工業的に生産されている株である。

３）　バチルス・レンツスＤＳＭ５４８３はドイツの土壌試料から単離した天然 由来の株である。

８、クローニングベクター １）　ｐｃＵ１９：ｐｃＵ１９は大腸菌の小型（２６８６ｂ　ｐ）プラスミドで あり、ｐＢＲ３２２とＭ１３ｍｐ１９の部分を有する。

これは、１３の異なった制限エンドヌクレアーゼにに対する認識部位を有する５ ４ｂｐからなるマルチプルクローニングサイトを有する。このプラスミドはヤニ ッシューベローン（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ ）第３３巻、第１０３頁（１９８５年））によって構築されたもので、ニュー・ イングランド・バイオラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ、（Ｂｅｗｖｅｒｌｙ、　ＭＡ））から購入 できる。

２）　ｐＴＺ１８Ｒ：Ｉ）ＴＺ１８Ｒ（メッド（Ｍｅａｄ、Ｄ、Ａ、）ら、プロ ティン−エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）第１巻 第６７頁（１９８６年））は多機能ファージプラスミド（ファスミド）ベクター である。これは、大腸菌ベクターｐＢＲ３２２および大腸菌ファージｆ１の複製 オリジンを有し、このため−末鎖ＤＮＡを生産できるようにする。これは、プラ スミドｐＵｃ１８のマルチプルクローニングサイトを含有する。このベクターは 、ファルマシア・エルケービー・バイオテクノロジー・インコーホレイテッド（ ＰｈａｒｌＩｌａｃｊ、ａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ、　（ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ））から購入することができる。

３）　ｐＴＺ１９Ｒ：ｐＴＺ１９ＲはプラスミドｐＵｃ１９のマルチプルクロー ニングサイトを有する以外はｐＴＺ１８Ｒと相同である。

４）　ｐｃＰ１３：ｐｃＰ１３は先に解析されているプラスミドｐＬＡＦＲＩ　 （フリートマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）第１８巻第２８９ 頁（１９８２年））から誘導した、広い宿主域を有するコスミドベクターである 。プラスミドｐｃＰ１３は２３ｋｂの大きさで、テトラサイクリンおよびカナマ イシン耐性をコードする。このプラスミドにはクローニングに適当な多様なユニ ークな制限部位を宵し、可動化することができるが、自己伝染性ではない。

５）　ｐｃ５０・ｐｃ５ｏはバチルスプラスミドｐＢｃ１６の誘導体である。こ のプラスミドには、ｐＢｃ１６のＢａｍＨＩ部位に組み込んだＤＳＭ６４１プロ テアーゼをコードする２ｋｂのＤＮＡを有する。

６）　ｐｃ５１　：ｐＣ５１はプラスミドｐｃ５０の第２世代誘導体である。Ａ ＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼをコードする、ｐｃ５ｏからの１５４ ０ｂｐのΔｖａＩ／Ｓｓ±Ｉフラグメントを最初に大腸菌プロテアーゼｐＵｃ１ ９のＸｍａＩ部位と一３ｓｔ工■部位の間に組み込み、プラスミドｐＨ９を作成 した。ＡＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺伝子をその後、ｐＨ９の旦且旦Ｒ１／ 旦且工ＨＩフラグメントから除き、プラスミドｐＢｃ１６のＥｃｏＲ１部位ｐＵ Ｂ１１０・ｐＵＢｌｌｏはカナマイシン耐性をコードする４５４８ｂｐのプラス ミドであり、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓを可■匡二匹里嬰狸至り）か らラージ−（Ｒ，ｊ　Ｌａｃｅｙ）により最初に単離された（ジェイ・メッド・ マイクロビオール（Ｊ、Ｍｅｄ、　１ｌｉｃｒｏｂｉｏｌ）第７巻第２８５頁（ １９７４年））。

８）　ｐＫｏｌｌｏ：ｐＫｏｌｌｏはｐＢＵｌｌｏ（７）７８０ｂｐの旦且旦Ｒ ｒ／互恵匹ＩＩフラグメントを除き、ｐＵｃ１９がらのポリリンカー領域を含有 するフラグメントと置き換えたものである。

９）　ｐＢｃ１６：ｐＢＣ１６はおよそ４２５０ｂｐの大きさで、テトラサイク リン耐性をコードする。このプラスミドは、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）から最初に単離され、バチルス・ズブチリス内へ形質転換 （パーナート（Ｂｅｒｎｈａｒｄ、　Ｋら、ジェイ・バクチリオール（１，Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ）第１３３巻第８９７頁（１９７８年））された。

１０）　ｐｃ１９４：ｐｃ１９４はクロラムフェニコール耐性をコードする２９ １０塩基対のプラスミドで、スタフィロコッカス・アウレウスから単離され、バ チルス・ズブチリス内へ形質転換（イオーダン（工ｏｒｄａｎｅｓｃｕ、　Ｓ、 ）ら、プラスミド第１巻第４６８頁（１９７８年）およびエーリソヒ（Ｅｒｌｉ ｃｈ、　Ｓ、　Ｄ、）　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ第７４巻第１６８０頁（１９７７年） された。

１１、　ｐＨ７Ｑ　ｐＨ７０はプラスミドＰＵＢ　１１０から誘導された。Ａ、 、ＴＣＣ５３９２６プロテアーゼ遺伝子をプラスミドｐＨ９（プラスミドｐｃ５ １の項参照）の旦且旦Ｒ１／旦見工ＨＩＤＮＡフラグメント上から分離し、ｐＵ Ｂｌｌｏの旦旦旦Ｒ１部位とＢａ３１　ＡＫＥ　ＫＹＬ　Ｉ　ＧＦＮＥＯＥＡＶ ＳＥＦＶＥＱＶＥＡＮＤＥＶＡ　Ｉ６１ＬＳＥＥＥＥＶＥＩＥＬＬ）ＩＥＦＥＴ ＩＰＶＬｓＶＥＬｓＰＥＤＶ９１ＤＡＬＥＬＤＰＡＩＳＹＩＥＥＤＡＥＶＴＴＭ ＡＱＳＶＰＷＧＩＳ１２１　ＲＶ　Ｑ　Ａ　Ｐ　Ａ　Ａ　ＨＮ　ＲＧ　Ｌ　Ｔ　 Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｖ　Ｋ　Ｖ　Ａ　Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｔ　Ｇ　Ｉ　Ｓ　Ｔ　ＨＰ２Ｓ５　 Ｄ　Ｌ　Ｎ　Ｉ　ＲＧ　Ｇ　Ａ　Ｓ　Ｆ　Ｖ　Ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｔ　Ｑ　Ｄ 　Ｇ　Ｎ　Ｇ　）（Ｇ　Ｔ　ｌ−１’Ｊ　Ａ　Ｇ　s １８１　１　ＡＡＬＮＮＳ　ＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＲ ２１１ＧＡ　Ｉ　ＳＳ　ｉ　ＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳ Ｐ２４１　Ｓ　Ａ　Ｔ　Ｌ　Ｅ　Ｑ　Ａ　Ｖ　Ｎ　Ｓ　Ａ　Ｔ　Ｓ　ＲＧ　Ｖ　 Ｌ　Ｖ　Ｖ　Ａ　Ａ　Ｓ　Ｇ　Ｎ　Ｓ　Ｇ　Ａ　Ｓ　Ｓ　１２７１５ＹＰＡＲＹ Ａ　ＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧ３０１ＬＤＩＶＡＰＧＶ ＮＶＱＳＴＹＰＧＳ、ＴＹＡＳＬＮＧＴＳ１４ＡＴＰ３３１’ＨＶＡＧＡＡＡＬ ＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱ　ＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴ３６１　Ｓ　Ｌ　Ｇ　Ｓ　Ｔ 　Ｎ　Ｌ　Ｙ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｌ　Ｖ　Ｎ　Ａ　Ｅ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｒアミノ酸組成 ５勾Ａ　ＱＣ８’Ｈ５Ｍ　２１Ｔ ９Ｒ１２Ｑ　１９＋　６Ｆ　３Ｗ ２４Ｎ　２８Ｅ　３０Ｌ　１７Ｐ　９Ｙ１１Ｄ　３６Ｇ　１０Ｋ　４３Ｓ　３６ Ｖ残基数　：３８０ 分子量（ＭＷ）　二　３８９５１ １１　５’　−ＧＧＣＣコＡＣＣＴＣＴＴ丁ＣＣＣ−３，（５３９２６、ト、ブ ストランド）＃２　５’　−ＧＧＡＡＴＧＣＣ二３１ＺＡＡＣＧＧ　−３’　（ ５３９２６、ボト、ニド、アト）宙工ｌ ＃３　５’　−ＧｆＧＧＡＡＴロＧ二ＧＣＣＡＴＣＧＴＧＡＡＣＡＣＧ　−３′ （５３９２６・ボトムストランド）！、Ｊｊｌ ＩＧ　Ｂ −一−−ト　転写方向 ＥｃｏＲ／　＜　５３７７ ＥｃｏＲ／ぐ５４６０ ＥｃｏＲ／　＜　５Ｊ５Ｊ ＮＯ２，１５’　ＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＴＸＣＣＸＴＧＧＧＧＧＡＴ−３’ＮＯ ２，２５’　ＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＴＸＣＣＸＴＧＧＧＧＡＡＴ−３’ＮＯ２， ３５’　ＧＧＣＡＧＡＴＣ丁ＧＴＸＣＣＸＴＧＧＧＧＴＡＴ−３’ＮＯ２，１１ ５’　ＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＴＸＣＣＸＴＧＧＧＧＣＡＴ−３’ＡＴ　Ｔ Ｎｏ４．１　５’　ＧＴＣＣＣＧＴＧＧＧＧＸＡＴＣＡＧ−３’ＧＴ　Ｔ ＮＯ４，２５’　ＧＴＴＣＣＧＴＧＧＧＧＸＡＴＣＡＧ−３’Ａ　Ｔ　Ｔ ＮＯ４，３５’　ＧＴＣＣＣＧＴＧＧＧＧＸＡＴＣＴＣ−３’ＧＴ　Ｔ ＮＯ４，４５’　ＧＴＴＣＣＧＴＧＧＧＧＸＡＴＣＴＣ−３’ＡＡＡＴ ＣＯ３，１５’　ＣＣＣＧＣＣＡＣＧＴＧＣＧＧＣＧＴ−３’ＧＡＡＴ ＣＯ３，２５’　ＣＣＴＧＣＴＡＣＧＴＧＣＧＧＣＧＴ−３’ＡＡＡＴ ＣＯ３，３５’　ＣＣＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＧＧＣＧＴ−３’ＧＡＡＴ ＣＯ３，４５’　ＣＣＣＧＣＴＡＣＧＴＧＣＧＧＣＧＴ−３’Ｘ　＝　（Ａ、Ｔ 、Ｇ　ｏｒ　Ｃ） ５１　ＡＴＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＣ ＣＴＣＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣｌｏｌ　ＴＣＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＧ ＧＴＣＴＡＴＴＣＡＴＡＣＴＴＴＣＧＡＡＣＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡ２ ５１　ＧＡＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＴＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴ ＴＣＴＧＡ八ＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧ４０１　ＣＡＡＣＣＧＧＣＧＡＡＡＡＡＴ ＧＴＴＧＡへＡＡＧＧＡＴＴＡＴＡＴＴＧＴＣＧＧＡＴＴＴＡＡＧＴＣＡＧＧ４ ５１　ＡＧＴＧＡＡＡＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴ ＣＡＡＡＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡ５０１　ＡＡＧＴＧＧＡＣＡＭ３ＣＡＧ丁 丁ＴＡＧＡＡ丁ＣＡＴＣＡＡＣＧＣＧＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＴＡＧＡＣ５ ５１ＡＡＡＧＡＡＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＡＧＴＣＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＣＧＧ ＡＴＧＴＣＧＣＴＴＡＴＧＴＧＧＡＭＡ丁ＬＩＲＥ　ＰＲＯＴＥＡＳＥ ７０１　ＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＣＣＧＴＣＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＡＡＴＣＣＡ ＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＧＧＡＣＴＴ７５１　ＧＡＡＣＧＴＡＧＴＣＧＧＣＧ ＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＡＡＣＡＣＣＧ ８０１　ＡＣＧＧＣＡＡＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＣＡＣＡＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴ ＡＣＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＣＴＴもＡＣ３５１ＡＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＴＧＴＡ ＴＴＡＧＧＣＧＴＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＧＴＡＴＣＣＴＴＧＴＡＣＧＣＧＧＴ９ ０１　ＴＡＡＡＧＴＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧ八ＴＣ八ＴＡ ＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＧＴＡＡＧＣＧＣ ９へ１　へＧ／すＬＴＣＧＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣ八ＡＣＡＡＡＣＧＧＣＡＴＧへ ＡＴＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＧＣＣＴＴ１０５１　ＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧ ＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＴ ＣＡＧｌｌｏｌ　ＧＡＡＡＣＡＣＧＡＡＴＡＣＡＡＴＴＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧＣ ＡＡＡＡＴＡＣＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＴＣＧＣＴ１１５１　ＧＴＴＧＧＴＧＣＧ ＧＴＡＧＡＣＴＣＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＣＴ丁ＣＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣ ＧＴＣＧＧ１２０１　ＡＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧ ＧＣＧＣＡＧＧＣＧＴＡＴＡＣＡＧＣＡＣＴＴＡＣＣ１２５１ＣＡＡＣＧＡＡＣ ＡＣＴＴＡＴＧＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＣＧＧＡＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴ ＣＣＴＣＡＴ１３０１ＧＴＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴ Ｇ■０ＡＡＡＡｃＡＴｃｃＧＡＡｃＣＴＴＴｃＡＧＣＣ １：５５１　ＴＴＣＡＣＡＡＧＴＣＣＧＣＡＡＣＣＧＴＣＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣ ＧＧＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧ典菖区Ｔぶ辺Ｉ ユ旬○］　ＣＣ丁ＴＣＴＡｆ：ＴＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧ ＴＣＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＡ＾１４５１　ＣＡＴＡＴＴＣＴＡＡＣ ＡＡＡＴＡＧＣＡＴＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＣＴ ＡＧＣ１５０１ＴＴＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴ丁ＧＴＴＣＡ ＡＴＡＴＴＴ丁ＧＡＡＴＣＣＧＴＴＣＣＡＴＧＡＣ １５５１ＡＴＣＧＴＣＧ臥四延ＣＧＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧ ＡＡＡＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＧＣ１６５１ＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＧＴ ＴＣＡＡＴＣＧＣＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＢＬＡ Ｐ生産比（％） ３１　ＬＬＩＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡ、、ＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮ６ １　ＧＨＧＴ）ＩＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＵＶＬＧＶＡＰＳＡＥＬＹＡ９１　 ＶＫＶＬＧＡＤＧＲＧＡＩＳＳＩＡＱＧＬ、ＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡ１２１　Ｎ 　Ｌ　Ｓ　Ｌ　Ｇ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　Ａ　Ｔ　Ｌ　Ｅ　Ｑ　Ａ　Ｖ　Ｎ　Ｓ 　Ａ　Ｔ　Ｓ　ＲＧ　Ｖ　Ｌ　Ｖ　Ｖ　Ａ　Ａ１５］　５ＧＮＳＧＡＳＳＩＳＹ ＰＡＲＹＡＮＡｌ’１ＡＶＧＡ丁ＤＱＮＮＮＲ１８］　ＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤ ＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳ２１１　ＬＮＧＴＳＭＡＴＰ）（ＶＡ ＧＡＩＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩ２４］ＲＮ　ＨＬ　Ｋ　Ｎ　Ｔ　Ａ　丁Ｓ 　Ｌ　Ｇ　Ｓ　Ｔ　Ｎ　Ｌ　Ｙ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｌ　Ｖ　Ｎ　Ａ　Ｅ　Ａ　Ａ　Ｔ 　Ｒアミノ酸配列 ２２Ｎ　５Ｅ　１９Ｌ　１３Ｐ　７Ｙ ６Ｄ　３勾Ｇ　５Ｋ　３１Ｓ、　２４Ｖ国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）ＤＳＭ５４８３か らの、約１１２アミノ酸残基から約３８０アミノ酸残基までのアミノ酸配列が実 質的にＦＩＧ．１に示したアミノ酸配列を有する、マチュアーなアルカリ性タン パク質分解酵素と、少なくともひとつのバチルス・リッシェニフォルミス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ・Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ５３９２６からの他のタ ンパク質分解酵素を含有する組成物。 ２．転写の方向に、バチルス・リッシェエフォルミスＡＴＣＣ５３９２６アルカ リ性プロテアーゼプロモーター、リボソーム結合部位、 および第１項記載のバチルス・レンツスＤＳＭ５４８３からのタンパク質分解酵 素をコードするマチュアー領域と操作可能なようにリンクしているプレープロ領 域に、操作可能なようにリンクしている開始コドンを含有する調節領域を有する ＤＮＡ配列を持つ、バチルス内で複製できるハイブリッドプラスミド。 ３．第１項記載のバチルス・レンツスＤＳＭ５４８３からのタンパク質分解酵素 をコードするマチュアー領域と操作可能なようにリンクしているバチルス・リッ シェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアーゼ転写ターミネータ ーをさらに含有している第２項記載のハイブリッドプラスミド。 ４．バチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６アルカリ性プロテアー ゼ遺伝子のカルボキシ末端部をさらに含有し、その転写ターミネーターが第１項 記載のバチルス・レンツスＤＳＭ５４８３からのタンパク質分解酵素をコードす るマチュアー領域と操作可能なようにリンクしている、第２項記載のハイブリッ ドプラスミド。 ５．第１項記載のバチルス・レンツスＤＳＭ５４８３からのタンパク質分解酵素 のプレープローマチュアー形をコードする、単離したＤＮＡ配列。 ６．実質的にＦＩＧ．１３に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミドｐ ＣＢ５５Ｃ。 ７．実質的にＦＩＧ．１４に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミドｐ ＣＢ５６Ｃ。 ８．実質的にＦＩＧ．１５に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミドｐ ＣＢ５８Ｃ。 ９．実質的にＦＩＧ．１６に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミドｐ ＣＢ７５Ｃ。 １０．実質的にＦＩＧ．１７に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミド ｐＣＢ７８Ｃ。 １１．実質的にＦＩＧ．１８に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミド ｐＣＢ５０Ｎ。 １２．実質的にＦＩＧ．１９に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミド ｐＣＢ５１Ｎ。 １３．実質的にＦ１Ｇ．２０に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミド ｐＣＢ５３Ｎ。 １４．実質的にＦＩＧ．２１に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミド ｐＣＢ７０Ｎ。 １５．実質的にＦＩＧ，２２に示した切断地図を有するハイブリッドプラスミド ｐＣＢ７３Ｎ。 １６．第６項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチルス 宿主細胞。 １７．第７項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチルス 宿主細胞。 １８．第８項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチルス 宿主細胞。 １９．第９項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチルス 宿主細胞。 ２０．第１０項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチル ス宿主細胞。 ２１．第１１項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチル ス宿主細胞。 ２２．第１２項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチル ス宿主細胞。 ２３．第１３項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチル ス宿主細胞。 ２４．第１４項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチル ス宿主細胞。 ２５．第１５項記載のハイブリッドプラスミドを含有する形質転換されたバチル ス宿主細胞。 ２６．宿主細胞がバチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６である、 第１６項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ２７．宿主細胞がバチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６である、 第１７項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ２８．宿主細胞がバチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６である、 第１８項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ２９．宿主細胞がバチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６である、 第１９項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ３０．宿主細胞がバチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６である、 第２０項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ３１．福生細胞がバチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６である、 第２１項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ３２．宿主細胞がバチルス・リッシェニフォルニスＡＴＣＣ５３９２６である、 第２２項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ３３．宿主細胞がバチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６である、 第２３項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ３４．宿主細胞がバチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６である、 第２４項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ３５．宿主細胞がバチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６である、 第２５項記載の形質転換されたバチルス宿主細胞。 ３６．第１項記載の酵素をコードする遺伝子を有するプラスミドで形質転換され た、バチルス・リッシェニフォルミスＡＴＣＣ５３９２６を栄養培地で培養し、 この酵素を回収する、第１項の酵素の製造方法。 ３７．プラスミドがｐＣＢ５５Ｃである、第３６項記載の方法。 ３８．プラスミドがｐＣＢ５６Ｃである、第３６項記載の方法。 ３９．プラスミドがｐＣＢ５８Ｃである、第３６項記載の方法４０．プラスミド がｐＣＢ７５Ｃである、第３６項記載の方法。 ４１．プラスミドがｐＣＢ７８Ｃである、第３６項記載の方法。 ４２．プラスミドがｐＣＢ５０Ｎである、第３６項記載の方法。 ４３．プラスミドがｐＣＢ５１Ｎである、第３６項記載の方法。 ４４．プラスミドがｐＣＢ５３Ｎである、第３６項記載の方法。 ４５．プラスミドがｐＣＢ７０Ｎである、第３６項記載の方法。 ４６．プラスミドがｐＣＢ７３Ｎである、第３６項記載の方法。 ４７．実質的にＦＩＧ．２９に示したアミノ酸配列を有する、マチュアーなアル カリ性タンパク質分解酵素と、少なくともひとつのバチルス・リッシェニフォル ミスＡＴＣＣ５３９２６からの他のタンパク質分解酵素を含有する組成物。 ４８．ＡＴＣＣ５３９２６の受け入れ番号で寄託している株のすべての特徴を有 するバチルス・リッシェニフォルミス株の生物学的に純粋な培養物。 ４９．ＤＳＭ５４８３の受け入れ番号で寄託している株のすべての特徴を有する バチルス・レンツス株の生物学的に純粋な培養物。 ５０．第１項記載のアルカリ性タンパク質分解酵素を界面活性剤とをともに含有 する組成物。 ５１．界面活性剤が直鎖アルキルベンゼンスルホネート、エトキシル化直鎖アル コール、アルキルエトキシル化サルフェート、硫酸化直鎖アルコールあるいはこ れらの組み合わせからなる群から選択される、第５０項記載の組成物。