JPH0419562A

JPH0419562A - 免疫アッセイ用希釈剤

Info

Publication number: JPH0419562A
Application number: JP12126290A
Authority: JP
Inventors: Koichi Sakano; 阪野　公一; Hirofumi Matsuyama; 浩文松山
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 1990-05-14
Filing date: 1990-05-14
Publication date: 1992-01-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の技術〕本発明は、免疫アッセイ用希釈剤、さらに詳しくは長期
間の常温保存が可能であり各種血清や抗体の非特異的吸
着を抑制する免疫アッセイ用希釈剤に関するものである
。

〔従来の技術〕

近年、免疫測定法が広く用いられるようになり、人の臨
床検査や診断、動物の病気の診断、又多くの分野の研究
に応用されている。この免疫測定法、例えば酵素免疫測
定法やラジオイムノアッセイでは、固体支持体、例えば
ポリスチレン等のマイクロプレートに抗原、抗体等を固
定しておき、この固体支持体を、分析対象としての抗体
、抗原等を含有する分析試料と接触せしめることにより
固体支持体に固定された抗原、抗体等と分析試料中の抗
体、抗原等とを特異的に結合せしめるが、この場合、固
体支持体表面上に存在する遊離結合基と分析試料中の分
析対象とが非特異的に結合し、これが測定誤差の原因と
なる。この非特異的結合を防止する手段として、固体支
持体をブロッキング剤によりコートして遊離結合基を飽
和せしめる方法に加えて、血清等の分析試料を、非特異
的結合を抑制する物質を含有する希釈剤により希釈する
方法が用いられている。

後者の方法としては、希釈基剤としてのリン酸緩衝液（
ＰＢＳ）に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したもの
や、これにさらに界面活性剤を添加したものが用いられ
ている。しかしながら、これらの希釈剤でも非特異的結
合を抑制する効果は必ずしも十分ではなく、また、ＢＳ
Ａは腐敗しやすく、濾過滅菌等の滅菌が必要であり、長
期間常温での保存に適さないという欠点があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明は、腐敗せず長期間の保存および滅菌操
作が簡単で、各種血清や抗体の非特異反応を抑制する優
れた希釈剤を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究の結
果、免疫アッセイ用希釈剤としてポリビニールアルコー
ルを用いることにより上記課題が達成されることを見い
だし本発明を完成するに至ったのである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明において使用するポリビニールアルコール（以下
ＰＶＡと略す）としては、通常平均重合度が１００〜１
００００　、好ましくは２００〜３０００である。

またＰＶＡの鹸化度は通常５０％〜９９．９％、このま
しくは、７０〜９９．９％である。また、このＰＶＡを
希釈剤中の成分として使うときの濃度は、通常０．０１
〜２０％、好ましくは、０．０５〜１０％である。ただ
し、ＰＶＡの分子量が大きくなると水に対する溶解度が
悪くなり、その場合はその濃度の上限は飽和溶解度とす
る。

このＰＶＡを使用する際、溶媒に溶解して用いられるが
、その溶媒としては、水、燐酸緩衝溶液、燐酸緩衝生理
食塩水等があり、又これらの液に対する濃度の上限は飽
和溶解度である。

免疫測定法としては、酵素免疫測定法、ラジオイムノア
ッセイ法、蛍光免疫アッセイ法、発光免疫アッセイ法、
ラテックス凝集法等が挙げられる。

例えば酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、及び発光免疫
測定法では、プラスチックプレート、プラスチックビー
ズ等の固体支持体に対象となる抗原を、吸着したのちブ
ロッキング剤を吸着させ、これに希釈剤で希釈した測定
対象の血清等を加え、固体支持体に固定された抗原に血
清中の抗体を結合させ、この抗体に結合する標識抗体を
希釈剤で希釈した液を加え、さらに基質を加え、吸光、
蛍光、又は発光を測定することにより測定がなされる。

ラジオイムノアッセイ法では、プラスチックプレートや
プラスチックビーズに対象となる抗原を吸着した後ブロ
ッキング剤を吸着させ、これに血清希釈剤で希釈した測
定対象の血清を加え抗原に抗体を結合させ、抗体に結合
するラジオアイソトープ標識抗体を希釈剤で希釈した液
を加え、結合したラジオアイソトープ量を測定する。ラ
テックス凝集法ではラテックス微粒子に抗原を吸着した
のちブロッキング剤を吸着させこれに希釈剤で希釈した
測定対象の血清を加え、凝集の変化を見ることにより診
断する。

この測定対象としては、組織、細胞、細菌、かび、マイ
コプラズマ、ウィルス、デオキシリボ核酸、タンパク質
、多糖、脂質、タンパク質に結合した各種ハプテン（抗
生物質、ホルモン等の低分子化合物）等を用いることが
出来る。血清としては、人、馬、牛、豚、羊、山羊、兎
、鶏、犬、猫、ラット、マウス等の血清が利用できる。

この中でもとりわけ非特異反応の出やすい鶏からの血清
による病気の診断に有用であり、たとえば鶏アデノウィ
ルス、鶏痘ウィルス、伝染性ファブルスキー嚢病ウィル
ス、伝染性気管支炎ウィルス、伝染性鼻気管炎ウィルス
、鶏インフルエンザウィルス、マレック病ウィルス、ニ
ュウカツスル病ウィルス、パラミクソ病ウィルス、鶏レ
オウィルス、ロタウィルス、クラミジア、ボルデテーラ
、細胞内皮腫症ウィルス、鶏白血病うレスパスツェラ、
マイコプラズマ、サルモネラ、雛白痢、コクシジウム、
ロイコチトゾーンあげられる。人では各種血清診断等ま
たその他動物の診断として牛の病気では、イバラキ病、
伝染性鼻気管炎、アデノウィルス感染症、流行熱、アカ
バネ病、牛ウィルス性下痢症、牛痘、炭そ病、豚の病気
では、豚コレラ、伝染性胃腸炎、豚バルボウィルスに有
用である。

この希釈剤は血清の希釈だけでなく抗体や標識抗体の希
釈にも有用である。この希釈剤の効果により、非特異的
なタンパク質例えば抗体の吸着を防ぐことが出来、より
正確な診断が可能となるものである。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ＰＶＡを用いることにより、腐敗せず
、常温保存が可能で、オートクレーブ滅菌が出来、各種
血清、抗体の非特異反応を抑制する優れた免疫アッセイ
用希釈剤を提供するものである。このＰＶＡを用いるこ
とにより、例えば血清診断を正確に出来るようになる。

〔実施例〕

次に、本発明にかかわる実施例をあげるが、本発明の主
旨に反しない限り、これらの実施例に限定されるもので
はない。

実施例１゜９６穴マイクロプレート　（フロララボラトリーズ社製
）の各ウェルにブロッキング剤として、ＰＶＡ（重合度
５００、鹸化度８８％）をＰＢＳ中に０．５％の濃度で
溶解したものを加え、室温で３０分放置した。液を捨て
、ＰＢＳで２回洗浄した。

希釈剤中の添加物として、次の第１表に示すＰＶＡを使
用した。

第　　１　　表これらのＰＶＡを第２表に示す濃度でＰＢＳに溶解して
希釈剤を調製した。次に、この希釈剤により鶏の雌血清
を３００倍に稀釈し、その５０ｄを各ウェルに加え、３
０分間放置した。なお、この鶏の血清は、各種ワクチン
を投与した２２週令の雌の鶏の血液から得たものである
。各ウェルから液を除き、ＰＢＳで３回洗浄した。西洋
ワサビのペルレオキシダーゼ標識兎抗鶏ＩｇＧ血清（マ
イルス　ラボラトリーズ社）を０．７％牛血清アルブミ
ンを含むＰＢＳで１／２０００に希釈し、各ウェルに５
０７’加え、３０分放置した。その抜液を除き、ツイー
ン２０を０．０２％含むＰＢＳで６回洗浄した。ついで
、２・２′−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリ
ン−６−スルフォンサン）アンモニウム塩溶液（以下Ａ
ＢＴＳと略す）と過酸化水素溶液の１：１混合液を５０
１１１ずつ各ウェルに加え室温で１時間放置した後、光
度計にて４０５ｎｍの吸光度を測定した。

この結果を第２表に示す。

比較例１゜実施例１と同様にし、但し希釈剤としてＰＶＡに代え、
第２表に示す緩衝液、血清アルブミン、又は界面活性剤
を加え、実施例１と同様な手順により吸光度を測定した
。結果を第２表に示す。

第　　２　　表以上の結果、試料３（０，１％、０．５％）、試料４（
０，１％、０．５％）で吸光度が０．０５以下であり、
その他の試料では高い吸光度を示した。これらのことか
ら、試料３、試料４は血清の非特異反応を抑え、希釈剤
として好ましいことが判明した。

これに対して、界面活性剤や塩の添加では吸光度が０．
１以上と高く、従来より一般的に用いられている血清ア
ルブミンでさえ、吸光度が０．０７以上であり、好まし
い希釈剤はみられなかった。

実施例２及び参考例２゜実施例１及び参考例１を反復した。但し、ブロッキング
剤としてＰＶＡ０代りに牛血清アルブミンの０．７％Ｐ
ＢＳ溶液を使用した。この結果を第３表に示す。

第３表本発明の試料３、試料４及び試料５で吸光度が低く、Ｂ
ＳＡをブロッキング剤としたときでも、これらのＰＶＡ
は血清の非特異反応を抑え希釈剤どして好ましいことが
判明した。これに対し、従来技術のアルブミン、塩又は
界面活性剤の添加においては吸光度が高く、非特異反応
の抑制効果が小さい。

以上の実施例１及び２並びに比較例１及び２の結果から
明らかなように、一般に本発明の希釈剤用のＰＶＡとし
ては、重合度５００〜２０００の範囲内では、鹸化度９
８．５％未満のもの、例えば鹸化度９５％以下のもの、
例えば鹸化度９０％以下のものが好適に使用される。

実施例３゜抗原の調製及びマイクロプレートへの固定マイコプラズ
マガリセプチカム　Ｃ３Ｆ７株を改変チャノック培地（
ＣＨＡＮＯＣＨ培地）で３日間培養し、培養液を遠心分
離（１５０００ｒｐｍ）　した。沈澱物を生理食塩水に
懸濁しさらに遠心分離を行い洗浄した。

この洗浄操作を３回行った。培養液濃度の５倍濃縮液１
ｍｊ！に対しドデシルスルフオン酸ナトリニウム（ＳＯ
３）　０．１％ＰＢＳ溶液を１ｍｊ２加え３０℃にて１
時間振とうした。その後、この液を遠心分離（１５００
０ｒｐｍ）　Ｌ、上澄みを菌濃度が培養液濃度の１／２
０になるように炭酸緩衝液により希釈して抗原溶液を調
製した。この抗原溶液を９６穴マイクロプレート　（フ
ロララボラトリーズ社製）の各ウェルに５０４’ずつ加
え、室温で２時間放置し、液を捨てＰＢＳで２回洗浄し
て抗原を固定したプレートを作製した。

ブロッキング剤のコーティングブロッキング剤として、ＰＶＡ　（重合度１０００　；
鹸化度９８．５％）をＰＢＳに０．５％で溶解したもの
を２０ＯＩずつ各ウェルに加え、室温で３０分間放置し
た後、液を捨てた。

血清試料との反応各ウェルに各種希釈剤で３００倍に希釈した鶏の雌血清
又はマイコプラズマにより免疫した鶏の雄の血清を５０
４を入れ、３０分放置した。この鶏の雌の血清は、各種
ワクチンを投与した２２週令の雌の鶏の血液から得たも
のであり、マイコプラズマで免疫した鶏の血清は雛をマ
イコプラズマ−完全アジュバントで免疫後、５週間たっ
た雄の鶏から採血した血液から分離したものである。各
ウェルから液をのぞき、ＰＢＳで３回洗浄した。

西洋ワサビのペルオキシダーゼ標識兎抗鶏ＩｇＧ血清（
マイルス　ラボラトリーズ社）を０．７％の牛血清アル
ブミンを含むＰＢＳで１／２０００に希釈し、各ウェル
に５０１１１加え、３０分放置した。その投波を除き、
ツイーン２０を０．０２％含むＰＢＳで６回洗浄した。

ついで、ＡＢＴＳ溶液と過酸化水素溶液の１：１混合液
を５０ｉｄずつ各ウェルに加え室温で１時間放置した後
、光度計にて４０５ｎｍの吸光度を測定した。この結果
を第４表に示す。

比較例３゜実施例２と同様にして、但し希釈剤のＰＶＡに代え、第
４図に示す緩衝液、血清アルブミン、又は界面活性剤を
加え、実施例３と同様な手順により吸光度を測定した。

この結果を第４表に示す。

第４表以上の結果、実施例１で好ましい希釈剤と判明した試料
３（０，１％、０．５％）、及び試料４（０，１％、０
．５％）では、免疫鶏の吸光度と未免疫、鶏の吸光度の
比が約１０程度と高く、抗原を吸着したときにおいても
好ましい結果が得られた。

これに対して、比較例１で比較的効果のあった血清アル
ブミンにおいて、免疫鶏と未免疫鶏との吸光度が約９と
高い値を示したが、界面活性剤や塩の添加では吸光度の
比が非常に小さかった。

実施例４及び比較例４゜実施例３及び比較例３を反復した。但し、ブロッキング
剤としてＰＶＡ溶液の代りに牛血清アルブミンの０．７
％ＰＢＳ溶液を使用し、血清の希釈を１００倍とし、基
質を添加して２０分後に吸光度を測定した。この結果を
第５表に示す。

第５表以上の結果、実施例２で好ましい希釈剤と判明した試料
３、試料４及び試料５では、免疫鶏についての吸光度と
未免疫鶏についての吸光度の比が約６程度と高く、抗原
を吸着した場合にも好ましい結果が得られた。これに対
して、アルブミン、塩や界面活性剤の添加では吸光度の
比が非常に小さく希釈剤としては好ましくないことが判
明した。

実施例５゜実施例１と同様のＰＶＡをＰＢＳに溶かし、密封して室
温で放置し、その外観の変化を観察した。

用いたＰＶＡはすべて６力月を経過しても外観上の変化
はみられなかった。結果を第６表に示す。

比較例５゜比較例１と同様の希釈剤をＰＢＳに溶かした液を、密封
し、その外観を観察した。約１カ月経過後に血清アルブ
ミンにおいて沈澱の形成がみられた。結果を第６表に示
す。

第表

Claims

【特許請求の範囲】１、ポリビニールアルコールを含有してなる免疫アッセ
イ用希釈剤。２、前記ポリビニールアルコールが重合度２００〜３０
００、及び鹸化度７５〜９９．９％を有する請求項１に
記載の免疫アッセイ用希釈剤。３、前記ポリビニールアルコール濃度が０．０１〜２０
％である請求項１に記載の免疫アッセイ用希釈剤。