JPH04213058A

JPH04213058A - 免疫アッセイ用希釈剤

Info

Publication number: JPH04213058A
Application number: JP41281990A
Authority: JP
Inventors: Koichi Sakano; 阪野　公一; ▲高▼田　青史; Aoshi Takada; Hirofumi Matsuyama; 浩文松山
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 1990-12-05
Filing date: 1990-12-05
Publication date: 1992-08-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の技術〕本発明は、免疫アッセイ用希釈剤、さらに詳しくは各種
血清や抗体の非特異的吸着を抑制する免疫アッセイ用希
釈剤に関するものである。

〔従来の技術〕

近年、免疫測定法が広く用いられるようになり、人の臨
床検査や診断、動物の病気の診断、又多くの分野の研究
に応用されている。この免疫測定法、例えば酵素免疫測
定法やラジオイムノアッセイでは、固体支持体、例えば
ポリスチレン等のマイクロプレートに抗原、抗体等を固
定しておき、この固体支持体を、分析対象としての抗体
、抗原等を含有する分析試料と接触せしめることにより
固体支持体に固定された抗原、抗体等と分析試料中の抗
体、抗原等とを特異的に結合せしめるが、この場合、固
体支持体表面上に存在する遊離結合基と分析試料中の分
析対象とが非特異的に結合し、これが測定誤差の原因と
なる。この非特異的結合を防止する手段として、固体支
持体をブロッキング剤によりコートして遊離結合基を飽
和せしめる方法に加えて、血清等の分析試料を、非特異
的結合を抑制する物質を含有する希釈剤により希釈する
方法が用いられている。後者の方法としては、希釈基剤
としてのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）を添加したものや、これにさらに界面活性剤を
添加したものが用いられている。しかしながら、これら
の希釈剤でも非特異的結合を抑制する効果は必ずしも十
分ではないという欠点があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明は、各種血清や抗体の非特異反応を抑制
する優れた希釈剤を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究の結
果、免疫アッセイ用希釈剤としてポリビニールアルコー
ル及び牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いることにより
上記課題が達成されることを見いだし本発明を完成する
に至ったのである。以下、本発明を詳細に説明する。本
発明において使用するポリビニールアルコール（以下Ｐ
ＶＡと略す）としては、通常平均重合度が１０〜１００
００、好ましくは２００〜３０００、さらに好ましくは
５００〜２０００である。またＰＶＡの鹸化度は通常５
０％〜９９．９％、好ましくは、６０〜９５％、さらに
好ましくは７０〜９０％である。また、このＰＶＡを希
釈剤中の成分として使うときの濃度は、通常０．０１〜
２０重量％、好ましくは、０．０５〜１０重量％である
。ただし、ＰＶＡの分子量が大きくなると水に対する溶
解度が悪くなり、その場合はその濃度の上限は飽和溶解
度とする。また、希釈剤中のＢＳＡの濃度は０．０１〜
１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。これ
らのＰＶＡ及びＢＳＡを使用する際、溶媒に溶解して用
いられるが、その溶媒としては、水、燐酸緩衝溶液、燐
酸緩衝生理食塩水等があり、又これらの液に対する濃度
の上限は飽和溶解度である。免疫測定法としては、酵素
免疫測定法、ラジオイムノアッセイ法、蛍光免疫アッセ
イ法、発光免疫アッセイ法、ラテックス凝集法等が挙げ
られる。例えば酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、及び
発光免疫測定法では、プラスチックプレート、プラスチ
ックビーズ等の固体支持体に対象となる抗原を吸着した
のちブロッキング剤を吸着させ、これに希釈剤で希釈し
た測定対象の血清等を加え、固体支持体に固定された抗
原に血清中の抗体を結合させ、この抗体に結合する標識
抗体を希釈剤で希釈した液を加え、さらに基質を加え、
吸光、蛍光、又は発光を測定することにより測定がなさ
れる。ラジオイムノアッセイ法では、プラスチックプレ
ートやプラスチックビーズに対象となる抗原を吸着した
後ブロッキング剤を吸着させ、これに血清希釈剤で希釈
した測定対象の血清を加え抗原に抗体を結合させ、抗体
に結合するラジオアイソトープ標識抗体を希釈剤で希釈
した液を加え、結合したラジオアイソトープ量を測定す
る。ラテックス凝集法ではラテックス微粒子に抗原を吸
着したのちブロッキング剤を吸着させこれに希釈剤で希
釈した測定対象の血清を加え、凝集の変化を見ることに
より診断する。この測定対象としては、組織、細胞、細
菌、かび、マイコプラズマ、ウイルス、デオキシリボ核
酸、タンパク質、多糖、脂質、タンパク質に結合した各
種ハプテン（抗生物質、ホルモン等の低分子化合物）等
を用いることが出来る。血清としては、人、馬、牛、豚
、羊、山羊、兎、鶏、犬、猫、ラット、マウス等の血清
が利用できる。この中でもとりわけ非特異反応の出やす
い鶏からの血清による病気の診断に有用であり、たとえ
ば鶏アデノウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性ファブルス
キー嚢病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉
頭気管炎ウイルス、鶏インフルエンザウイルス、マレッ
ク病ウイルス、ニュウカッスル病ウイルス、パラミクソ
病ウイルス、鶏レオウイルス、ロタウイルス、クラミジ
ア、ボルデテーラ、細胞内皮腫症ウイルス、鶏白血病ラ
レスパスツエラ、マイコプラズマ、サルモネラ、雛白痢
、コクシジウム、ロイコチトゾーンあげられる。

人では各種血清診断等またはその他動物の診断として牛
の病気では、イバラキ病、伝染性鼻気管炎、アデノウイ
ルス感染症、流行熱、アカバネ病、牛ウイルス性下痢症
、牛痘、炭そ病、豚の病気では、豚コレラ、伝染性胃腸
炎、豚パルボウイルスに有用である。この希釈剤は血清
の希釈だけでなく抗体や標識抗体の希釈にも有用である
。この希釈剤の効果により、非特異的なタンパク質例え
ば抗体の吸着を防ぐことが出来、より正確な診断が可能
となるものである。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ＰＶＡ及びＢＳＡを用いることにより
、各種血清、抗体の非特異反応を抑制する優れた免疫ア
ッセイ用希釈剤を提供するものである。このＰＶＡ及び
ＢＳＡを用いることにより、例えば血清診断を正確に出
来るようになる。

〔実施例〕

次に、本発明にかかわる実施例をあげるが、本発明の主
旨に反しない限り、これらの実施例に限定されるもので
はない。

実施例１．マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｉｃｏｐｌａｓｍ
ａ　　ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）を改変チャノック
培地（ＣＨＡＮＯＣＨ培地）で３日間培養し、培養液を
遠心分離（１５０００ｒｐｍ）した。沈澱物を生理食塩
水に懸濁しさらに遠心分離を行い洗浄した。この洗浄操
作を３回行って得た沈澱物を炭酸緩衝液で培養液濃度に
対し１／１００に希釈し、９６穴マイクロプレート（フ
ロウラボラトリーズ社製）の各ウエルに５０μｌずつ加
え、室温で２時間放置し、液を捨てＰＢＳで２回洗浄し
た。ついで、ブロッキング剤として、ＢＳＡの燐酸緩衝
溶液を加え、室温で３０分放置した後、液を捨て、ＰＢ
Ｓで２回洗浄した。各ウエルにＰＶＡ（重合度５００、
鹸化度８８％）とＢＳＡの燐酸緩衝溶液で１／３００に
希釈した鶏のマイコプラズマ感染雌鶏血清５検体または
未感染雌鶏血清５検体５０μｌをいれ、３０分放置した
。各ウエルから液を除き、ＰＢＳで３回洗浄した。西洋
ワサビのペルオキシダーゼ標識兎抗鶏ＩｇＧ血清（マイ
ルス　　ラボラトリーズ社）を、０．７％牛血清アルブ
ミンを含むＰＢＳで１／４０００に希釈し、各ウエルに
５０μｌ加え、３０分放置した。その後液を除き、ツイ
ーン２０を０．０２％含むＰＢＳで６回洗浄した。つい
で、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾ
リン−６−スルホン酸）アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）溶
液と過酸化水素溶液の１：１混合液を５０μｌずつ各ウ
エルに加え室温で３０分放置した後、光度計にて４０５
ｎｍの吸光度を測定した。この結果を第１表に示す。

比較例１．実施例１と同様の方法を行ったが、検体の希釈剤として
、ＰＶＡ及びＢＳＡの両者を含有する溶液に代えてＢＳ
Ａのみを含有する溶液を用いた。この結果を第１表に示
す。

実施例２．実施例１と同様の方法を行ったが、検体用希釈剤中に使
用するＰＶＡとして、ＰＶＡ（重合度５００、鹸化度８
８％）の代わりにＰＶＡ（重合度１０００、鹸化度８８
％）を用い、その他はすべて同じ条件とした。この結果
を第２表に示す。

実施例３．実施例１と同様の方法を行ったが、検体用希釈剤中に使
用するＰＶＡとして、ＰＶＡ（重合度５００、鹸化度８
８％）の代りにＰＶＡ（重合度２０００、鹸化度８８％
）を用い、その他はすべて同じ条件である。この結果を
第３表に示す。

実施例４．実施例１と同様の方法を行ったが、検体中に使用するＰ
ＶＡとして、ＰＶＡ（重合度５００、鹸化度８８％）の
代りにＰＶＡ（重合度１０００、鹸化度９９％）を用い
、その他はすべて同じ条件である。この結果を第４表に
示す。

以上の結果、ＰＶＡ−ＢＳＡ混合溶液では、未感染系と
感染鶏の吸光度の比が高く、約１０倍となっている。Ｐ
ＶＡとしては鹸化度９９％のものより８８％のものの方
が望ましい。これにたいして、ＢＳＡの単独溶液では未
感染鶏と感染鶏の吸光度の比が２〜６倍と低い値を示し
た。

Claims

【特許請求の範囲】

１．　　ポリビニールアルコール及び牛血清アルブミン
を含有してなる免疫アッセイ用希釈剤。
２．　　前記ポリビニールアルコールが重合度１０〜１
０，０００、及び鹸化度５０〜９９．９％を有する請求
項１に記載の免疫アッセイ用希釈剤。
３．　　前記ポリビニールアルコール濃度が０．０１〜
２０重量％であり、そして前記牛血清アルブミン濃度が
０．１〜５重量％である請求項１に記載の免疫アッセイ
用希釈剤。