JPH04197182A - アルカリプロテアーゼＹａ酵素をコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡを用いたアルカリプロテアーゼＹａの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は耐アルカリ性及び耐界面活性剤性に優れ、洗浄
力の改善に寄与しうるＹａ酵素（特開昭６１−２８０２
７８号）の遺伝子をコードするＤＮＡ断片及び該断片を
含むプラスミドを導入した微生物を用いてＹａ酵素を製
造する方法に関する。

〔従来の技術〕

耐アルカリ性及び耐界面活性剤性に優れたＹａ酵素は、
通常のアルカリプロテアーゼが失活するような高ｐ）Ｉ
液体洗浄剤に配合した場合でも、蛋白質分解活性を保持
し、洗浄力の向上に寄与する能力を有している。Ｙａ酵
素は、バチルス・エスピー　Ｙ株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｓｐ、　Ｙ）　（微工研菌寄第８０８８号）を培養する
ことにより、その培養物中に見いだすことができるが、
通常の培養を行なってもその生産量は低くこの状態では
工業的レベルでの計算は困難と言わざるをえない。

一般に、バチルス属が生産するアルカリプロテアーゼの
生産性を向上させるためには、化学物質、紫外線照射等
による変異処理等を用いた菌株の育種や培養条件の改良
等を行ない、生産性を向上させることが試みられている
。ところが菌株または製造物の種類によってその効果の
程度は様々であり、偶然性によるところが大きい。そこ
で合理的かつ理論的に生産性の高まる製造方法、すなわ
ち遺伝子組換え技術を用いたＹａ酵素の製造方法が望ま
れている。

また好アルカリ性細菌であるバチルス・エスピー　Ｙ株
は、アルカリ性の培地で培養を行なうために、栄養源の
変質や培養液の着色等の様々な不都合が生じる。そのた
め中性付近での培養が可能になれば、培養工程や精製工
程の簡略化が可能となり工業生産において有利である。

〔発明が解決しようとする課題〕

Ｙａ酵素の生産性を高めるためには、バチルス・エスピ
ー７株を用いた従来の変異処理法を主体とした育種法で
は不十分な点がある。そこで本発明は、遺伝子組換え技
術を用いることによりＹａ酵素の生産性の向上に利用で
きるＹａ酵素をコードする遺伝子を提供すること、及び
該遺伝子を用いてＹａ酵素の生産性を向上させうる方法
を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、Ｙａａ素生産菌よりＹａａ素遺伝子を単離し
、その塩基配列を決定することにより、又Ｙａ酵酵素遺
伝子方Ｙａ酵素のプロモーターからシグナルペプチド、
前駆体領域、成熟酵素領域及びターミネータ−までをコ
ードする領域を含むＤＮＡ断片を適当な宿主菌に導入す
ることによりＹａ酵素を生産し、さらにはプロモーター
領域（以下、プロモーター領域とは一般的に大腸菌等で
定義されるコンセンサス配列に加えて構造遺伝子の直前
にあるＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｎｏａ列を含む転写及び
翻訳に関与する５′末端非翻訳領域とする。）を、その
宿主菌において効率よく作動するような他の遺伝子由来
のプロモーター領域に置換することによりＹａ酵素を高
生産化できることを見出し、該知見に基づいて完成され
た。

本発明に係るＹａａ素遺伝子は、第１図に示す塩基配列
とアミノ酸配列を有する。この配列中には、転写、翻訳
開始に関する領域、前駆体領域と成熟蛋白領域とが含ま
れ、このうち、２０３残基目〜６３５残基目のアミノ酸
配列が成熟タンパク質に相当し、本発明において重要で
ある。つまり、本発明によれば上記２０３〜６３５　（
成熟酵素領域）残基の上流に位置するプロモーター領域
、分泌のための領域等を公知の手段により他の蛋白質を
コードする遺伝子のそれらと置換し、より効率的にＹａ
酵素を製造することができる。この際、本発明では、２
０３〜６３５残基の上流に位置するブロモ−多−領域を
バチルス属細菌で強力に機能するようなプロモーター領
域をもった遺伝子、例えばバチルス属細菌由来の中性又
はアルカリプロテアーゼ又はアミラーゼ遺伝子のプロモ
ーター領域で置換したＤＮＡをプラスミドに導入し、こ
れをバチルス属細菌に導入することによって、中性領域
（ｐＨ６〜８近辺）で培養することによりＹａ酵素を効
率的に製造することができる。

第１図に示す塩基配列は、Ｙａａ素遺伝子のクローニン
グにより決定できた。ここで用いるクローニング法とし
ては、Ｙａ酵素をコードする遺伝子をクローニングでき
る方法であればいかなる方法でも構わないが、例えば下
記に示すような大腸菌を宿主菌として、バチルス・エス
ピー　Ｙ株染色体のＤＮＡ断片を保持する組換え体を作
製し、Ｙａ酵素をコードする遺伝子と相補的なりＮＡを
利用したハイブリダイゼーション法によってＹａａ素遺
伝子をクローニングすることができる。

Ｙａａ素生産菌、例えばバチルス・エスピー７株からＹ
ａ酵素を精製し、必要に応じてトリプシン消化等により
得られたＹａａ素断片等を用いてアミノ酸配列を決定し
、このうち好適なアミノ酸配列に対応する一重鎖オリゴ
ヌクレオチドをＤＮＡプローブとして合成することがで
きる。

次に、Ｙａａ素生産菌より染色体ＤＮＡを抽出する。用
いる菌株としてはＹａ酵素を生産する菌株であればいか
なる菌株でも構わないが、例えばバチルス・エスピー　
Ｙ株があげられる。染色体ＤＮＡを抽出する方法として
はサイトウーミウラの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｓ、Ａｃｔａ、　７２．　６１９（１９６３））等に
よって調製することができる。

このように取得した染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ。

ＸｂａＩなどの制限酵素を用いて断片化し、アガロース
ゲル電気泳動に供し、合成したＤＮＡプローブを用いて
サザンハイプリダイゼーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ、　２ｎｄ　Ｅｄｉｔ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ）１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　９．３１　（１９８９）　）を行ない、Ｄ
ＮＡプローブの相補性及びその相補するＤＮＡ断片の大
きさを特定する。染色休園ＤＮＡを消化する制限酵素は
、他の制限酵素であっても構わない。ＤＮＡプローブは
Ｔ３２ｐ−ＡＴＰを用いることによって標識することが
できる。

次に特定したＤＮＡ断片を回収する。回収方法はどのよ
うな方法でも構わないが、例えばＤＩＥＡＥペーパー法
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２　ｎｄ　Ｅ
ｄｉｔ、、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　　６．２４（１９８
９）＞を用いてそのＤＮＡ断片を回収することができる
。

さらに回収したＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとを連結す
る。そのＤＮＡ断片を消化した制限酵素と同じ制限酵素
認識部位を持つベクターＤＮＡ。

例えばｐＢＲ３２８、ｐＵｃ１１８などを同一の制限酵
素で消化する。さらにアルカリフォスファターゼで脱燐
酸したのち同一の制限酵素認識部位を有するＤＮＡ断片
とＴ４リガーゼにより連結することができる。この反応
物をＨａｎａｈａｎの方法（ＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖ
ｏｌ、　１　１ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、　１０９（１
９８５））に準じて大腸菌に導入することができる。

形質転換を行なった菌株の中からＹａ酵素遺伝子を保持
する菌株を選択する。選択方法にはコロニーハイブリダ
イゼーション法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　
２　ｎｄ　Ｅｄｉｔ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ−ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、１．
９０　（１９８９）　）等、様々な方法を用いることが
できるが、例えば形質転換を行なった各菌株よりアルカ
リ−３ＤＳ法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　２
　ｎｄ　Ｅｄｉｔ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒ−ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、１．２５
　　（１９８９）　）を用いてＤＮＡを抽出し、前記と
同様にサザンハイプリダイゼーションを行ない、ＤＮＡ
プローブと相補する組換えプラスミドを保持する菌株を
選択することによりＹａ酵素遺伝子を保持する形質転換
株を取得することができる。

取得したＹａ酵素遺伝子の塩基配列はＳａｎｇｅｒらの
方法等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ　７４゜５４６３　（１９７７））により決定する
ことができる。さらにその塩基配列によってＹａ酵素の
アミノ酸配列を解明することができる。

本発明のＤＮＡ配列は天然のＤＮＡ配列のみに限定され
るめではなく、本発明により明らかにされたＹａ酵素の
アミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も含まれる。

また、本酵素の特徴である耐界面活性剤性及び耐アルカ
リ性等のＹａ酵素の機能を損なわない限りにおいて本発
明のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列に人為的な挿入、欠失
、置換等を行なうことにより改造することは可能であり
、本発明にはそのような変異遺伝子及び改質酵素蛋白質
も含まれる。

Ｙａ酵素遺伝子を発現させるために、Ｙａ酵素遺伝子を
適当な宿主菌に導入する。宿主菌としては、大腸菌、バ
チルス属、シュウトモナス（Ｐｓｅｕｄｏｉｏｎａｓ）
属等の細菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
）属、サッカ０フイセス（Ｓａｃｃｈａｒ−ｏｍｙｃｅ
ｓ）属、キャンシダ（Ｃａｎｄ　１ｄａ）属等の微生物
があげられるが他の宿主菌でも構わない。例えばバチル
ス属を宿主菌とした場合、Ｙａ酵素遺伝子を分断するこ
となく消化する制限酵素と同じ制限酵素でベクタープラ
スミド、例えばｐＵＢｌｌｏ、ｐＢＤ６４等を消化し、
これとＹａ酵素遺伝子をＴ４’Ｊガーゼを用いて連結さ
せる。この反応物をプロトプラスト法（Ｓ、　　Ｃｈａ
ｎｇ、　　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

１６８．１１１　　（１９７９））を用いてバチルス属
細菌に導入することができる。Ｙａ酵素遺伝子を含む　
ＤＮＡを導入した宿主菌を培養し、その培養物よりＹａ
酵素を取得する。Ｙａ酵素の発現の確認及びその発現量
はウェスタン・プロッティング、蛋白質分解力の測定等
により行なうことができる。

Ｙａ酵素の生産性を増大させるためには、プロモーター
領域を宿主菌にとって効率のよいプロモーター領域と交
換して発現させることにより、生産性を増大させること
ができる。例えばバチルス属細菌を宿主菌とした場合に
は、バチルス属細菌由来の中性またはアルカリプロテア
ーゼ遺伝子のプロモーター領域、アミラーゼ遺伝子のプ
ロモーター領域等が好都合である。例えばＹａ酵素遺伝
子由来のプロモーター領域をバチルス・ライヘンホルミ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）
由来のアミラーゼ遺伝子のプロモーター領域に交換する
。そして、例えばプロモーター領域後方部分に部位特異
的変異法を用いて制限酵素認識部位、例えばＢｃｌｌ認
識邪位等を作製し、制限酵素を用いたプロモーター領域
の切除及びＴ４リガーゼを用いた連結等を行なうことに
よりプロモーター領域の交換を行なうことができる。さ
らにプロモーター領域の交換を行なったＹａ酵素遺伝子
をバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ）に導入し、培養を行なうことによりＹａ酵素
を生産させる。これによりもとのＹａ酵素遺伝子由来の
プロモーター領域を用いた場合に比べて生産性を増大さ
せることができる。

上記に示す手法によりプロモーター領域を交換したＹａ
酵素遺伝子を含むプラスミドを保持するバチルス・サチ
ルスを用いてＹａ酵素の極めて高い生産性を獲得す、る
ことができる。

上記バチルス・サチルスは、上記バチルス・サチルスが
生育できる培地であればいずれでもかまわないが、例え
ば炭素源としてグルコース、澱粉、糖蜜等、窒素源とし
てはペプトン、ポリペプトン８１大豆粉、コーンステイ
ープリカー等、さらにミネラル等を含む培地を用いて温
度３０−４０℃、５０−１００時間培養することができ
る。また培養物から陰イオン交換クロマトグラフィー、
ゲルろ過等により、Ｙａ酵素を精製できる。

以下に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例　１ サザンハイプリダイゼーション Ｙａ酵素のＮ末端領域のアミノ酸配列をアプライド・バ
イオ・システムズ社（ＡＢＩ社）製プロテインシークエ
ンサー３７７Ａを用いて決定した。

結果は以下に示す通りであった。

Ｎ’　−ＡｓｎＡｓｐＶａｌＡｌａＡｒｇＧｌｙｌｌｅ
ＶａｌＬｙｓＡｌａＡｓｐＶａｌＡｌａＧｌｎＡｓｎＡ
ｓｎＴｙｒＧｌｙ Ｙａ酵素の中央部ないしＣ末端領域のアミノ酸配列を解
析するため、トリプシン消化により得られた試料を用い
て同様の操作を行なった。その結果を以下に示す。

Ｎ’　−ＬｙｓＴｙｒＡｌａＴｙｒＭｅｔＧｌｙＧｌｙ
ＴｈｒＳｅｒＭｅｔＡｌａＴｈｒこれらの解析結果より
イノシン法に基いて以下に示すオリゴヌクレオチドＤＮ
ＡをＡＢＩ社製ＤＮＡ合成装置３８１Ａを用いて作製し
た。

ＡＴ プローブＮ：　５’　ＣＣＡＴＡ　ＴＴ　ＴＴ　ＴＧＩ
ＧＣＩＡＣＡＴＣＩＧＣ３’ＧＣ Ｔ プローブＣ：　５’　ＧＴＩＣＣＩＣＣＣＡＴＡＴＡＩ
ＧＣＴＡ　ＴＴ　３’Ｃ 上記プローブについては、ｒ　−”Ｐ−ｄＡＴＰ（アマ
ジャム社製）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製）を用いて５′末端を３２ｐで標識した。

バチルス・エスピー　Ｙ株をＮａｚＣ０３１０ｇ／ｌを
含むブイヨン培地（極東製薬社製）２０〇−を含む坂ロ
フラスコに植菌し、３０℃で終夜培養した。菌体的２ｇ
を取得し、サイトウーミウラの方法に準じて染色体ＤＮ
Ａを２．８　ｍｇ調製した。

このＤＮＡｌ０／ＪｇをＥｃｏＲＩ（制限酵素はすべて
宝酒造製）またはＸｂａＩで消化後アガロースゲル電気
泳動に供し、先に調製したプローブＮを用いてサザンハ
イプリダイゼーションを行なった。

その結果、ＥｃｏＲＩで消化した染色体ＤＮＡ断片では
、約２．８にｂｐのＤＮＡ断片が、またＸｂａｌで消化
した断片では約１．２　ＫｂｐのＤＮＡ断片がハイブリ
ダイズした。さらに同操作をプローブＣについても行な
ったところ、ＥｃｏＲＩで消化した染色体ＤＮＡ断片で
は約２．　ＯＫｂｐのＤＮＡ断片が、またＸｂａＩで消
化した断片では約１．２　ＫｂｐのＤＮＡ断片がハイブ
リダイズした。

クローニング 前述の染色体ＤＮＡ２００μｇをＥｃｏＲＩで消化後ア
ガロースゲル電気泳動に供し、約２．８　ＫｂｐのＤＮ
Ａ断片をＤＥＡＥペーパー法を用いて２０μｇ回収した
。また約２．　ＯＫｂｐのＤＮＡ断片についても同様の
操作を行ない２０μｇ回収した。染色体ＤＮＡ　２００
μｇをＸｂａｌで消化し同様の操作を行ない約１．２　
ＫｂｐのＤＮＡ断片を１０μｇ回収した。ｐＢＲ３２８
（ベーリンガー社製）１μｇをＥｃｏＲＩで消化しアル
カリフォスファターゼ（ベーリンガー社製）で脱燐酸後
、フェノール抽出、すなわちフェノール−、クロロホル
ム混液（１：１）を加え蛋白質変性を行ない、遠心分離
後土浦を回収する操作を行なった。さらにエタノール沈
澱、すなわち０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４
，８）及び２倍量のエタノールを加え一８０℃１０分冷
却後遠心分離によりＤＮＡを回収する操作を行なった。

このうち０．２μｇと前述の約２、８　ＫｂｐのＥｃｏ
ＲＩ断片０．０５μｇをライゲーションキット（宝酒造
社製）を−用いて連結した。この反応物をハナハンの方
法に準じて大腸菌Ｈ８１０１株に導入した。生育した形
質転換体５００株よりアルカ！Ｊ−３ＤＳ法を用いてＤ
ＮＡを抽出し、前記のプローブＮを用いてサザンハイプ
リダイゼーションを行なった。その結果プローブＮとハ
イブリダイズするプラスミド　ｐＹＴｌｏｌ（第２図）
を見いだし、そのプラスミドを保持する菌株を取得した
。さらに約２　ＫｂｐのＥｃｏＲＩ断片についても前述
のプローブＣを用いて同様の操作を行ない、プローブＣ
とハイブリダイズするプラスミドｐＹＢ２　（第３図）
を見いだし、そのプラスミドを保持する菌株を取得した
。また、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）１μｇをＸｂａＩ
で消化しアルカリフォスファターゼで脱燐酸後、フェノ
ール抽出、エタノール沈澱を行なった。このうち０．２
μｇと前述の約Ｌ　２　ＫｂのＸｂａＩ断片０．０５μ
ｇをライゲーションキットを用いて連結し、同様の操作
をプローブＮを用いて行なった。その結果プローブＮと
ハイブリダイズするプラスミドｐＹＸ１（第４図）を見
いだし、そのプラスミドを保持する菌株を取得した。

塩基配列の決定 取得したプラスミドｐＹＴ１０１、ｐＹＢ２及びｐＹＸ
ｌのＹａ酵素遺伝子の一部をｐＵｃ１１８及びｐＵｃ１
１９（宝酒造社製）にサブクローニングし、宝酒造社製
のマニュアルに従って１重鎮ＤＮＡを調製した。この１
重鎮ＤＮＡとα−３ＳＳ−ａｃｒｐｉアマジャム社製＞
　３７　Ｔ　Ｂ　ｑ　／ｍｍｏｌ）及びＳ［ＥＱＵＥＮ
ＡＳε　（東洋紡社製）を用いて塩基配列の決定を行な
った。この結果得られた塩基配列を第１図に示す。２１
８ｂｐから２１２２ｂｐに存在するオーブン・リーディ
ングフレームより解明されたアミノ酸配列には、前述の
Ｙａ酵素のプロネンシークエンサーによるアミノ酸配列
の解析により確認されたアミノ酸配列と一致する配列が
２０３残基目からと４４８残基目からに見いだせる。ま
たＮ末端が２０３残基目から始まることから、１訳開始
から２０２残基目までが前駆体領域であり、２０３残基
目以降が成熟酵素を構成する領域と判断される。

実施例　２ プロモーターの取得 バチルス・ライヘンホルミスＬＢ８９０７株をブイヨン
培地２００−を含む坂ロフラスコに植菌し、３０℃で終
夜培養を行ない、菌体的１ｇを取得し、サイトウーミウ
ラの方法に準じて染色体ＤＮＡを２．０■調製した。こ
のうち５０μｇをＥｃｏＲＩで消化し、フェノール処理
、エタノール沈澱を行なった。ｐＵｃ１１８　１μｇを
ＥｃｏＲＩで消化後アルカリフォスファターゼを用いて
脱燐酸し、フェノール処理、エタノール沈澱を行ない、
このうち０．２μｇと染色体ＤＮＡのＥＣ０ＲＩ断片０
．０５μｇをライゲーションキットを用いて連結し、こ
の反応物をハナハンの方法に準じて大腸菌ＪＭＩ　０９
株に導入した。生育した形質転換体を１％サツマイモデ
ンプン（純正化学社製）を含むＬ培地（バタトトリブト
ンＬｏｇ／Ｉ、バクトイ−ストエキス５ｇ／Ｌ　Ｎａ（
１５ｇ／Ｌバクトアガー２０ｇ／ｌ、アンピシリン　１
０■／１゜ｐＨ７，２）に植菌し３７℃で約４０時間培
養した。

その結果形質転換体２０００株より、デンプンを分解す
る、即ちアミラーゼ遺伝子を有する菌株を１株取得した
。この菌株が保持するプラスミドｐＴＡ１　（第５図）
のプロモーター領域の塩基配列を実施例１に準じて決定
し、その結果を第６図に示す。

Ｙａ酵素を発現しうるプラスミドの作製プラスミドｐＹ
８２　５０μｇをＥｃｏＲＩ及び５ｐｈＩで渭化しＤＥ
ＡＥペーパー法を用いて約２ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収
した。そのうち０．０ｂｐｇと、あらかじめＥｃｏＲＩ
、５ｐｈＩで消化・しアルカリフォスファターゼを用い
て脱燐酸処理後、フェノール処理、エタノール沈澱を行
ない回収したｐＵｃ１１８　０．２μｇをライゲーショ
ン・キットを用いて連結した。この反応物をハナハンの
方法に準じて大腸菌ＪＭＩ　Ｏ９株に導入した。生育し
た形質転換体の中から第７図に示すｐＵＣ１１８ＥＳを
保持する菌株を取得した。ｐＹＴｉｏｌ　５０μｇをＥ
ｃｏＲＩで消化しＤＥＡＥペーパー法を用いて約２．７
にｂｐ−のＤＮＡ断片を回収した。そのうち０．０ｂｐ
ｇと、あらかじめＥｃｏＲＩで消化しアルカリフォスフ
ァターゼを用いて脱燐酸処理後、フェノール処理、エタ
ノール沈澱を行ない回収したｐＵｃ１１８Ｅ３０．２μ
ｇをライゲーション・キットを用いて連結した。この反
応物をハナハンの方法に準じて大腸菌ＪＭ１０９株に導
入し、生育した形質転換体の中から第７図に示すｐＴＢ
３を保持する菌株を取得した。

ＡＢＩ社製ＤＮＡ合成装置３８１Ａ型を用いて下記に示
すＤＮＡプローブ（第１図の１１８１−１２１０ｂｐに
対応）を合成し、 ５’　−ＣＣＡＡＧＡＧＴＴＡＧＴＡＴＧＧＡＴＴＣＴ
ＴＧＣＴＣＣＡＧＣ−３’宝酒造社製部位特異的変異法
キッ）　Ｍｕｔａｎ−Ｋを用いて、ｐＴＢ３のＹａ酵素
のアミノ酸配列を変えずに塩基配列を改変し、ＥｃｏＲ
ＩｉＢ位を消失させたプラスミドｐＴＢ３Ｅを取得した
。さらに下記に示すＤＮＡプローブ（第１図の２００−
２２９ｂｐに対応）を合成し、 ５’　−ＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡ
ＡＣＴＣＣＴＣＡＴ　−３’同様にして塩基配列を改変
し、Ｙａ酵素翻訳開始コドン上流にＢｃｌＩ認識部位を
作製したプラスミド　ｐＴ８３ＥＢを取得した。

また下記に示すＤＮＡプローブを合成し、（第６図の２
１６−２４５ｂｐに対応）を合成し、５’　−ＴＧＴＴ
ＧＴＴＴＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＣＣＣＣＴＴＴＣＡ
Ａ　−３’同様にしてｐＴＡｌの塩基配列を改変し、プ
ロモーター領域下流にＢａ１ｌ認識部位を持つプラスミ
ドｐＴＡＩＢを作製した。

ｐＵｃ１１８　１ＪＪｇをＥｃｏＲＩで消化し７ＪＬ。

カリフォスファターゼで脱燐酸後、フェノール処理、エ
タノール沈澱を行ない回収した。このうち０．２μｇと
あらかじめＥｃｏＲＩで消化し、フェノール処理、エタ
ノール沈澱を行い回収したｐＵ８１１００．０ｂｐｇを
ライゲーションキットを用いて連結した。この反応物を
ハナハンの方法に準じて大腸菌ＪＭＩ　０９株に導入し
た。生育した形質転換体の中から第８図に示すプラスミ
ドｐＵＢ８１を保持する菌株を取得した。ｐＴＢ３Ｅ　
　５μｇをＥｃｏＲＩで消化し、フェノール処理、エタ
ノール沈澱を行なった後、フレノウフラグメント（宝酒
造社製）を用いてＤＮＡ末端を平滑化した。

さらにフェノール抽出、エタノール沈澱を行い、このう
ち０．２μｇと５ｐｈＩリンカ−にューイングランドバ
イオラブ社製）５０ｎｇをライゲーションキットを用い
て連結した。この反応物をハナハンの方法を用いて大腸
菌ＪＭＩ　Ｏ９株に導入した。

生育した形質転換体のうちＳ　ｐｈ　Ｉ　＃Ｉｌ織部位
が新たに作製されたプラスミドｐＴ８３ＥＳ　（第８図
）を保持する菌株を取得した。ｐＴＢ３Ｅ３　５０μｇ
を５ｐｈＩで消化し、ＤＥＡＥペーパー法を用いて４．
６にｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片０．
０ｂｐｇと、Ｓ　ｐｈ　Ｉで消化し、フェノール抽出、
エタノール沈澱を行なったｐＵＢ８１０．２μｇとをラ
イゲーションキットを用いて連結した。この反応物をプ
ロトプラスト法を用いてバチルス・サチルス１０１２株
に導入した。生育した形質転換体のうち第８図に示すプ
ラスミドｐＨＢ８Ｙを保持する菌株を取得した。

ｐＴＡＩＢ５０μｇをＥｃｏＲＩ及びＢｃｌＩで消化し
、ＤＥＡＥペーパー法を用いて約Ｉ　ＫｂｐのＤＮＡ断
片を回収した。ｐＴ８３Ｅ８１μｇをＥｃｏＲＩ及びＢ
ｃｌＩで消化しアルカリフォスファターゼで脱燐酸後、
フェノール抽出、エタノール沈澱を行ない回収した。こ
のうち０．２μｇと前記のｐＴＡＩＢ由来のＩＫｂｐＤ
ＮＡ断片０．０５μｇとをライゲーション・キットを用
いて連結した。

この反応物をハナハンの方法に準じて大腸菌ＪＭ１０９
株に導入した。生育した形質転換体のうち第９図に示す
プラスミドｐＡＹ１を保持する菌株を取得した。

ｐＡＹｌ　　５０μｇをＳ　ｐｈ　Ｉ、さらにベクター
側の７ラグメントを分断するためＸｍｎＩで消化し、Ｄ
ＥＡＥペーパー法を用いて約３．５　ＫｂのＤＮＡ断片
を回収した。ｐＵ８８１　１μｇを５ｐｈｌで消化しア
ルカリフォスファターゼで脱燐酸後、フェノール抽出、
エタノール沈澱を行ない回収した。

このうち０．２μｇと前述したｐＡＹ１由来の３．５Ｋ
ｂ　　ＤＮＡ断片０．０５μｇをライゲーションキット
を用いて連結した。この反応物を、プロトプラスト法を
用いてバチルス・サチルス１０１２株に導入した。生育
した形質転換体のうち第９図に示すプラスミドｐＵＢ８
Ａを保持する菌株を取得した。

Ｙａ酵素の発現 ｐＵＢｌｌｏ、ｐＵＢ８ＹＳｐＵＢ８Ａを保持するバチ
ルス・サチルス１０１２株の形質転換体を以下に組成を
示す培地（溶性澱粉９０ｇ／ｌ、ポリペプトンＳ（大五
栄養社製）５０ｇ／Ｉ、に２ＨＰＯ４５ｇ／Ｉ　５Ｍｇ
５Ｏ＜　　・７　Ｈ２００，２ｇ／Ｌ硫酸カナマイシン
５０■／Ｉ、ｐＨ７，５）を含む坂ロフラスコに植菌し
３３℃にて９０時間培養した。培養上清のアルカリプロ
テアーゼ活性はアンソン−萩原の変法（ｔ（ａｇｉｗａ
ｒａ、　Ｂ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　４５．　１８８　　（１９５８）
　）に準じて測定した。すなわち３５℃、ｐＨ１０，５
の条件下で１０分間反応し、１分間にチロシン１μｇ相
当量を遊離させる酵素量を１アル力リプロテアーゼ単位
（ＡＰＵ）とした。各培養上清のアルカリプロテアーゼ
活性の結果を表−１に示す。ｐＵＢ８Ｙを保持する形質
転換体のアルカリプロテアーゼの生産量は、ｐＵＢｌｌ
ｏを保持する形質転換体に比べて約３倍高く、またｐＵ
Ｂ８Ａを保持する形質転換体は、ｐＵ８８Ｙを保持する
形質転換体に比べて約３０倍の高いＹａ酵素の生産性を
示した。

表　　　　１ ＡＰ［Ｉ／ｒｎｌ Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１０１２　（ｐＵＢ
８Ｙ）　８５０（ｐＵＢ８Ａ）　２５４００ （ｐＬＩＢｌｌｏ）　３２０

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｙａ酵素遺伝子の構造遺伝子領域の塩基配列
およびそれに対応するアミノ酸配列である。 第２図は、Ｙａ酵素遺伝子のうち構造遺伝子のＮ末端側
及びプロモーター領域を保持するプラスミドｐＹＴ１０
１の制限酵素切断地図である。 第３図は、Ｙａ酵素遺伝子のうち構造遺伝子Ｃ末端側及
びターミネータ−領域を保持するプラスミドｐＹＢ２の
制限酵素切断地図である。 第４図は、Ｙａ酵素遺伝子のうち構造遺伝子中央部を保
持するプラスミドｐＹＸ１の制限酵素切新地図である。 第５図は、バチルス・ライヘンホルミスＬＢ８９０７よ
り単離したアミラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＴ
Ａ１の制限酵素切断地図である。 第６図は、バチルス・ライヘンホルミスＬＢ８９０７よ
り単離したアミラーゼ遺伝子のプロモーター領域近傍の
塩基配列およびそれに対応するアミノ酸配列である。 第７図は、ｐＹＴｌｏｌとｐＹＢ２のＹａ酵素遺伝子の
領域を連結したプラスミドｐＴＢ３の作製行程図である
。 第８図は、ｐＴＢ３のうちＹａ酵素遺伝子の領域をバチ
ルス属細菌で複製可能なプラスミドｐＵＢＩＩＯに連結
したプラスミドｐＵ８８Ｙの作製行程図である。 第９図は、ｐＴＢ３ＥＢのＹａ酵素遺伝子のプロモータ
ー領域をｐＴＡＩＢのアミラーゼ遺伝子のプロモーター
領域に交換し、バチルス属細菌で複製可能なプラスミド
ｐＵＢ１１０に連結したプラスミドｐＵＢ８Ａの作製行
程図である。 Ｂａ　：　ＢａｍＨＩ　　　　　Ｂｃ　：　ＢｃｌＩＢ
ｇ　：ＢｇｌＩ　Ｉ　　　　　Ｃ：Ｃ１ａＩＥ　　　：
ＥｃｏＲＩ　　　　　Ｈ：Ｈｉｎｃ　　Ｉ　　ＩＫ　　
　：ＫｐｎＩ　　　　　　Ｐ　　−ニーＰｓｔＩＳ　　
　：　５ｐｈＩ　　　　　　Ｘｂ　：ＸｂａＩＸｍ：Ｘ
ｍｎ１ へＰ：アルカリフォスファターゼ ＭＣ３：マルチクローニングサイト Ａｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子 ’ｌ’ｃ’：テトラサイクリン耐性遺伝子ｏｒｉ：複製
領域。 肱 （Ｂ） Ｅ　　　　　　　　　　　Ｂａ　　　Ｃ×’　　ＨＥ第
２図 関 第３図 第４図 第５図 第　６　図アミラーゼ・ブロモ−゛ター遺伝子の塩基配
列ＣＡＡＣＧＴＣＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡ
ＧＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡ
ＧＧＣＴＡＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴ＜
：Ａ　ＧＣＴＴＧＡＡ　ＧＡＡＧＴＧ　ＡＡＧＡＡＣＧ
ＡＧＡＧＡＧＧ　ＣＴ　ＡＴＴＧ　ＡＡＴＡ　ＡＡＴ@
ＧＡ　ＧＴＡ ＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＡＴＣＧＣＴＴＴＴＣＴ　ＴＴ
ＴＧＧＡ　ＡＧＡＡＡＡＴ　ＡＴＡＧＧＧＡ　ＡＡＡＴ
ＧＧＴＡＴＴＴＧＴ　ＴＡＡ`Ａ ｅｔＬｙｓ ＡＴＴＣＴＧＡＡ　ＴＡＴＴＴＡＴ　ＡＣＡＡＴＡＴ　
ＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧ
Ｇ　ＡＧＡＡＴＣＡ　ＴＧＡ`Ａ Ｇ　Ｉ　ｎＧ　ｌ　ｎＬｙｓＡ　ｒｇＬｙｓＴｙ　ｒＡ
　Ｉ　ａＡ　ｒｇＬｅｕ　ＬｅｕＰ　ｒｏＬｅｕ　Ｌｅ
ｕ　ＰｈｅＡ　Ｉ　ａＬｅｕ@ｌ　ｌ　ｅＰｈｅＬｅｕ
　Ｌｅｕ ＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＧ（ＴＴ　ＴＡＣＧＣＣＣＧＡ
ＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴ　ＧＴＴＡＴＴＴ　ＧＣＧＣＴ
ＣＡＴＣＴＴ（：Ｔ　ＴＧＣs　Ｇ ＰｒｏｌｌｉｓＳｅｒＡＩａ ＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡ ３０１　　　　３＋２ 手続補正書−友式） １．事件の表示　　　平成２年特許願第３２７１１０号
３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　　（６７６）ライオン株式会社４、代理人 ５、補正命令の日付　　　　平成３年、３月１２日を別
紙の通り補正す’２　　　　　／イ【＝〕さ、■、事件
の表示　　平成２年特許願第３２７１１０号３、補正を
する者 事件との関係　　出願人 名　称　　（６７６）ライオン株式会社４、代理人 ５、補正命令の日付　　自　　発 ６、補正の対象　　　　明細書の発明の詳細な説明の欄
間面 （１）明細書の以下の箇所を以下の通り補正する。 （２）図面の第１図　　　　　　　　　　　　　　・第
６図及び第９図を別紙の通り補正する。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルカリプロテアーゼＹａ酵素をコードするＤＮ
   Ａ。
2. （２）下記のアミノ酸配列で特定される請求項１記載の
   ＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
3. （３）下記のＤＮＡ配列で特定される請求項１記載のＤ
   ＮＡ。 【遺伝子配列があります】
4. （４）請求項１又は２のＤＮＡの上流に、中性またはア
   ルカリプロテアーゼ遺伝子の転写及び翻訳に関する５′
   末端の非翻訳領域又はアミラーゼ遺伝子の転写及び翻訳
   に関する５′末端の非翻訳領域を有する請求項１記載の
   ＤＮＡ。
5. （５）請求項１〜４のいずれか１項に記載のアルカリプ
   ロテアーゼＹａ酵素をコードするＤＮＡを含有するプラ
   スミドＤＮＡ。
6. （６）請求項５記載のプラスミドＤＮＡを導入した微生
   物。
7. （７）微生物がバチルス属細菌である請求項６記載の微
   生物。
8. （８）請求項６又は７記載の微生物を培養することによ
   り培養物からアルカリプロテアーゼＹａを採取すること
   を特徴とするアルカリプロテアーゼＹａの製造方法。
9. （９）微生物がバチルス属細菌であり、中性で培養する
   請求項８記載の製造方法。