JPH04197193A

JPH04197193A - ヌクレオシド化合物の製造方法

Info

Publication number: JPH04197193A
Application number: JP32233190A
Authority: JP
Inventors: Nobuaki Hori; 堀　伸明; Kyoko Uehara; 上原　京子
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1990-11-28
Filing date: 1990-11-28
Publication date: 1992-07-16
Anticipated expiration: 2012-01-16
Also published as: JP2572890B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、収率の高いヌクレオシド化合物の製造方法
に関する。

〔従来の技術〕

塩基の交換反応を用いてヌクレオシド化合物を製造する
方法としては、Ｎ、Ｈｏｒｌ、　Ｍ、Ｗａｔａｎａｂｅ
、　Ｙ、Ｙａａａｚａｋｌ　ａｎｄ　Ｙ、Ｍｉｋａａ＋
１．　Ａｇｒｌｃ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　５３゜１
９７　（１９８９）に報告された方法がある。この方法
は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌ
クレオシドホスホリラーゼとを用い、リン酸の存在下に
おいて、チミンとイノシンとを反応させて塩基の交換反
応を行ない、リボース−１−リン酸を中間体として５−
メチルウリジンを製造するものである。

上記反応は、以下の二つの反応よりなる。

−〉イノシン＋リン酸　　　〈− リボース−１−リン酸中ヒポキサンチン　（１）リボー
ス−１−リン酸＋チミン；＝＝寸５−メチルウリジン士
リン酸　　　　　（２）したがって、反応全体としては
、イノシン＋チミ７←−一− ５−メチルウラシル＋ヒポキサンチン　　（３）である
。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述の塩基の交換反応（３）の平衡定数Ｋｌ（Ｋｌ−［
５−メチルウリジン］　　［ヒポキサンチン］／［イノ
シン］　［チミン］）は０．２１　　（４０℃）であり
、イノシシとチミンの初期濃度が同じであれば、収率は
平衡定数に規定されるので、５−メチルウリジンの最大
収率はわずか３１％となる。これは、チミン以外の他の
塩基を用いた場合も同様であり、塩基の交換反応による
ヌクレオシド化合物の収率は低い値に止まっている。

この発明は、塩基の交換反応を利用する、収率の高いヌ
クレオシド化合物の製造方法を提供することを目的とす
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記事情に鑑み、ヌクレオシド化合物の
収率をより高めるために鋭意研究を行なった。その結果
、塩基交換により生成されるヒポキサンチンを系から除
外することによりヌクレオシド化合物をより高収率で得
る方法を見出した。

すなわち、この発明のヌクレオシド化合物の製造方法は
、イノシンおよびデオキシイノシンからなる群より選ば
れるヌクレオシドと、ピリミジン塩基およびプリン塩基
からなる群より選ばれる塩基とを、リン酸もしくはリン
酸塩存在下の水溶液中において、前記塩基がピリミジン
塩基の場合にはプリンヌクレオシドホスホリラーゼおよ
びピリーゼにより塩基交換反応させ、さらに、この塩基
交換反応により生成したヒポキサンチンをキサンチンオ
キシダーゼにより尿酸に変換させることを特徴とする。

ここで、前記ピリミジン塩基としてはウラシル、シトシ
ン、チミン、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシ
ル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−エ
チルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−
カルボキシウラシル等を、前記プリン塩基としてはアデ
ニン、グアニン、２−クロロプリン、６−クロロプリン
、２．６−ジクロロプリン、２−アミノ−６−クロロプ
リン、２．６−ジアミツプリン、６−メルカプトプリン
、６−メチルチオプリン、２−７ミノプリン等をそれぞ
れ挙げることができる。

以下、この発明のヌクレオシド化合物の製造方法を、ヌ
クレオシドと塩基交換反応を行なう塩基をピリミジン塩
基として詳細に説明する。

まず、プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、出発
物質であるイノシンまたはデオキシイノシンとリン酸も
しくはリン酸塩とから、ヒポキサンチンとリボース−１
−リン酸もしくはデオキシリボース−１−リン酸が生成
する。

次に、生成したリボース−１−リン酸もしくはデオキシ
リボース−１−リン酸が、ピリミジンヌクレオシドホス
ホリラーゼにより、ピリミジン塩基と置換反応を行なう
。これにより、リボース−１−リン酸とピリミジン塩基
との反応からピリミジンヌクレオシドが生成し、デオキ
シリボース−１−リン酸とじリミジン塩基との反応から
はピリミジンデオキシヌクレオシドが生成する。

これと同時に、反応溶液中に存在するピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼにより、逆反応として、塩基交換
反応により生成したこれらのヌクレオシドおよびリン酸
もしくはリン酸塩が、再びピリミジン塩基とリボース−
１−リン酸もしくはデオキシリボース−１−リン酸とに
分解し、系全体として平衡状態に至る。

しかしながら、この発明の方法においては、さらに、反
応溶液中にキサンチンオキシダーゼが共存している。こ
れにより、上記イノシンまたはデオキシイノシンの分解
により生成したヒポキサンチンは、酸素とキサンチンオ
キシダーゼにより不可逆的に酸化されてキサンチンを経
て尿酸となる。

生成した尿酸は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼお
よびピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの基質では
ないので、塩基の交換反応には関与せず、系から除外さ
れる。よって、化学量論的にイノシンは全てリボース−
１−リン酸と尿酸とになり、デオキシイノシンは全てデ
オキシリボース−１−リン酸と尿酸とになる。したがっ
て、イノシンまたはデオキシイノシンと塩基との初期濃
度が等しいときには、結果的にリボース−１−リン酸ま
たはデオキシリボース−１−リン酸と塩基との濃度は等
しい。よって、生成するヌクレオシドの生成量は、下式
の平衡定数にのみ依存する。

リボース−１−リン酸または　　　　　　生塩基デオキシリボース−１−リン酸ヌクレオシド −〉〈−または　　　＋リン酸デオキシヌクレオシドここで、出発物質としてイノシン、塩基としてチミンを
用いた場合を考えると、最終生成物である５−メチルウ
リジンは、上記式（２）に従って生成するので、その収
量は反応式（２）の平衡定数（Ｋ−［リボース−１−リ
ン酸コ　［チミン］／［５−メチルウリジンコ　［リン
酸］　）　　０．０８２によって規定される。すなわち
、イノシンとリン酸の初期濃度を各々ｌおよびＰとし、
イノシンとチミンの初期濃度を等しいとするとき、反応
終了時のチミンおよび５−メチルウリジンの濃度Ｔおよ
びＭは以下の式（４）および（５）によって計算するこ
とができる。

１５．１２　Ｔ２　＋　（１＋Ｐ）　Ｔ−Ｐ−１−０（
４）Ｍ　−１−Ｔ　　　　　　　　　　　　　　　（５
）ヌクレオシドと交換反応を行なう塩基がプリン塩基で
ある場合には、イノシンまたはデオキシイノシンから生
じたリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１
−リン酸とプリン塩基との置換反応は、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼによって起こる。これにより、リボ
ース−１−リン酸とプリン塩基との反応からプリンヌク
レオシドか生成し、デオキシリボース−１−リン酸とプ
リン塩基との反応からはプリンデオキシヌクレオシドが
生成する。また、この逆反応である、プリンヌクレオシ
ドまたはプリンデオキシヌクレオシドとリン酸またはリ
ン酸塩とからプリン塩基とリボース−１−リン酸または
デオキシリボース−１−リン酸が生じる反応もプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼによって起こる。したがって
、ヌクレオシドと交換反応を行なう塩基がプリン塩基で
ある場合には、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
は必要ない。

本発明に用いられるキサンチンオキシダーゼ、プリンヌ
クレオ”シトホスホリラーゼ、およびピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼは、いかなる起源のものでも構わ
ない。この発明において用いたキサンチンオキシダーゼ
は、ベーリンガー・マンハイム山之内社製の牛乳由来の
ものである。

また、この発明において用いたプリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ、およびピリミジンヌクレオシドホスホリラ
ーゼは、この２種の酵素を同時に産生ずるバチラス・ス
テアロサーモスフイルスＪＴＳ８５９より調製した。

この菌株は、通商産業省工業技術院微生物工業研究所に
寄託されており、その寄託番号は、微工研菌第９６６６
号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９６６６）である。

この菌株の菌学的性質を、パージエイズ・マニュアル第
２巻に準じて検討した結果を以下に示す。

１、形態桿菌：５．４〜Ｂ、５　、ｃｎＸ　　Ｑ、７〜０．９ｐ
楕円形の胞子形成：２．０〜２．３ρ×１．１Ｘ１．２
ｇｍ。

１細胞に１個、位置は末端２、培養的性質ＮＢ培地　＝６２℃、２日間培養平板上　　：白色、僅かに黄色を含む光沢あり不透明盛り上がらないコロニーの形は円形波状スラント上：白色、僅かに黄色を含む光沢あり不透明盛り上からない生育は中程度３、生化学的性質（１）ダラム染色　　　　　　　　陽性（２）嫌気的培
養　　　　　　　　生育せず（３）運動性　　　　　　
　　　　あり、周毛（４）オキシダーゼ　　　　　　　
陽性（５）カタラーゼ　　　　　　　　陽性（６）ゼラ
チンの液化　　　　　　液化能あり（７）リドマスミル
ク　　　　　　　凝固させる（８）ＯＦテスト　　　　
　　　　発酵タイプ（９）Ｖ−Ｐテスト　　　　　　　
陰性（１０）グルコースからのガスの発生　　　　　　　　発生せず（１１）グルコースからの酸の産生　　　　　　　　　産生じた（１２）アラビノースからの酸の産生　　　　　　　　　産生ぜず（１３）マンニトールからの酸の産生　　　　　　　　　産生した（１４）キジロールからの酸の産生　　　　　　　　　産生ぜず（１５）サブロー培地での生育スラント　　　　　　　生育した液体　　　　　　　　　生育した（１Ｂ）　０．００１％リゾチーム下での生育　　　　　　　　　生育せず（１７）　０．０２％アザイド下での生育　　　　　　　　　生育せず（１ｇ）　７％ＮａＣＩ下での生育　　　　生育せず（
２％までは生育した）（Ｉ９）カゼインの加水分解　　　　分解能あり（２０
）デンプンの加水分解　　　　分解能あり（２１）ジヒ
ドロキシアセトンの生成　　　　　　　　　　　生成せず（２２）エラグヨーク試験　　　　　生育せず（２３）
クエン酸の利用　　　　　　陰性（２４）インドールの
産生　　　　　陰性（２５）ウレアーゼ活性　　　　　
　陽性（２６）フェニルアラニンの脱アミノ化　　　　　　　　陰性（２７）アルギニンデヒドロラーゼ活性　　　　　　　　　　　陽性（２８）チロシンの分解　　　　　　陰性（２９）レバ
ンの産生　　　　　　　陰性（３０）硝酸塩の還元　　
　　　　　陽性（３１）硝酸ナトリウムの脱窒能　　　　　　　　　　陰性（３２）硫化水素の生成　　　　　　陽性（３３）無機
窒素源の利用ＮＯ，を唯一の窒素源として　　　　　　生育したＮＨ４を唯一の窒素源として　　　　　　生育した（３４）ＧＣ含量　　　　　　　　　４７．３％（３５
）生育温度　　　　　　４０〜７１”Ｃで生育最適　６
０〜６８℃ （３Ｂ）　ｐＨ範囲　　　　　　　　ｐＨ５，７〜８．
５最適ｐＨ６，０〜７．０この発明の方法において、反応液は、イノシンまたはデ
オキシイノシン、アデニン、ウラシルおよびチミンから
なる群より選ばれる塩基、リン酸もしくはリン酸カリウ
ム等のリン酸塩、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、
ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびキサン
チンオキシダーゼを含めばよい。この反応液における、
イノシンまたはデオキシイノシシの濃度は５〜ｔｏｏ　
ｓＭ、塩基の濃度は５〜１００　ｍＭ、およびリン酸も
しくはリン酸塩の濃度は５〜２０　ｓＭであることが好
ましい。イノシンまたはデすキシイノシンと塩基とは同
一濃度とし、イノシンまたはデオキシイノシシとリン酸
もしくはリン酸塩との濃度比は大きいほうがヌクレオシ
ド化合物の収率は増加する。反応液のｐＨは、７．０〜
９．０、好ましくは７．０〜８．０である。反応温度は
３５℃ないし４２℃、好ましくは３７℃ないし４０℃で
ある。

反応液からの生成物の採取は、オクタデシル基の逆層ク
ロマトグラフィーにより好適に行なうことができる。

〔実施例〕

製造例１　プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびピ
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼの粗酵素液の調製まず、バチルス・ステアロサーモフィルスＪＴＳ８５９
を、以下の手順で培養した。

菌の培養には、ペプトン２０ｇ１イーストエキス１０　
ｇ、グルコース３ｇおよび水１ｇよりなるｐＨ８，０の
培地を用いた。この培地２ｇに、バチルス・ステアロサ
ーモフィルスＪＴＳ８５９の胞子３．２Ｘ１０７個を添
加し、撹拌翼（直径８０＋ａｍ、上下部各６枚）を有す
るジャーファーメンタ−を用い、撹拌翼を８８Ｏｒｐｍ
で回転させつつ、通気量１．５　ＶＶ１％培養温度６５
℃、ｐＨ５，９〜６．２で８時間培養した。

培養終了後、菌体を遠心分離（１００００ｇ、４℃、１
５分）により集菌した。次いで、粗酵素液を以下のよう
にして調製した。

得られた湿菌１６０ｇを５００膓Ｍリン酸カリウム溶液
（ｐＨ７，０、以下単に「緩衝液」と記述する）に懸濁
し、ダイモミルで菌体を破壊した。次いで、緩衝液を添
加して全体を１４００ａｌｔとした後、遠心分離（８３
００ｇ、　２０分）を行ない、上清１３００−を得た。

沈殿物はさらに５００＠Ｉの緩衝液に懸濁して全体を１
０３０−とした後、遠心分離（８３００ｇ、　２０分）
を行ない、上清９９０−を得た。この上清９００−を先
の上清１３００−と合わせ、６３℃で１時間穏やかに撹
拌した。次いで、遠心分離（８３００，ｇ　、　４０分
）を行ない、上清２１３０−を得た。

この上清２１３０−を熱処理した後、−１０℃に冷却し
たアセトン２００−および緩衝液２００ａｌｌの混合溶
液を添加した。さらに、−１０℃に冷却したアセトンＩ
、８１を添加して５〜１０℃で工５分間撹拌した後、遠
心分Ｍ　（９０００ｇ、　　５分）を行なった。得られ
た上清に一１０℃のアセトン２．５ｇを添加して１５分
間撹拌し、遠心分離（９０００ｇ、５分）を行なって沈
殿物を得た。この沈殿物を８００−の緩衝液に懸濁させ
、アセトン処理済み粗酵素液８５０−を得た。

実施例１５＋ｎＭのイノシン、５匝翼のチミン、５ＩＩＩＭのリ
ン酸カリウム、キサンチンオキシダーゼＩＵ　、および
粗酵素液（製造例１で得られたもの）２５ｏρを含む１
−の反応液（ｐＨ７，０）を４０℃で１１時間反応させ
、反応液中に含まれる各成分の濃度を測定した。その結
果を第１図に示す。

また、キサンチンオキシダーゼを添加しないこと以外は
全て上記手順と同一の条件で反応を行ない、反応後の各
成分の濃度を測定した。その結果を第２図に示す；これらの図において、縦軸はｍＭで表わす各成分の濃度
、横軸は反応時間を示す。また、−０−はイノシン、−
・−はヒポキサンチン、−ローは５−メチルウリジン、
−■−はチミン、−ム−は尿酸、および−△−はキサン
チンをそれぞれ表わす。

第１図および第２図より′明らかなように、キサンチン
オキシダーゼが存在する場合（第１図）には、存在しな
い場合（第２図）より、生成物である５−メチルウリジ
ンの含有量が非常に高くなっている。特に、キサンチン
オキシダーゼが存在する場合には、イノシン含有量の減
少に従ってヒポキサンチと共にキサンチンおよび尿酸が
見られるようになり、平衡状態では尿酸以外のイノシン
、ヒポキサンチンおよびキサンチンの含有量がほぼ０に
なることが示されている。これは、キサンチンオキシダ
ーゼにより、はぼ全てのイノシンが酸化されたことを示
している。

具体的には、キサンチンオキシダーゼが反応系に存在す
る場合には、３　、８ｍＭの５−メチルウリジンが生成
した。存在しない場合には、５−メチルウリジンの生成
量は１．４ＥｖＭであった。

このように、キサンチンオキシダーゼの存在下において
、より高い収率で５−メチルウリジンを得ることができ
た。

実施例２１〜２０ｍＭのチミン、チミンと同じ濃度のイノシン、
５ｆｆ１Ｍのリン酸カリウム、キサンチンオキシダーゼ
４Ｕ　、および粗酵素液（製造例１で得られたもの）　
　２５０ｄを含む反応液１−を４０℃で反応さ七イノシ
ンが消失したときの５−メチルウリジンの存成量を測定
した。その結果を第３図に一争−でｊす。この収量は、
破線で示す、式（４）、（５）で割算した理論曲線と比
べて大変よい一致をみた。

実施例３および４５ｍＭのイノシン、下記第１表に示す５ｉＭの塩層５ｄ
のリン酸カリウム、キサンチンオキシダーゼ１υ、およ
び粗酵素液（製造例１で得られたもの２５０ｄを含むｌ
−の反応液（ｐＨ７，０）を４０℃で８時間反応させ、
反応液中に含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定した
。

また、キサンチンオキシダーゼを添加しないこと以外は
全て上記手順と同一の条件で反応を行ない、反応後の生
成ヌクレオシドの濃度を測定したこれらの結果を、下記
第１表に併記した。

ヒ、　　　第１表）　　　５″Ｍの２−デオキシイノシン・下記第２表に
示す５１Ｘの塩基、５ｓＭのリン酸カリウム、キサンチ
・ンオキシダーゼＩＵ　、および粗酵素液（製造例１で
得られたもの）　　２５０ｔｌＪを含む１ｗＪの反応液
（ｐＨ７，０）を４０℃で８時間反応させ、反応液中に
含まれる生成ヌクレオシドの濃度を測定した。

また、キサンチンオキシダーゼを添加しないこと以外は
全て上記手順と同一の条件で反応を行ない、反応後の生
成ヌクレオシドの濃度を測定した。

これらの結果を、下記第２表に併記した。

ｊｆｉ２表〔発明の効果〕以上のように、この発明のヌクレオシド化合物の製造方
法は、塩基交換反応を利用して、簡便に、かつ高収率で
ヌクレオシド化合物を得ることが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の実施例１における反応液中の各成分
の濃度の経時変化を示すグラフ、第２図はキサンチンオ
キシダーゼを添加しないこと以外は第１図に示すグラフ
と同じ条件における反応液中の各成分の濃度の経時変化
を示すグラフ、および第３図は実施例２におけるチミン
濃度と５−メチルウリジン生成量との関係を示すグラフ
である。第１図第２図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）イノシンおよびデオキシイノシンからなる群より
選ばれるヌクレオシドとピリミジン塩基とを、リン酸も
しくはリン酸塩存在下の水溶液中において、プリンヌク
レオシドホスホリラーゼおよびピリミジンヌクレオシド
ホスホリラーゼにより塩基交換反応させ、さらに、この
塩基交換反応により生成したヒポキサンチンをキサンチ
ンオキシダーゼにより尿酸に変換させることを特徴とす
るヌクレオシド化合物の製造方法。
（２）イノシンおよびデオキシイノシンからなる群より
選ばれるヌクレオシドとプリン塩基とを、リン酸もしく
はリン酸塩存在下の水溶液中において、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼにより塩基交換反応させ、さらに、
この塩基交換反応により生成したヒポキサンチンをキサ
ンチンオキシダーゼにより尿酸に変換させることを特徴
とするヌクレオシド化合物の製造方法。