JPH0515368A - 新規プルラナーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 酸性条件下でのｐＨ安定性に優れた新規プル
ラナーゼを提供する。 【構成】 バチルス属に属する微生物、特にバチルス
ブレビスＯＫ−１３０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１６２）
を培養することにより酸性条件下でのｐＨ安定性に優れ
た新規プルラナーゼが製造される。この酵素は例えば澱
粉からグルコースやマルトースを製造する際に有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規プルラナーゼおよび
その製造方法に関する。更に詳しくは、バチルス属に属
する微生物を培養することにより得られる新規プルラナ
ーゼおよびその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα
−１，６−グルコシダーゼは、グルコアミラーゼとの併
用により澱粉からグルコースを製造したり、またβ−ア
ミラーゼとの併用により澱粉からマルトースを製造した
りする際に、これらの糖の増収に有効であることが認め
られている。現在までに報告されているα−１，６−グ
ルコシダーゼは、例えば、エシエリヒア インターメデ
ィア（Escherichia intermedia）のイソアミラーゼ〔ア
プライド マイクロバイオロジー（Applied Microbio
l.）、１５，４９２（１９６７）〕、ストレプトコッカ
ス ミテイス（Streptococcus mitis ）のプルラナーゼ
〔バイオケミカル ジャーナル（Biochem.J.）、１０
８，３３（１９６８）〕、ストレプトマイセス属（Stre
ptomyces sp.）のイソアミラーゼ〔ジャーナル オブ
ザ ファーメンテイション テクノロジー（J.Ferment.
Tech. ）、４９，５５２（１９７１）〕、バチルス属
（Bacillussp.）のプルラナーゼ〔アグリカルチャラル
アンド バイオロジカルケミストリー（Agric.Biol.C
hem ）、４０，１５１５（１９７６）；スターチ（Star
ch）、３４，３４０（１９８２）〕などがある。しか
し、これらのα−１，６−グルコシダーゼは、温度安定
性およびｐＨ安定性に劣り、また多くはその最適温度が
４０〜５０℃程度である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一般に澱粉糖の生産
は、６０℃以上の高温で、かつｐＨ４．５以下の酸性条
件下で行われている。この様な条件下で作用するα−
１，６−グルコシダーゼとしては、バチルス アシドプ
ルリチカス（Bacillus acidpullulyticus ）［特公昭６
２−２５０３７］やバチルス セクトラマス（Bacillus
sectorramus）［特開昭６３−８４４８５］由来のプル
ラナーゼが知られているにすぎない。しかし、両者の酵
素の安定ｐＨ範囲において、ｐＨ４．５以下は範囲限界
に近いため、より酸性条件下でのｐＨ安定性に優れたα
−１，６−グルコシダーゼが求められる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、酸性側に
最適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲を有し、耐熱性であるα−
１，６−グルコシダーゼを生産する菌株を求めるために
広く自然界より検索した結果、京都府福知山市の土壌中
から採取されたバチルス ブレビス（Bacillusbrevis
）ＯＫ−１３０株が上記目的を達成するものであると
認め、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明の新規プルラナーゼは、
以下のような理化学的性質を有している。 (イ) 作用および基質特異性 プルランに作用し、主としてマルトトリオースを生成す
る。アミロペクチン、β−限界デキストリンおよび可溶
性澱粉のα−１，６−グルコシド結合を分解する。 (ロ) 最適ｐＨおよびｐＨ安定性 最適ｐＨはｐＨ５．５近傍であり、５０℃、３０分間の
加熱条件下ではｐＨ３．５〜７．０の範囲内で安定であ
る。 (ハ) 温度安定性 ｐＨ５．０において３０分間保持した場合、６０℃まで
安定である。 (ニ) 最適温度 ５５℃〜６０℃の範囲に最適温度を有する。 (ホ) 分子量 ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動による分子量は
９８０００である。 (ヘ) 等電点 等電点電気泳動による等電点は５．２である。

【０００６】本発明の新規プルラナーゼは、バチルス
（Bacillus）属菌、特にバチルス ブレビス（Bacillus
brevis ）ＯＫ−１３０株（微工研菌寄第１２１６２
号）により生産される。この菌株は以下に示すような菌
学的性質を有する。菌学的性質の試験および分類法は、
「バージェーズ マニュアル オブ ディターミネイテ
ィブ バクテリオロジー 第８版（１９７４）」および
「バージェーズ マニュアル オブ システマテイック
バクテリオロジー（１９８６）」に従って行った。 Ａ．形態 （１）細胞の形 桿菌 （２）細胞の大きさ 0.8 〜1.0 ×3.0 〜9.0 μｍ （３）運動性の有無 有 （４）胞子の有無 有 （５）グラム染色 陽性 （６）抗酸性染色 陰性 Ｂ．各培地における生育状態 （１）標準寒天平板培養 コロニーは正円形、表面はスム ーズで半透明な薄茶色。 （２）標準寒天斜面培養 表面はスムーズで半透明な薄茶 色。 （３）標準液体培養 全体的に混濁する。色素の生成 はない。 （４）標準ゼラチン穿刺培養 変化なし （５）リトマスミルク 変化なし Ｃ．生理学的性質 （１）硝酸塩の還元性 陽性 （２）脱窒反応 陰性 （３）メチルレッド試験 陰性 （４）ＶＰテスト 陰性 （５）インドールの生成 陰性 （６）硫化水素の生成 陰性 （７）澱粉の加水分解 陽性 （８）クエン酸の利用 陰性 （９）無機窒素源の利用 硝酸塩 陽性 アンモニウム塩 陰性 (10) 色素の生成 陰性 (11) ウレアーゼ活性 陰性 (12) オキシダーゼ活性 陽性 (13) カタラーゼ活性 陽性 (14) 生育温度の範囲 １０〜４
５℃ (15) 酸素に対する態度 好気性 (16) ジオキシアセトンの生成 陰性 (17) 馬尿酸の分解 陰性 (18) アルギニンの分解 陰性 (19) フェニルアラニンの脱アミノ 陰性 (20) 温度抵抗性（８５℃、１０分の耐性） 陽性 (21) 塩化ナトリウムの耐性（２％） 陰性 (22) サブロウ寒天培地における生育 陽性 (23) 0.001 ％リゾチーム培地における生育 陽性 (24) チロシンの分解 陰性 (25) クエン酸・アンモニウム寒天培地 でのアルカリ産生 陰性 (26) カゼインの分解 陰性 (27) ゼラチンの分解 陰性 (28) 嫌気性培地における生育 陰性 (29) マッコンキー培地における生育 陰性 (30) レシチナーゼ反応 陰性 (31) ＶＰ培地におけるアルカリ産生 陽性 (32) 糖類の利用と生酸性 （ａ）Ｌ−アラビノース 陰性 （ｂ）Ｄ−キシロース 陰性 （ｃ）Ｄ−グルコース 陰性 （ｄ）Ｄ−マンノース 陰性 （ｅ）Ｄ−フラクトース 陽性 （ｆ）Ｄ−ガラクトース 陽性 （ｇ）麦芽糖 陽性 （ｈ）ショ糖 陽性 （ｉ）乳糖 陽性 （ｊ）トレハロース 陽性 （ｋ）Ｄ−ソルビット 陰性 （ｌ）Ｄ−マンニット 陰性 （ｍ）イノシット 陰性 （ｎ）グリセリン 陰性 （ｏ）澱粉 陽性 （ｐ）メリビオース 陽性 （ｑ）サリシン 陽性 （ｒ）エタノール 陰性

【０００７】この微生物を培養して本発明のプルラナー
ゼを生産させるには、通常の静置培養、振盪培養、通気
攪拌培養、あるいは固体培養等により連続的あるいは間
欠的に行うことができる。用いる培地は、窒素源として
は例えば、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆
粉、コーンスチープリカ、コーンミール等の有機窒素源
の他、硫安、塩安、硝安、リン安等の無機窒素源が必要
に応じて適宜混合して、または単独で用いられる。炭素
源としては、例えば、水飴、マルトース、各種澱粉、可
溶性澱粉、澱粉液化液、デキストリン、プルラン等が必
要に応じて適宜混合して、または単独で用いられる。培
地には窒素源、炭素源の他に例えば、リン酸、Ｍｇ²⁺、
Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ｆｅ³⁺、Ｚｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎ
ａ⁺ 、Ｋ⁺ の塩や各種ビタミン類が必要に応じて適宜混
合して、または単独で用いられる。培地のｐＨは通常ｐ
Ｈ４．０〜８．０、好ましくはｐＨ５．０〜６．０が適
当である。培養の温度は通常２０〜４５℃、好ましくは
３７〜４２℃で培養するのが適当である。また培養時間
は該菌の生育およびプルラナーゼの生産に十分な時間続
行されるが、通常６〜４８時間を要する。

【０００８】このようにして培養した後、培養物を遠心
分離または濾過することによって菌体を分離して上清を
得、この上清から通常の手段、例えば塩析法、溶媒沈澱
法（例えばエタノール、アセトン等）によって蛋白質を
沈澱させたり、または限外濾過により濃縮させて本発明
のプルラナーゼを得る。塩析法、溶媒沈澱法ではプルラ
ナーゼを沈澱させ、濾過あるいは遠心分離で沈澱物を集
めた後、これを脱塩処理した物を凍結乾燥粉末とするこ
ともできる。更に上記で得られたプルラナーゼを塩析
法、溶媒沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、イオン交
換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法、アフィニティー
クロマトグラフィー法、晶出法等の通常の酵素の精製手
段を適宜組み合わせることによって比活性の向上した粗
酵素乃至精製酵素とすることもできる。

【０００９】プルラナーゼの活性測定法並びに活性表示
法は以下の通りである。即ち、０．２Ｍの酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）に溶解させた２％（ｗ／ｖ）のプルラン
溶液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌを混合し、６０℃で
３０分間反応させた後、遊離した還元性基の濃度をＤＮ
Ｓ法〔ラボラトリー イクスペリメント イン バイオ
ロジカル ケミストリー（Laboratory Experiments in
Biological Chemistry）、３４３５、（１９４４）〕に
より測定する。酵素活性の単位は、前述の条件下で１分
間に１μｍｏｌのグルコースと当量の還元性基を生成す
る酵素量を１単位とする。

【００１０】

【実施例】以下に実施例をもって、本発明の内容をより
具体的に示す。これらはいずれも本発明の内容を例示す
るものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではな
い。

【００１１】実施例 １ バチルス ブレビス（Bacillus brevis ）ＯＫ−１３０
株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１６２）をプルラン１．０％、
ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、NaCl
０．５％、MgSO₄ ・７H₂O ０．０５％、MnCl₂ ０．００
１％、CaCl₂・２H₂O ０．００５％、KH₂PO₄ ０．２
％、(NH₄)₂SO₄ ０．２％を含む培地（ｐＨ６．０）１０
ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で好気的に１６時間振盪
培養を行った。培養終了後、得られた培養物を遠心分離
（１００００ｒｐｍ、１０分間）により菌体および不溶
物を除去し、得られた培養上清を酵素液としてそのプル
ラナーゼ活性を測定した。この結果、本実施例で得られ
た酵素液のプルラナーゼ活性は５．９単位／ｍｌであっ
た。

【００１２】実施例 ２ 実施例１で述べた培地および培養方法を用いてバチルス
ブレビス（Bacillusbrevis ）ＯＫ−１３０株を３７
℃で１６時間前培養して得られる種菌液１０ｍｌを１０
リッター容のジャーファーメンター中のプルラン２．０
％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス１．０％、NaCl
０．５％、MgSO₄ ・７H₂O ０．０５％、MnCl₂ ０．０
０１％、CaCl₂ ・２H₂O ０．０５％、KH₂PO₄ ０．２
％、(NH₄)₂ SO₄ ０．２％を含む培地（ｐＨ６．０）５リ
ッターに添加し、３７℃、通気量１ｖｖｍ、攪拌回転数
５００ｒｐｍで２０時間通気攪拌培養を行った。培養終
了後、得られた培養物を１００００ｒｐｍ、４℃で連続
遠心分離して菌体および不溶物を除去した後、平均分画
分子量１００００の限外濾過膜を用いて約１０倍に濃縮
した。この上清に固形硫酸アンモニウムを３０％飽和濃
度となるように添加し夾雑物を析出させ、遠心分離によ
り除去した後、上清に固形硫酸アンモニウムを６５％飽
和濃度となるように添加し、４℃で一夜放置した。生じ
た沈澱を遠心分離により回収し、脱イオン水２００ｍｌ
に溶解させた後、脱イオン水に対して一夜４℃で透析し
た。透析後の粗酵素溶液を凍結乾燥することによって、
８１００単位／ｇのプルラナーゼ活性を持つ粗酵素粉末
４．２ｇを得た。

【００１３】実施例 ３ 実施例２で得た粗酵素粉末１ｇを１２．５ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したＤ
ＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東洋曹達製）のアニオン
交換カラムに吸着させ、０〜０．５ＭのNaClを含む１
２．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法に
よって酵素を溶出させた。溶出した活性画分は、２５ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して一夜４℃で透析し
た。次に２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化し
たα−サイクロデキストリン−エポキシセファロース６
Ｂ（ファルマシア製）のアフィニティーカラムに吸着さ
せ、０〜０．３ｍｇ／ｍｌのβ−サイクロデキストリン
を含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の濃度勾配法
によって酵素を溶出させた。溶出した活性画分は、脱イ
オン水に対して一夜４℃で透析した後、平均分画分子量
１００００の限外濾過膜を用いて５．５ｍｌに濃縮し
た。この濃縮液は、１７５単位／ｍｌのプルラナーゼ活
性を持ち、ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動によ
り１バンドであることが認められた。

【００１４】実施例 ４ 実施例３で調製した酵素試料を市販のグルコアミラーゼ
と併用して澱粉の糖化反応を行った。基質としては、コ
ーンスターチを市販液化酵素スピターゼＨＳ（ナガセ生
化学工業（株）製）でＤＥ１２に液化したものを使用し
た。糖濃度は糖化時３３重量％になる様に調製した。市
販グルコアミラーゼＸＬ−４（ナガセ生化学工業（株）
製）を液化澱粉固形分１ｇに対して３．３単位の酵素量
と本発明のプルラナーゼを液化澱粉固形分１ｇに対して
４．０単位の酵素量を加え、ｐＨ４．５、６０℃で糖化
反応を行った。糖化反応試料のデキストロース含量は、
高速液体クロマトグラフィーにより種々の時間で分析し
た。結果は、次の表１に示す。

【００１５】

【００１６】実施例 ５ 実施例３で調製した酵素試料を市販のβ−アミラーゼと
併用して澱粉の糖化反応を行った。基質としては、コー
ンスターチを市販液化酵素スピターゼＨＳ（ナガセ生化
学工業（株）製）でＤＥ１２に液化したものを使用し
た。糖濃度は糖化時３３重量％になる様に調製した。市
販β−アミラーゼ１５００（ナガセ生化学工業（株）
製）を液化澱粉固形分１ｇに対して１５．０単位の酵素
量と本発明のプルラナーゼを液化澱粉固形分１ｇに対し
て４．０単位の酵素量を加え、ｐＨ４．５、６０℃で糖
化反応を行った。糖化反応試料のマルトース含量は、高
速液体クロマトグラフィーにより種々の時間で分析し
た。結果は、次の表２に示す。

【００１７】

【００１８】

【発明の効果】本発明の酵素は、従来のα−１，６−グ
ルコシダーゼに較べて酸性側でのｐＨ安定性に優れてお
り、グルコアミラーゼとの併用により澱粉からグルコー
スを製造したり、β−アミラーゼとの併用により澱粉か
らマルトースを製造する際に、その生産性を改善するも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 足立 朋子 京都府福知山市長田野町１−52 ナガセ生 化学工業株式会社福知山工場内 (72)発明者 武貞 好昭 京都府福知山市長田野町１−52 ナガセ生 化学工業株式会社福知山工場内 (72)発明者 山内 三郎 京都府福知山市長田野町１−52 ナガセ生 化学工業株式会社福知山工場内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の理化学的性質を有する新規プルラ
   ナーゼ (イ) 作用および基質特異性 プルランに作用し、主としてマルトトリオースを生成す
   る。アミロペクチン、β−限界デキストリンおよび可溶
   性澱粉のα−１，６−グルコシド結合を分解する。 (ロ) 最適ｐＨおよびｐＨ安定性 最適ｐＨはｐＨ５．５近傍であり、５０℃、３０分間の
   加熱条件下ではｐＨ３．５〜７．０の範囲内で安定であ
   る。 (ハ) 温度安定性 ｐＨ５．０において３０分間保持した場合、６０℃まで
   安定である。 (ニ) 最適温度 ５５℃〜６０℃の範囲に最適温度を有する。 (ホ) 分子量 ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動による分子量は
   ９８０００である。 (ヘ) 等電点 等電点電気泳動による等電点は５．２である。
2. 【請求項２】 以下の理化学的性質を有する新規プルラ
   ナーゼ生産能を有するバチルス属に属する微生物を培地
   に培養し、培養物から該プルラナーゼを採取することを
   特徴とする新規プルラナーゼの製造方法。 (イ) 作用および基質特異性 プルランに作用し、主としてマルトトリオースを生成す
   る。アミロペクチン、β−限界デキストリンおよび可溶
   性澱粉のα−１，６−グルコシド結合を分解する。 (ロ) 最適ｐＨおよびｐＨ安定性 最適ｐＨはｐＨ５．５近傍であり、５０℃、３０分間の
   加熱条件下ではｐＨ３．５〜７．０の範囲内で安定であ
   る。 (ハ) 温度安定性 ｐＨ５．０において３０分間保持した場合、６０℃まで
   安定である。 (ニ) 最適温度 ５５℃〜６０℃の範囲に最適温度を有する。 (ホ) 分子量 ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動による分子量は
   ９８０００である。 (ヘ) 等電点 等電点電気泳動による等電点は５．２である。
3. 【請求項３】 バチルス属に属する微生物がバチルス
   ブレビス（Bacillusbrevis ）である請求項２記載の新
   規プルラナーゼの製造方法。
4. 【請求項４】 バチルス属に属する微生物がバチルス
   ブレビス（Bacillusbrevis ）ＯＫ−１３０株である請
   求項３記載の新規プルラナーゼの製造方法。