JPH04198196A

JPH04198196A - Ｃｐｂ―ｉの安定化方法及びこの製剤組成物

Info

Publication number: JPH04198196A
Application number: JP2328287A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Yoshizaki; 栄男吉崎; Toshimi Mizoguchi; 俊美溝口; Hiroshi Mizogami; 寛溝上; Satoshi Adachi; 聡足達
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Kowa Co Ltd
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Kowa Co Ltd
Priority date: 1990-11-28
Filing date: 1990-11-28
Publication date: 1992-07-17
Anticipated expiration: 2014-07-05
Also published as: JP2916948B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は抗血液凝固剤、皮膚・角膜疾患治療剤として有
用なＣＰＢ−１又はリコンビナントＣＰＢ−１の安定化
方法及び製剤組成物に関し、詳細には、これらの分離精
製、凍結乾燥等の操作を行う際に有用な安定化方法及び
保存安全性に優れた製剤組成物に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕ＣＰＢ
−１はヒト胎盤をはじめとする生体内の組織及び分泌液
に広く分布しくＣｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａ、　Ｂｕｌｌ
、　３８゜１９５７〜１９６０．１９９０）、また細胞
内では細胞質に存在する抗血液凝固作用等の生理活性を
有する物質である。

ＣＰＢ−Ｉはヒトあるいは動物の臓器から抽出すること
ができ（特開昭６２−１７４０２３号公報）、このよう
にして得られたＣＰＢ−１は以下の性質を有する。

■　分子量（ＳＯ３−ポリアクリル了ミドゲル電気泳動
法、還元状態）３４、０００±２．０００ ■　等電点（アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法）４．７±０．１ ■　安定性（イ）５０℃、３０分加熱処理で失活（ロ）ｐＨ４〜１０で安定（ハ）血漿中３７℃、３０分で安定 ■　血液凝固系に対する作用（イ）カルシウム回加凝固時間を延長（ロ）プロトロンビン時間を延長（ハ）活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 ■　アミノ酸分析アミノ酸分析で、了スバラギン酸、スレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、％シ
スチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン
、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン及
びアルギニンの存在が認められる。

また、ＣＰＢ−Ｉはヒト又は動物のＣＰＢ、ｆをコード
する遺伝子断片を用いて、遺伝子組換え技術により大腸
菌、酵母等で発現させることができる（特開昭６４−２
００９５号公報）。このように遺伝子組換えにより得ら
れた［’ＦＢ−Ｉ　　（以下、これを「リコンビナント
Ｃ’ＰＥｌ−４」という）は下記のアミノ酸配列を有す
る。

Ａｌａ−ＧＩｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＧＩ　ｙ−
Ｔｈｒ−シａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
　Ｉ　ｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａｒｇ−Ａ　
１ａ−Ａｓｐ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡＩａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ＧＩｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ＧＩｕ−５ｅ
ｒ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１ｅｕ−Ｔｈ
ｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　
Ｉｎ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　１ｕＪ　Ｉｅ−３ｅｒ−
Ａ　１ａ−Ａ　ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅ−ＧＩｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−しｅｕ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−５ｅｒに１ｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ＝Ｐｈｅ−ＧＩｕ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−１１ｅ−ＶａＩ−ＡＩａ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａ
ｓｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＧＩｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉ
ｓ−ＡＩａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ　１　ｙ−Ａ　１ａ−
Ｇ　１ｙ−Ｔｈ　ｒ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｌ　ｙｓ
−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇ　１　ｕ−Ｉ　ｌｅ−
Ｉ　１　ｅ−Ａ　１ａ−３ｅｒ−Ａ　ｒｇ−Ｔｈ　ｒ−
Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ　
Ｉａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　１　ｎ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ
−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇ　１　ｕ−Ｔ　ｙｒ−Ｇ
　１　ｙ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ａｓ　
ｐ−Ａ　５ｐ−Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　１−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ
ｓｐ−Ｔｈ　ｒ−３ｅｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｔｙｒ−Ｔ　ｙ
ｒ−Ｇ　１　ｎ−Ａｒｇ−Ｍｅ　ｔ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１
−Ｖ　ａ　１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　１　ｎ−Ａ　ｌ　
ａ−Ａｓｎ−Ａ　ｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａ　
１　ａ−Ｇ　１ｙ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａ　
１ａ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａ　１−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　１　ｎ−
Ａｓｐ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｎ−八１ａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−ＧＩｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−＾５ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−＾ｓｐ
−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｉ　１　ｅ−３ｅ
ｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｐｈｅ−Ｇ　１　ｎ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　
ｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｖ
ａ　１−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−３ｅｒ−１１ｅ−＾ｒｇ−
３ｅｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−３ｅｒ−＾ｒｇ−３
ｅｒ−Ｇｌｕ−１１ｅ−＾ｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ
−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａ　１　ａ−Ｔｈｒ−３ｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇ　１　ｙ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｕ
−Ａｓｐ−Ａｓｐまた、リコンビナントＣＰＢ−Ｉは大
腸菌以外にも酵母を使用しても製造することができる。

この場合、アミノ末端のアラニンにアセチル基が結合し
たアミノ酸配列となる。

このようなＣＰＢ−１又はリコンビナントＣＰＢ−１は
、液剤、ゲル化剤、軟膏、点眼液、注射剤等積々の剤形
とすることができる。

しかしながら、製剤化の過程で分離精製・凍結乾燥等を
行なう必要があり、また上記のような製剤とした後、長
期保存する必要があり、このときＣＰＢ−Ｉが重合等を
起こし、その活性が低下してしまうという欠点があった
。

従って、ＣＰＢ−ｒ又はリコンビナント［１’ＰＢ−Ｉ
の安定化方法及び安定な製剤組成物が望まれていた。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明者らは上記実状に鑑み鋭意研究を重ねた結果、Ｃ
ＰＢ−１又はリコンビナントＣＰＢ−Ｉに糖類を添加す
れば、これらの安定化を図ることができ、分離精製・凍
結乾燥等の操作を行っても、またこれを製剤化して長期
保存しても活性が低下しないことを見出し本発明を完成
した。

すなわち本発明は、ＣＰＢ−１又はリコンビナントｃｐ
ｅ−ｒに糖類を添加することを特徴とする［’ＰＢ−Ｉ
又はリコンビナント　ＣＰＢ−１の安定化方法及びＣＰ
Ｂ−■又はリコンビナント　ＣＰＢ−１及び糖類を含有
することを特徴とするＣＰＢ−Ｉ又はリコンビナントＣ
ＰＢ−Ｉが安定化された製剤組成物に関する。

本発明で用いられる糖類としては、例えば、グルコース
、グルコサミン、キシロース、サッカロース、デキスト
ランＴ〜４０等が挙げられるが注射用製剤とする場合は
グルコースが好ましい。糖類の配合量はＣＰＢ−Ｉ又は
リコンビナントＣＰＢ−１（以下、ｒ　ＣＰＢＪ等）と
いう）を含有する溶液ｌ−あたり０．４〜２０ｍｇ程度
が好ましい。なお、粉末に添加する場合の安定化剤の添
加量は、当該粉末を溶解した際に、上記の溶液濃度にな
るようにすればよい。糖類の配合量が０．４■未満であ
ると安定化が図り難く、２０■を超えて配合してもあま
り効果の向上は望めない。

糖類の添加方法は特に限定されず、ＵＰＳ−１等の溶液
に直接添加する方法、あらかじめ糖類を水又は適当な緩
衝液に溶解して添加する方法、糖類の粉末をｃｐｅ−、
ｒ等と混合せしめて水等に添加・溶解する方法等、適宜
選択すればよい。また、添加時期も特に限定されず、Ｃ
ＰＢ−１等の分離精製工程、製剤工程のいずれであって
もよい。

［：ＰＢ−１等に糖類を添加した本発明の安定化組成物
は、溶液の場合Ｏ〜３０℃、特に０〜１０℃で分離精製
、製剤化又は保存することが好ましい。また、同溶液を
凍結状態で保存する場合は０℃以下、特に−２０℃以下
とすることが好ましい。

本発明のＣＰＢ−Ｉ等含有安定化製剤組成物は、用途に
応じて種々の剤形とすることができる。例えば、抗血液
凝固剤として用いる場合は、水性注射剤等の形態とし皮
膚・角膜疾患治療剤として用いる場合は、液剤、ゲル、
クリーム、軟膏、点眼液、眼軟膏等の形態とすることが
できる。

〔発明の効果〕

本発明の方法によれば、ＣＰＢ−Ｉ等を凍結・融解、水
性媒体への溶解等の分離・精製、製剤化工程を経てもＣ
ＰＢ−Ｉ等の活性が保持される。また本発明の製剤組成
物は長期保存してもＣＰＢ−１の活性低下がなく、医薬
品として有用である。

〔実施例〕

実施例１１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解したＣＰＢ
−４６，７６ｍｇ／−に安定化剤としてグルコース、グ
ルコサミン塩酸塩、キシロース、サッカロース、デキス
トランＴ−４０の夫々を１ｒｒＬＩ！あたり各５■加え
た溶液１００μｌを一４０℃で凍結させ、室温で融解し
た。

この操作を６回繰り返した後下記測定方法により分析を
行った。結果を表１に示す。

ＨＰ　Ｌ　ＣによるＣＰＢ−１の重合体の測定あらかじ
め０．１４Ｍ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）で平衡化した東ソー社製ＨＰＬＣゲル濾適
用カラムＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷｘｔ（７，８
Ｘ　３００ｍｍ）に同上緩衝液１■／−に希釈した試料
溶液２０μｌを注入した。流速１ｍ／ｍ１１１で重合体
との分離を行い、カラムから溶出された試料の吸光度を
波長２８Ｏｒｏｎで測定し、面積値よりＣＰＢ−Ｉとそ
の重合体との割合を算出した。

以下余白表１実施例２１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解したＣＰＢ
−Ｉ６．７６■／ｄに安定化剤としてグルコースを１−
あたり０．０４〜２０ｍｇ加えた溶液１００μｌを一４
０℃で凍結させた後室温で融解した。この操作を５回繰
り返した後実施例１と同様にして分析を行った。結果を
表２に示す。

以下余白表２実施例３１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解したＣＰＢ
−１６、７６ｍｇ　／　ｒｒｄ！に安定化剤としてグル
コースを１−あたり１０■を加えた溶液について下記方
法により抗血液凝固活性の測定を行った。結果を表３に
示す。

抗血液凝固活性の測定０．５％ウシ血清アルブミン及び０．１５Ｍ　ＮａＣ１
を含む２０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）で５
及び１０μｇ／ｍｊｌ！に希釈した試料溶液１００μβ
に３０ｍＭＣａＣ１□溶液で希釈した持田製薬社製すオ
ブラスチン０，５ｍｇ／ｍｌを１００μｌ加え３７℃で
３分間ブレインキュベートした。更に、３７℃で生理食
塩水２−に溶解したオーツ社製コントロール血漿２００
μｍを加えエルマ光学社製コアグチツクＴＢ−６００を
用いて血漿が凝固するまでの時間を測定した。

表３以上

Claims

【特許請求の範囲】１、ＣＰＢ−Ｉ又はリコンビナントＣＰＢ−Ｉに、糖類
を添加することを特徴とするＣＰＢ−Ｉ又はリコンビナ
ントＣＰＢ−Ｉの安定化方法。２、ＣＰＢ−Ｉ又はリコンビナントＣＰＢ−Ｉ及び糖類
を含有することを特徴とするＣＰＢ−Ｉ又はリコンビナ
ントＣＰＢ−Ｉが安定化された製剤組成物。３、糖類がグルコース、グルコサミン、キシロース、サ
ッカロース及びデキストランから選ばれる一種又は二種
以上である請求項１記載の安定化方法。４、糖類がグルコース、グルコサミン、キシロース、サ
ッカロース及びデキストランから選ばれる一種又は二種
以上である請求項２記載の製剤組成物。