JPH0419836B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物によるソホローズの製造法に関
する。 〔従来の技術〕 微生物によるセルラーゼ生産の生産促進物質、
化粧品原料として有用なソホローズは、槐の木
（Sophora japonica L.）の実のさや中のカンフ
エロール配糖体の糖成分として最初に見い出され
たが、自然界では遊離状態の二糖として得られる
ことは稀であつて、わずかにロイヤルゼリー中に
存在することが知られているにすぎない。 また、微生物のソホローズ生産については、
Khan等が細菌アセトバクター（Acetobacter）
属に属する微生物によるオリゴ糖生成研究におい
て少量のソホローズ生成を認めた以外に知られて
いない〔A.W.Khan et al.，Nature，183，682
（1959）、T.K.Walker et al.，Arch.Bio−Chem.
Biophys.，83，161（1959）〕。 〔発明が解決しようとする問題点〕 斯かる実状において、ソホローズ生産微生物の
早急な探索が望まれていた。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者は、ソホローズ生産能を有する微生物
を広く検索した結果、酵母トルロプシス
（Torulopsis）属に属する微生物中に斯様の能力
を有するものがあることを見い出し、本発明を完
成した。 すなわち本発明は、酵母トルロプシス属に属す
るソホローズ生産菌を培養し、培地中にソホロー
ズを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする微生物によるソホローズの新規製造方法を
提供するものである。 本発明で使用する微生物は、トルロプシス属に
属しソホローズ生産能を有するものであつて、例
えばトルロプシス・ボンビコーラ（Torulopsis
bombicola）KSM−36、同ATCC−22214、同
PRL123−64、同NRRL・Ｙ−1445N等が挙げら
れ、就中特にトリロプシス・ボンビコーラKSM
−36が好ましい。 トルロプシス・ボンビコーラKSM−36は、本
発明者が東京都武蔵野市のキヤベツ畑のキヤベツ
葉より分離し、微工研菌寄第7586号として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託したもので、以
下の菌学的性質を有する。 (a) 各培地における生育状態 麦芽汁培地、麦芽汁寒天培地、ポテト−デキ
ストロース寒天培地及びコーンミール寒天培地
上での生育状態は、いずれも、楕円乃至長楕円
酵母で、（0.75〜3.0）×1.5〜5.5）μの大きさを
有し、多極出芽方式で、真性菌糸、偽菌糸の形
成は認められなかつた。 (b) 子嚢胞子の形成 麦芽抽出液寒天培地を用いて子嚢胞子形成の
有無を検討した結果、子嚢胞子の形成を認めな
かつた。 (c) 射出胞子の形成 麦芽汁寒天培地で培養して射出胞子の有無を
検討した結果、射出胞子の形成を認めなかつ
た。 (d) 各生理的性質 成育条件 PH３〜８（最適５〜６） 温度 ７〜38℃（最適25〜34℃） 硝酸塩の同化 − 脂肪の分解 ＋ 尿素の分解 − ゼラチンの液化 − 塩化ナトリウム耐性 ６〜８％（ｗ／ｖ） カロチノイドの生成 − カスター培地における有機酸生成
＋ デンプン様物質の生成 − ビタミンの要求性 ＋ （ビオチン、チアミン要求性） (e) 同化性、発酵性の有無

【表】

〔作用〕

本発明に使用するトルロプシス属に属する菌株
は、後記実施例に示す如くソホローズ生産能を有
する。 〔発明の効果〕 前述の如く、微生物のソホローズ生産能につい
ては、僅かに１例知られているのみで、しかも少
量のソホローズ生成を認めたというに過ぎない。
これに対し、本発明はトルロプシス属に属する菌
株が高いソホローズ生産能を有するという新知見
に基くもので、微生物によるソホローズの製造を
可能にするものである。 〔実施例〕 次に参考例及び実施例を挙げて本発明を説明す
る。 参考例 １ () 東京都武蔵野市郊外のキヤベツ畑のキヤベ
ツ葉10ｇを滅菌水30mlの入つたビーカーに入
れ、10分間マグネチツクスターラーで懸濁分散
させた。静置後、その上澄液を10ml採取し、こ
れを下記組成の分離用液体培地100mlを含有し
た500ml容坂口フラスコに接種し、30℃、120ス
トローク／分で７日間振盪培養した。この操作
を繰り返し行い、４回集積培養を行つた。 （分離用液体培地の組成） ｎ−ヘキサデカン 100ml 硝酸アンモニウム 25ｇ リン酸二水素カリウム 10ｇ 硝酸マグネシウム・７水塩 5.0ｇ 塩化カリウム 5.0ｇ 酵母エキス 1.0ｇ 水道水 1000ml PH4.5 () 次いで、各段階の集積培地液から培養液0.5
ml採取し、これを下記方法で調整された分離用
寒天培地の表面にコンラジー棒で均一に塗布し
たのち、ｎ−エキサデカンを含浸漬させたロ紙
で覆いセロテープで密封し、30℃で培養した。 （分離用寒天培地の調製） ｎ−エキサデカンを除いた上記分離用液体培
地に寒天を液体培地に対し外比で2.5重量％添
加したのち蒸気減菌した。これを保温下で滅菌
シヤーレに一定量分注し平板寒天培地とした。 () 次いで、上記培養により生育したコロニー
の一白金耳を滅菌水で100培希釈し、この希釈
液0.1mlを前述の分離用寒天培地と同組成の寒
天培地に再度塗布し、同様にｎ−ヘキサデカン
を含浸させたロ紙で覆つてｎ−ヘキサデカンを
供給しながら30℃で３日間培養した。生じた複
数のコロニーが相互に相異しないことを、肉眼
的及び顕微鏡的に観察することにより確認し
た。更に上記コロニーのうち10個のコロニーを
それぞれ分離用寒天培地と同組成の斜面寒天培
地に接種し、ｎ−ヘキサデカンを含浸させたロ
紙によりｎ−ヘキサデカンを供給しつつ30℃で
３日間培養した。10本の斜面培地上の菌株が肉
眼的及び顕微鏡的に同一菌株であることを再確
認し、また、これら10菌株の各培地上の性状及
び生理学的性質が同一であることを確認した。
上記菌株の各培地上の性状及び生理学的性質は
前述した通りである。 上記試験の結果、各10本の培養菌はすべて自
然界より純粋に分離された単一菌株であること
が判る。 () 次いで、上記で純粋培養された斜面培地上
の菌株より一白金耳を滅菌した10％グリセリン
水溶液（２ml）の入つた凍結保存用バイアルに
懸濁し、−80℃にて凍結保存する。かくして３
ケ月凍結保存後、迅速に解凍し得られる懸濁液
の一白金耳を普通寒天培地に蘇生後前記と同条
件下に各培地上での性状及び生理学的性質を調
べた結果、凍結前とは変化が認められなかつ
た。 また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰
り返した菌株について同様に、各培地上での性
状及び生理学的性質を調べた結果、変化は認め
られなかつた。 実施例 １ () 滅菌したグルコース５重量／容量％（以
下、ｗ／ｖ％で示す）−コーンステイーブリツ
カー2w／ｖ％含有する種培地（PH6.2）500ml
を入れた５容培養三角フラスコに、同組成の
培地を入れた500ml容坂口フラスコ中で30℃、
48時間培養して得たトルロプシス・ボンビコー
ラKSM−36培養液を50ml接種し、30℃で48時
間振盪培養した。次いで、この培養液300mlを、
バーム油15w／ｖ％−グルコース10w／ｖ％−
酵母エキス0.5w／ｖ％を含有する本培地（PH
5.6）15を入れた30容のジヤーフアーメン
ターに接種し、温度：30℃、通気：0.5VVM、
内圧：0.75Kg／cm²、撹拌：350rpmの条件下で
５日間培養した。 () 培養液約15を内径15cm、長さ100cmの先
端部が円錐状の保温ジヤケツト付分相管に入
れ、下部より空気を噴出させて撹拌しながら約
70℃で30分加温したのち通気を止め、30分間培
養液を放置沈降させた。このとき培養液は４相
に分相する。最下沈降相及びその上の菌体相を
下部ノズルから静かに抜きとつた後、その上相
（分相時の上から第２相）にあたる水相を静か
に採取した。 () 次いで、採集水相部１を採り、必要に応
じて分液ロート中でクロロホルム−メタノール
混液（２：１）500mlで抽出操作を行い、水相
中のクロロホルム−メタノール司溶性物質を除
去する。そして、この抽出処理水相部を５℃、
3500rpmで30分間遠心分離を行い上清液を得
た。この上清液をロータリーエバポーレーター
で35℃温浴上にて混在するメタノール等を留去
するとともに減圧濃縮した。更に、得られた濃
縮液約50mlからイオン性物質を除去するため
に、これにカチオン交換樹脂とアニオン交換樹
脂を添加し、２時間撹拌したのちイオン交換樹
脂を洗浄除去した。 () この脱イオン処理水相320ml全量を活性炭
カラムに充填した。なお、活性炭カラムは内径
2.5cm、長さ60cmのガラスカラムに180ml容量の
活性炭〔クロマト用活性炭、和光純薬(株)製〕を
充填したのち、４規定−塩酸水溶液を1000mlを
流し、次いで蒸留水400mlを流して調製したも
のを使用した。この活性炭カラムによる分離操
作は、最初溶離液として蒸留水1000mlを流し、
次に５％エタノール水溶液2500ml、10％エタノ
ール水溶液1000ml、20％エタノール水溶液1000
mlの順序でステツプワイズ（段階的）溶出を行
い、最後に50％エタノール水溶液1000mlを流し
て終了した。溶出液は大型フランクシヨンコレ
クターで100ｇ重量分画／フラクシヨンで分取
した。分離された各分画部を薄層クロマトグラ
フイー、ガスクロマトグラフイー及びガスクロ
ーマススペクトロメトリー（GC−MS）など
で分析することによりNo.11〜No.40の画分に分離
分画された物質がソホローズであることが確認
された（第１図）。上記発酵条件で得られたソ
ホローズは発酵液１あたり約30ｇであつた。 実施例 ２ シード培地（グルコース5w／ｖ％−酵母エキ
ス0.5w／ｖ％）10mlを入れた試験管に、YMスラ
ントに生育した新鮮なトルロプシス・ボンビコー
ラ類（第１表）から各々一白金耳を採り、各々接
種したのち、30℃で48時間培養した。次いで、こ
の培養液１mlをグルコース10w／ｖ％−サフラワ
ー油10w／ｖ％−酵母エキス0.5w／ｖ％含有する
本培地50mlを入れた坂口フラスコに接種し、30
℃、120ストローク／分で10日間発酵した。この
発酵液５mlを採取し、遠心分離−ロ過処理し、清
澄な発酵液を得たのち、その全量を20ml容のサン
プルビンに入れ、凍結真空乾燥を行い粉末とし、
その重量を測定した。 次に、この粉末10mgを正確に５ml容バイヤル器
に秤り採り、これにトリフルオロ酢酸３mgとホル
ムアミド0.5mlを加え均一に溶解させたのち、最
後に無水トリフルオロ酢酸を加え、密栓して10分
間室温に放置した。この反応液の一定量をガスク
ロマトグラフイー分析に供し、ソホローズを定量
分析した。ガスクロマトグラフイー分析は、３％
Silicone SE−52−Chromosorb W80／100メツ
シユ〔島津製作所(株)製〕を２mmφ×４フイートの
ガラスカラムに充填したものを用いて行つた。な
お、カラム温度は最初５分間は100℃に維持し、
次いで10℃／分の昇温速度で昇温したのち、230
℃で２分間維持した。キヤリアガスはヘリウムを
用い、流量は30ml／分とした。検出には水素炎検
出器を用いた。 各トルロプシス・ボンビコーラ類のソホローズ
生産量は第１表に示す通りである。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるカラムクロマトグ
ラフイーの結果を示す溶出曲線である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ トルロプシス属に属するソホローズ生産菌を
   培養しソホローズを生成蓄積せしめ、これを採取
   することを特徴とするソホローズの製造法。