JPH0420597B2 - - Google Patents
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- JPH0420597B2 JPH0420597B2 JP58080002A JP8000283A JPH0420597B2 JP H0420597 B2 JPH0420597 B2 JP H0420597B2 JP 58080002 A JP58080002 A JP 58080002A JP 8000283 A JP8000283 A JP 8000283A JP H0420597 B2 JPH0420597 B2 JP H0420597B2
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- Japan
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- glucose
- enzyme
- glucose dehydrogenase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
3−デヒドロカルニチンの非対称還元によるL
−カルニチンの生産方法はフランス特許第
2398046号に記載されている。この方法は、例え
ばAurichおよびcoll、Hoppe−Seyker′s Z.
Physiol.Chem.第349巻、1310頁(1968年)にそ
の化学合成法が記載されている3−デヒドロカル
ニチンまたはそれらの塩の1つを、下記の成分を
水性培地において同時作用に付すことにより成
る。すなわち (a) カルニチン脱水素酵素 (b) デヒドロカルニチンの還元用カルニチン脱水
素酵素により用いられる助酵素。この助酵素は
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであ
り、これは酸化形態(NAD+)で存在しても還
元形態(NHDH)で存在してもよい。
−カルニチンの生産方法はフランス特許第
2398046号に記載されている。この方法は、例え
ばAurichおよびcoll、Hoppe−Seyker′s Z.
Physiol.Chem.第349巻、1310頁(1968年)にそ
の化学合成法が記載されている3−デヒドロカル
ニチンまたはそれらの塩の1つを、下記の成分を
水性培地において同時作用に付すことにより成
る。すなわち (a) カルニチン脱水素酵素 (b) デヒドロカルニチンの還元用カルニチン脱水
素酵素により用いられる助酵素。この助酵素は
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであ
り、これは酸化形態(NAD+)で存在しても還
元形態(NHDH)で存在してもよい。
(c) ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸
化形態の還元の化学系(または化学薬剤)また
は酵素系(または酵素剤)。この系はあらゆる
場合に還元剤(R)を含み、その他の酵素還元
の系の場合酵素(E)を含む。
化形態の還元の化学系(または化学薬剤)また
は酵素系(または酵素剤)。この系はあらゆる
場合に還元剤(R)を含み、その他の酵素還元
の系の場合酵素(E)を含む。
L−カルニチンの調整反応の使用条件は前記フ
ランス特許に記載されている。
ランス特許に記載されている。
NAD+の種々の還元系(NADHの再生系とも
呼ばれる)は特に酵素系について(この場合還元
剤Rと酵素Eの化合物)の既に引用したフランス
特許に記載されている。最良の結果は還元剤がグ
ルコースであり、酵素がグルコース脱水素酵素
(E.C.I.I.I.47)である系を用いて得られた。
呼ばれる)は特に酵素系について(この場合還元
剤Rと酵素Eの化合物)の既に引用したフランス
特許に記載されている。最良の結果は還元剤がグ
ルコースであり、酵素がグルコース脱水素酵素
(E.C.I.I.I.47)である系を用いて得られた。
NAD+の還元反応はしたがつて次のように表わ
すことができる。
すことができる。
グルコース+NAD+グルコース脱水素酵素
―――――――――――――→
(R) (E)
グルカノラクトン+NADH+H+
しかしながらこの系を利用して良好な成績を得
るには、精製グルコース脱水素酵素の使用が必要
であつた。この条件は工業的には使用しえない。
酵素すなわちこの場合グルコース脱水素酵素の精
製の費用は一般に非常に高い。粗抽出物の使用
(すなわち求める酵素活性を有する微生物の懸濁
液の破壊および例えば遠心分離による細菌細胞破
片の除去の後で得られる調製物の使用)またはグ
ルコース脱水素酵素の酵素活性を有するほとんど
精製されていない抽出物の使用は、従つてかなり
この費用を減じることができる。不都合なこと
に、あまりに大量な粗抽出物の使用が要求されて
いるにしてはあまりに粗抽出物の活性が低いとい
う事実によつて、またそれ自体酵素であつてもよ
くかつ当該合成に対して不利な作用をあれこれと
及ぼす種々の化合物がこれらの抽出物に存在する
という事実によつて、この使用は多くの場合不可
能であることが証明されている。
るには、精製グルコース脱水素酵素の使用が必要
であつた。この条件は工業的には使用しえない。
酵素すなわちこの場合グルコース脱水素酵素の精
製の費用は一般に非常に高い。粗抽出物の使用
(すなわち求める酵素活性を有する微生物の懸濁
液の破壊および例えば遠心分離による細菌細胞破
片の除去の後で得られる調製物の使用)またはグ
ルコース脱水素酵素の酵素活性を有するほとんど
精製されていない抽出物の使用は、従つてかなり
この費用を減じることができる。不都合なこと
に、あまりに大量な粗抽出物の使用が要求されて
いるにしてはあまりに粗抽出物の活性が低いとい
う事実によつて、またそれ自体酵素であつてもよ
くかつ当該合成に対して不利な作用をあれこれと
及ぼす種々の化合物がこれらの抽出物に存在する
という事実によつて、この使用は多くの場合不可
能であることが証明されている。
この不利な作用の原因は様々であるがしばしば
併合的なものであつて、必ずしも知られているわ
けではない。例えば粗抽出物の存在の結果おこる
反応において用いられる酵素および助酵素の非常
に急速な不活性化、存在する基質からの種々の生
成物の合成、抽出物中に含まれる生成物によるL
−カルニチンの合成の阻害などを挙げることがで
きる。
併合的なものであつて、必ずしも知られているわ
けではない。例えば粗抽出物の存在の結果おこる
反応において用いられる酵素および助酵素の非常
に急速な不活性化、存在する基質からの種々の生
成物の合成、抽出物中に含まれる生成物によるL
−カルニチンの合成の阻害などを挙げることがで
きる。
粗酵素抽出物の使用のもう1つの不都合は、使
用される粗抽出物中に含まれる不純物の存在の結
果L−カルニチンの精製が困難であることであ
る。
用される粗抽出物中に含まれる不純物の存在の結
果L−カルニチンの精製が困難であることであ
る。
本出願人はグルコース脱水素酵素の安定かつ活
性的粗抽出物の調製と、L−カルニチンの合成用
としてのその利用を可能にする条件を発見した。
性的粗抽出物の調製と、L−カルニチンの合成用
としてのその利用を可能にする条件を発見した。
本発明の方法の発見に導く実験を以下に要約し
た。
た。
グルコース脱水素酵素の活性をバシルス・サブ
チリス(Bacillus subtilis)種に属する種々の細
菌株に由来する酵素抽出物において測定した。あ
る種の胞子形成突然変異体(生育終了時に不完全
な発達をした胞子を形成する突然変異体)は、野
生株(souche de sauvage)の活性よりはるかに
高いグルコース脱水素酵素活性を有することが認
められた。類似の結果が、バシルス・セレウス
(Bacillus cereus)のような他のバシルス種に属
する菌株を用いた場合でも認められる。しかしな
がら多くの場合酵素抽出物の安定性は悪く、グル
コース脱水素酵素は数時間でその活性の大部分を
失うが、一方精製後の同じ酵素の安定性ははるか
に良好であつた。この不安定性の理由から明らか
にされなかつたが、これはグルコース脱水素酵素
のような酵素をこれら酵素のペプチド結合のある
ものを加水分解することによつて不活性化するプ
ロテアーゼの存在の少なくとも1部基づいている
可能性がある。バシルス・メガテリウム
(Bacillus megaterium)の特別な胞子形成の突
然変異体の場合、粗抽出物におけるグルコース脱
水素酵素は高い活性と前記の場合より良好な安定
性とを有することが今や発見された。この突然変
異体は実験室の保存菌株であるバシルス・メガテ
リウムIFP180から得られた。この菌株は
“Bergey′s manual of determinative
bacteriology”第8版(1974年)、The Williams
&Wilkins Company、Baltimore、第529頁に記
載されているようなバシルス・メガテリウム種に
対応する特徴を有する温度耐性の内生胞子を形成
する桿菌形の好気性細菌である。生育を終えその
胞子形成を行なつたバシルス・メガテリウム
IFP180の培養を新しいグルコース培地上に連続
的に植菌した。数回の連続的な植菌を受けた培養
物から得た酵素抽出物のグルコース脱水素酵素活
性がかなり増加したことが認められた。従つて例
えば12回の連続的植菌固体培地上への拡散後、コ
ロニーの分離によつて培養物を精製した。得られ
た新しい菌株をバシルス・メガテリウムIFP188
と名付ける。これは母菌株のバシルス・メガテリ
ウムIFP180と似ている特徴を示すが、はるかに
低い胞子形成率と明らかに高いグルコース脱水素
酵素活性によりこれとは異なる。これにより、無
胞子性の突然変異体の選別を有利にするために知
られ〔J.P.Aubert、J.Millet、E.PineauおよびG.
Milhaud、Biochim、Biophys.Acta、51巻、
(1961年)第529〜537頁〕かつ上記のように行な
われた植菌が、その他に高いグルコース脱水素酵
素活性を有するという特性を示すような突然変異
体を得ることに効果的に導かれたと結論できた。
IFP188株はATCC寄託番号第39118号である。
チリス(Bacillus subtilis)種に属する種々の細
菌株に由来する酵素抽出物において測定した。あ
る種の胞子形成突然変異体(生育終了時に不完全
な発達をした胞子を形成する突然変異体)は、野
生株(souche de sauvage)の活性よりはるかに
高いグルコース脱水素酵素活性を有することが認
められた。類似の結果が、バシルス・セレウス
(Bacillus cereus)のような他のバシルス種に属
する菌株を用いた場合でも認められる。しかしな
がら多くの場合酵素抽出物の安定性は悪く、グル
コース脱水素酵素は数時間でその活性の大部分を
失うが、一方精製後の同じ酵素の安定性ははるか
に良好であつた。この不安定性の理由から明らか
にされなかつたが、これはグルコース脱水素酵素
のような酵素をこれら酵素のペプチド結合のある
ものを加水分解することによつて不活性化するプ
ロテアーゼの存在の少なくとも1部基づいている
可能性がある。バシルス・メガテリウム
(Bacillus megaterium)の特別な胞子形成の突
然変異体の場合、粗抽出物におけるグルコース脱
水素酵素は高い活性と前記の場合より良好な安定
性とを有することが今や発見された。この突然変
異体は実験室の保存菌株であるバシルス・メガテ
リウムIFP180から得られた。この菌株は
“Bergey′s manual of determinative
bacteriology”第8版(1974年)、The Williams
&Wilkins Company、Baltimore、第529頁に記
載されているようなバシルス・メガテリウム種に
対応する特徴を有する温度耐性の内生胞子を形成
する桿菌形の好気性細菌である。生育を終えその
胞子形成を行なつたバシルス・メガテリウム
IFP180の培養を新しいグルコース培地上に連続
的に植菌した。数回の連続的な植菌を受けた培養
物から得た酵素抽出物のグルコース脱水素酵素活
性がかなり増加したことが認められた。従つて例
えば12回の連続的植菌固体培地上への拡散後、コ
ロニーの分離によつて培養物を精製した。得られ
た新しい菌株をバシルス・メガテリウムIFP188
と名付ける。これは母菌株のバシルス・メガテリ
ウムIFP180と似ている特徴を示すが、はるかに
低い胞子形成率と明らかに高いグルコース脱水素
酵素活性によりこれとは異なる。これにより、無
胞子性の突然変異体の選別を有利にするために知
られ〔J.P.Aubert、J.Millet、E.PineauおよびG.
Milhaud、Biochim、Biophys.Acta、51巻、
(1961年)第529〜537頁〕かつ上記のように行な
われた植菌が、その他に高いグルコース脱水素酵
素活性を有するという特性を示すような突然変異
体を得ることに効果的に導かれたと結論できた。
IFP188株はATCC寄託番号第39118号である。
従つて本発明の方法は、生育を終えかつその胞
子形成を行なつたバシルス・メガテリウム株のグ
ルコース培地上の連続的植菌により得られたバシ
ルス・メガテリウムの突然変異体IFP188(ATCC
寄託番号第39118号)の培養によるグルコース脱
水素酵素の製造から成る。
子形成を行なつたバシルス・メガテリウム株のグ
ルコース培地上の連続的植菌により得られたバシ
ルス・メガテリウムの突然変異体IFP188(ATCC
寄託番号第39118号)の培養によるグルコース脱
水素酵素の製造から成る。
バシルス菌株の培養のために用いられた栄養培
地の組成が、これらの培養から得られた酵素調製
物のグルコース脱水素活性に対してかなり影響を
及ぼすこともまた認められた。グルコースが1〜
40g/の濃度で培地中に存在することがグルコ
ース脱水素酵素の良好な活性を得るために不可欠
であることが確かめられた。一般的には例えば大
豆のペプトン、カゼインの水解物、とうもろこし
の浸漬液(コーンステイープリカー“corn
steepliquor”)、肉のエキスなどのようなアミノ
酸源の添加を行なうと、良好な成育および高い酵
素活性を得るのに有利である。Chatelainおよび
Fargett、C.R.Hebd.Seances Acad.Sci.、Dシリ
ーズ1976年、283(13)、第1563〜1566頁に記載さ
れているバシルス・メガテリウム突然変異体
KM59、これは燐酸塩の欠乏という条件下でしか
グルコース脱水素酵素を生じないものであるが、
これとは逆にIFP188株は過剰な燐酸塩の存在下
で培養された時でさえ、高いグルコース脱水素酵
素活性を有する。
地の組成が、これらの培養から得られた酵素調製
物のグルコース脱水素活性に対してかなり影響を
及ぼすこともまた認められた。グルコースが1〜
40g/の濃度で培地中に存在することがグルコ
ース脱水素酵素の良好な活性を得るために不可欠
であることが確かめられた。一般的には例えば大
豆のペプトン、カゼインの水解物、とうもろこし
の浸漬液(コーンステイープリカー“corn
steepliquor”)、肉のエキスなどのようなアミノ
酸源の添加を行なうと、良好な成育および高い酵
素活性を得るのに有利である。Chatelainおよび
Fargett、C.R.Hebd.Seances Acad.Sci.、Dシリ
ーズ1976年、283(13)、第1563〜1566頁に記載さ
れているバシルス・メガテリウム突然変異体
KM59、これは燐酸塩の欠乏という条件下でしか
グルコース脱水素酵素を生じないものであるが、
これとは逆にIFP188株は過剰な燐酸塩の存在下
で培養された時でさえ、高いグルコース脱水素酵
素活性を有する。
培地中へのグルコース添加は培養の初めにただ
1度で行なうことができる。ある場合には最高の
酵素活性は発酵の間グルコースの漸次添加により
得られた。
1度で行なうことができる。ある場合には最高の
酵素活性は発酵の間グルコースの漸次添加により
得られた。
培養におけるグルコースの割合は好ましくは1
〜40g/である。好ましい培地は少なくも1
g/のグルコースと少なくとも1g/のとう
もろこしの浸漬液とを含む。
〜40g/である。好ましい培地は少なくも1
g/のグルコースと少なくとも1g/のとう
もろこしの浸漬液とを含む。
バシルス・メガテリウムIFP188の培養から、
遠心分離によつて細菌を採集しついでこれらの細
菌の緩衝液中懸濁液を、超音波処理、ガラス球を
用いての粉砕などのような既知の技術によつて破
壊することにより、高いグルコース脱水素酵素活
性を有する粗酵素抽出物を調製する。細胞破片を
除去するために、破壊された細胞懸濁液の遠心分
離後、L−カルニチンの合成のたに用いられるグ
ルコース脱水素酵素の粗酵素抽出物を得る。
遠心分離によつて細菌を採集しついでこれらの細
菌の緩衝液中懸濁液を、超音波処理、ガラス球を
用いての粉砕などのような既知の技術によつて破
壊することにより、高いグルコース脱水素酵素活
性を有する粗酵素抽出物を調製する。細胞破片を
除去するために、破壊された細胞懸濁液の遠心分
離後、L−カルニチンの合成のたに用いられるグ
ルコース脱水素酵素の粗酵素抽出物を得る。
IFP188菌株から得た粗抽出物中のグルコース
脱水素酵素の安定性を調べた結果、安定性は良好
であり、前に調べたバシルス菌種から得た抽出物
の安定性より明らかに良いことが認められた。さ
らに、この安定性は0.1〜1Mの濃度のグルコース
の存在によつて明らかに改善されていることが認
められた。サツカロース、フルクトース、マンニ
トールあるいはグリセロールのようなその他の糖
や多価アルコールは安定化効果が非常に劣る。結
局酵素の安定性はPH6〜7で良好であるがPH7.5
では劣る。PH8かそれ以上のようなよりアルカリ
性のPHでは安定性は悪い。上に記載した安定性の
条件は有利にはL−カルニチンの合成に用いられ
る。
脱水素酵素の安定性を調べた結果、安定性は良好
であり、前に調べたバシルス菌種から得た抽出物
の安定性より明らかに良いことが認められた。さ
らに、この安定性は0.1〜1Mの濃度のグルコース
の存在によつて明らかに改善されていることが認
められた。サツカロース、フルクトース、マンニ
トールあるいはグリセロールのようなその他の糖
や多価アルコールは安定化効果が非常に劣る。結
局酵素の安定性はPH6〜7で良好であるがPH7.5
では劣る。PH8かそれ以上のようなよりアルカリ
性のPHでは安定性は悪い。上に記載した安定性の
条件は有利にはL−カルニチンの合成に用いられ
る。
本発明はグルコース脱水素酵素の粗酵素抽出物
の使用に制限されるものではない。所望であれば
硫酸アンモニウム、種々の型のクロマトグラフイ
ー(イオン交換、ゲル上透過、親和力)などを用
いての選択的沈澱のような酵素の精製の既知方法
の使用によつて、上に記載した粗抽出物から得た
グルコース脱水素酵素の精製抽出物をもL−カル
ニチンのこの合成用に使用することができるから
である。
の使用に制限されるものではない。所望であれば
硫酸アンモニウム、種々の型のクロマトグラフイ
ー(イオン交換、ゲル上透過、親和力)などを用
いての選択的沈澱のような酵素の精製の既知方法
の使用によつて、上に記載した粗抽出物から得た
グルコース脱水素酵素の精製抽出物をもL−カル
ニチンのこの合成用に使用することができるから
である。
実施例 1
バシルス・メガテリウム株(IFP180菌株)を
1につきグルコース2.5g、K2HPO42.5g、塩
化ナトリウム5g、カゼインの三重(tryptique)
水解物17g、大豆のパパイン・ペプトン3gを含
有する培地上で培養し、115℃で30分間の滅菌後
PH7.0に調整する。これらの条件は行なわれる培
養の燐酸塩に制限を加えるようなものではない。
1につきグルコース2.5g、K2HPO42.5g、塩
化ナトリウム5g、カゼインの三重(tryptique)
水解物17g、大豆のパパイン・ペプトン3gを含
有する培地上で培養し、115℃で30分間の滅菌後
PH7.0に調整する。これらの条件は行なわれる培
養の燐酸塩に制限を加えるようなものではない。
30℃で24時間の培養後細胞を採集し、燐酸カリ
ウム緩衝液100mM(PH7.5)中に懸濁させ、つい
で細胞懸濁液の冷間(0〜10℃)超音波処理(10
回15秒)ついで遠心分離による細胞破片を除去に
よつて酵素抽出物を調製した。グルコース脱水素
酵素の酵素活性をこのようにして得られた抽出物
において測定すると抽出物のプロテイン1mgにつ
き0.085単位であつた。酵素単位(U)は実験条
件下において1分につき1マイクロモルのグルコ
ースの変換を可能にする酵素の量として定義す
る。
ウム緩衝液100mM(PH7.5)中に懸濁させ、つい
で細胞懸濁液の冷間(0〜10℃)超音波処理(10
回15秒)ついで遠心分離による細胞破片を除去に
よつて酵素抽出物を調製した。グルコース脱水素
酵素の酵素活性をこのようにして得られた抽出物
において測定すると抽出物のプロテイン1mgにつ
き0.085単位であつた。酵素単位(U)は実験条
件下において1分につき1マイクロモルのグルコ
ースの変換を可能にする酵素の量として定義す
る。
IFP180菌株から天然の胞子形成突然変異体を、
上に記載した培地上への連続的植菌によつて選別
した。5回の植菌後、培養物のグルコース脱水素
酵素活性が改善されたことが認められた。植菌を
20回まで続行して行なわれた異なる連続培養の固
体培地上への拡散によつて単離されたコロリーを
得た。ついでこれらのコロニーを培養し、当初の
菌株IFP180と同じ条件下で処理し、グルコース
脱水素酵素の酵素活性を、得られた抽出物におい
て測定した。たん白質1mgにつき0.50μである最
良の酵素活性を、IFP188菌株と名付けたこれら
コロニー1つの培養物から得た。さらにIFP188
菌株は非常に低い胞子形成率(0.4%以下)を有
し、従つて胞子形成突然変異体を成すことが認め
られた。巨大菌突然変異体IFP188を後の実験に
おけるグルコース脱水素酵素の製造用に取つてお
いた。
上に記載した培地上への連続的植菌によつて選別
した。5回の植菌後、培養物のグルコース脱水素
酵素活性が改善されたことが認められた。植菌を
20回まで続行して行なわれた異なる連続培養の固
体培地上への拡散によつて単離されたコロリーを
得た。ついでこれらのコロニーを培養し、当初の
菌株IFP180と同じ条件下で処理し、グルコース
脱水素酵素の酵素活性を、得られた抽出物におい
て測定した。たん白質1mgにつき0.50μである最
良の酵素活性を、IFP188菌株と名付けたこれら
コロニー1つの培養物から得た。さらにIFP188
菌株は非常に低い胞子形成率(0.4%以下)を有
し、従つて胞子形成突然変異体を成すことが認め
られた。巨大菌突然変異体IFP188を後の実験に
おけるグルコース脱水素酵素の製造用に取つてお
いた。
グルコース脱水素酵素の安定性をこの菌株
IFP188の酵素抽出物において測定した。これら
の実験において抽出物を濾過により滅菌し、PH
7.0の燐酸カリウム緩衝液中に30℃に保持した。
これらの条件下に保持した抽出物のグルコース脱
水素酵素活性を周期的に測定したが、約15時間の
半減期(酵素活性の半分を失うのに要する時間)
という結果が得られた。
IFP188の酵素抽出物において測定した。これら
の実験において抽出物を濾過により滅菌し、PH
7.0の燐酸カリウム緩衝液中に30℃に保持した。
これらの条件下に保持した抽出物のグルコース脱
水素酵素活性を周期的に測定したが、約15時間の
半減期(酵素活性の半分を失うのに要する時間)
という結果が得られた。
グルコース0.6Mの添加は粗抽出物中の酵素の
安定性をかなり増す。これは上記の条件下におい
て21日間で活性の損失は全く認められなかつたか
らである。グルコースの安定化効果はグルコース
の濃度による。0.2Mの濃度において半減期は40
〜50時間である。0.4Mにおいては約12日である。
安定性をかなり増す。これは上記の条件下におい
て21日間で活性の損失は全く認められなかつたか
らである。グルコースの安定化効果はグルコース
の濃度による。0.2Mの濃度において半減期は40
〜50時間である。0.4Mにおいては約12日である。
比較としてはバシルス・サブチリスを用いて得
られたグルコース脱水素酵素の抽出物は0.045単
位/抽出物のたん白質mgの活性しかなかつた。
られたグルコース脱水素酵素の抽出物は0.045単
位/抽出物のたん白質mgの活性しかなかつた。
バシルス・サブチリスの最良の突然変異体の活
性は0.085μ/たん白質mg以上ではなかつた。バシ
ルス・サブチリスの野生菌株およびそれらの突然
変異体はすべて2〜6時間の半減期を有してい
た。
性は0.085μ/たん白質mg以上ではなかつた。バシ
ルス・サブチリスの野生菌株およびそれらの突然
変異体はすべて2〜6時間の半減期を有してい
た。
実施例 2
大豆のパパイン・ペプトン30g/を含有する
培地を含む20の発酵装置内でバシルス・メガテ
リウムIFP188株を培養した。最初の滅菌を実施
例1のように行なつた。PHを10Nアンモニアの添
加によつてPH7.3に維持した。培地1につき空
気0.5/分の注入により培地の通気を行なつた。
20時間後細胞を採集し、酵素抽出物を実施例1の
ように調製した。たん白質1mgにつき0.002μのグ
ルコース脱水素酵素活性が、このような抽出物に
おいて測定された。
培地を含む20の発酵装置内でバシルス・メガテ
リウムIFP188株を培養した。最初の滅菌を実施
例1のように行なつた。PHを10Nアンモニアの添
加によつてPH7.3に維持した。培地1につき空
気0.5/分の注入により培地の通気を行なつた。
20時間後細胞を採集し、酵素抽出物を実施例1の
ように調製した。たん白質1mgにつき0.002μのグ
ルコース脱水素酵素活性が、このような抽出物に
おいて測定された。
培地が大豆のパパイン・ペプトンの他の10g/
のグルコースを含むということを除いて同一の
条件下で同じ菌株を培養した。この培養に得られ
た細菌細胞を用いて前記のように調製した酵素抽
出物は、たん白質1mgにつき0.42μのグルコース
脱水素酵素活性を有していた。
のグルコースを含むということを除いて同一の
条件下で同じ菌株を培養した。この培養に得られ
た細菌細胞を用いて前記のように調製した酵素抽
出物は、たん白質1mgにつき0.42μのグルコース
脱水素酵素活性を有していた。
実施例 3
16の容積の培養培地が都市水道から成り、そ
の中に培養の間ずつと100g/Kgのトウモロコシ
の浸漬液(コーンステープリカー“cornsteep
liquor”)400g/Kgのグルコースを注入したこと
を除いて実施例2と同様に、IFP188菌株のもう
1つの培養を行なつた。この混合物の注入速度は
50ml/時であつた。20時間の生育後採集して得ら
れた細胞を用いて調製した酵素抽出物はたん白質
1mgにつき0.60μのグルコース脱水素酵素活性を
有していた。
の中に培養の間ずつと100g/Kgのトウモロコシ
の浸漬液(コーンステープリカー“cornsteep
liquor”)400g/Kgのグルコースを注入したこと
を除いて実施例2と同様に、IFP188菌株のもう
1つの培養を行なつた。この混合物の注入速度は
50ml/時であつた。20時間の生育後採集して得ら
れた細胞を用いて調製した酵素抽出物はたん白質
1mgにつき0.60μのグルコース脱水素酵素活性を
有していた。
実施例 4
実施例3において調製したグルコース脱水素酵
素の酵素抽出物を下記の条件下でL−カルニチン
の合成を行なつために用いた。1につきミリモ
ル(mM)で示した濃度の下記の成分すなわち燐
酸アンモニウム50mM(PH7.0)、NAD+1mM、グ
ルコース600mM、カルニチン脱水素酵素(フラ
ンス特許第2398046号の実施例1に記載されたよ
うにして調製したもの)450単位(すなわち酵素
抽出物10ml)およびグルコース脱水素酵素150単
位(すなわち粗酵素抽出物10ml)を含有する培地
500mlを含む、サーモスタツトで25℃に保たれて
いる2反応器を用いた。ついでデヒドロカルニ
チン・臭化水素塩(濃縮塩酸の添加によりPH0.5
にしてあるもの)を1につき800mM含む溶液
を注入した。注入速度は5ml/時であつた。PHは
2Nアンモニアの添加によりPH7.0に維持した。こ
のアンモニア添加は自動PHメーター滴定器を用い
て管理された。酵素的方法により定量された形成
L−カルニチンの量は、48時間後30.5gであつ
た。
素の酵素抽出物を下記の条件下でL−カルニチン
の合成を行なつために用いた。1につきミリモ
ル(mM)で示した濃度の下記の成分すなわち燐
酸アンモニウム50mM(PH7.0)、NAD+1mM、グ
ルコース600mM、カルニチン脱水素酵素(フラ
ンス特許第2398046号の実施例1に記載されたよ
うにして調製したもの)450単位(すなわち酵素
抽出物10ml)およびグルコース脱水素酵素150単
位(すなわち粗酵素抽出物10ml)を含有する培地
500mlを含む、サーモスタツトで25℃に保たれて
いる2反応器を用いた。ついでデヒドロカルニ
チン・臭化水素塩(濃縮塩酸の添加によりPH0.5
にしてあるもの)を1につき800mM含む溶液
を注入した。注入速度は5ml/時であつた。PHは
2Nアンモニアの添加によりPH7.0に維持した。こ
のアンモニア添加は自動PHメーター滴定器を用い
て管理された。酵素的方法により定量された形成
L−カルニチンの量は、48時間後30.5gであつ
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 バシルス(Bacillus)菌株を培地中で培養し
かつ得られた酵素を抽出することより成るグルコ
ース脱水素酵素の生産方法において、バシルス菌
株が、生育を終えかつ胞子形成を行なつたバシル
ス・メガテリウム(Bacillus megaterium)の菌
株のグルコース培地上への連続的植菌により得ら
れた突然変異体IEP188(ATCC寄託番号第39118
号)であることを特徴とする方法。 2 培養が1〜40g/の濃度のグルコースの存
在下において行なわれる、特許請求の範囲第1項
記載の方法。 3 培養が少なくとも1g/のグルコースと少
なくとも1g/のとうもろこしの浸漬液とを同
時に含む培地において行なわれる、特許請求の範
囲第1または2項記載の方法。 4 培養の間にグルコースが漸次導入される、特
許請求の範囲第1〜3項のうちのいずれか1項記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8208036A FR2526442B1 (fr) | 1982-05-06 | 1982-05-06 | Production de glucose deshydrogenase et utilisation de l'enzyme obtenu dans la synthese enzymatique de la l-carnitine |
| FR8208036 | 1982-05-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58201985A JPS58201985A (ja) | 1983-11-25 |
| JPH0420597B2 true JPH0420597B2 (ja) | 1992-04-03 |
Family
ID=9273858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58080002A Granted JPS58201985A (ja) | 1982-05-06 | 1983-05-06 | グルコ−ス脱水素酵素の生産方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0095950B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58201985A (ja) |
| AT (1) | ATE22702T1 (ja) |
| CA (1) | CA1205032A (ja) |
| DE (1) | DE3366707D1 (ja) |
| ES (1) | ES8407094A1 (ja) |
| FR (1) | FR2526442B1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2583432B1 (fr) * | 1985-06-13 | 1988-11-04 | Inst Francais Du Petrole | Procede de production enzymatique de l-a-aminoacides a partir d'a-cetoacides |
| FR2596756B1 (fr) * | 1986-04-04 | 1988-07-22 | Elf Aquitaine | Procede de purification de la carnitine |
| US4877733A (en) * | 1986-05-02 | 1989-10-31 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Glucose dehydrogenase and its production |
| DE3711881A1 (de) * | 1987-04-08 | 1988-10-27 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur herstellung von glucosedehydrogenase aus bacillus megaterium |
| FR2621325B1 (fr) * | 1987-10-02 | 1990-03-30 | Elf Aquitaine | Procede perfectionne de preparation de l-carnitine |
| CN105505787A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-04-20 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种产葡萄糖转苷酶的黑曲霉突变菌株 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2398046A1 (fr) * | 1977-07-18 | 1979-02-16 | Inst Francais Du Petrole | Synthese enzymatique de la l-carnitine |
-
1982
- 1982-05-06 FR FR8208036A patent/FR2526442B1/fr not_active Expired
-
1983
- 1983-04-18 DE DE8383400758T patent/DE3366707D1/de not_active Expired
- 1983-04-18 EP EP83400758A patent/EP0095950B1/fr not_active Expired
- 1983-04-18 AT AT83400758T patent/ATE22702T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-04-29 ES ES521943A patent/ES8407094A1/es not_active Expired
- 1983-05-06 JP JP58080002A patent/JPS58201985A/ja active Granted
- 1983-05-06 CA CA000427564A patent/CA1205032A/fr not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2526442B1 (fr) | 1985-09-27 |
| EP0095950A1 (fr) | 1983-12-07 |
| DE3366707D1 (en) | 1986-11-20 |
| CA1205032A (fr) | 1986-05-27 |
| ATE22702T1 (de) | 1986-10-15 |
| EP0095950B1 (fr) | 1986-10-08 |
| FR2526442A1 (fr) | 1983-11-10 |
| ES521943A0 (es) | 1984-08-16 |
| ES8407094A1 (es) | 1984-08-16 |
| JPS58201985A (ja) | 1983-11-25 |
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