JPS5860995A - 発酵法によるｌ−プロリンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるＬ−プロリンの製法に関する。

Ｌ−プロリンは医薬、飼料添加物薬として勺″用なアミ
ノ酸である。従来９発酵法にょるＬ−プロリンの製法と
しては、ブレビバクテリウム属、ミクロコツカス属、ク
ルチア属、サツカロミセス属、バチルス属、ニジエリア
属、ミクロ　バクテリウム属、コリネバクテリウム属、
アースロバフタ−鯛に属するＬ−プロリン生産菌を培養
して培地中ＫＬ−プロリンを生産せしめる方法が知られ
て３８５５７、同４８−３８８７６、同５１−３３１９
０、特開昭５５−１４８０９６等）。しかしながら、セ
ラチア属に鵬すΔ微生物を用いてＬ−プロリンを生成蓄
積せしめた報告はない。

本発明者等は発酵法によるＬ−プロリンの製法について
種々研究を重ねた結果、セラチア属に鵬する微生物はＬ
−プロリン分解酵素能が強く、かつＬ−プロリン生合成
が化ｌＭｇ１節を受けているため通常Ｌ−プロリンを生
成蓄積しないが、該微生物を変異誘導してＬ　−、７０
リン分解酵素欠損性とプロリンアナログ及び／又はプリ
ンアナログに対する耐性を付与することにより、Ｌ−プ
ロリンを著量生成蓄積することを見いだし９本発明を完
成　５− するに至った。

すなわち１本発明はセラチア属に属し、Ｌ−プロリン生
産能を有する微生物を培地に培養し、培地中にＬ−プロ
リンを生成蓄積せしめ、これを採取することからなる発
酵法によるＬ−プロリンの製法である。

本発明を実施するに当って用いられる微生、物としては
、セラチＬｒ属に属し、Ｌ−プロリン分解酵素（例えば
、Ｌ−プロリンオキシダーゼ）欠損性でかつプロリンア
ナログ（例えば、３．４−デヒドロ−ＤＬ−プロリン、
Ｌ−チアゾリン−４−カルボン酸、Ｌ−アゼチジン−２
−カルボン酸−）及び／又はプリンアナログ（例えば、
２，６−ジブロムプリン）に耐性なＬ−プロリン生産菌
か挙げられる。かかる菌株の好ましい例としては１例え
ばＬ−プロリン分解酵素欠損性でかつゾロリンアナログ
耐性なセラチア・マルセッセンス、Ｌ−プロリン分解酵
素欠損性でかつプロリンアナログ及びプリンアナログに
耐性、なセラチア・マルセッセンスなどが好適に挙げら
れる。更に具体的には。

　６− 例えばＬ−プロリンオキシダーゼ欠損性でがっ３．４−
デヒドロ−ＤＬ−プロリンに耐性なセラチア・マルセッ
センス、Ｌ−プロリンオキシダーゼ欠損性でかつ３．４
−デヒドロ−ＤＬ−７’ロリン及びＬ−チアゾリジン−
４−カルボン酸に耐性なセラチア・マルセッセンス、Ｌ
−プロリンオキシダーゼ欠損性でかつ３．４−デヒドロ
−ＤＬ−プロリン及び２．６−ジブロムプリンに耐性な
セラチア・マルセッセンスなどが好適に挙げられる。

上記の如き咬異株は次の如くして取得することができる
。例えば、Ｌ−プロリン分解酵素欠損性でかつプロリン
アナログ耐性な変異株は、線法（例えば、セラチア・マ
ルセッセンスｓｒ　４１　）　　に変Ｊｌｌ銹゛起処理
１例えば紫外線照射するか、又は変異誘起剤（例えば、
Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジン、
エチルメタンスルフォネートなど）で処理して、貧異を
誘起せしめたのち。

Ｌ−プロリンを主たる炭Ｘ源もしくは窒素源として含む
ようにした平板培地（例えばデービスの最少培地）で３
０℃にて３〜５日間培養し、生じたコロニーのうち小さ
いものを釣菌分離することによりＬ−プロリン分解酵素
欠損株を取得し９ついで該欠損株に上記と同様にして変
異を誘起せしめた後、プロリンアナログ（例えば、３．
４−デヒドロ−ＤＬ−プロリン）α２　ｔｑ／ｄを添加
した乎板越地（例えば、デービスの最少培地）で３０℃
にて１〜３日間培養し、生じたコロニーを釣薗４分離す
ることにより取得することができる。か（して得られる
変異株の代表的な例としては、セラチア・マルセッセン
スＤｒ−９Ｃ微工研菌寄第１ｔ／Ｃ９号）（Ｌ−プロリ
ンオキシダー欠損性でかつ３゜４−デヒドロ−ＤＬ−、
プロリンに耐性な変異株）が挙げられる。尚、上記で得
られた鍛異株に、更に上記と同様にして変異を誘起せし
めた後、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸１．０〜を
含、む平板培地（例えば、炭素源をコハク酸ナトリウム
０．５％にしたデービスの最少培地）で３０℃にて３〜
５日培貞し、生じたコロニーを釣菌分離することにより
、Ｌ−プロリンオキシダーゼ欠損性でかつ３．４−デヒ
ドロ−ＤＬ−プロリン及びＬ−チアゾリジン−４−カル
ボン酸に耐性な変異株が得られる。かくして得られる変
異株の代表的な例としては、セラチア・マルセッセンス
ＤＴｒ−１２（微工研菌寄第６７６０号）が挙げられる
。又、Ｌ−プロリン分解酵素欠損性でかつプロリンアナ
ログ及びプリンアナログ耐性な変異株は、上記で得られ
たＬ−プロリン分解酵素欠損性でかつプロリンアナログ
に耐性な変異株に変異を誘起せしめた後。

プリンアナログ（例えば、２．６−ジブｐムブリン）２
〜−を含む平板培地で３０℃にて１〜３日間培養し、生
じたコロニーを釣菌分離することにより取得することが
できるやかくして得られる変異株の代表的な例としては
、セラチア・マルセッセンスＤＢｒ−５１（微工研繭寄
第　ｂｔ＜９号）（Ｌ−プロリンオキシダーゼ欠損性で
かつ３．４−デヒドロ−ＤＬ−プロリン及び２．６−ジ
ブロムプリンに耐性な変異株）が挙けられる。

尚、Ｌ−プロリン生産能を有する変異株の取得方法は前
記方法に限定されるものではなく９例えばＬ−プロリン
分解酵素欠損性、プロリンアナ口　９　− グ耐性、プリンアナログ耐性などの性質を的記とは異な
った順序で付与するか。或いは別個に各性質を有する変
異株を取得した後、形質導入などの遺伝的組み換え手法
を採用することによっても。

Ｌ−プロリン生産能を有する変異株を取得することがで
きる。

本発明方法において使用するＬ−プロリン生産用培地と
しては、炭素源としてブドウ糖、シミ１軸。

糖蜜の如き糖類、コハク酸、クエン酸、フマール酸の如
き有機酸、グリセロールの如き糖アルコール類等を１０
〜２０％、窒素源としてフマール酸アンモニウム、コハ
ク酸アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウムの如き無機アンモニウム塩
や尿素等を１〜５％、有機栄養物としてコーンステイー
プリカーペプトン、酵母エキス、魚肉エキス等を０〜１
％の範囲でそれぞれ適当量含有し、他に無機物としてリ
ン酸カリウム硫酸マグネシウムを少量加えた培地が好適
に使用できる。

これらの他に培地の虜を６〜８に保つために炭＝１０− 酸カルシウムあるいはアンモニア水、クエン酸などを必
要に応じて添加してもよい。更番ここのような培地にＬ
−プロリン生合成の前駆物質となるＬ−グルタミン酸、
Ｌ−アスパラギン酸などを適宜添加した培地も好適番こ
使用できる。

本発明によれば、上記培地に前記のＬ−プロリン生産性
変異株を接種し、２５〜４０℃にて振盪培養あるいは通
気攪拌の如き好気的条件下で２〜７日間培養することに
よって培地中にＬ−プロリンを著量に蓄積せしめること
ができる。生成したＬ−プロリンは培養終了後、菌体そ
の他の不溶物を除去したのち実施例に示した如くイオン
交換樹脂を用いる通常の分離精製操作によって谷筋に採
取することができる。

以下、実施例及び参考例をあげて本発明方法を説明する
が、実施例中Ｌ−プロリンの確認はペーパークロマトグ
ラムのニンヒドリン反応及びイサチン反応によって行な
い。その定量はロイコノストック・メゼンテロイデスＰ
−６０によるバイオアッセイによって行なった。

実施例１ シヨ糖１０％、尿素１％、第２リン酸カリウム０、１％
、硫酸マグネシウム０．０５％、コーンステイープリカ
ー０．１％、炭酸カルシウム１％を含む発酵培地（ｐＨ
７，０）１５−を５００−容振釦コルベンに注入し、加
熱滅菌した。但し、シー軸は別滅菌後、添加した。この
発酵培地にブイヨン斜面培地で３０℃に（−晩培養した
セラチア・マルセッセンスＤｒ−９株（微工研菌寄第乙
ｌζ２号辻仁白金耳植菌した。３０℃、１４０回転／分
、振幅７Ｃ１ｌの条件下で７２時間培養した時、　９．
５−ｑ／ｄのＬ−プロリンが培地中に生成蓄積した。

実施例２ 実施例１と同一組成の発酵培地にブイヨン斜面培地で３
０℃にて一晩培養したセラチア・マルセッセンスＤＢｒ
−５１株（微工研菌寄第ｂｔｌ、Ｓ号）を１白金耳植−
した。３０℃、１４０回転／分。

振軸７ｃｘの条件下で７２時間培養した時、　Ｉ　２．
６、・ｒｇ／ｄのＬ−プロリンが培地中番こ生成蓄積し
た。

実施例３ シ璽糖１５％、尿累２％、第２リン酸カリウム０、１％
、硫酸マグネシウム０．０５％、コーンステイープリカ
ー０．６％、炭酸カルシウム１％を含む発酵培地（ｐＨ
７，０）１５／を５００ｍ容振盪コルベンに注入し、加
熱滅菌した。但し、ショ糖は別滅菌後、添加した。この
発酵培地にブイヨン斜面培地で３０℃にて一晩培養した
セラチア・マルセフセンスＤＴｒ−１２株（倣工研菌寄
ＷＥ　６１６９号）を−白金耳植菌した。３０’Ｃ，１
４０回転７分シ振幅７個の条件下で７２時間°培養した
時、２５．６・４ｄのＬ−プロリンが培地中に生成蓄積
した。その培養液１１を集めて熱処理した後、ろ過する
ことにより菌体その他の不溶物を除外した。ろ液を陽イ
オン交換樹脂アンバーライトＩＲ−１２０８（Ｈ＋型・
）を充填したカラムに導通した。水洗後。

吸着したＬ−プロリンを５％アンモニア水で溶出し、溶
出液を減圧濃縮した。濃縮液を冷却し、放装置したとこ
ろ、Ｌ−プロリンの結晶１　＆Ｏ／を得た。

参考例１ １３− ｆ （セラチア・マルセッセンスＤｒ−９株の取得方法）セ
ラチア・マルセッセンス５ｒ４１株をブイヨン培地に少
量接種し、３０℃にて培養した。培養液中の細菌がおよ
そ１０　細胞／ｄに達したところで。

Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロングアニジンの
１幅−水溶液をα２５４ｄになるように加えて、３０℃
で２０分間培養した後、遠心分離、シたこの菌体を生理
食塩水で洗浄した後、新しいブイヨン培地を加えて３０
℃で６時間培養した。この培養液を遠心分離し、上溝を
捨て、生理食塩水を加えて細胞を懸濁した。この細胞懸
？１１！欣を生理食塩水で希釈しておよそ１０細胞〜に
なるよう調整した。この＠濁液０．１　ｍをＬ−プロリ
ンを主たる室累源とする寒天平板培地（グルコース０．
５％。

Ｌ−プロリン０．２％、硫酸、アンモニウムｏ、　ｏ　
ｏ　。

２％、リン酸第二カリウムα７％、リン酸第−カリウム
０．３％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１％、寒
天１．５％）ｋ塗布し、３０℃にて３日間培養した。生
じたコロニーのうち小さいものを釣菌分離し、Ｌ−プロ
リンオキシダーゼ活性をデン１４− ジンガーらの方法〔ジャーナル　オブ　バクテリオロジ
ー、１０３巻、第１４４頁〜第１５２頁。

１９７０年〕に準じて測定し２本酵素活性が欠損してい
る株、を取得した。このようにして取得したＬ−プロリ
ン分解酵素欠損株を上記と同様にしてＮ−１＋ルーＮ′
−二トローＮ−二トロングアニジンで処理し、およそ１
０９細胞／−の細胞懸濁液を調製した。この懸濁液０．
１　ｍを３．４−デヒドロ−ＤＬ−プロリンα２ＦＩＷ
−を含む寒天平板培地（グルコースα５％、硫酸アンモ
ニウム０．１％、リン酸第二カリウムα７％、リン酸第
−カリウム０．３％、硫酸マグネシウム・７水和物０．
０１％、寒天１．５％・）ｋ塗布した。これを３０℃に
て２日間培養して生じたコロニーを釣菌分離し、Ｌ−プ
ロリン生産性を実施例１に記載したように調べてセラチ
アφマルセッセンスＤｒ−９株を取得した。

参考例２ （セラチア・マルセッセンスＤＢｒ−５１株の取得方法
） セラチア・マルセッセンス５ｒ４１から統導したＬ−プ
ロリン分解酵素欠損性でかつ３．４−デヒドロ−ＤＬ−
プロリン耐性な変異株Ｄｒ−９を参考例１に従って取得
した。このＤｒ−９株を、奈考例１と同様にしてＮ−メ
チル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジンで変異誘
導麩理し、細胞！ｉ４濁液を軸装した。この懸濁液０．
１ｄを、２．６−ジブロムプリン２　ｅｑ；ｔ／ｄを含
む寒天平板培地（グリ、セロール０．５％、硫酸アンモ
ニウム０．１％、！ｊン＃１ニカリウム０．７％、リン
酸第１カリウム０．３％。

硫酸マグネシウム・７水和物０６０１％、寒天１．５％
）に塗布した。これを３０℃にて３日間培焚して生じた
コロニー釣菌分離し、Ｌ＝−プロリン生馳性を実施例１
に記載したようにして調・べ、セラチア・マルセッセン
スＤＢｒ−５１株を取？４１だ。

参考例３ （セラチア・マルセッセンスＤＴｒ　−１２株の取得方
法） セラチア・マルセッセンス５ｒ４１から誘寺したＬ−プ
ロリン分解酵素欠損性でかつ３．４−デヒドロ−ＤＬ−
プロリン耐性な変異株Ｄｒ−９を参考例１に従って取得
し°た。このＤｒ−９株を参考例１と同様にしてＮ−メ
チル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロングアニジンで変異誘
等処理し、細胞懸濁液を調製した。この懸−液０．１　
ｄを、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸１．０　、ａ
ｙ／ｄ！を含む寒天平板培地（コハク酸ナトリウム０５
％、硫酸アンモニウム０．１％、第１リン酸カリウム０
，３％、９Ｊ２リン酸カリウム０．３％、硫酸マグネシ
ウム０．０１％、寒天１．５％）に塗布した。これを３
０℃、４゛日間培養して生じたコロニーを釣菌分離し、
Ｌ−プロリン生産性を実施例１に記載したようにして調
べ。

セラチア・マルセッセンスＤＴｒ−１２株を取得シた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　セラチア属に属し、Ｌ−プロリン生産能を自する
   微生物を培養して培地中にＬ−プロリン、を生成蓄積せ
   しめ、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ
   −プロリンの製法。 ２、　微生物が、セラチア−に鵬し、Ｌ−１０リン分解
   酵素欠損性でかつプロリンアナログ及び／又はプリンア
   ナログに耐性なＬ−ゾロリン生産菌である特許請求の範
   囲第１項記載の製法。 ３　微生物が、セラチア属に属し、Ｌ−プロリン分解酵
   素欠損性でかつプロリンアナログ耐性なＬ−ゾロリン生
   産菌である特許請求の範囲９ｉｓＩ項記載の製法。 屯　微生物が、セラチア属に属し、Ｌ−プロリン分解酵
   素欠損性でかつプロリンアナログ及びプリンアナログに
   耐性なＬ−プロリン生鼓圃である特−２、特 許請求の範囲第１項記載の製法。 ＆　微生物が、Ｌ−プロリン生産能を有するセラチア・
   マルセッセンスである特許請求の範８第１項記載の製法
   。 ａ　セラチア・マルセッセンスが、Ｌ−プロリン分解酵
   素欠損性でかつプロリンアナログ及び／又はプリンアナ
   ログに耐性なＬ−プロリン生産能を有スるセラチア・マ
   ルセッセンスである特許請求の範囲第５項記載の製法。 ７、　セラチア−マルセッセンスが、Ｌ−プロリン分解
   ＃素欠加性でかつプロリンアナログ耐性なＬ−プロリン
   生産能を有するセラチア・マルセッセンスである特許請
   求の範囲第５項記載の製法。 ａ　セラチア・マルセッセンスが、Ｌ−プロリン分解酵
   素欠損性でかつプロリンアナログ及びプリンアナログに
   耐性なＬ−プリン生産能を有するセラチア・マルセッセ
   ンスである特許請求の範囲第５項記載の製法。 張　セラチア［株］マルセッセンスが、Ｌ−プロリンオ
   キシダーゼ欠損性でかつ３．４−デヒドロ−Ｄ−３− Ｌ−プロリンに耐性なＬ−プロリン生産能を旬Ｊるセラ
   チア・マルセッセンスである特許請求の範囲第５項記載
   の製法。 １０　　セラチア・マルセッセンスか、Ｌ−プロリンオ
   キシダーゼ欠損性でかつ３．４−ナヒドローＤＬ−プロ
   リン及び２．６−ジブロムプリンに耐性なＬ−プロリン
   生産能を有するセラチア・マ、ルセッセンスである特許
   請求の範囲第５項記載の製九１１、セラチア・マルセッ
   センスが、Ｌ−プロリンオキシダーゼ欠損性でかつ３．
   ４−デヒドロ−ＤＬ−プロリン及びＬ−チアゾリジン−
   ４−カルボン酸に耐性なＬ−プロリン生産能を有するセ
   ラチア・マルセッセンスである特許請求の範囲第５禎記
   載の製法。