JPH042059B2

JPH042059B2 -

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Publication number: JPH042059B2
Application number: JP61063861A
Authority: JP
Priority date: 1985-03-22
Filing date: 1986-03-20
Publication date: 1992-01-16
Also published as: AU5502286A; EP0196197A3; JPS61226052A; CA1254137A; DE3680366D1; AU581588B2; EP0196197A2; US4642117A; EP0196197B1; ATE65405T1

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は身体治療成分および方法、および特に
法人可能な機械的に剪断したコラーゲン繊維組織
注入材料、およびこれの調製と使用方法に関する
ものである。（従来の技術）コラーゲンは皮膚、腱、軟骨、骨および間質な
どの硬、もしくは軟結合組織の置換または増大の
ための挿入材料として使用されてきた。初期のコ
ラーゲン挿入材料はしばしば、機械的性質の改
良、免疫原性の低下、および／もしくは吸収に対
する抵抗性の増大のために、化学薬剤、照射もし
くは他の方法で、架橋された固体コラーゲン材料
であつた。固体架橋コラーゲン挿入材料の大きな
欠点は切開手段により外科的挿入処置を必要とす
ることである。固体コラーゲン挿入材料の他の欠
点は変形能および柔軟性の欠如である。外科的挿入固体コラーゲン材料に対する有効な
代替物が米国特許No.3949073に開示され、そして
軟組織を増大させるための注入可能な挿入材料と
してコラーゲンの分解ペプチドの使用を含んでい
る。本挿入材料はまず、典型的にはコラーゲンを
１つあるいはそれ以上の低PHで作用するタンパク
分解酵素で処理することにより、分解ペプチドコ
ラーゲン繊維の溶液を作ることにより調製され
る。可溶化された繊維は繊維溶液のPH、イオン強
度および／もしくは温度を上げることにより再形
成された繊維材料を形成する能力を有する。特許
’073の方法を行うには、可溶化された繊維懸濁
液を生理的イオン強度およびPH条件にし、そして
皮下注射針を用いて増大させるべき部位へ注入す
る。注入の前に始まり、増大部位で持続する繊維
の再形成過程は固体コラーゲン挿入物に対し、注
入可能であることに加えて、多数の重要な利点を
有する繊維コラーゲン材料を生ずる。一般的に認められている米国特許No.4424208は
再形成されたコラーゲンと化学的に架橋された分
解ペプチドコラーゲンの双方を含む注入可能なコ
ラーゲン材料を開示している。この材料は改善さ
れた持続性、すなわち上記特許’073に述べられ
ている再形成された非架橋性挿入材料に対し、挿
入物の容積の一定性、を提供する。上述の特許に開示された注入可能なコラーゲン
挿入材料の利点および全般的な有用性にも拘わら
ず、特に材料を長期間保存した場合に、本材料の
注入に付随した問題が生じた。一つの問題は、適
切な大きさの注射針を通して本コラーゲン材料を
押し出すのに、比較的高い押出力、約50〜60N
（ニユートン）、が必要なことである。関連した問
題点は針を通して材料を押し出すのに必要な圧の
急激な増大により特徴的な“詰り”効果が生ず
る、すなわちこの材料が針の中で部分的につまる
傾向があるということである。極端な場合、注射
器に圧をかけ続けると針あるいは注射器が凝集し
たコラーゲン繊維により壊れ、針の連結部から注
入材料が注射器の外へこぼれ出す。高粘性、詰
り、および漏出問題が合わさつて、コラーゲン注
入処理での使用に対し、この材料が不適当となる
傾向があり、また保存期間と共にこれら問題点の
程度が増大するので挿入材料の有効保存寿命を制
限している。粘性を低下させた改良架橋コラーゲン挿入材料
が“注入可能な架橋コラーゲン挿入材料”の名称
で1984年10月28日に差し出された共有のCIP出願
No.663478号に開示されている。この改良材料は小
繊維内架橋を主に生ずる条件下で再形成分解ペプ
チドコラーゲンを架橋することにより調製され
る。粘性低下に加え、上述の２特許の材料に比べ
本架橋材料はまた改良された持続性とタンパク分
解酵素分解に対する抵抗性を示す。これらの利点
にも拘わらず、詰りおよび注射器破損に関する問
題が、特に数ケ月の保存期間後には、注入による
本材料投与の際に生ずる。（発明が解決しようとする問題点）本発明は架橋および非架橋両方のコラーゲン注
入繊維懸濁液において改良された注入可能特性を
提供する、注入可能なコラーゲン注入材料を含
む。本材料は再形成され機械的に剪断された分解
ペプチドコラーゲン繊維を含む。この繊維は50〜
200ミクロンのサイズの範囲にあることが望まし
い。この改良された注入可能特性は投与の際の低
い押出力、典型的には剪断されていない繊維材料
より20〜30％低い押出力、および詰りや注射器破
損の実質的な除去を含む。本材料は従つて投与が
容易でかつ安全であり、一般に長期間の保存寿命
を有する。本発明の方法では、挿入材料はまず分解ペプチ
ドコラーゲン溶液をコラーゲン繊維の懸濁液を生
ずるように再形成することにより調製される。こ
の懸濁液を最大の繊維のサイズを低下させるよう
に、典型的には1/2以下に低下させるように、機
械的剪断をかける。好ましい方法としては、再形
成された繊維を200〜300ミクロンのメツシユサイ
ズを有する硬いスクリーンメツシユに複数回通す
ことにより剪断する。この再形成され、機械的剪
断を受けたコラーゲン材料を出来れば８〜24時間
保温し、洗浄し、ヒト患者への患者への注入に適
した形に再懸濁する。剪断後の保温は、小繊維内
架橋を主に生ずる条件下で、架橋剤の存在下で行
なう。本発明の一つの一般的な目的は、比較的低い押
出し圧で皮下注射器により投与出来、それに付随
して詰りや注射器破損を起こさない、機械的に剪
断した挿入材料を提供することである。本発明の他の目的は架橋型もしくは非架橋型の
いずれかで、そのような材料を提供することであ
る。本発明の更に他の目的は注入能の明らかな低下
なしに１年間もしくはそれ以上の期間、保存可能
なコラーゲン挿入材料を提供することである。そのような材料の調製方法を提供することもま
た本発明の他の目的である。本発明のこれらおよび他の目的と特色は、以下
の本発明の詳細な説明を添付図と共に読めば、更
に全体が明らかになるであろう。（問題点を解決するための手段）本発明の注入可能なコラーゲン材料は、再生成
され機械的に剪断された分解ペプチドコラーゲン
繊維より成る。本発明の注入可能なコラーゲン材料は、繊維サ
イズが約50〜150ミクロンの再形成され、架橋さ
れていない、機械的に剪断された分解ペプチドコ
ラーゲン繊維からなる。本発明の注入可能なコラーゲン材料は、繊維サ
イズが約50〜200ミクロンの再形成され、架橋さ
れ、機械的に剪断された分解ペプチドコラーゲン
繊維から成る。本発明のコラーゲン挿入材料を調製する方法
は、再形成された分解ペプチドコラーゲン繊維を
供給すること、および繊維サイズを実質的に短く
しサイズが不均一になる迄該繊維を機械的に剪断
すること、を包含する。第１節再形成コラーゲン繊維の調製本発明のコラーゲン挿入材料は、かなり多数の
ホ乳類を源として得たコラーゲンに由来し得る。
供給源は、材料が永久的に挿入される宿主とは遺
伝的に同じである必要はない。その入手の容易さ
のため、牛あるいは豚の真皮がふつう用いられて
いる。再形成コラーゲン繊維の調製の第１段階は、動
物の皮の真皮より溶液中分解ペプチドを調製する
ことである。皮を弱酸に浸し、毛、表皮そして脂
肪を除くためにこすることにより柔らかくする。
毛を抜いた皮を弱酸中に再び浸し、そしてこすり
減らしたり、きり刻んだり、粉砕したりあるいは
物理的処理により細かに砕く。粉砕は可溶化のた
めの皮を調製する。分割した組織を、水性媒質に分散させ非変性状
態下で可溶化し、コラゲナーゼ以外のタンパク分
解酵素、酸性PHで活性のある酵素の方が好ましい
が、により消化する。変性を防ぐためにふつう、
低温で希釈酸溶液を用いる。塩酸のような鉱酸、
もしくは酢酸、マロン酸もしくは乳酸のようなカ
ルボン酸を使つてもよい。用いた酵素により、PH
は約1.5から５の範囲に、また温度は約５℃〜25
℃の範囲にする。好ましい手順としては、細かく
砕いた組織を塩酸に、濃度を10〜30ｇ／で、PH
は約２で、20℃で分散させる。組織を分散させた
後、酵素を加え、混合液を分解ペプチドや組織の
他の可溶成分を酵素が消化できるように保温す
る。ヘリツクス部分は変性していないコラーゲン
の分解ペプチド部分に作用する酵素を用いる。こ
のような酵素の例としてはペプシンとパパインが
ある。ペプシンが好ましい、というのは、比較的
容易に不活性化し、可溶化したコラーゲンより除
去できるからである。酵素濃度は、ふつうコラー
ゲンを基準にした重量の約0.1％から10％の範囲
にする。保温期間は典型的には約２日から２週間
の間にする。１度、可溶化が完了すると、酵素を
不活性化し（変性させ）、除去する。酵素を変性後、変性した酵素や可溶化時に消化
した組織の部分を除くために溶液を処理する。
種々の透析、沈澱、および濾過技術が、このよう
な除去を行うのに用いられる。米国特許番号
3949073、第３欄、10から22行目および米国特許
番号4140537第５欄、48行目から第16欄、34行目
まで、を見よ。そこで開示されていることはここ
では参考として組み込まれている。沈澱を濾過
し、濾液を濃縮して、移植材料を作るのに使用で
きる実質的に純粋な分解ペプチドコラーゲン溶液
を生産する。“分解ペプチド”は、ここでは（可
溶化のための酵素処理により）除去された末端の
未分解ペプチド群を持つ可溶化したコラーゲンと
して定義し、それゆえに三重らせんコラーゲンを
実質的に構成している。牛の分解ペプチドコラー
ゲン小繊維溶液の調製は、以下の実施例１に詳し
く述べられている。挿入材料を調製する次の段階は、溶液から分解
ペプチドコラーゲン繊維を再形成することであ
る。再形成は、温度を下げて、約10℃から25℃が
好ましいが、溶液を中和することにより行うのが
好ましい。中和した溶液のイオン強度は生理的条
件に照らして等張が好ましい。イオン強度は約
0.03から0.1の範囲、好ましくは0.06であるが、で
典型的には用いられるだろう。中和は、水酸化ナ
トリウムもしくはリン酸ナトリウムのような適当
な塩基あるいは緩衝液を加えることにより、溶液
のPHを典型的に約６から８の間にまで、溶液中の
コラーゲン小繊維が、ここでは繊維と言及してい
る繊維状の会合体を形成するレベルにまで、上げ
ることを含む。これらの条件下で繊維形成は、PHが約4.9から
10.0の範囲で起こる。再形成媒質の最終PHは、約
５と８の間が好ましい。再形成段階の持続期間
は、通常1/2時間から12時間の間で、約１〜４時
間の間が好ましい。本発明による機械的剪断の有
効な効果は、コラーゲンを実質的に長時間、例え
ば24時間を越えて再形成させるときよりも、剪断
が再形成の数時間以内に完了するときの方が実質
的に大きい、ということを本発明を支持するため
に行なつた実験は示している。牛のコラーゲン分
解ペプチド繊維を再形成させる方法は実施例２で
詳しく述べている。２時間もしくは１日の再形成
期間後、コラーゲン繊維材料における機械的剪断
の効果は、実施例６に見られる。第２節機械的に剪断されたコラーゲン繊維の調
製第１図は、本発明の方法により再形成したコラ
ーゲン繊維の懸濁液を機械的に剪断するのに用い
るシステムを図式化している。システムは加工し
た再形成材料を保つ容器１０を含む。容器は容器
の内容物をシステム操作中充分撹拌されるように
保つよう働く振とう器１２に支えられている。容
器からの材料は、約７〜８／minまでの望まし
いポンプ容量を持つポンプ２０によりシステムを
通じて再循環させる。望ましいポンプは蠕動運動
型ポンプで、材料が無菌状態で加工されるような
ものである。本発明で充分であることを証明した
１つの蠕動運動型ポンプは、Randolphペリスタ
ルチツクポンプ、モデル＃610−101で、ランドル
フ・コーポレーシヨン（マンカカ、TX）より購
入した。このシステムの機械的剪断は、フイルターセツ
ト１４内に支持され、納められている堅めのメツ
シユスクリーン１６を通じて、再形成したコラー
ゲン繊維材料をポンプで送ることで成し得た。そ
のセツトは、掃除やスクリーンの取換え用に解体
でき得る。クリエイテイブ・サイエンテイフイツ
ク社（ロングビーチ、CA）より購入した47mmの
フイルターのセツトは、本発明を実行するにあた
り充分使えた。異なるメツシユサイズを持つスク
リーンは、このセツト用に利用できるもので、機
械的に剪断された材料に最良の利益をもたらすよ
うメツシユサイズの選択ができる。以下の実施例
３に見られるように、60メツシユスクリーンは、
約250ミクロンのメツシユサイズを持つが、濾過
された材料について観察された注入特性より証明
されたように、優れた機械的剪断の特質を供す
る。さらに一般的には、約200〜300ミクロンの間
のスクリーンメツシユサイズが本発明を実行する
のに好ましい。再循環している材料は、熱交換器１８を通るこ
とにより冷やされる。冷水循環付きの従来の水ジ
ヤケツト型熱交換器で充分である。この型の熱交
換器は、実施例４で見られるように約７／min
までのシステム流速が適当である。フラスコ、フイルターセツト、熱交換器、およ
びポンプは、融通の効く管組織２２あるいはそれ
に似た、1/2“IDゴムチユーブのようなものによ
り、図に示したようにして連結している。全体の
システムは、好ましくは集合単位として、殺菌で
きる。濾過したコラーゲン材料のある注入特質で証明
されているような再形成繊維の所望のサイズを達
成するために、スクリーンメツシユスサイズ、ポ
ンプの流速、および剪断システムにおける全容積
の循環時間を選択する。皮下注射針、典型的には
27−30ゲージの針であるが、を通して、未濾過コ
ラーゲン調製物の状態で押出すと遭遇する上記に
挙げた問題の面から、これらの特質が理解され
る。これらの問題のうちの１つは、針を通して材
料を押出すのに必要とされる比較的高い圧力であ
る。取り上げたようにこの問題は未濾過材料の高
い粘度によるものであり、材料を注入する際の困
難に通じ得る。究極的に高い粘性は、押出し力が
約70Nより高いようなところでは材料を役立たな
くしてしまう。本発明により剪断すると、繊維挿
入材料は実質的に減じた押出し圧力、典型的には
同条件下で未濾過コラーゲン挿入材料を押出すの
に必要なものよりも20〜50％低い押出し圧力、を
示す。従来の型のコラーゲン挿入材料を注入する
ことに関連する２つの大きな問題、詰りおよび漏
れ出すこと、は最適な剪断条件下で生み出される
挿入材料では実質的に除外される。スクリーンメツシユサイズ、ポンプの流速、お
よび全循環時間の粘性、詰り、および漏れ出し特
性に対する影響をこれから考える。スクリーンメ
ツシユサイズは上に挙げたように、200〜300ミク
ロンの間が好ましい。より小さいメツシユサイズ
では、例えば150ミクロンでは、スクリーンは容
易につまりやすく、システムが使えなくなる。比
較的大きなメツシユサイズ、例えば、約１mmもし
くはそれ以上では、材料は押出し圧力のわずかの
減少を示すが、未濾過材料に対し、詰りおよび漏
れ出しにほんのわずかの変化しか示さないであろ
う。実施例３中のデータは、250ミクロンメツシ
ユスクリーンを通して繊維材料を濾過することは
未濾過材料に対して50％まで押出し圧力を減じ、
実質的に押し出し中の詰りや、漏れ出しを防ぐと
いうことを示している。比較することにより、
1.19mmメツシユスクリーンを通しての濾過は押出
し圧力が適切な減少を示すが、材料のかなりの詰
りおよび漏れ出しが残つている。流速の影響を考えると、減少した押出し圧力や
濾過した材料における詰りおよび漏れ出しがより
起こりにくいということより証明されているよう
に、より高い流速は一般的により効果的な機械的
剪断が伴う。スクリーンが250ミクロンメツシユ
スクリーンであると、濾過した材料の良好な押出
し特性が、以下の実施例４で示されているデータ
からわかるように、およそ６／minから７／
minの範囲の流速で得られる。未濾過材料に対し
て押出し圧力の約50％の減少と、詰りおよび漏れ
出しを事実上除くということをデータは示してい
る。流速が５／minでは、未濾過材料に対して
押出し圧力の部分的な減少だけが観察され、押出
し中にある程度の詰りおよび漏れ出しが起こつ
た。比較的高い流速、例えば８／minでは、あ
まりにも多くの熱が管組織で生じ、繊維材料の変
性をもたらす。６／minと７／minの両方の
流速では、濾過した材料において好ましい注入特
性を生み出すが、低い６／minの流速の方がシ
ステムにおける圧力や熱生成が少なく好ましい。システムの循環時間は、材料がメツシユスクリ
ーンを多数回、好ましくは約50と180回の間であ
るが、通過できるように選択する。１回以上の必
要性は、未濾過材料の注入特性を一回の通過もし
くは約60回の通過による濾過材料の注入特性と比
較している実施例５のデータに示されている。そ
のデータは、１回通過するだけで押出しにおいて
中程度の減少があるが、実質的には押出し中に観
察される何回もの詰りは減少しないことを示す。上記の最適循環時間を越えて、さらに濾過する
と材料の押出し圧力を増加させることができる。
約250ミクロンのメツシユサイズのメツシユスク
リーンに対して約６／minの流速で、約180回
後（実施例５）に、材料の押出し圧力増大が観察
される。循環を多くした時に見られる増大した押
出し圧力効果は、小さい繊維の高濃度の材料で予
想される増大した材料の粘度によるものであると
言えそうである。かくして、機械的剪断過程は、
針の内壁に沿つて詰りを誘導したり、針内部に繊
維網を形成するぐらいの非常に大きなものと比較
的高い粘性効果を生み出す非常に小さなものの間
のサイズの中間であるような繊維になるような条
件下で、最適に行なえる。機械的剪断のための条
件は、繊維のサイズが50から200ミクロンの範囲、
望ましくは50〜150ミクロンサイズである最終挿
入材料を生み出すように選択することが望まし
い。第３節挿入材料用に濾過した材料の調製濾過手順に続いて、注射特性を促進させるた
め、材料を再形成媒質中でさらに保温する。濾過
後の保温段階は、所望の最終挿入材料に応じて、
選択した濃度と化学反応条件下で行う。架橋して
いない挿入材料を作るため、再形成し濾過した材
料を、典型的に約２〜５mg／mlの濃度で、約11℃
から24℃の間で数時間保温する。濾過後の普通の
保温時間は約４時間から24時間の間であるが、好
ましくは約12時間である。以下の実施例６は、濾
過したコラーゲン繊維懸濁液の押出しプラトー圧
力に及ぼす一晩保温することの効果を表してい
る。一般的に、濾過後の保温は、第２節および実
施例３〜６で取り上げているように、プラトー圧
力を顕著に低下させるのに必要である。おそらく
濾過後の保温の効果は、濾過後の懸濁液内で起こ
る繊維の会合状態の付加的な変化によるものであ
る。実施例７で示されている繊維の測定から、最
終的に濾過して、保温した材料は60〜125ミクロ
ンの範囲の繊維サイズを持つ。この範囲は、同じ
条件下において機械的剪断なしで調製した材料が
約60〜350サイズの範囲であることと異なる。繊
維サイズの減少は、広範囲の剪断速度で測定する
と（実施例７）、粘度の約20〜30％の減少を伴う。濾過し、保温した材料を濃縮し、例えば１回あ
るいはそれ以上の遠心分離段階を経て、そして最
終的に所望の濃度、典型的には適切な注入媒質で
約20〜80mg／ml、になるように再懸濁する。１つ
の好ましい最終的な挿入材料は、PH６〜８の等張
な媒質に約65mg／mlのタンパク濃度になるように
懸濁した繊維より成る。濾過し、保温した材料
は、架橋していないコラーゲン繊維の挿入材料と
して用いるのに適切である。材料は、減少した粘
性（実施例７）と減少した押出し圧力（実施例３
〜６）を持ち、注入時に詰まつたり、あるいは洩
れたりすることは実質的に起こらない。材料の貯
蔵性は以下で考察する。本発明の第２の具体例は、注入可能な架橋コラ
ーゲン挿入材料に関する共有特許出願において詳
しく述べている架橋法に従つて、繊維内架橋を主
にもたらす条件下で、再形成し濾過した懸濁液を
保温することである。典型的な反応条件下で、濾
過したコラーゲン懸濁液を、約0.1〜10mg／mlの
間の濃度で、さらに一般的には１〜５mg／mlの濃
度で、最終濃度が約0.001重量％から0.10重量％
の間になるように、グルタルアルデヒドのような
アルデヒド架橋剤と反応させる。架橋反応の時間
はふつう１時間半から約１週間という範囲であ
り、反応はふつう約10℃から35℃の間で行う。反
応は、遊離したリジンのような可溶性アミンを加
えることにより励起できる。再形成と架橋反応が
終結した後、材料を洗浄し、適切な注入緩衝液に
懸濁してタンパク濃度の範囲を典型的な約20と65
mg／mlの間にしてさらに調製する。以下の実施例
９は、PH7.0の等張な緩衝液に懸濁した約35mg／
mlの繊維を含む濾過し架橋した挿入材料を調製す
る手順を詳しく述べている。濾過し架橋した繊維のサイズを測定すると、濾
過し架橋していない材料で観察されるものと同じ
約80〜125という繊維サイズの範囲を示す。対照
的に、濾過していない架橋繊維は約80〜710ミク
ロンで、上限は未濾過の非架橋材料のそれの大ま
かに言つて２倍、というサイズの範囲を持つ。ひ
とまとめに言つて繊維サイズのデータは、より小
さい濾過した繊維は、大きい未濾過繊維（その最
も大きいサイズは架橋により２倍になる）よりも
繊維間架橋（架橋しても繊維のサイズの範囲に評
価できるほどの変化がないということにより示さ
れる）を形成しにくいということを示している。実施例10で示されているように、濾過し架橋し
た材料の粘度は、同様に調製はしたが未濾過の架
橋した材料のそれよりも約50％以下である。非架
橋材料よりも濾過することにより作成した架橋繊
維の粘度がより大きく減少していることは、非架
橋材料で作成したよりも濾過することにより作成
した架橋した材料により大きな繊維サイズの減少
があるということに一致する。また、実施例11に
示すように27ゲージの針の中を濾過、または未濾
過架橋材料を押出すのに要する圧力の測定結果
は、このサイズおよび粘性のデータに一致する。
未濾過の架橋材料に関して50％かそれ以上の押出
し圧力を濾過することで減少させているというこ
とがわかる。実施例11に示されている試験も未濾過架橋材料
に見られる顕著なレベルの詰まりや閉塞が実質的
に除かれていることを示している。このように濾
過し架橋した材料は、未濾過、未架橋材料で観察
されるより低い押出し圧力や、詰まり、注射器の
閉塞が顕著に減少するという点において、同じ利
点を示している。濾過することにより成し得る押出し圧力や詰ま
る回数の減少な第５図でも見られ、そこでは30ゲ
ージの針の付いたツベルクリン用注射器から架橋
コラーゲン材料を押出すのに要する圧力を示して
いる。第５図Ａは0.0075％グルタルアルデヒドで
架橋し、35mgタンパク／mlでリン酸緩衝化食塩水
に懸濁した未濾過の繊維状コラーゲンについて、
第５図Ｂは、同様に調製したが、濾過した架橋材
料について示したものである。濾過した挿入材料、架橋および非架橋の両方で
観察される向上した注入特質は、かなりの貯蔵期
間にわたつて維持されている。以下の実施例10で
報告しているように、濾過し架橋した材料は、注
入特質を調べた２ケ月間以上、押出し圧力あるい
は詰まりや閉塞の程度は顕著に変化しないことを
示している。濾過した非架橋材料においては、未
濾過材料に比べて調製物の減少した粘性は12ケ月
間以上も維持され、最初の３ケ月の貯蔵後に粘性
の比較的小さい初期増加が起こつた後は実質的な
変化は示さなかつた。これらの結果は実施例11に
詳しく述べてある。前述のことから、いかに本発明の種々の目的と
特徴が希望にかなつているかが、評価できる。架
橋そして非架橋両方の機械的に剪断した挿入材料
は未濾過材料に要求されるよりも実質的に少ない
押出し圧力で注射により投与することができる。
減少した押出し圧力は、材料は投与したり、投与
速度をよりよく制御することがより容易になるよ
うにしている。本発明の重要な特徴によると、手順は詰まりや
投与中の注射器の閉塞を実質的になくし、材料を
より容易に、より安全に使えるようにしている。
詰まりや閉塞の問題は未濾過の調製物において貯
蔵を増加させる傾向にあるので、剪断過程は材料
の貯蔵生命を実質的に拡張している。本発明に従つて形成したコラーゲン挿入材料を
皮内あるいは皮下に注射することにより、軟組織
を増加させたり、先天性異常、後天性疾患あるい
は美容的欠点を治したりあるいは整形したりする
ことができる。組織増量用の特別な使用は、上記
に挙げた共有特許と特許出願において詳しく述べ
ている。本発明は、単一の濾過装置を用いることにより
容易に実現し、またスクリーンサイズ、ポンプの
流速、そして全循環時間を含む操作条件を、取り
扱う材料の注射特質を最適にするよう変化させる
ことができる。以下の実施例は、調製法、剪断手順の効力に及
ぼす様々な因子の影響、そして濾過した架橋およ
び非架橋材料の特質、を含む本発明の様々な具体
例を示している。これらの実施例は本発明の展望
を制限するものではない。（実施例）以下に本発明の実施例について説明する。実施例１分解ペプチドの牛コラーゲン溶液の調製牛の皮をなめし、酢酸溶液を用いた処理により
抜毛した。次にその皮を細かく砕き、PH２、濃度
10〜30ｇ／の塩酸溶液に懸濁した。新しく調製
したペプシン溶液（0.5ｇ／10ml0.01M HCl）を、
その懸濁液に全タンパク重量に対して0.1％とな
るように加え、その混合液を15〜20℃で約100〜
300時間保温した。ペプシン処理に続いて、保温
媒質のPHを7.0以上に上げてペプシンを変性させ
反応を終結させるためにNaOHを加えた。次に
その溶液を精製して、希薄HCl、PH１〜４中で最
終濃度を３mg／mlとした。実施例２繊維状コラーゲンの材料の再形成 0.2MのNa₂HPO₄を加え中和することにより実
施例１のコラーゲン小繊維溶液から繊維状コラー
ゲンを再形成した。その後溶解させたコラーゲン
小繊維を15〜22℃、２時間で凝集させた。実施例３スクリーンのメツシユの大きさの効果第１図に図示し、上記の第２節で概説した濾過
システムを用いて実施例３〜４を行つた。システ
ムの構成としては、Randolph Corp.
（Manchaca、TX）から購入したRandolphモデ
ル610−101ペリスタルチツクポンプ、Creative
Scientific Co.（Long Beach、CA）から購入し
たモデル47806−000 47mmフイルターセツトそし
てMillipore Corporation（Bedford、MA）から
購入した100（149μｍ）、60（250μｍ）、14（1.19mm
）
の網目状ワイヤースクリーンを含んでいた。実施例２のように調製した亜形成コラーゲン繊
維懸濁液の各々のサンプルを濾過システム容器中
に置いた。各サンプルの体積は約400mlで、材料
の濃度は約３mg／mlであつた。このシステムのフ
イルターセツトには、100メツシユ、60メツシユ
または14メツシユスクリーンのいずれかを使用し
た。サンプルは体積速度６／minでシステム中
を循環させ、その間フラスコの内容物を、振盪に
より撹拌した。合計の循環回数は、その材料がフ
イルターを約225回通過するのに相当した。 100メツシユスクリーンはすぐに目詰まりし、
その材料はそれ以後の処理および検査を行わなか
つた。濾過しない材料（対照）および14メツシユ
と60メツシユスクリーンで濾過した材料を室温で
一晩保温し、その後17000ｇでの遠心によりサン
プルを濃縮し最終濃度が約65mg／mlとなるように
0.02M Na₂HPO₄、0.13M NaCl、PH7.4に再懸濁
した。各々のサンプルを1.25c.c.シリンダーに入
れ、押出し速度約30mm／minで30ゲージの針の中
を押出した。押出しプラトー出力、および押出し
中に見られる詰まりと洩れの程度を調べるために
押出しの過程を監視した。材料を一定速度で針を通して押出すのに必要な
プラトーの、即ち定常の圧力として押出し圧力を
測定した。シリンダーに加えられた力は、圧力変
換器により測定した。下記の表１の第２欄に示さ
れ、ニユートン（Ｎ）で表されている、得られた
データは、機械的剪断、特に60メツシユスクリー
ンを繰り返し通過させることにより剪断は、押出
し圧力を濾過しない材料に比べて50％以上も減少
させることができることを示している。

【表】詰まりは押出し操作中に観察された60N以上の
一時的な圧力のピークとして測定した。洩れはシ
リンダーと針の間の接続部からの材料の漏出とし
て検出した。表１のデータは（合計の押出し体積
３〜４mlについて測定した）詰まりと洩れが60メ
ツシユスクリーンに何回も通した材料においてか
なり減少したことを示している。実施例４流速の効果再形成したコラーゲン繊維懸濁液（３mg／ml、
２時間で再形成）を調製し、材料400mlのサンプ
ルを実施例３の濾過システム中の容器に加えた。
フイルターセツトに60メツシユのワイヤースクリ
ーンを装着した。ペリスタルチツクポンプは、ポ
ンプ作動時間を材料が約60回スクリーンを通過す
るように合わせるために、下記の表２の左に示し
てある４種の異なるポンプ速度の１つで操作し
た。対照サンプル（濾過なし）と４種の機械的剪断
サンプルの各々を一晩保温し、遠心により凝縮
し、そして最終濃度が約65mg／mlとなるように再
懸濁した。押出しのプラトー圧力、そしてサンプ
ルを27ゲージ針を通して押出した時に起こる詰ま
りと洩れの回数を実施例３に述べられた操作に従
つて調べた。結果を下記の表２に示す。

【表】８／minの流速で、システム中の熱の蓄積に
よりコラーゲンタンパクが変性し、その材料につ
いてはそれ以後の処理および検査を行わなかつ
た。５／minで行われた機械的剪断は、比較的
高いプラトー圧力と、６または７／minで処理
されたサンプルで見られるよりも多い詰まりと洩
れの回数から明らかなように準最適であつた。実施例５処理時間の効果実施例２からの再形成コラーゲン繊維懸濁液の
サンプル（３mg／ml、２時間で再形成）を、循環
回数の選択のために第１図のシステムで60メツシ
ユのスクリーンを通過させて循環させた。最初に、材料の400mlサンプルを４秒（１回）
もしくは５分（75回）間循環させ、その後一晩保
温し、遠心により凝縮し最終濃度が約65mg／mlと
なるように再懸濁した。２種のサンプルと対照
（濾過していない）サンプルを30ゲージの針を通
して押出し、そしてプラトー圧力および詰まりと
洩れの回数を実施例３のように決定した。下記の
表３に示した結果は、詰まりを減少させ、押出し
圧力の最大の減少を得るためには、材料をメツシ
ユスクリーンに何回も通過させることが必要であ
ることを示している。

【表】 60メツシユスクリーンを通してのさらに多くの
循環の効果を、実質的に同様な実験条件において
調べた。各々400mlずつの５つのサンプルを60メ
ツシユスクリーンを通して、６／minの流速で
下記の表４の左の欄に示されている回転数に対応
して時間間隔を増加させて循環させた。材料はそ
の後一晩保温し、遠心により濃縮し、上記と同様
に最終濃度が約65mg／mlとなるように再懸濁し
た。５つのサンプルと対照（濾過していない）サ
ンプルを30ゲージの針を通して押出し、表４の右
に示してあるようなプラトー押出し圧力が得られ
た。

【表】このデータは、流速約６／minで60メツシユ
スクリーンを用い材料を約60から180回の間で循
環させることにより、機械的濾過操作における最
も良い有効性が生み出され、これ以上の循環回数
は非常に高い押出しプラトー圧力を起こすことを
示している。実施例６機械的剪断の前後における繊維の保温時間の効
果実施例１からのコラーゲン繊維懸濁液を最終タ
ンパク濃度が約３mg／mlとなるように調製した。
この材料を８つのサンプルに分け、次のように処
理した：最初の対照（Con−１）サンプルは実施
例２の操作に従つて２時間の再形成の後遠心し、
その後遠心により濃縮して最終濃度が約65mg／ml
となるように再懸濁した。２番目の対照（Con−
２）サンプルは、再形成の条件下で24時間保温
し、その後上記と同様にして遠心し再懸濁した。
実施例３と同様にして測定した30ゲージの針を通
しての押出しでの押出しプラトー圧力を表５の右
側に示す。このデータは、再形成時間それ自体は
小繊維状材料の押出し圧力には大きく影響しない
ことを示している。表５で３〜６と示された、さらに４つのサンプ
ルは、実施例３に従つた再形成媒質中での２時間
の保温の後に各々を濾過した。そのサンプル（各
700ml）は流速７／minでそれぞれおおまかに
50または75回転に相当する５または7.5分間、60
メツシユスクリーンを通して濾過した。サンプル
３と４は濾過後ただちに遠心し、各々について最
終濃度が約65mg／mlとなるように再懸濁した。サ
ンプル５と６は表５に示すように濾過後一晩保温
し、その後遠心により濃縮し、サンプル３と４と
ほぼ同じ濃度に再懸濁した。４つのサンプルを
個々に30ゲージの針を通して押し出すことにより
表に示されている押出しプラトー圧力を得た。そ
の結果は、濾過後の保温により押出し圧力をさら
に減少させることを実証している。表５で７、８と示された最後のサンプルは、７
／minで60メツシユスクリーンで５分間（50
回）の機械的濾過をする前に再形成媒質中で24時
間保温した。その濾過材料は、ただちに遠心して
適当な押出し緩衝液に再懸濁する（サンプル７）
か、または遠心と押出し溶液への再懸濁の前に一
晩保温する（サンプル８）かした。２つのサンプ
ルを次に表に示す押出しプラトー圧力で30ゲージ
の針を通して押出した。その結果は第１に、機械
的剪断はわずか２時間で再形成した材料に比べ24
時間で再形成した材料における押出し圧力を減少
させることに対して実質的に効果が少ないこと、
第２にもつと長い再形成時間を用いれば、濾過に
続いての一晩の保温は押出し圧力に対して実質的
に効果がないことを示している。

【表】実施例７濾過−非架橋材料の粘性と繊維の大きさ実施例２からの再形成コラーゲン繊維懸濁液を
約60回の総体積循環に相当する時間、60メツシユ
スクリーンを通して７／minの流速で循環させ
た。濾過した材料をさらに一晩保温し、遠心によ
り濃縮し、最終タンパク濃度が約65mg／mlとなる
ように0.02M Na₂HPO₄、0.13M NaCl、PH7.4に
再懸濁した。濾過しない材料は、濾過段階を除く
ことのほかは同一の条件において調製した。濾過済材料および未濾過材料の繊維の大きさを
測定するために、材料の少量のサンプルを２枚の
顕微鏡のスライドの間に置き、地質学上の大きさ
を決める図表からの大きさの標準物と比較して、
サンプルの粒子の大きさを解剖鏡を用いて評価し
た。濾過した粒子の大きさは62ミクロンと125ミ
クロンの間であつた：濾過していない粒子の大き
さは62〜350ミクロンの間であつた。濾過済サンプルおよび未濾過サンプルの粘性
は、20℃の定温において10^-6から１／secまでの
いろいろな剪断速度で測定した。粘性測定は
Couetteセルに取りつけたContraves−Pheomat
モデル135粘性測定器（Contraves AG、Zurich、
Switzerland）を用いて行つた。濾過済材料
（△）および未濾過材料（〇）の粘性対剪断速度
の図を第２図に示す。見てわかるように、両方の
材料は剪断粘性（η）の対数と剪断速度（γ）の
対数とが直線関係となる。各粘性測定点で、濾過
済材料の粘性は未濾過材料のそれと比べて約25％
低かつた。実施例８濾過済−非架橋材料の安定性各々実施例７のようにして調製した３組の挿入
材料を５℃で最高12ケ月までの期間保存した。
0.5、１、２、３、４、10および12ケ月の保存期
間で実施例３の手順に実質的に従つて材料押出し
能について材料を検査した。第４図に示す結果
は、最初の数ケ月間は押出し力が徐々に増加し、
その後約30と40Nの間で力が一定となることを示
している。実施例９濾過−架橋挿入材料の調製実施例１からのコラーゲン懸濁液を実施例２に
従つた２時間で再形成し、７／minの流速で約
60回循環に相当する時間で60メツシユのワイヤー
スクリーンを通して循環させることにより機械的
濾過を行つた。約３mg／mlの濃度の再形成済・機
械的濾過済コラーゲン懸濁液165mlに0.075％グル
タルアルデヒド溶液PH３を18.3mlを加えた。グル
タルアルデヒド溶液は、最終濃度が0.0075％とな
るように撹拌しながら徐々に加えた。16時間の反
応期間後、架橋されたコラーゲンを0.02M
Na₂PO₄、0.13M NaCl、PH7.4の緩衝液約100ml
で３回洗浄し、各洗浄の間に17000×ｇで５〜７
分間遠心した。最後の洗浄と遠心の後タンパク濃度が約35mg／
mlとなるようにコラーゲンを上記の緩衝液で再懸
濁し、その懸濁液を27ゲージの針を取りつけたシ
リンダーに入れた。機械的濾過段階を行わずに他
は実質的に同様な方法で調製した対照の（濾過し
ていない）架橋済のコラーゲン懸濁液が約15Nの
プラトー力を示すのに比べ、この材料は針を通し
て押出した時に約6Nのプラトー力を示した。実施例 10 濾過−架橋材料の粘性と繊維の大きさ実施例９からの濾過−架橋材料と、濾過を除い
て同様に調製した未濾過−架橋材料を実施例７と
同様に地質学の図表の標準物と比較することによ
り繊維の大きさについて調べた。濾過済の材料は
約88と125ミクロンの間の範囲の繊維の大きさで
あり、未濾過材料は約88と710ミクロンの間であ
つた。濾過済と未濾過のサンプルの粘性を、実施例７
と同様にして剪断速度を10^-6から10²／秒の範囲
で測定した。濾過済材料（△）と未濾過材料
（〇）の粘性対剪断速度の図を第３図に示す。実
施例７で観察された結果に類似して、両方の材料
は剪断粘性の対数と剪断速度の対数とが直線関係
を示した。粘性測定の各点で濾過済の材料の粘性
は未濾過の材料のそれに比べ約50％少なかつた。実施例 11 濾過−架橋材料の安定性数組の濾過−架橋材料を実施例10のように調製
し、未濾過−架橋材料も濾過段階のみを除き同様
にして調製した。その材料を４℃または35℃で最
高８週間まで保存した。０、１、２、４、と８週
間の時点で多数のサンプルを両方の保存温度にお
いて27ゲージの針を通して押出し能を調べた。押
出しプラトー圧力と詰まりの回数を決定した。この試験で観察された濾過済材料の平均押出し
力は7.4（±0.8）Ｎであり、一回の押出しにおけ
る平均の詰まり回数は0.2（±0.3）であつた。８
週間の試験期間に渡つて、押出し能に大きな変化
は見られず、また４℃と35℃とで大きな違いも見
られなかつた。未濾過材料では平均の押出し力は
17.8（±4.6）Ｎで、押出し可能のサンプルについ
て、平均７（±３）回の詰まりが見られた。期間
または２つの保存温度の間で、大きな変化は見ら
れなかつた。本発明の望ましい具体例を述べてきたが、いろ
いろな変更や修正を本発明から離れることなく行
うことができることは明らかである。特に、機械
的剪断による再形成繊維状材料の処理について強
固メツシユスクリーンを通しての繊維の濾過を特
定の参照として述べてきたが、ここで述べた、繊
維の大きさを変える所望の効果を生み出すのに効
果的な他の機械的剪断方法も本発明を実施する場
合に用いられることも良いであろう。（要約）再形成され機械的に剪断された分解ペプチドコ
ラーゲン繊維からなる注入可能なコラーゲン材料
であつて、該材料は再形成されたコラーゲン繊維
を、十分繊維サイズを低下させ、サイズを不均一
化するまで、繰り返し硬いメツシユスクリーンを
通すことにより調製される。この機械的に剪断さ
れた繊維は挿入特性を改善するためにさらに架橋
されるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法に従つて再形成され、
機械的に剪断されたコラーゲン繊維の生成装置
を、ある程度概略的に示す図である。第２図およ
び第３図は架橋されていない（第２図）あるいは
架橋された（第３図）剪断された（△）および剪
断されていない（〇）コラーゲン繊維材料につい
ての剪断速度に対する粘度のプロツトである。第
４図は３種の剪断され架橋されていない挿入材料
サンプルについて、押出し力を12ケ月間に渡る保
存期間の関数としてプロツトしたものである。第
５図は剪断されていない(A)もしくは剪断された(B)
架橋コラーゲンを注射器から押出すのに要する力
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１再形成され機械的に剪断された分解ペプチド
コラーゲン繊維より成る注入可能なコラーゲン材
料であつて、剪断されていないこと以外は同様のコラーゲン
材料と同一条件下で測定した場合に、 (a) 27〜30ゲージの針を通して、該材料を、約35
〜65mg／mlの濃度で注入するのに必要な力が約
30〜70％減少し、かつ (b) このような針を通して、該材料を、このよう
な濃度で注入するのに必要な力が一時的に上昇
する回数および大きさが実質的に減少する、注入可能なコラーゲン材料。２前記繊維の名目の大きさが約200ミクロンよ
り小さい特許請求の範囲第１項に記載の材料。３前記繊維が約50〜150ミクロンのサイズの範
囲にある特許請求の範囲第２項に記載の材料。４ 20℃で剪断速度が10^-6〜10^-2／秒の範囲で、
そしてタンパク濃度が約65mg／mlで測定した粘度
が、同一条件下で測定した剪断されていない材料
の粘度より約20〜30％低い特許請求の範囲第１項
に記載の材料。５機械的に剪断された前記繊維を、小繊維内架
橋を優先的に生ずる条件下で架橋することにより
生ずる特許請求の範囲第１項に記載の材料。６約35mg／mlの濃度、20℃で10^-6〜10^-2／秒の
剪断速度範囲で測定した粘度が、同一条件下で測
定した剪断しない架橋材料の粘度より約40〜60％
低い特許請求の範囲第５項に記載の材料。７前記繊維が、最大繊維のサイズの1/2以下に
なる条件下で金属メツシユスクリーンを繰返し通
すことにより、機械的に剪断される特許請求の範
囲第１項に記載の材料。８約20〜80mg／mlの濃度でPH６〜８の実質的に
等張な媒質に含まれている特許請求の範囲第１項
に記載の材料。９繊維サイズが約50〜200ミクロンの再形成さ
れ、架橋され、機械的に剪断された分解ペプチド
コラーゲン繊維から成る注入可能なコラーゲン材
料。１０約15〜70mg／mlの濃度でPH６〜８の実質的
に等張な媒質に含まれている特許請求の範囲第９
項に記載の材料。１１前記繊維が実質的に小繊維内架橋を含む特
許請求の範囲第９項に記載の材料。１２再形成された分解ペプチドコラーゲン繊維
を供給すること、および繊維サイズを実質的に短
くしサイズが不均一になる迄該繊維を機械的に剪
断すること、を包含するコラーゲン材料を調製す
る方法であつて、該コラーゲン材料は、剪断されていないこと以
外は同様のコラーゲン材料と同一条件下で測定し
た場合に、 (a) 27〜30ゲージの針を通して、該材料を、約35
〜65mg／mlの濃度で注入するのに必要な力が約
30〜70％減少し、かつ (b) このような針を通して、該材料を、このよう
な濃度で注入するのに必要な力が一時的に上昇
する回数および大きさが実質的に減少するもの
である、注入可能なコラーゲン材料を調製する方法。１３前記供給が、分解ペプチドコラーゲン繊維
の懸濁液をPH６〜８、温度約10℃〜25℃で約１〜
８時間高張液で再形成すること、を含む特許請求
の範囲第１２項に記載の方法。１４前記剪断が、前記再形成繊維を選択された
サイズの硬いメツシユスクリーンを多数回通過さ
せることを含む特許請求の範囲第１２項に記載の
方法。１５前記スクリーンが約200〜300ミクロンのメ
ツシユサイズを有する特許請求の範囲第１４項に
記載の方法。１６前記スクリーンが60メツシユス（250ミク
ロン）の金属スクリーンである特許請求の範囲第
１５項に記載の方法。１７前記繊維が約５〜７／分の流速で前記メ
ツシユを通過する特許請求の範囲第１５項に記載
の方法。１８前記繊維が約50〜200回メツシユを通過す
る特許請求の範囲第１５項に記載の方法。１９前記通過が繊維のサイズを約200ミクロン
より下に下げるのに効果的な特許請求の範囲第１
４項に記載の方法。２０前記通過が繊維のサイズを約150ミクロン
より下に下げるのに効果的な特許請求の範囲第１
９項に記載の方法。２１剪断された前記繊維を更に６〜24時間保温
することを更に含む特許請求の範囲第１２項に記
載の方法。２２前記剪断が、タンパク濃度65mg／ml、剪断
速度10^-6〜10^-2／秒、20℃で測定した剪断され保
温された材料の粘度を剪断されていない保温材料
の粘度の約20〜30％低下させるのに有効な特許請
求の範囲第２１項に記載の方法。２３剪断され保温された前記繊維を遠心分離に
より濃縮すること、および該繊維を人間の患者へ
注入するのに適した媒質へ再懸濁することを更に
含む特許請求の範囲第２１項に記載の方法。２４前記繊維がタンパク濃度約40〜80mg／ml、
PH６〜８の実質的に等張な媒質に再懸濁される特
許請求の範囲第２３項に記載の方法。２５前記剪断繊維を架橋剤と反応させることを
更に含む特許請求の範囲第１２項に記載の方法。２６前記繊維を繊維濃度約0.1〜10mg／ml、架
橋剤濃度約0.001〜0.1％で架橋剤と反応させ、実
質的に小繊維内の架橋を生ずる特許請求の範囲第
２５項に記載の方法。２７前記剪断が、タンパク濃度約35mg／ml、剪
断速度10^-6〜10^-2／秒、20℃で測定した剪断され
架橋された材料の粘度を剪断されていない架橋材
料に関し約40〜60％低下させるのに有効な特許請
求の範囲第２６項に記載の方法。２８前記剪断され架橋された繊維を遠心分離に
より濃縮すること、および該繊維を人間の患者へ
注入するのに適した媒質へ再懸濁することを更に
含む特許請求の範囲第２６項に記載の方法。２９前記繊維がタンパク濃度15〜70mg／mlでPH
６〜８の実質的に等張な媒質に再懸濁される特許
請求の範囲第２８項に記載の方法。