JPH04207199A - ハムスター免疫グロブリンと反応する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ハムスター免疫グロブリンと特異的に反応す
るモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマ、および該モノクローナル抗体を利用
する免疫測定法に関する。

（従来の技術） 近年、主としてマウスの免疫系細胞を用い、その各種表
面抗原に対する抗体を利用して免疫系の働きや免疫疾患
発症の機序を解明する研究が大きく進歩した。即ち、免
疫系細胞はその表面に各種の抗原を持っており、それら
表面抗原は免疫系細胞の種類、機能、分化の程度等によ
り変化するので、それら表面抗原の各々に対するモノク
ローナル抗体を用いて各種表面抗原の有無を調べること
により、免疫系細胞の同定（タイピング）を簡単に行え
る様になり、これが免疫学の基礎研究に大きく貢献した
。

マウスの免疫系細胞表面抗原に対する抗体の大部分はマ
ウスの免疫系細胞を抗原としてラットを免疫感作するこ
とにより得られたものであったか、最近はハムスターを
免疫感作して得るという新しい方法によっても免疫系細
胞表面抗原に対する抗体の開発が盛んに行われている。

これらの抗体を用いてマウスの免疫系細胞表面抗原を調
べる方法としては、従来、これらの抗体をＦＩＴＣ（フ
ルオレセイン・インチオンアネート）、ＰＥ（フィコエ
リスリン）等の蛍光色素、ＨＲＰ○（西洋ワサビペルオ
キンダーゼ）、ＡＰ（アルカリ性ホスファターゼ）等の
酵素、または１！５Ｉ、”Ｃ１３Ｈ等の放射性同位元素
のいずれかで標識し、表面抗原に反応した抗体を検出す
る免疫測定法が用いられている（「免疫学実験入門」■
標識抗体：学会出版センター、１９８１年）６また、当
分野では、ある抗原を用いて作成した抗体を一次抗体と
し、この−次抗体を抗原とじて作成した抗体を二次抗体
として用いる免疫測定法も用いられている。

（発明が解決しようとする課題） 上記のように、従来のマウス免疫系細胞の表面抗原に対
する抗体の大部分はラット由来のものであった。しかし
、ラットとマウスは近縁種であるため、ある種のマウス
の免疫系細胞抗原とラットの同じ抗原のホモロジーが非
常に高く、ラットをこの種のマウス免疫系細胞抗原で免
疫感作しても抗体を得ることはできないという問題があ
った。

そのため近年ではマウスと遠い種であるハムスターを用
いる場合が増えてきた。しかし、このハムスター抗体を
一次抗体として用いる場合、適当な二次抗体が存在しな
かった。即ち、ラットとは異なりハムスターを用いた場
合には、ハムスターの免疫グロブリンのすべてに反応す
る抗ハムスター免疫グロブリン・モノクローナル抗体が
存在せず、ハムスターの免疫グロブリンでウサギあるい
はヤギを免疫することにより得た抗血清（ポリクローナ
ル抗体）が存在するのみであった。この抗血清はハムス
ター免疫グロブリンのみならず、う、トやマウスの免疫
グロブリン、マウスの免疫系細胞との交差反応が認めら
れ、また、マウス免疫系細胞表面抗原の検出のためのハ
ムスターの免疫グロブリンを効率良く作製できないとい
う問題があった。そのため、ハムスターの免疫グロブリ
ンのすべてと反応するモノクローナル抗体を得ること、
およびこれを工業的に生産し得る方法を開発することは
意義深いことであるが、今のところまだ満足なものが得
られていない。

即ち、本発明の目的は上記のようなハムスター免疫グロ
ブリンに対するモノクローナル抗体を提供することであ
る。さらに、該モノクローナル抗体を工業的に生産する
方法を提供すること、ならびに該モノクローナル抗体を
利用した免疫測定法（イムノアッセイ法）を提供するこ
とも本発明の重要な目的を構成する。

（課題を解決するための手段） 本発明者等は、上記のような特性を有するハムスター免
疫グロブリンに対するモノクローナル抗体を得るべく種
々検討および研究を行った結果、ハムスター抗体で感作
した鰯歯類動物の抗体産生細胞と鼾歯類動物の骨髄腫（
ミエローマ）細胞との融合細胞、即ちハイブリドーマを
使用することが有利であることを見い出し、本発明を完
成するに至った。

本発明のモノクローナル抗体および該モノクローナル抗
体を産生ずるハイブリドーマは、以下のようにして製造
することができる。即ち、（ａ）ハムスター免疫グロブ
リンを抗原として蔭歯類動物を免疫し： 、（ｂ）該鼾歯類動物の抗体産生細胞と鰯歯類動物ノミ
エローマ細胞を融合させ。

（Ｃ）工１（ａ）で用いたハムスター免疫グロブ＋）　
７およびその他のハムスター免疫グロブリンのすべてと
反応するモノクローナル抗体を産生じているハイブリド
ーマを選択し；そして （ｄ）工程（ｃ）で選択したハイブリドーマを適当な条
件下で培養し、該モノクローナル抗体を回収する、 ことによって製造することができる。

工程（ａ）の脳歯類動物の免疫は、ノ＼ムスターの免疫
グロブリン、例えばマウスのＣＤ２分子に対するモノク
ローナル抗体、マウスのＣＤ３分子に対するモノクロー
ナル抗体、マウスのＴＣＲαβ分子に対するモノクロー
ナル抗体、マウスのＴＣＲγδ分子に対するモノクロー
ナル抗体などを抗原として動物に投与し、一定期間経過
後さらに同一の抗原で動物を処理することによって行う
ことができる。好ましい／％ムスター免疫グロブリンは
マウスＣＤ２分子に反応する７％ムスターモノクローナ
ル抗体である。誓書類動物としては、マウス、う、ト、
モルモットなどを用いることができるが、好ましい動物
はラット、特にＦ３４４う・ノド（日本チャールズリバ
ー）である。通常、抗原は完全フロインドアジュバント
と混合し、これを動物に注射投与する。

工程（ｂ）の細胞融合は、工程（ａ）で免疫された鈑歯
類動物の抗体産生細胞と鈑歯類動物のミエローマ細胞を
用い、常法によって行うことができる。

抗体産生細胞としては、例えば肺細胞、リンパ節細胞、
末梢リンパ球を挙げることができるか、肺細胞またはリ
ンパ節細胞が好ましい。Ｗｉ＠類動初動物エローマ細胞
としては、例えばラット由来のＹ３、マウス由来のＰ３
−Ｘ６３−Ａｇ８，６５３、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８＝Ｕ
　１、Ｎ５−１、ＳＰ２１０−Ａｇ１４、ＰＡＩなどを
用いることができるが、マウス由来の８−アザグアニン
耐性株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ　１（Ｐ３Ｕ　１）が
好ましい。

細胞融合法としてはポリエチレングリコール法、電気融
合法などを挙げることができる。

工程（ｃ）のハイブリドーマの選択は、例えば酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳＡ法）によって調へることができる。

即ち、ハムスター免疫グロブリンをアッセイプレートに
分注し、これを固定する。次いで、このプレートにハイ
ブリドーマの培養上清を分注し、反応させた後、工程（
ａ）の免疫に用いた動物の免疫グロブリンに対して生成
させた抗【ｇ抗体（ビオチンで標識）を加えて結合させ
る。次に、酵素ペルオキシダーゼを結合させ、ざらに０
−フェニレンジアミンおよび過酸化水素水を加えて、そ
の発色反応により、ハイブリドーマが産生じている抗体
がハムスター免疫グロブリンと反応するか否かを測定す
ることができる。

上記のようにして種々のハムスター免疫グロブリンとの
反応性を調べ、目的の抗体を産生じているハイブリドー
マを選択することができる。

工程（ｄ）のモノクローナル抗体の回収は、例えば工程
（Ｃ）で選択したハイブリドーマのクローンをマウスの
腹腔内に移植した後、その腹水液から、あるいは大量培
養装置を用いてノ１イブリド−マクローンを培養した培
養液から、常法によって回収することができる。また、
回収した抗体を、硫安塩析、分子ふるい、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフイー等
によって精製してもよい。

（作用） 上記のようにして得られた本発明のモノクローナル抗体
は、ハムスター免疫グロブリンに特異的に反応するので
、免疫測定法（イムノアッセイ法）において有利に使用
することができる。特に、後記実施例に詳しく記載する
本発明のハイブリドーマ（ＲＨＩｇ−８７）が産生ずる
抗体は、ハムスター免疫グロブリンに特異的に反応する
だけでなく、マウスの免疫系細胞および免疫グロブリン
と交差反応しないので、マウスの免疫系細胞表面抗原を
調べる免疫測定法において特に有利に使用することがで
きる。その第１の方法は既に述べた様に、本発明のモノ
クローナル抗体を蛍光色素、酵素もしくは放射性同位元
素で標識し、−次抗体としてのハムスター由来の抗体も
しくは抗血清に対する二次抗体として使用する。本発明
のモノクローナル抗体を用いる別の測定法においては、
上記モノクローナル抗体にビオチンを結合させたものを
用意し、これを二次抗体として用いる。これに、上記の
各種標識物質のいずれかとアビジンもしくはストレフト
アビジンを結合させた物質を加えてビオチンと反応させ
ることにより、容易に免疫系細胞の表面抗原を検出する
ことができる。この方法ヲ用いれば、上記モノクローナ
ル抗体にビオチンを結合させてお（たけて、免疫測定法
が変わってもそれに適した標識物質とアビジンもしくは
ストレフトアビジンの結合物質を選ぶことにより対応す
ることができ、さらに便利である。

このような免疫測定法は当分野で既知の方法に従って行
うことができる。標識として用いる蛍光色素にはフルオ
レセイン・インチオンアネート、フィコエリスリンおよ
びテトラローダミン・インチオシアネートなどが含まれ
、酵素としては西洋ワサビペルオキングーゼ、アルカリ
性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトンダーゼ、アセチルコリンエステラーセ、乳酸
デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびチロシナー
ゼなとが挙げられ、そして放射性同位元素としては１！
５■、＋４Ｃ，３）（、３！ｐ、　３５Ｓ、　４ＳＣａ
。

５ＩＣｒおよび１３１１などが挙げられる。

かくして本発明のモノクローナル抗体は、表面抗原に反
応するハムスター由来の複数の抗体に標識物質を結合す
る手間を省くことに加え、より高感度で安定な免疫測定
法を実現することを可能とするものである。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例） Ａ　動物の免疫 マウスのＣＤ２分子と反応するハムスター抗体を産生ず
るハイブリドーマの培養上清から精製したハムスター免
疫グロブリン（１００μ９）を、完全フロインドアジュ
バントとｌ：１の比で混合して乳濁化させ、これをＦ３
４４ラット（日本チャールズリバー）の肉鉦に注射した
。次いで６日目、９日目にハムスター免疫グロブリン１
００μ９を同一ラットの内証に注射することにより免疫
感作した。

Ｂ、細胞融合 最終免疫の３日後に上記ラット１匹からリンパ節を取り
出した。両足のそけい部から取り出したリンパ節を細断
した後、メッシニで濾過し、ＲＰＭｒ１６４０培地に浮
遊させ、リンパ節細胞を１ＸＩＯ”個得た。このリンパ
節細胞とマウス由来の８−アザグアニン耐性株（ヒポキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠
損株）Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ（Ｐ３Ｕ１）　［ｈ
レント・トビノクス・イン・マイクロバイオロジー・ア
ンド・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　
ｉｎ　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｌａａｕｎｏｌｏｇｙ）、靴
、ｌ−７（１９７８）］　２　Ｘ１０’個を約５・ｌの
割合で混合し、遠心した（１５００　ｒｐｍ、５分）。

得られた沈澱に５０％ポリエチレングリコール４０００
（メルク社製）／　ＲＰ　ＭＩ　１６４０溶液３１Ｑを
３７°Ｃ１温水中で撹拌しながら１分間を要して加えた
。これにＲＰＭｒ１６４０液１５１ｅを撹液口５１ｅ６
分間を要して加え、細胞融合を行った。融合後、大量の
ＲＰＭＩ　１６４０を加え、遠心（１５００ｒｐｍ、５
分）して上清を除去した。次いでヒポキサンチン（１０
０μＭ）、アミノプテリン（０，４μＭ）、チミジン（
１０μＭ）を含む１０％ＦＣ５（牛胎児血清）−ＲＰＭ
１１６４０培地（ＨＡＴ培地）にてリンパ節細胞がｌＸ
１Ｏ＠個／ｘＱになるように調製した。

Ｃ，ハイブリドーマの選択 上記Ｂで調製した細胞浮遊液を９６ウ工ルマイクロプレ
ート５枚に２００μσずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガ
ス下にあるＣＯ２インキュベーターで細胞を培養した。

７日後にはハイブリドーマのみがコロニーを形成して増
殖していることが確認できた。

Ｃ−２，抗体の検出 ハイブリドーマが十分に増殖していることが確認された
ので、その培養上清を用い、以下に示す酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ法）によって抗体の検出を行った。免疫感
作に用いたハムスター抗マウスＣＤ２モノクローナル抗
体をＰＢＳで１０μ９／ｚＱの濃度に希釈し、５０μＱ
ずつアッセイブレート（グイナテック・イムロン２）に
分注し、この抗原を固定した（４℃／ｌ夜）。次に、抗
原液を除去し、プロ／キング液（ブロックエース；大日
本製薬社製）を加えてブロッキングした（室温／２時間
）。

プロ／キング液を除去した後、ハイブリドーマの培養上
清５０μＱを分注し、室温にて１時間反応させた。０．
０５％Ｔｖｅｅｎ２０を含むＰＢＳでプレートを４回洗
浄した後、ビオチンで標識した抗うットＩｇ抗体（ベク
ター社製）を１００倍希釈した液５０μＱを加え、結合
させた（室温／１時間）。次（Ｘで、もう−度０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０−　Ｐ　Ｂ　Ｓでプレートを４回洗浄
した後、ベクタスティンのＡＢＣ牛、トエリート（ベク
ター社製）を用いて、酵素（ペルオキシダーゼ）を結合
させたく室温／３０分）。

再び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−　Ｐ　Ｂ　Ｓでプレー
トを４回洗浄した後、Ｏ−フ二二レンジアミン（０，４
１１９／　ｘｃ）および過酸化水素水０．０１２％を含
むリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）１００μａを
プレートに加え、発色反応により抗体を検出した。この
ようにして、ハムスター抗マウスＣＤ２モノクローナル
抗体と反応する抗体を産生じているウェルを選択した。

Ｃ−３，クローニング 上記Ｃ−２で選択したウェルで増殖しているＩ＼イブリ
ドーマを限界希釈法でクローニングした。

希釈後の細胞濃度が０５個／ウェルとなるように１０％
ＦＣ３−ＲＰＭＩ　１６４０培地で希釈し、９６ウエル
マイクロプレートに２００μＱずつ分注した。３７°Ｃ
１５％ＣＯ７存在下で培養を行った。

コロニーがある程度の大きさになってから、上記ハムス
ター抗マウスＣＤ２モノクローナル抗体に対する抗体が
産生されているかどうかをもう一度Ｃ−２の酵素免疫測
定法で調べた。ノ・ムスター抗マウスＣＤ２モノクロー
ナル抗体に強く反応したウェルのハイブリドーマを、上
述と同様にしてもう一度限界希釈法でクローニングし、
ノ・イブリドーマを得た。

Ｃ−４，［々のハムスター・モノクローナル抗体との反
応性 上記ｃ−３で得られたハイブリドーマが産生ずる抗体が
、種々のハムスター・モノクローナル抗体と反応するか
否かをＣ，−２の酵素免疫測定法を用いて検討した。マ
ウスのＣＤ３に対する／％ムスターモノクローナル抗体
（１４５−２Ｃｌ　ｌ）、マウスのγδＴ細胞レセプタ
ーに対するノ＼ムスターモノクローナル抗体（３ＡＩＯ
）、マウスのαβＴ細胞レセプターに対する／％ムスタ
ーモノクローナル抗体（Ｈ５７）、マウスのＣＤ２分子
に対するノ＼ムスターモノクローナル抗体（８Ｍ２−１
７．３０．３１、−１−３）の合計７種類のモノクロー
ナル抗体との反応性を調べた。その結果、ここで調べた
ハムスターモノクローナル抗体のすべてと反応する抗体
を産生ずるノ＼イブリドーマが得られ（第１図参照）、
このノ＼イブリドーマ・クローンをＲＨｌｇ−８７と命
名した。このクローンは微工研園寄第１１８６５号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−１１８６５）として寄託されている（寄託
臼：平成２年１１月２６日）。

Ｃ−５，マウス免疫グロブリンとの反応性上記Ｃ−４で
得たハイブリドーマが産生ずる抗体が種々のマウス免疫
グロブリンと反応するか否かをＣ−２の酵素免疫測定法
を用いて検討した。

ラットモノクローナル抗体に対するマウスモノクローナ
ル抗体（７Ｃ４）、ラットのＩＣＡＭ−１分子に対スる
マウスモノクローナル抗体（ＩＡ−２９）、およびマウ
ス血清中の免疫グロブリンの合計３種の抗体との反応性
を調べた（第１図委照）。

その結果、得られた抗体は調べた３種いずれとも反応し
ないことが分かった。

Ｃ−６，抗体のマウス免疫系細胞との反応性上記Ｃ−４
で得たハイブリドーマが産生ずる抗体がマウス免疫系細
胞と反応するか否かをＦＡＣ８を用いて調べた。まずＢ
ａ１ｂ／ｃマウスから肺細胞を調製し、これをＦｒＴＣ
で標識した上記Ｃ−３の抗体と反応させ、ＦＡＣＳｃａ
ｎ（ベクトン・ディノキンソン社）で蛍光測定した。そ
の結果、得られた抗体はマウスの肺細胞と反応しないこ
とがわかった（第２図参照）。

Ｄ、大量の抗体のＲ製および精製 ハイブリドーマ・クローンＲＨＩｇ−８７を、１０％Ｆ
Ｃ３−ＲＰＭｒ　１６４０培地で培養して大量に増殖さ
せた後、ヌードマウスの腹腔内にｌＸｌ０’細胞／マウ
スの割合で接着した。この細胞がマウス腹腔内で生育し
、大１１（約１０ｃｃ）の腹水がたまった時点で、マウ
ス腹腔内から腹水を回収することによって大量の抗体を
得た。回収した腹水に等量の飽和硫安（１００％硫酸ア
ンモニウム）を加えることによって抗体を沈澱させた。

この沈澱物を少量（約５　ｃｃ）のＰＢＳで溶解した後
、Ｍａｂ　ｔｒａｐＧＴＭ（ファルマンア製）を用いて
精製した。

得られた抗体のアイソタイプを、アイソタイプタイピン
グキ、ト（ザイメノト社製）の抗う、ト抗体（抗１　ｇ
ｃ　、、■ｇＧｙａ、ＩｇＧｔｂ、ＴｇＧ、ｃ、ＩｇＭ
）とハイブリドーマ培養上清中の抗ハムスターグロブリ
ン・モノクローナル抗体とを反応させる酵素免疫測定法
によって測定した。その結果、この抗体はアイソタイプ
ＩｇＧ、。に属することがわかった。

Ｅ、抗体の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 こうして得られた抗体５μ９について１０％５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行った。

クマシーブリリアントブルーによりタンパク質を染色し
、得られた抗体を分析した。その結果、ＲＨ［ｇ−８７
抗体は、分子量約５万の抗体のＨ鎖と分子量約２．５万
の抗体のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した（第
３図参照）。

（発明の効果） 以上説明したように、本発明のモノクローナル抗体は、
ハムスター免疫グロブリンに対して特異的に反応するの
で、免疫測定法において有用である。特に、本発明のハ
イブリドーマＲＨＩｇ−８７が産生ずる抗体は、マウス
の免疫系細胞および免疫グロブリンと交差反応しないの
で、マウス免疫系細胞の表面抗原を調べるのに有用であ
る。このようなモノクローナル抗体を二次抗体として用
いる場合には、表面抗原に反応するハムスター由来の複
数の一次抗体に標識物質を結合させる手間が要らず、し
かも安定して高い検出感度を達成し得る免疫測定法が提
供できることになる。従って、本発明はマウスを用いる
多くの実験系に対して有効な手段を提供するものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のモノクローナル抗体のハムスター免
疫グロブリンに対する反応性とマウス免疫グロブリンに
対する反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示すグラフ
である。 第２図は、ビオチン標識した本発明のモノクローナル抗
体とＦＩＴＣアビジンを用いてＢａ１ｂ／ｃマウスの肺
細胞に対する反応性をＦ　Ａ　ＣＳ　ｃａｎで調べた結
果を示すグラフである。 第３図は、ハイブリドーマＲＨＩｇ−８７が産生ずる抗
体を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し
た結果を示す模式図である。 特許出願人　住友電気工業株式会社 代理人弁理士青山　葆（外１名） 第２図 １００　　　　　Ｔｏ’　　　　　＋０２１０３蛍光強
度　ＦＬ１ 第３図 ９４に□ ６７に□ ４３に−。 ３０に一一− ２０に□ ｔｖ＋４ 拳−抗体り領 一　　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ハムスター免疫グロブリンと特異的に反応するモノ
   クローナル抗体。 ２、ハムスター免疫グロブリンで免疫感作された齧歯類
   動物の抗体産生細胞と齧歯類動物のミエローマ細胞とを
   融合して得られるハイブリドーマであって、ハムスター
   免疫グロブリンと特異的に反応するモノクローナル抗体
   を産生するハイブリドーマ。 ３、ハムスター免疫グロブリンに特異的に反応するモノ
   クローナル抗体を蛍光色素、酵素、または放射性同位元
   素で標識し、これをハムスター由来の抗体もしくは抗血
   清に対する二次抗体として使用することを特徴とする免
   疫測定法。 ４、ハムスター免疫グロブリンに特異的に反応するモノ
   クローナル抗体にまずビオチンを結合させ、得られる結
   合体をハムスター由来の抗体もしくは抗血清に反応させ
   た後、蛍光色素、酵素または放射性同位元素とアビジン
   またはストレフトアビジンとの結合体と反応させること
   を特徴とする免疫測定法。