JPH0420859A - 免疫学的凝集反応試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は免疫学的な凝集反応に基つく測定試薬に関する
。

［従来の技術及びその問題点］ 従来、不溶性担体粒子に物理吸着あるいは共有結合の形
成により抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子（以
下、固定化担体粒子と略す）と血清や尿などの検体中の
対応する抗体又は抗原との間における抗原抗体反応に基
づく凝集反応あるいは凝集阻止反応を観察することによ
り、検体中の対応する抗体又は抗原を測定する免疫学的
な測定試薬か知られている。そして、この固定化担体粒
子を用いる測定方法は検体中に含まれる比較的微量の抗
体又は抗原を迅速に、高精度でかつ簡便に測定でき、数
分の内に測定をしうるためにその場での診断か可能であ
り、広く利用されている。

しかしながら、免疫学的凝集反応試薬を使用する医療の
現場からは、より早期に診断して早期の治療を実現する
ために、従来に増してより微量の抗体又は抗原を測定す
ることが求められている。

従来免疫学的凝集反応の試薬の中にポリエチレングリコ
ールを添加すると、試薬の測定感度か向上することが知
ちれている（特開昭５８−４７２５６）が、ポリエチレ
ンク刃コールと検体とが反応したり、ポリエチレンク刃
コールと固定化担体粒子とが反応したりして測定の特異
性が劣る欠点があった。また不溶性担体粒子を使用しな
い、次元免疫拡散法においてポリビニルピロリドンを添
加する技術がすでに公知（特開昭５８−５８４６８）で
あるが、この技術は、沈降輪が不鮮明な低分子の抗原に
対して、ポリビニルピロリドンの添加により沈降輪を鮮
明にするものであり、感度の向上効果については何ら言
及していない。

［問題を解決するための手段１ 本発明者らは、上記目的を達成し得る免疫学的凝集反応
試薬を得るため鋭意研究してきた結果、固定化担体粒子
と緩衝液を含有して成る測定試薬において、ポリビニル
ピロリドンを含む場合には、臨床的な於断において特異
性を損なわず、且つ感度が向上することを見出だし、本
発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、抗原又は抗体を固定化した不溶性担体
粒子と緩衝液を含有して成る測定試薬において、ポリビ
ニルピロリドンを含むことを特徴とする免疫学的凝集反
応試薬である。

本発明においては、固定化担体粒子と緩衝液を含有して
成る測定試薬にポリビニルピロリドンを含有させる。該
測定試薬は、単一の液である必要は無く、複数の液及び
固形物で構成されていても良い、測定試薬が単一の液の
場合、検体と測定試薬を混合して使用し、測定試薬が複
数の液及び固形物で構成されている場合は、一定の操作
手順に従って試薬の各構成部品と検体とを混合して使用
する。測定試薬が複数の液及び固形物で構成される場合
には、ポリビニルピロリドンを添加して保存中に試薬特
性の変化か生じない様にポリビニルピロリドンを含有す
る構成部品を選べば良い。なお測定試薬が単一の液の場
合には、固定化担体粒子を分散した液とポリビニルピロ
リドンを添加した緩衝液の２液を調製し、使用直前に１
液に混合して使用すれば、保存中の固定化担体粒子とポ
リビニルピロリドンとの非特異的な反応が完全に防止で
きて好適である。また、固定化担体粒子の乾燥品及び固
形状ポリビニルピロリドンをそれぞれ別個に測定試薬の
一構成部品とすることも可能である。

本発明で使用するポリビニルピロリドンは、工業的に合
成されている分子量１万から３６万程度のものが限定さ
れずに使用できるが、ポリビニルピロリドンの粘度の指
標であるフィケンチャーの粘度式におけるに価で２０以
上のものは感度の向上効果が高く好適であり、Ｋ価で５
０以上のものがさらに好適である。

本発明において、ポリビニルピロリドンを固体のまま試
薬の構成部品とすることもできるが、測定操作を簡便に
行うために、あらかじめＭ衝液に溶解して使用する態様
が好ましい０本発明において使用する緩衝液は種々の緩
衝液が限定されずに使用できるが、リン酸緩衝液、グリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、
塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液、などのＭ新液が
好適に使用される。

ポリビニルピロリドンの使用量は、感度が向上する効果
と、固定化担体粒子が非特異的に凝戴して特異性が低下
する現象と、さらには試薬粘度が増加して攪拌が困難に
なる現象とを勘案して定めれば良いが、測定時の全液量
に対するポリビニルピロリドンの濃度が０，０１〜５％
の範囲にある場合が特に好適である。

本発明において固定化担体粒子は抗原又は抗体を不溶性
担体粒子に固定化して調製する。

不溶性担体粒子としては、固定化、保存及び測定を行う
時に用いられる液体媒体に実質的に不溶性の不溶性担体
粒子であり、詳しくは後述するが平均粒子径１０μｍ程
度以下の微粒子が好適に用いられる。

これらの粒子としては、すでに抗原抗体反応に使用され
るものが種々知られており、本発明においてもこれらの
公知の微粒子か特に限定されず使用できる。特に好適に
使用されるものを例示すると例えば、ポリスチレン、ス
チレン−ブタジェン共重合体、スチレン−メタクリル酸
共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイ
ン−エチレングリコールジメタクリレート共重体の様な
乳化重合法により得られる有機高分子ラテックス粒子な
どの有機高分子物質の微粒子、あるいはうりカ、シリカ
−アルミナ、アルミナの様な無機酸化物または該無機酸
化物などにシランカップリング処理などの操作で官能基
を導入した無機粒子さらにはヒト○型赤血球、ヒツジ赤
血球などの生物由来の粒子などである。

上記不溶性担体粒子の粒子径については、粒子径が大き
い場合、凝集にともなう粒子径の変化量は大きいが凝集
反応速度が遅く、粒子径が小さいとブラウン運動が活発
で凝集反応速度は速いが一次粒子径が小さいために凝集
反応にともなう粒子径の変化量が小さい。このために凝
集反応に用いられる不溶性担体粒子の平均粒子径は１０
μｍ程度以下、好ましくは０−０５〜５．０μｍの不溶
性担体粒子が好適に用いられる。

本発明において、不溶性担体粒子に固定化する抗原又は
抗体としては、特に限定的でなく公知のものか使用でき
る。代表的なものを例示すれば、例えば、ヒトＣ反応性
蛋白（ＣＲＰ）・抗ＣＲＰ抗体、ストレプトリジン○・
抗ストレプトリジン０抗体、変性ガンマグロブリン・リ
ウマチ因子、アルブミン・抗アルブミン抗体、イムノグ
ロブリンＧ（ＩｇＧ）・抗ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ・抗Ｉｇ
Ａ抗体、ＩｇＭ・抗ＩｇＡ抗体、補体第三成分（Ｃ３）
・抗Ｃ３抗体、Ｃ４抗Ｃ４抗体、アルファフェトプロテ
ィン（ＡＦＰ）・抗ＣＲＰ抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ
）　　抗ＣＥＡ抗体、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）・
抗ＣＰ抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、抗
ＣＥ抗体、インシュリン　抗インシュリン抗体、Ｂ型肝
炎表面抗原（ＨＢｓ）　・抗ＨＢｓ抗体、Ｃａｎｄｉｄ
ａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　・抗Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉ
ｃａｎｓ抗体、梅毒トレボネマ抗原、風疹抗原、抗ロタ
ウィルス抗体、抗アデノウィルス抗体、等の公知の抗原
又は抗体をあげることができる。

本発明において、不溶性担体粒子に抗原又は抗体を固定
化する方法は、物理的吸着、化学的共有結合の形成のい
ずれでも良い、化学的共有結合の形成についてはすでに
多くの方法が提案されており、固定化する抗体の特性に
合わせ公知の方法から固定化方法を選択すれば良い、一
般には分散媒中で抗体を必要に応じて架橋剤の存在下に
不溶性担体粒子と混合すれば良い、架橋剤としてはグル
タルアルデヒド、１−エチル−５−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの公知のものが
使用できる。

不溶性担体粒子に抗原又は抗体を固定化する際の分散媒
は特に限定的ではなく公知のものか使用されるが、上記
の架橋剤を使用する場合には分散媒中の成分が架橋剤と
反応しない分散媒を用いる必要がある。固定化する際の
不溶性担体粒子の分散媒中の濃度は特に限定されるもの
ではないが、一般には抗原又は抗体と混合した時点で０
，０５重量％以上、好ましくは０．２〜２．０重量％と
なる様に選ぶのが好適である。抗原又は抗体の濃度も特
に限定されるものではないか、−ｉには不溶性担体粒子
と混合した時点で０．０００５重量％以上、好ましくは
０．００２〜０−２重量％となる様に選ぶのが好適であ
る。

本発明において、固定化担体粒子を用いた免疫学的測定
方法即ち、抗体固定化担体粒子上の抗原又は抗体と被検
体中の対応する抗体又は抗原などとの間における抗原抗
体反応に基づく凝集反応あるいは凝集阻止反応を観察す
る方法は、目視、光学的測定方法など公知の方法が特に
限定されず使用できる。

［作用及び効果］ ポリビニルピロリドンの化学的特性として、種々の無機
、有機化合物を吸着したり、錯体を形成し、例えばヨウ
素や染料の溶解度を著しく増したり、ポリアクリル酸な
どの高分子電解質および蛋白質と相互作用をすることが
知られている。

本発明においては、不溶性担体粒子の表面に重合開始剤
の切片などのアニオンが存在し、不溶性担体粒子か一踵
のポリアニオンと考えられる。また固定化した抗原又は
抗体が存在しており、検体中の抗体又は抗原との間でポ
リビニルピロリドンが相互に作用して凝集反応の仲立ち
となっているものと考えられる。このため蛋白質間の距
離が接近し、相互作用が起こり易くなり、抗原抗体の反
応が促進され、測定感度が向上したものと考えられる。

一方ヨウ素や染料の溶解度を著しく増すことから推察し
て固定化担体粒子の分散安定化にも寄与しているものと
考えられる。

［実施例］ 以下、実施例によりさらに本発明の詳細な説明するが本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１〜３ （１）固定化担体粒子の調製 腟カンジダ症の原因となる真菌のＣａｎｄｉｄａ　ａｌ
ｂｉ（ａｎｓに対する抗Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａ
ｎｓ抗体を常法に従いアフィニティー精製した後、精製
抗体を１７６０モルのリン酸緩衝液（以下ＰＢと略す、
ｐＨ６−３＞で透析し、ＰＢを加え濃度０．２５ｍｇ／
ｍｌの抗体液を調製した。実施例１として、平均粒子径
０−７２８μｍのポリスチレンラテックス粒子（担体粒
子）をＰＢで希釈し、ラテックス濃度か１重量％の分散
液を調製し、上記抗体液に等容量添加し直ちに攪拌混合
した。２時間静置後、ウシ血清アルブミン（凍結乾燥品
）を０．１重量部加えさらに２時間靜置した９次いて、
遠心分離し、得られた沈渣（固定化担体粒子）に上記抗
体液の２倍容量のＰＢを加えて懸濁（粒子濃度・約０１
５ｆｆｉｊｌ）Ｌ、抗Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎ
ｓアフィニティー精製抗体を固定化した抗体固定化担体
粒子の分散液すなわちカンジダ試薬を得た。

（２）凝集反応試験 Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｃ−ａ−１１１（
千葉大真核微生物センターより入手）を菌濃度１０８個
／′ｍｌに調製した抗原の原液をＰＢて希釈して１０＋
１当たりの菌濃度か２５　Ｘ　７０５個、１２−５ｘｌ
Ｏ５個、６３ｘ１０’個、３−２×１０５個、１．６×
１０５個、０．８×１０５個、０−４Ｘ１０”個、０．
２Ｘ１０’個、の抗原液を調製しな。一方ポリビニルピ
ロリトンに６０（分子量１６万）をＰＢに溶解して濃度
を１０％に調整した液を原液として、ポリビニルピロリ
ドンに６０の濃度が１０％、１．ｏｒ６．０．１０％の
ＰＢ浴溶液調製し、上記の抗原液とそれぞれ等量混合し
て、ポリビニルピロリドンに６０を５．０％、０．５０
％、Ｏ−０５０％の濃度で含み、菌濃度が１２．５ｘ１
０’個から０．１×１０５個、の抗原希釈液を調製し、
それぞれ実施ＰＡｌ、２．３としな、また、陰性像を評
価するためポリビニルピロリドンに６０を５０％、０５
０％、０．０５０％の濃度で含み、抗原を含まない液を
調製した。（１）で得たカンジダ試薬をガラス平板上に
１滴ずつ滴下し、各１滴のカンジダ試薬に上記Ｃａｎｄ
ｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓの抗原希釈液１滴を加え、爪
楊枝で混合し、直ちに平沢制作所■製テーバー式攪拌機
によりガラス平板を１分間に１２０回転の速度で２分間
水平回転し攪拌した。撹拌後の凝集状態を肉眼で判定し
、凝集が明らかに認められた抗原の抗原希釈液中の最小
濃度をもってカンジダ試薬の抗原に対する感度として、
結電を第１表に示した。

（３）特異性試験 Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｃ−ａ−１１１に
かえて、他ノ興ノ真菌６株（千葉大真核微生物センター
より入手）、さらにカンジダ試薬を使用する際に検体中
に存在する常在菌１４種（理化学研究所より入手）をそ
れぞれＰＢで希釈して１ｍｌ当たりの菌濃度が１００　
Ｘ、１０５個となるように菌体液を調製しな、感度試験
と同様に凝集試験を行った。凝集状態を肉眼で判定し、
’ａａが認められない場合（−）、凝集の有無が判定し
がたい場き（±）、明らかに凝集か認められた場合（十
）と判定して、上記２０種の内（＋）の発生した割合を
第１表に示した。

比較Ｓ１〜７ 実施例１において、ポリビニルピロリドンに６０の希釈
液を混合し、抗原希釈液として使用した代わりに抗原希
釈液をＰＢのみとした場合を比較例１とした。ポリビニ
ルピロリドンに６０の希釈液の代わりにポリエチレンク
リコール６０００の希釈液を混合して、ポリエチレンク
リコール６゜００を５．０％、０．５０％、０．０５０
％ノ濃度で含み、菌濃度が１２．５ｘ＋０５個がら０−
　１×１０５個、の抗原希釈液を調製し５それぞれ比較
例２．３．４とした。同様にテキストラン（分子量６〜
９万）を５．０％、０．５０％、０．０５０％の濃度で
含み、菌濃度か１２．５ｘ１０’個がら０．１ｘ１０’
個、の抗原希釈液を調製し、それぞれ比較例５．６．７
としな、実施例１〜３と同様に感度試験及び特異性試験
を行い、得られた結果を第１表に示した。

第１表に示したとおり、ポリビニルピロリドンに６０を
添加した実施例１〜３は添加物を含まない比較例１に比
へ、感度が２〜１６倍向上し、陰性像並びに特異性の低
下が無く良好な試薬特性を示した。これに対して、ポリ
エチレングリコール６０００又はデキストランを添加し
た比較例２〜７は、添加濃度が低い場合には感度が向上
したが陰性像及び特異性が実施例１〜３及び添加物を含
むまない比較例１に比べ劣った。さらに添加量か増すと
陰性像並びに陽性像ともに非特異的にａｔｉし測定が不
能となった。

実施例４〜６ 実施例１のポリビニルピロリドンに６０に代えて、ポリ
ビニルピロリドンに９０（分子量３６万）を測定時に２
％となる様に抗原希釈液を調製した場合（実施例４）、
ポリビニルピロリドンに２５（分子量２４５００＞を測
定時に４％となる様に抗原希釈液を調製した場合（実施
例５）、ポリビニルピロリドンに１５（分子］１０００
０）を測定時に８％となる様に抗原希釈液を調製した場
合（実施例６）につき、実施例１と同様に操作して感度
及び特異性を評価した。結果を第２表に示した。

第２表に示したとおり、実施例４及び実施例５ては添加
物を含むまない比較例１に比べ、明らかに試薬感度か向
上したが、Ｋ価が１５の実施例６第２表 の場合は抗原濃度か３−２Ｘ１０’個／ｍｌの抗原濃度
の検体に対しａ＆を示す場合と凝集の有無が判定しがた
い場合とがあり、わずかの感度の増加にとどまった。実
施例４の添加濃度を４％に、実施例５の添加濃度を８％
に各々増した場合は、試薬が粘稠となり試薬と検体とを
強力に混合する必要があった。

実施例７と比較例８ アルファフェトプロティン（以下ＡＦＰ）に対する抗Ａ
ＦＰ抗体を常法に従いアフィニティー精製した後、精製
抗体を０−１モルの塩化アンモニウム−アンモニア緩衝
液（以下ＡＢと略す、ｐＨ８，２）で透析し、ＡＢを加
え濃度０．２５ｍｇ／ｍｌの抗体液を調製した。平均粒
子径０−２３２μｍのポリスチレンラテ・ノクス粒子（
担体粒子）をＡＢで希釈し、ラテックス濃度が１重量％
の分散液を調製し、１記抗体液に等容量添加し直ちに攪
拌混合した。２時間静置後、ウシ血清アルブミン（凍結
乾燥品）を０．１重量部加えさらに２時間静置した６次
いで、遠心分離し、得られた沈渣（固定化担体粒子）に
上記抗体液の４倍容量のＡＢを加えて懸濁（粒子濃度：
約０．２５重量％）し、抗ＡＦＰアフィニティー精製抗
体を固定化した抗体固定化担体粒子の分散液を得な。

実施例７として、ＡＢにポリビニルピロリドンに６０を
０−４％添加して血清希釈液を調製した。

日立７０５０形生化学多項目自動分析機に上記の試薬を
適応して以下の測定条件でＡＦＰを測定した。まず、血
清２０μｌを光学セル中にサンプリングし、血清希釈液
３００μｌを加え攪拌する。

血清希釈液を加えて約５分後に、抗体固定化担体粒子の
分散液１００μｌを加え攪拌する。抗体固定化担体粒子
を加えて約１分後と５分後との間の約４分間における波
長６００ｎｍの吸光度の変化量を自動的に計測した。

実施ｆｇ！４７の血清希釈液に代えて、血清希釈液かポ
リビニルピロリドンに６０を含まないＡＢのみの場合（
比較ＰＡ８）は、ＡＲＰ濃度が２０００ｎｇ／ｍＩの検
体に対して上記吸光度変化量は００２１Ａｂｓ−てあっ
たが、実施例７の試薬は、同一検体に対して上記の吸光
度変化量が０．１５２Ａｂｓ−と約７倍高感度を示した
。なお、ＡＲＰ濃度が１０ｎｇ／ｍ１以下の検体に対し
て、実施例７及び比較例８ともに上記の吸光度変化量は
（Ｌ　０ＯＩＡｂｓ、以下であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 抗原又は抗体を固定化した不溶性担体粒子と緩衝液を含
   有して成る測定試薬において、ポリビニルピロリドンを
   含むことを特徴とする免疫学的凝集反応試薬。