JPH03128462A - 抗体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗原・抗体反応により、特定の抗原に対する
試料中の抗体の量及び抗体の免疫グロブリンクラスの判
別を決定する方法に関する。特に、医療診断の分野にお
ける感染症や自己免疫疾患の鑑別診断のための血清検査
のごとく臨床検査法としての抗体測定法に関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］感染
症や自己免疫疾患では、患者の血清中に疾患固有の抗原
に対する抗体が出現する。従来の臨床検査では単に抗体
の有無を調べていたが、近年病因や病態の詳細な把握を
目的として、抗体量の定量及び抗体の免疫グロブリンク
ラス（ヒトの場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、
ＩｇＥの５種類が存在する）の判別が注目されている。

例えば、感染症の診断の場合、該感染症の病原体に対す
る抗体の存在からは単に過去の該感染症の既往の有無し
かわからないが、抗体量の変動や免疫グロブリンクラス
を知ることにより、感染の時期や病勢の進行状況につい
ての手掛かりが得られる。具体的には、例えば「ウィル
ス抗体測定結果の解釈」という題で「日本臨床」誌第４
３巻・秋季臨時増刊号下巻第２７頁（昭和６０年）に紹
介されているように、風疹の診断においてはＩｇＭ抗体
の検出が必要である。

測定す、る免疫グロブリンクラスは同じでも、多種の抗
原のうちどの抗原と反応するのかを調べる場合もある０
例えばアレルギー疾患の診断において重要となる免疫グ
ロブリンクラスはＩｇＥであるが、起因物質であるアレ
ルゲン種類の特定及び該アレルゲンと反応するＩｇＥ量
を測定するＲＡＳＴ法（放射性アレルゲン吸着試験）が
有用な試験法として実施されている。

従来この分野において、特に定量的測定法として主導的
役割を果たしてきたのはＲＩＡ及びＥＩＡである。ＲＩ
Ａ、ＥＩＡは高感度で定量が可能なばかりでなく、調べ
ようとする抗体の免疫グロブリンクラスをも判別可能な
ため診断的意義には高いものがあるが、抗原と反応した
抗体を分離、洗浄しなければならず、操作が面倒で時間
がかかる欠点がある。また、分離、洗浄等試料を扱う操
作が多いと試料からの感染の危険も無視できない。

加えてＲＩＡには放射性廃棄物問題、特殊設備の必要性
など取り扱い上難点が多い。ＥＩＡには標識別として酵
素を用いる関係上、反応時間や温度の管理が厳しい、妨
害反応の影響を受は易いといった弱点がある。

臨床検査分野における主な抗体測定技術として、上記Ｒ
ＩＡ及びＥＩＡのほかに、受身血球凝集法、ラテックス
凝集法が挙げられるが、これらは判定が定性に限られ免
疫グロブリンクラス判別ができない、検出感度が比較的
低い等の欠点がある。こうした欠点を一部改良するもの
として、抗原担持磁性粒体及び抗グロブリン抗体担持血
球を用いる抗体の免疫グロブリンクラス別検出法が開示
されている（特開昭６０−１７７２６５号公報）。

上記のような凝集法を用いて特定の抗原に対する抗体ク
ラスの判別・定量を行うためには、該抗原担持担体粒子
と試料中の該抗原反応性の抗体との反応の結果生ずる凝
集量を測定する必要がある。

この際、該抗原担持担体粒子のみによる抗体の凝集、ま
た、試料血清中に大量に存在する、該抗原とは非結合性
の免疫グロブリンによっても、抗体の免疫グロブリンク
ラスに対する特異性を持つ物質を担持した粒子どうしの
凝集がおこり得るため、まず抗原担持担体粒子と試料を
反応させ、その反応物を分離・洗浄して該抗原とは非結
合性の免疫グロブリンを除いた後に、免疫グロブリンク
ラスに対する特異性を持つ物質を担持した不溶性担体粒
子を反応させるといった、操作上置も面倒な洗浄・再懸
濁工程が依然必須であること、判定までの所要時間が長
いこと、検出感度がＲＩＡ、ＥＩＡに及ばないこと等の
問題は未解決であった。

また、ＷＯ３９１０１１６１号公報には、モノクローナ
ル抗体を担持した磁性体含有粒子と検体中の抗原を反応
させ、さらに抗体を担持した磁性体を含有しない不溶性
担体粒子を反応させた後、磁場を付与して未反応の磁性
体含有粒子と各粒子及び抗原から成る凝集塊を分離し、
残存する磁性体を含有しない抗体担持不溶性担体粒子の
量を測定し、その濁度の減少から被検体中の抗原を定量
する方法が開示されているが、抗体の免疫グロブリンク
ラスの判別については全く記載されてなく、抗体量の測
定かつ抗体の免疫グロブリンクラスの判別が可能であり
、さらに短時間で処理できる高感度の測定法が望まれて
いた。

［問題点を解決するための手段］ そこで本発明者らは、該抗原担持担体粒子と試料中の該
抗原反応性の抗体との反応の結果生ずる凝集量を直接測
定するのではなしに、該凝集物を分離した残りの未反応
分を計測することにより間接的に該反応を定量出来るこ
と、免疫グロブリン分子（抗体クラス）に対する特異性
を持つ物質を磁性体含有担体とすることにより、該凝集
物の分離を容易に行い得ることに着目し、本発明の基本
構想を得た。更に実際に実験を重ねた結果、驚くべきこ
とに、従来法では必須である、該抗原と試料中抗体との
反応後の分離洗浄操作が、本性では省略しても充分目的
が達せられる事、従来法より短い所要時間で、しかもＥ
ＩＡを上回る感度が可能であることを見出し本発明に到
達した。

即ち本発明の要旨は、特定の抗原に対する試料中の抗体
の量及び該抗体の免疫グロブリンクラスの別を、該抗原
を担持させた不溶性担体粒子と、免疫グロブリンと特異
的に反応する物質を担持させた不溶性担体粒子を用いて
測定する方法であって、不溶性担体粒子に該抗原を担持
させた物を第一試薬、免疫グロブリン分子と特異的に及
第し得る物質を磁性体含有粒子に担持させた物を第二試
薬とし、該抗原に対する抗体を含むと考えられる試料を
、同一反応系内にて両試薬と反応させ、試料中に存在し
た該抗原に対する抗体を介して抗原担持不溶性担体粒子
と磁性体含有粒子を凝集させた後に、磁場を付与して磁
性体含有粒子及び磁性体含有粒子を含む凝集物を分離し
、残存する未反応の抗原担持不溶性担体粒子量を目視乃
至は光学的に検知することにより、試料溶液中の抗体量
を測定すると共に、磁性体含有粒子担持物質の特異性か
ら試料中の該抗体の免疫グロブリンクラスを知ることを
特徴とする抗体測定法に存する。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で言う「抗原」とは、人、或は動物に対し抗体産
生を惹起する能力のあるすべての物質のうち、例えば診
断等特別の目的の下に選択された単一或は複数の物質、
乃至はそれらを含有する混合物を指す０例えば感染症の
診断を目的とした場合のウィルスやバクテリア、乃至は
それらの構成成分である特定のタンパク質やｔＪ！鎖等
が挙げられる。

抗原担持用の「不溶性担体粒子」としては例えば赤血球
などの細胞やゼラチン粒子、リポゾーム等のマイクロカ
プセル類、ポリビニルトルエン、ポリスチレン等のラテ
ックス粒子のような有機高分子物質、カーボンブラック
等の無機微粒子、または、各種金属及び金属化合物コロ
イド粒子が用いられるが、光学的に測定する都合上反応
媒体中での分散性に優れ、容易に沈降しないものが好ま
しい。

「免疫グロブリンと特異的に反応する物質」とは、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｉｇ、Ｄ、ＩｇＥもしくはそれら
の抗体軽鎖部分に対する抗体、プロティンＡまたは補体
成分の一種であるＣ１ｑ等のように、ある種の抗体分子
の特徴を選択的に認識して結合する能力を有する物質を
言う、但し、該免疫グロブリンそれ自身の持つ抗体活性
に基づく反応物質、即ち抗原として該免疫グロブリンと
反応する物質はここに含まない。

免疫グロブリンと特異的に反応する物質を担持させた磁
性体を含有する「不溶性担体粒子」としては、アガロー
ス、デキストラン及びカルボキシメチルセルロース等の
多糖類並びにゼラチン、重合化アルブミン等のタンパク
質及びタンパク質誘導体も用いられるが、より好ましく
はスチレン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニル化合物
および／またはメタクリル酸エステル誘導体等の重合に
よって得られる合成高分子が用いられる。該不溶性担体
に担持させる「磁性体」としては、鉄及び四酸化三鉄等
の磁性酸化鉄、或はこれらと他の金属乃至は金属酸化物
との混合物及び合金であって残留磁気のないものが好ま
しく、また、平均粒径は１０〜２００人であることが好
ましい、これらを５〜１００重量％、さらに好ましくは
１５〜６５重量％の割合で上記担体に含有させる。

上記不溶性担体粒子および磁性体含有粒子の平均粒径は
、０．１〜１０μｍ１好ましくは０．２〜３μｍである
ものが用いられる０両粒子の組合せとしては不溶性担体
粒子の平均粒径が０．５〜３μｍのものと磁性体含有粒
子の平均粒径が０．２〜２ｐｍのものとの組合せ、好ま
しくは、不溶性担体粒子の平均粒径が１〜２．５μｍの
ものと磁性体含有粒子の平均粒径が０．５〜１．５μｍ
のものとの組合せが用いられる。かかる粒子の平均粒径
は、不溶性担体粒子の平均粒径が小さすぎると単位重量
あたりの表面積が大きくなり抗原担持量が多くなって該
不溶性担体粒子どうしの凝集を引き起こしやすくなり、
さらにこの凝集反応は、検体成分の影響が少ない６００
〜１１０００ｎの波長で測定する場合、濁度の増加とし
て検出されるため感度低下の原因となるので好ましくな
い。この凝集反応は、磁性体含有粒子の平均粒径が大き
すぎる場合にも起り得る。また、不溶性担体粒子の平均
粒径が大きすぎると粒子の自然沈降が早まり、磁性体含
有粒子の平均粒径が小さすぎると磁場による分離に時間
がかかり、それぞれ実用的でない。

担体粒子に抗原あるいは免疫グロブリンクラスと特異的
に反応する物質を担持させる方法としては、物理吸着、
官能基を利用した共有結合何れでもよい。

担体粒子と担持させる物質の量比については特に制限は
ないが、担持物質に対し重量比で５〜２００倍量の担体
粒子を用いると、多くの場合良い結果が得られる。

抗原を担持させた不溶性担体粒子と、免疫グロブリンク
ラスと特異的に反応する物質を担持させた磁性体含有粒
子は、該抗原に対する抗体を含むと考えられる試料溶液
と混合し反応させる。反応開始時の混合は十分に行う必
要があるが、均一に混合された後は混合を止め放置して
反応させてもよい。反応は一般の免疫化学反応と同様に
９Ｈ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９にて行う。温度に
ついては、２〜５０°Ｃの範囲で実施可能であるが、望
ましくは室温乃至は３７〜４０°Ｃで反応させる。

反応時間は、反応直後から１昼夜まで任意であるが、感
度、操作性を考慮して、通常５〜６０分の範囲で設定さ
れる。これらの反応条件は、以降の工程についても同様
である。

目的のｐＨを維持するために、通常緩衝液が用いられる
。緩衝液としては、例えばリン酸、トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン等が用いられるが、中性から弱ア
ルカリ性で常用される殆どの緩衝液が使用可能である。

多くの場合、非特異反応を避けるために、塩化ナトリウ
ム等の塩類及び牛血清アルブミン等のタンパク質が添加
される。

抗原担持不溶性担体粒子と試料、及び免疫グロブリンと
特異的に結合する物質を担持させた磁性体含有粒子を混
合すると、試料中に含まれる抗体が担体粒子表面上の抗
原に結合し、さらにこの抗原に結合した抗体と磁性体含
有粒子上に担持された物質とが結合することにより不溶
性担体粒子と磁性体含有粒子間の凝集が成立する。この
場合、不溶性担体粒子上に担持された抗原と試料中杭体
、或は試料中杭体と磁性体含有粒子上に担持された物質
いずれの結合が先行しても、或は同時進行しても良いが
、抗原担持不溶性担体と試料中杭体を先ず反応させた後
に免疫グロブリンクラスに特異的に反応する物質を担持
させた磁性体含有粒子を作用させた方が、その逆の順序
の場合に比べ、磁性体含有粒子の反応効率上昇による感
度向上が期待でき、より好ましい。

上記の抗原担持不溶性担体粒子と免疫グロブリンクラス
と特異的に反応する物質を担持させた磁性体含有粒子の
使用割合は、ｌ：２０〜２０：ｌ、好ましくは１：４〜
４：１の範囲から選ばれる。

この範囲を越えていずれかの粒子の割合が多（なると、
抗原担持不溶性担体粒子どうしの凝集、あるいは、磁性
体含有粒子どうしの凝集がおこり、感度低下の原因とな
るので好ましくない。

抗原担持不溶性担体と試料中の抗体との反応では次の２
通りの場合が考えられる。

ｌ）抗体１分子が２粒子と結合し凝集を起こす。

２）抗体１分子は１粒子とのみ反応し粒子間の凝集は起
こらない。

通常のラテックス凝集反応においては、ｌ）の結果を測
定するので２）の反応が少ないほど好ましいが、本発明
では１）が少なく２）が多いほど望ましい。

何故なら１）の反応は抗体のクラスを問わず起こり得、
光学的測定に影響を与えるので、抗体クラス別定量の精
度を低下させる要因となるからである。

上記（１）の反応が少なく（２）の反応が多くなる具体
的な方法としては、 ■物理吸着あるいは共有結合により不溶性担体粒子に抗
原を高密度に担持させる。

■通常使用する不溶性担体の粒子径的０．１〜０゜８μ
ｍより大きい約１μｍ以上、好ましくは、１−２．５μ
ｍの不溶性担体を使用し、不溶性担体粒子１個あたりの
抗原数を増やす。

■反応液中の不溶性担体粒子の濃度を低くしたり、粒径
が約１μｍ以上、好ましくは、１〜２．５μｍと大きく
、かつ粒子が自然沈降をおこさない程度の高比重の不溶
性担体粒子を使用する等により、粒子どうしの衝突（粒
子間の衝突確率）を減少させる。

しかしながらこうした精度低下要因も実用上差し支えな
い程度であれば良いのであって、事実、抗原担持不溶性
担体粒子の量、担持抗原量、粒径を適当に選択（好適な
例として、不溶性担体粒子の平均粒径を１〜２．５μｍ
とし、かつ磁性体含有粒子の平均粒子を０．５〜１．５
μｍとし、さらに不溶性担体粒子と磁性体含有粒子の使
用割合を１＝０．８〜２とすることが挙げられる。）す
ることにより、１）の反応を相対的に抑制したり、ある
いは１）の反応は起こっても光学的測定結果への影響を
最小限に抑えることができる。

従って本発明は、その反応様式において２）のみに限定
されるものではな（，１）　、　２）いずれの場合も包
含する。

磁場のかけ方に関しては、磁性体含有粒子及び磁性体含
有粒子を含む凝集物を５〜２０分で分離できるような磁
場の強度及び反応系の形状が好ましい。分離に要する時
間が短すぎると、一般に感度、再現性の低下を招き、長
すぎると操作性を悪化させる。こうした理由から反応系
の大きさは比較的小さい方が扱い易い。９６穴マイクロ
プレートなどは個々のウェルのサイズは小さ（、ウェル
間の隙間に小磁石を置けば、マイクロプレートを利用し
たＥＩＡと同様にマイクロプレートリーグを用いて容易
に定量できるので本発明の実施に適した材料である。磁
石としては、永久磁石、電磁石等を使用する。

磁場により磁性体含有粒子を分離すると、磁性体含有粒
子と凝集を起こした抗原担持担体粒子も一緒に分離され
るので、分離後の、未反応の抗原担持担体粒子を含む反
応溶液の濁度乃至は担体粒子量を測定することにより、
該抗原と試料中の抗体との反応の度合いを容易に知るこ
とが出来る。

即ち該抗原と試料中の抗体との反応が強い程、濁度（吸
光度）は小さくなる。

この際、磁性体含有粒子の一部が分離しきれずに残り、
未反応抗原担持担体粒子と共に測定に掛かる場合がある
が、実用上問題のない程度であれば構わない。

光学的に検知する方法としては、最も単純には、照明下
黒色背景上で、抗原担持不溶性担体粒子残存量に応じた
濁度の違いを直接肉眼で観測しても良いが、各種比色計
や濁度計を用いれば定量が可能である。測定光波長とし
ては可視光または近赤外光相当の波長が、好ましくは６
００〜１ｌ１００ｎが用いられる。さらにはレーザー光
を用いたフローサイトメトリー法等を適用して残存粒子
数を直接計測しても良い。

定量を行う場合は、予め該抗体濃度既知品を、或は抗体
基準品を試料として測定を行い、得られた定量値を試料
の抗体濃度に対して図示すれば該抗体の検量線が得られ
るので、濃度未知試料の反応定量値から該抗体の濃度が
求められる。

［実施例］ 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明は以下に限定されるものではない。

〔実施例１〕 抗カルシオリピン抗体の測定 （試薬の調製法） １）カルシオリビン抗原担持炭末懸濁液の調製炭末（三
菱化成社製サーマルカーボンＭＴ、粒径０．３μｍ）１
０■を４ｄのエタノールに懸濁し分散する。炭末は沈澱
、凝集し易いので適宜超音波処理して分散させる（−以
降の工程も同様）０分散径遠心して炭末を沈澱させ、上
清を除去した所へ、カルシオリピン０．０３％、レシチ
ン０．０３％、コレステロール０．９％、及びエタノー
ル溶液４戚を加え再分散させ、更に３０分撹拌して均質
化する。続いて０．１Ｍリン酸緩衝食塩液（以下、「Ｐ
ＢＳＪと略記する）　　（ｐＨ７，４）　３．２ｒＩＩ
ｉを激しく撹拌している中へ、この炭末懸濁液全量を手
早く滴下し、更にＰＢＳ溶液１６．４　ｄを加え１０分
間激しく撹拌し続けることにより抗原を含む脂溶性成分
を炭未表面に吸着させる。吸着が完了したら遠心し上清
を除去して、塩化コリンｌＯ％を含むリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）２０ｍｌ！を添加し再分散して試薬とする。

こうして出来た炭未懸濁液は、梅毒試験の一種であるＲ
ＰＲ法（炭末凝集の肉眼判定による抗カルシオリビン抗
体検出法）用試薬としても、市販品と同等以上の感度を
持つ。

２）抗１ｇＧ、ＩｇＭ抗体Ｆ　（ａｂ’　）を担持磁性
体含有ラテックスの調製 家兎にヒトＩｇＧ、或はヒトＩｇＭを免疫して得られた
抗血清をベンス・ジョーンズ蛋白（χ及びλ）により吸
収し、得られたＩｇＧＳ　ＩｇＭのＨ鎖特異的抗血清か
ら常法によりＩｇＧ抗体両分を取り、ペプシンにて消化
後、分子ふるいカラムクロマトグラフィーにてＦ（ａｂ
’）、を得る。

一方ローヌプーラン社製磁性体含有ラテックス（エスタ
ボールＳＭＬ２６６、粒径０．７μｍ、１０％）１ｍｌ
を精製水１９ｄと充分に混合の後、遠心分離（１０００
０ｒｐｍ、１０分）して上清を除き、洗浄ラテックスペ
レットとする。そこへ０．ＩＭＦリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）（以下、「トリス緩衝液」と略記する）１０ｄに、
先に調製した抗■ｇｃ、乃至は抗ＴｇＭ抗体Ｆ　（ａｂ
’　）ｚ　４ｍｇを溶解した抗体溶液を加え再分散し、
更に１時間撹拌して磁性体含有ラテックス表面上にＦ（
ａｂ’）ｚを担持させる。再度遠心して上清を除き、０
．３％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝液１０戚に
て再分散、懸濁し安定化させた後、もう−度遠心して０
．（１５％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝液１０ｄ
中に懸濁し、４〜ｌＯ°Ｃで保存する。

（操作方法） ＲＰＲ法（前述）にて陽性（検出限界希釈倍率１６倍）
の梅毒患者血清、及び対照として陰性の健常者血清を、
０．１％ウシ血清アルブミン及び０゜９％食塩を含む０
．　Ｉ　Ｍ　Ｆリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）（以下、
ｒＴＢＳ緩衝液」と略記する）にて２０倍を始めとして
２倍ずつ段階的に３２０倍まで希釈系列を用意し、９６
穴マイクロプレートのウェルに各希釈系列試料及び対照
としてＴＢＳＩＩ衝液をそれぞれ１００μｌを各２ウエ
ルずっ分注する。

そこへカルシオリビン抗原担持炭末懸濁液をトリス緩衝
液にて２倍希釈したものを５０μｌずっ分注後、ただち
にマイクロプレート側方を軽＜１０秒はど叩いて内容物
を混合し、室温にて３０分間放置、反応させる。続いて
抗１ｇＧ担持磁性体含有ラテックス及び抗１ｇＭ担持磁
性体担持ラテックスをトリス緩衝液にて８倍に希釈した
ものを、それぞれ５０μβずつ試料の各希釈系列光たり
１ウヱルずつ分注し、同様に軽く叩いて混合して１０分
間室温放置、反応させた後、３　ｍｎ＋φの小型棒磁石
をマイクロプレート各ウェル外側面４方向から１０分間
作用させて磁性体含有ラテックスを側方に集める。そし
て各ウェル内に磁性体含有ラテックスと凝集せずに残っ
た抗原担持炭末懸濁液の濁度を、マイクロプレートリー
ダ（日本インターメッド社製、ＮＪ−２０００）を用い
て波長６２０ｎｍにて定量した。

表１に結果を示す。

抗１ｇＧ、ＩｇＭいずれの抗体担持磁性体含有ラテック
スとも陽性血清希釈試料に対しては３２０倍希釈品でも
反応し、ＲＰＲ法の感度を大幅に上回った。一方陰性試
料とはいずれの希釈倍率試料も反応を示さなかった。

〔実施例２〕 リウマトイド因子の測定 リウマトイド因子は慢性関節リウマチ患者血清中に見出
される抗ヒトＩｇＧ自己抗体で、他の動物１ｇＧ、特に
ウサギＩｇＧと交差反応する事が多い、リウマトイド因
子の抗体クラスは１ｇＭが一般的だが、ＩｇＧ、ＩｇＡ
も出現し、抗体クラスと病因との関係が注目されている
。

（試薬の調製法） １）ウサギＩｇＧ担持ラテックス試薬の調製ウサギＴ−
グロブリン（ＦｒＩＩ、ＩｇＧを７０〜９０％含む）４
■をトリス緩衝液１０ａ１！に溶解し、同様にトリス緩
衝液にて調製した粒径２．０２μのポリビニルトルエン
ラテックス（セラジエン社製）２％懸濁液と３０分撹拌
混合してラテックス表面にウサギγ−グロブリンを担持
させる。遠心分離後（１００００ｒｐｍ、１０分）上滑
を除き、０．３％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝液
２０ｄを加え、撹拌３０分にて再分散し、更に超音波処
理し分散度を高めラテックスを安定化させる。

引き続いて遠心分離の後、０．（１５％アジ化ナトリウ
ム、を含むトリス緩衝液２０１ｄに分散、懸濁して４〜
１０″Ｃにて保存する。

２）抗１ｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ抗体Ｆ　（ａｂ’　）。

担持磁性体含有ラテックスの調製法。

家兎にヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＡ、或はヒトＩｇＭを免疫
して得られた抗血清をベンス・ジョーンズ蛋白（χ及び
λ）により吸収し、得られたＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭの
Ｈ鎖特異的抗血清から常法によりＩｇＧ抗体画分を取り
、ペプシンにて消化後、分子ふるいカラムクロマトグラ
フィーにてＦ（ａｂ’）ｘを得る。一方ローヌプーラン
社製磁性体含有ラテックス（エスタボールＳＭＬ　２６
６、粒径０．７　ｐ　ｍ、１０％）ｌｄを精製水１９ｄ
と充分に混合の後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０
分）して上清を除き、洗浄ラテックスペレットとする。

そこヘトリス緩衝液１０ａｌｌ！に、先に調製した抗１
ｇＧ、乃至は抗ＩｇＭ抗体Ｆ（ａｂ’）！４■を溶解し
た抗体溶液を加え再分散し、更に１時間撹拌して磁性体
含有ラテックス表面上にＦ（ａｂ’Ｌを担持させる。再
度遠心して上清を除き、０．３％ウシ血清アルブミンを
含むトリス緩衝液１０ｄにて再分散、懸濁し安定化させ
た後、もう−度遠心して０．（１５％アジ化ナトリウム
を含むトリス緩衝液１０ｄ中に懸濁し、４〜１０°Ｃで
保存する。

（操作方法） （１）　　ＲＡ　ＨＡ法との比較 ＲＡＨＡ法（ウサギＩｇＧ感作ヒツジ赤血球凝集法によ
るリウマトイド因子検出法）により力価検定済みのリウ
マチ患者血清２０検体を、０．１％ウシ血清アルブミン
及びＴＢＳ緩衝液にて１００倍希釈したものを、マイク
ロプレートを用意してＩｇＧ、ＩｇＡＳ　１ｇＭ各クラ
ス検出用に１００ｐｌずつ３つのウェルに分注し、そこ
へウサギγ−グロブリン担持ラテックス懸濁液をトリス
緩衝液にて８倍希釈したものを５０μβずつ分注後、た
だちにマイクロプレート側方を軽く１０秒はど叩いて内
容物を混合し、室温にて１０分間放置、反応させる。続
いて抗１ｇＧ、乃至は抗１ｇＡ、抗１ｇＭ抗体担持磁性
体含有ラテックスをトリス緩衝液にて８倍に希釈したも
のを、それぞれ５０ｐｌずつ試料の各希釈系列光たり１
ウエルずつ分注し、同様に軽く叩いて混合して１０分間
室温放置、反応させた後、３　ｍｍφの小型棒磁石をマ
イクロプレート各ウェル外側面４方向から１０分間作用
させて磁性体含有ラテックスを側方に集める。

そして各ウェル内に磁性体含有ラテックスと凝集せずに
残ったウサギ−Ｔグロブリン担持ラテックス懸濁液の濁
度を、マイクロプレートリーグ（日本インターメッド社
製、ＮＪ−２０００）を用いて波長６２０ｎｍにて定量
し、ＲＡＨＡ法による力価と比較した。表２に結果を示
す。

概ねＲＡＨＡ法のタイターが高いものほど反応する傾向
にあるが、特に１ｇＭクラスとの相関が強い。

（２）ＥＩＡ法との比較 （１）の検討の結果、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭいずれの
クラスのりウマトイド因子をも含む事が分かっているｌ
検体を選び、ＴＢＳＩＩ街液にて６０倍から３倍希釈列
で１３１２２０倍希釈品までを調製して、（１）と同様
に測定し、ＥＩＡ法と比較した。

ＥＩＡ法は次のように行った。磁性体含有ラテックスに
担持させたものと同一の抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ
　　Ｆ（ａｂ’）ｚに同品の方法（「日本臨床」第３７
巻・夏期増刊号第１１２頁（１９７９年））に従ってパ
ーオキシダーゼ標識した。マイクロプレートにＰＢＳ緩
衝液溶解１００μｇ／ｒａｌウサギＴ−グロブリンを吸
着させ、更にウシ血清アルブミンＰＢＳ緩衝液処理した
ものを固相として同一検体の２０倍から３倍希釈列で４
３７４０倍希釈品までを調製し、５０μｌウエルに分注
、３７°Ｃで２時間反応させた。次にＰＢＳ緩衝液でプ
レートを５回洗浄の後、上記標識抗体の１０００〜２０
００倍希釈品５０μ２を分注し３７°Ｃ１２時間反応さ
せた。続いてｌＯ回ＰＢＳ１３１衝液洗浄を行ってから
、４−アミノアンチピリンを発色剤として室温で３０分
反応後、前記マイクロプレートリーグを用いて４９０ｎ
ｍの波長にて測定した。

結果を第１．２．３図に示す。

ＥＩＡ法では反応が強いほど吸光度が増大するので、検
体希釈倍率が高くなるに従って吸光度は減少するが、本
発明においては、反応は濁度の減少として測定されるの
で、検体希釈倍率が高くなり反応性が低下するほど濁度
は増加する。

ＥＩＡ、本性とも最大吸光度変化量は約０．６であるの
で、５０％反応値に相当する、吸光度０．３に対応する
検体希釈倍率で比較すると、ＩｇＧで５倍、ＩｇＡで９
０倍、ＩｇＭで１２倍、ＥＩＡに比べ本性のほうが検出
感度的に優れていることが分かる。

［発明の効果］ 本発明の方法によれば、従来の方法では必須であった分
離・洗浄等の面倒な操作を行うことなく、安全で、しか
もＲＩＡやＥＩＡに優るとも劣らない高感度で、抗体の
量の測定、さらに免疫グロブリンクラスの判別を決定す
ることが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、リウマチ患者血清検体希釈倍率とＩｇｃクラ
スリウマトイド因子反応性の関係について、本発明（・
）及びＥＩＡ法（０）で比較した図面である。反応性は
それぞれの吸光度で示した。 第２図及び第３図は、第１図と同様にして同一検体の、
それぞれＩｇＡ、ＩｇＭクラスリウマトイド因子の反応
性について示した図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）特定の抗原に対する試料中の抗体の量及び該抗体
   の免疫グロブリンクラスの別を、該抗原を担持させた不
   溶性担体粒子と、免疫グロブリンクラスと特異的に反応
   する物質を担持させた不溶性担体粒子を用いて測定する
   方法であって、不溶性担体粒子に該抗原を担持させた物
   を第一試薬、免疫グロブリンクラスと特異的に反応し得
   る物質を磁性体含有粒子に担持させた物を第二試薬とし
   、該抗原に対する抗体を含むと考えられる試料を、同一
   反応系内にて両試薬と反応させ、試料中に存在した該抗
   原に対する抗体を介して抗原担持不溶性担体粒子と磁性
   体含有粒子を凝集させた後に、磁場を付与して未反応の
   磁性体含有粒子及び磁性体含有粒子を含む凝集物を分離
   し、残存する未反応の抗原担持不溶性担体粒子量を目視
   乃至は光学的に検知することにより、試料溶液中の抗体
   量を測定すると共に、磁性体含有粒子担持物質の特異性
   から試料中の該抗体の免疫グロブリンクラスを知ること
   を特徴とする抗体測定法。 （２）不溶性担体粒子が、細胞、ゼラチン粒子、マイク
   ロカプセル類、有機高分子物質、無機微粒子、または、
   金属及び金属化合物コロイド粒子であることを特徴とす
   る請求項（１）記載の抗体の測定法。 （３）有機高分子物質がポリビニルトルエンまたはポリ
   スチレンであることを特徴とする請求項（２）記載の抗
   体の測定法。 （４）無機微粒子がカーボンブラックであることを特徴
   とする請求項（２）記載の抗体の測定法。 （５）免疫グロブリンクラスと特異的に反応し得る物質
   が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくは
   それらの抗体軽鎖部分に対する抗体、プロテインＡまた
   はＣ１ｑであることを特徴とする請求項（１）記載の抗
   体の測定法。 （６）磁性体含有粒子が多糖類、タンパク質およびタン
   パク質誘導体または合成高分子であることを特徴とする
   請求項（１）記載の抗体の測定法。 （７）合成高分子が芳香族ビニル化合物および／または
   メタクリル酸エステル誘導体の重合により得られること
   を特徴とする請求項（８）記載の抗体の測定法。 （８）磁性体含有粒子の磁性体が鉄または四酸化三鉄で
   あることを特徴とする請求項（１）記載の抗体の測定法
   。 （９）磁性体含有粒子の磁性体の平均粒径が１０〜２０
   ０Åであることを特徴とする請求項（１）記載の抗体の
   測定法。 （１０）磁性体含有粒子の磁性体含有量が５〜１００重
   量％であることを特徴とする請求項（１）記載の抗体の
   測定法。 （１１）磁性体含有粒子の磁性体含有量が１５〜６５重
   量％であることを特徴とする請求項（１０）記載の抗体
   の測定法。 （１２）不溶性担体粒子および磁性体含有粒子の平均粒
   径が０．１〜１０μｍであることを特徴とする請求項（
   １）記載の抗体の測定法。 （１３）不溶性担体粒子および磁性体含有粒子の平均粒
   径が０．２〜３μｍであることを特徴とする請求項四記
   載の抗体の測定法。 （１４）不溶性担体粒子の平均粒径が０．５〜３μｍで
   あり、かつ磁性体含有粒子の平均粒径が０．２〜２μｍ
   であることを特徴とする請求項（１）記載の抗体の測定
   法。 （１５）不溶性担体粒子の平均粒径が１〜２．５μｍで
   あり、かつ磁性体含有粒子の平均粒径が０．５〜１．５
   μｍであることを特徴とする請求項（１４）記載の抗体
   の測定法。（１６）不溶性担体粒子と磁性体含有粒子と
   の使用割合が１：２０〜２０：１であることを特徴とす
   る請求項（１）記載の抗体の測定法。 （１７）不溶性担体粒子と磁性体含有粒子との使用割合
   が１：４〜４：１であることを特徴とする請求項（１６
   ）記載の抗体の測定法。 （１８）不溶性担体粒子の平均粒径が１〜２．５μｍで
   あり、かつ磁性体含有粒子の平均粒径が０．５〜１．５
   μｍであって、さらに不溶性担体粒子と磁性体含有粒子
   の使用割合が１：０．８〜２であることを特徴とする請
   求項（１）記載の抗体の測定法。 （１９）を不溶性担体粒子及び磁性体含有粒子の各担体
   粒子が担持させる物質に対し重量比で５〜２００倍量で
   あることを特徴とする請求項（１）記載の抗体の測定法
   。 （２０）不溶性担体と試料中の抗体を反応させ、次いで
   免疫グロブリンに特異的に反応する物質を担持させた磁
   性体含有粒子を作用させることを特徴とする請求項（１
   ）記載の抗体の測定法。