JPH04210590A - 動物細胞の育種方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１１

【産業上の利用分野］本発明は外来遺伝子の導入による
形質転換動物細胞の育種方法に関するものである。更に
詳しくは、ある形質転換動物細胞に新たな特性を付与す
る方法に関するものである。 ［０００２］ 【従来の技術】動物細胞に外来遺伝子を導入し、形質転
換体を得る技術は有用な生理活性ペプチドの製造によっ
て重要である。遺伝子導入の親株としてはＣＨＯ，ＢＨ
Ｋ、ＨｅＬａなど種々の細胞株が用いられている。目的
物質を得るために重要な親株の特性は目的物質の単位細
胞当りの生産速度、適切な翻訳後修飾能及び好ましい培
養特性などが挙げられる。しかしこれらをすべて満たす
親株を選択するのは困難である。特に翻訳後修飾の複雑
なタンパク質を生産しようとする場合、適切な修飾能を
持つ宿主細胞は極めて限定され、しかもそのような細胞
は目的物質生産能や培養特性などの面で好ましくない場
合が多い。 ［０００３］例えば抗血栓剤として有望なヒトプロティ
ンＣの場合、実用的な活性を得るためにはＬ鎖Ｎ末端か
ら数えて初めの９個のグルタミン酸残基がγ−カルボキ
シル化されてγ−カルボキシグルタミン酸となる必要が
ある。しかし、プロティンＣ遺伝子を導入して十分にγ
カルボキシル化がなされ、十分活性を持つプロティンＣ
を産生できる細胞株はごく少ない（Ｓ、Ｃ，Ｙａｎ　ｅ
ｔ　ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｓｃｉ、、１ｐ２６４　（１９８９））　、現在知ら
れている最もγ−カルボキシル化活性の高い細胞株はヒ
ト胎児腎由来２９３株である（Ｓ、Ｃ，Ｂｅｔｔｙ　Ｙ
ａｎ　ｅｔ　ａ　ｌ；ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、
　　８６５５（１９９０）　）が、この株は細胞同志の
凝集性が高く、最も効率的と考えられているザンペンジ
ョン培養には不向きであり、また接着能も弱いため担体
接着型培養にも適さないという培養特性上の欠点を持つ
。 ［０００４］一方凝集性が低くザスペンジョン培養に適
した細胞株としてはサスペンション馴化ＢＨＫ株がある
が、この株はγ−カルボキシル化活性が低いという欠点
を持つ。 ［０００５］これらの異なる特性を持つ細胞株の特性改
善法の一つとして細胞融合法がある。遺伝子導入形質転
換細胞と他の細胞の融合により特性を改善させた例とし
ては、ＨＢｓ抗原遺伝子を導入したＶｅｒｏ細胞株と、
サル肝臓初代培養細胞を融合してＨＢｓ抗原産土産生増
大させた例がある（Ｎｉｃｏｌｅ　Ｃｈｅｎｉｎｅｒ　
ｅｔ　ａｌ；　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、　　８
，８５８（１９９０））。しかしこれまで細胞融合によ
り遺伝子導入細胞の翻訳後修飾能の改善あるいは培養特
性の改善を行なった例は報告されていない。 ［０００６］

【発明の目的】そこで本発明者らは−Ｆ記の問題を解決
すべく、好ましい特性を合わせ持つ目的物質生産細胞株
を得ることを目的として研究を進めた。その結果、細聰
融合法を用いることにより目的が達成され得ることを見
出した。 ［０００７］

【発明の構成】本発明はγ−カルボキシル化及び培養特
性について一方は優れているが一方は劣っているという
特性を持つ細胞に分子内にＧＩ　ａドメインを有するタ
ンパク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転
換体と、これと反対の特性を持つ細胞を融合することを
特徴とする動物細胞の育種方法である。 ［０００８］かかる本発明によれば、高いγ−カルボキ
シル化活性と優れた培養特性を合わせ持つ目的物質生産
株を得ることが可能となる。 ［０００９］すなわち本発明は、低凝集性動物細胞Ｃ１
およびγ−カルボキシル化活性を有する動物細胞Ｃ２の
どちらか一方に、分子内にＧｌａｌミドメインするタン
パク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換
体ともう一方の動物細胞とを細胞融合し、Ｇｌａｌミド
メインルボキシル化したタンパク質を効率的に生産する
細胞を選択することからなる動物細胞の育種方法である
。 ［００１０１また本発明は、低凝集性動物細胞Ｃ］およ
びγ−カルボキシル化活性を有する動物細胞Ｃ２とを細
胞融合して得られた融合細胞に、分子内にＧ　ｌ　ａド
メインを有するタンパク質をコードする遺伝子を導入し
、Ｇｌａｌミドメインルボキシル化したタンパク質を効
率的に生産する細胞を選択する動物細胞の育種方法であ
る。 ［００１１１本発明においては、分子内にＧ１　ａドメ
インを有するタンパク質としてヒトプロティンＣまたは
ヒト活性化プロティンＣが好適である。本発明において
、低凝集性動物細胞としてＢＨＫ株が好適である。γ−
カルボキシル化活性を有する動物細胞はヒｈ胎児由来２
９３株が好適である。 ［００１２］また本発明は、低凝集性動物細胞Ｃ１およ
びｒ−カルボキシル化活性を有する動物細胞Ｃ２のどち
らか一方に、分子内にＧｌ　ａドメインを有するタンパ
ク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体
ともう一方の動物細胞とを細胞融合し、Ｇ　ｌ　ａドメ
インがカルボキシル化したタンパク質を効率的に生産す
る細胞を選択することにより得られるＧｌａ化率５０％
以上の動物細胞を包含する。本発明の実施例によればＧ
ｌａ化率の上限は８０％前後であるが好ましくは１００
％である。かかる動物細胞の平均凝集度は低凝集性動物
細胞Ｃ１と同程度、すなわち１〜５個／凝集塊程度であ
る。 ［００１３］本発明の低凝集性動物細胞とはサスペンシ
ョン培養を行なう際の培養の難易度の指標となる細胞の
平均凝集度が１〜５個／凝集塊である細胞である。細胞
の平均凝集度は種々の方法で測定することができるが、
適当客層（約５０〜１００＋ｎｌ）の三角フラスコ中に
適当密度の細胞懸濁塵（１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度）
を適当層（１０〜２０ｍ１）入れ、一定時間（１８〜２
４−時間）振盪培養し、一定量の培地中の凝集塊数を計
数して平均凝集度を算出するという方法が簡便かつ適切
である。ある細胞では凝集性がカルシウムイオン依存性
であることが知られているため、この際に用いる培地は
通常濃度（０，３〜１．８＋ｕＭ）のカルシウムイオン
を含む無血清培地を用いるべきである。 ［００１４３細胞のγ−カルボキシル化活性は、細胞に
分子内にＧ［ａトメ・インを有するタンパク質をコード
する遺伝子を導入して生産されるタンパクのＧｌａ化の
程度を測定することにより知ることができる。Ｇｌａ化
率は生産タンパクを精製後アミノ酸分析を行なうことに
よって測定しても良いが、より簡便には目的タンパク質
のＧｌａｌミドメイン異的に認識するモノクローナル抗
体を用いたＥＬＩＳＡにより求められる。本発明では後
者の方法に依った。 ［００１５３本発明で用いる導入遺伝子のコードするタ
ンパク質はその分子内にＧｌ　ａドメインを有し、翻訳
後のγ−カルボキシル化が活性発現の為に不可欠である
ようなものである。例としては血液凝固線溶因子である
プロ１へロシビン、第１Ｘ因子、第Ｘ因子、第■■Ｉ因
子、プロティンＣ，プロティンＳあるいはオステオカル
シン、ポーングラタンバクなどが挙げられる。 ［００１６］プロテインＣは、生体内での血液凝固及び
フィブリン溶解活性の発生において重要な役割を演する
セリンプロテアーゼのチモーゲン又は前駆体である。こ
のものは肝臓中で単鎖ポリペプチドとして合成され、こ
のポリペプチドはかなりのプロセシングを受けてジルス
フイド結合により一緒に保持された重鎮（Ｍｒ＝４０゜
０００）及び軽鎖（Ｍｒ＝２１，０００）を含んでなる
２本鎖分子となる。循儂中のこの２本鎖中間体は、重鎮
のアミノ末端からのＪ２残基ペプチドのトロンビン介在
開裂により°”活性化されたプロティンＣ′’　　（Ａ
ＰＣ）として知られる生物学的に活性な形の分子に転換
される。 ［００１７］本発明においてはかかるタンパクをコード
する遺伝子を宿主細胞に導入した細胞を細胞融合に用い
ることができる。 ［００１８］本発明で用いる動物細胞の種類及び組合せ
は特に限定はないが遺伝子導入宿主細胞としてはＢＨＫ
細胞株が適している。特にサスペンション培養に馴化し
たＢＨＫ細胞株が有利である。これに対する融合パート
ナ−は樹立細胞株であっても初代培養細胞であっても良
い。樹立細胞株としてはヒト胎児腎由来２９３株が有利
に用いられる。 ［００１，９］細胞の融合法はポリエチ１／ングリコー
ルによる方法や電気パルスによる工Ｉ／クトロボレーシ
ョン法などが一般的であるが、どのような方法を用いて
も良い。 ［００２０１融合株の選択は、樹立細胞株同志の融合の
場合には異なる薬剤耐性マーカー遺伝子を用いることに
より行なうことができる。例えば、細胞ＣＩにｄｈｆｒ
遺伝子をマーカーとして目的タンパク質遺伝子を導入し
、ＭＴＸで選択した場合、ネオマイシン耐性遺伝子を導
入してＧ４１８で選択した細胞Ｃ２と融合してＭＴＸ及
びＧ４１８を共に含む選択培地で融合株を選択すること
ができる。融合パートナ−に初代培養細胞を用いる場合
には、遺伝子導入細胞にヒボキサンチンホスホリボシ月
用ヘランスフエラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株あるいはチ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株を用い、融合後にＨＡＴ
選択培地で融合株を選択することができる。この他にも
無血清培地での増殖性の相違や培養器壁への接着性の相
違などの特性の相違を利用した選択法、あるいはセルソ
ーターによる分離、さらにはこれらの方法の組合せなど
種々の方法が考えられる。 ［００２１１得られた融合株からの高Ｇｌａ化タンパク
質生産クローンの選択はＧ１　ａドメイン特異的モノク
ローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡなどで行う。すなわち
各クローンの培養上清中のタンパクのＧｌａ化率の高い
クローンを選ぶことにより行える。 ［００２２］本発明においてＧｌａｌミドメインルボキ
シル化したタンパク質を効率的に生産する細胞とは、該
細胞の平均凝集度がサスペンション培養を行うに際して
充分低く、かつ、Ｇｌａ化率が充分高い細胞のことをさ
す。一つの基準として、融合に用いた低凝集性細胞と同
程度の平均凝集度を有し、かつ、融合に用いたもう一方
のγ−カルボキシル化活性を有する細胞と同程度のＧｌ
ａ化率を有する細胞を選択することができる。たとえば
、低凝集性細胞であるＢＨＫ株と高いＧｌａ化率を有す
る２９３株を融合させた融合細胞においては、ＢＨＫ株
の平均凝集度１〜５個／凝集塊程度を維持し、かつ、２
９３株のＧｌａ化率５０〜１００％を維持している細胞
を選択することができる。 ［００２３］

【発明の効果】かくして、本発明方法によれば高いγカ
ルボキシル比活性と優れた培養特性を合わせ持つ目的物
質産生細胞を容易に得ることが可能となる。 ［００２４］

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を詳述する。 ［００２５）

【実施例１】融合株は以下の方法により作成した。 ［００２６１遺伝子導入宿主細胞としては無血清サスペ
ンション培養馴化低凝集性ＢＨＫ１２Ｄ株を用いた。こ
の低凝集性ＢＨＫ１２Ｄ株はＢＨＫ５０７株のクローニ
ングにより得られたものであり、無血清サスペンション
培養に適した株であり、先に出願した特願平１１８１４
７号（平成２年７月１１日出願：低凝集性ＢＨＫ細胞及
びこれを用いた培養方法）に記載した方法により分離し
た株である。ＢＨＫ５０７株とはＢＨＫ２１株より得ら
れた温度感受性味（ｔ　ｓ　１３）　　（Ｔａｌａｖｅ
ｒａ　ａｎｄ　Ｂａｃ口１ｉｃｏ、Ｊ、Ｃｅ１ｌＰｈｙ
ｓｉｏ１．９２，４２５−４３６　（１９７７））によ
り分離されたチミジンキナーゼ欠損株（Ｗａｅｃｈｔｅ
ｒ　ａｎｄ　Ｂａ５ｅ　ｒｇａ、ＰＮＡＳ　７９．１１
０６−１１１０（１９８２）　）である。 ［００２７］融合パートナ−としてはヒト胎児腎細胞由
来の２９３株を用いた。この株はγ−カルボキシル化（
Ｇｌ　ａ化）活性は高いが、通常の培地では大きな凝集
塊を形成し、また無血清培地での増殖能も低いため無血
清サスペンション培養には不向きである。 ［００２８］　ＢＨＫＩ２Ｄ株にｄｈｆｒを選択マーカ
ー遺伝子としてヒト活性化プロティンＣ（ＡＰＣ）に遺
伝子を導入し、メソトレキセート（ＭＴＸ）によりＡＰ
Ｃ生産株を選択した。 ［００２９］得られたコロニを２４ｗｅｌｌプレートに
移し、２ｍｌ／ｗｅｌｌの選択培地を加え、コンフルエ
ントに達するまで培養し、上清中の全ＡＰＣ濃度および
Ｇｌ　ａ化ＡＰＣ濃度を測定した。ＡＰＣはサンドイツ
チ法ＥＬＩＳＡにより行ない、−次抗体にＧ１　ａ非特
異的抗ＰＣモノクローナル抗体を用い、２次抗体には全
ＡＰＣ測定の場合には抗ＰＣポリクローナル抗体を、Ｇ
ｌａ化ＡＰＣ測定の場合にはＧｌａ特異的抗ＰＣ抗体を
用いた。Ｇｌａ化率は（Ｇｌａ化ＡＰＣ濃度（ｔＬｇ／
ｎ＋ｌ）　／全ＡＰＣ濃度（μｇ／ｍｌ）　）　Ｘｉ　
００で算出した。ＡＰＣ生産速度はｉｏｃｍφプレート
でコシフルエンドに達した後、培養上清を除き、新たに
選択培地４ｍｌを加えて２４時間培養することにより求
めた。結果を（表１）に示す。このうち最もＡＰＣ産土
産生高かったＢＨＫ１２ＤＡＩＡ１株を融合に用いた。 ［００３０１

【表１］ ２９３株にはネオマイシン耐性遺伝子を導入し、Ｇ４１
８による選択によりＧ４１８耐性株を得た。 ［００３１１細胞融合は以下の方法により行なった。 ［００３２］融合剤としてはＰＥＧ４０００を用いた。 ＢＨＫ１２ＤのＡＰＣ生産株のうちの１クロ一ンＢＨＫ
１２ＤＡＩＡ１株と２９３Ｇ４１８耐性株をそれぞれ２
×１０７個ずつを混合し、５０％ＰＥＧ４０００溶液に
より融合を行なった。融合後の選択は１μＭのＭＴＸ。 ５００　ｕ　ｇ／ｍｌのＧ４１８，５％透析ＦＣ３，５
μｇ／ｍｌのビタミンＫｌ　を含むグルコース増強ダル
ベツコ変法イーグル培地で行なった。 ［００３３］融合後約３週間でコロニーが出現した。コ
ロニー出現効率は全処理細胞数当り３〜５Ｘ１０−６で
あった。このコロニーを拾い、それぞれのＡＰＣ産生臘
。 Ｇｌａ化率を測定した。Ｇｌａ化率は（Ｇ　ｌ　ａ化Ａ
ＰＣ濃度（μｇ／ｍｌ）　／全ＡＰＣ濃度（μｇ／ｍｌ
）　）　Ｘ　１００で算出した。 ［００３４］融合株のＡＰＣ産生能力を測定した。 ［００３５］融合により得られたコロニーを２４ｗｅｌ
ｌプレートに移し、２ｍｌ／ｗｅｌｌの選択培地を加え
、コンフルエントに達するまで培養し、上清中の全ＡＰ
Ｃ濃度及びＧｌａ化ＡＰＣ濃度を測定した。ＡＰＣ濃度
の測定はサンドイツチ法ＥＬＩＳＡにより行なった。１
次抗体にはＧｌａ非特異的抗ＰＣモノクローナル抗体を
用い、２次抗体には全ＡＰＣ測定の場合には抗ＰＣポリ
クローナル抗体を、Ｇｌａ化ＡＰＣ測定の場合にはＧｌ
ａ特異的抗ＰＣ抗体を用いた。ＡＰＣ生産速度は］、Ｏ
ｃｍΦプレートでコンフルエントに達した後、培養上清
を除き、新たに選択培地４ｍｌを加えて２４時間培養す
ることにより求めた。 ［００３６］クローンは全部で１０個取得した。それぞ
れの２４ＷｅｌｌプレートでのＡＰＣ産生量、Ｇ　Ｉ　
ａ化率は（表２）に示す。 ［００３７］ 【表２】 （表２）に示すように各クローンは２．　４．　９．　
１０のようにＧｌａ化率の高いクローンと１．　３．　
５．　６゜７．８のようにＧｌａ化率の低いクローンと
に大別された。 ［００３８１Ｇｌａ化率の高かったクローン２，４゜９
．１０の単位細胞、単位時間当りのＡＰＣ産生速度を求
めた。その結果を（表３）に示す。 ［００３９］

【表３】 最もＧ　ｌ　ａ化ＡＰＣ産土量の高かったクローン４を
以後の実験に用いた。 ［００４０］

【比較例１１２９３株との融合に用いたＢＨＫ１２ＤＡ
ＩＡＩ株のＡＰＣ生産速度を測定した。 ［００４１１培地にＧ４１８を含まない選択培地を用い
た以外は実施例１のクローン２．４．　９．　１０のＡ
ＰＣ生産速度を求めた条件と同様に行なった。結果を（
表４）に示す。 ［００４２１ 【表４］ このように（Ｊ　ｌ　ａ化率、　Ｇ　１．　ａ化ＡＰＣ
生産速度はクローン２．　４．　９．　１０のいすね、
にも劣っていた。 ［００４３］ 【実施例２】融合株の培養特性を調べるため細胞の凝集
度を測定した。 ［００４４］　５０ｍ１の容量の三角フラスコ中にトリ
プシン処理によりプレー１−から分離し、新鮮培地に懸
濁した細胞懸濁液１０ｍ１を入れロータリーシェーカー
により一定時間撹拌した後、次式により平均凝集度を算
出した。 平均凝集度−初期細胞数／撹拌後全細胞塊数（個／凝集
塊）撹拌の条件は下記の通りである。 ［００４５］細胞密度：　Ｉ　Ｘ　１０６ｃｅｌｌｓ／
ｍｌ培地：ダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）振
盪機：大洋ロータリーシェーカーＲ−１１振盪速度：１
３５ｒｐｍ 温度：３７℃ 振盪時間：１８時間 雰囲気：５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ ＢＨＫ１２ＤＡＩＡ１と２９３株の融合株であるクロー
ン４の平均凝集度を測定したところ２．２個／凝集塊で
あった。 ［００４６］

【比較例２】細胞にＢＨＫ１２ＤＡＩＡ１株及び２９３
株を用いた以外は実施例２と同様に行ない、ＢＨＫ１２
ＤＡＩ、Ａ］−株および２９３株の凝集度を調べた。 ［００４７］　ＢＨＫ１２ＤＡＩＡ１および２９３株の
平均凝集度を（表５）に示す。 ［００４８］

【表５】 このように融合株の凝集度はＢＨＫ株に近かった。 ［００４９１

【実施例３］融合株クローン４の生産したＡＰＣの抗凝
固活性を調べた。 ［００５０１Ｂ■（Ｋｌ　２ＤＡＩＡ１と２９３の融合
株クローン４を血清を含む選択培地でプレー　ト上にコ
ンフルエン１〜に達するまで増殖させた後血清を含まな
い選択培地に交換し、約１日後培養上清を採取した。こ
の培養」二清からＧＩ　ａ特異的抗ＡＰＣモノクローナ
ル抗体アフィニティーカラムによりＧｌ　ａ化ＡＰＣを
精製し、抗凝固活性を測定した。 ［００５１１抗凝固活性は下記の手順により測定した。 ［００５２］ヒト正常血漿（ミドリ十字社すイｊ〜ロー
ルＩ）１００μｍを３７℃で１分間インキュへ−Ｉ−後
、適当濃度に希釈した精製ＡＰＣ１００μｍ及びＡＰＴ
Ｔ試薬（ミドリ十字社データファイ・ＡＰＴＴ）１００
ＩＬ１を加えた。３７℃で２分間インキュベート後、２
５ｍＭ塩化カルシウム溶液１００μｍを加え、自動血液
凝固測定装置（東亜医用電子ＣＡ−１００）で凝固時間
を測定した。ＡＰＣを添加しない場合の凝固時間に対す
る凝固時間の増加を抗凝固活性の指標とした。 ［００５３１融合株のクローン４が生産するＡＰＣの抗
凝固活性（血漿凝固時間の増加）を（表６）に示す。 ［００５４］ 【表６】 ［００５５］

【比較例３］　ＢＨＫＡＩＡＩ　　１２Ｄ株を用いた以
外は実施例３と同様に行ない、ＢＨＫＡＩＡＩ　　１２
Ｄ株の生産したＡＰＣの抗凝固活性（凝固時間増加）を
調べた。 ［００５６］血漿凝固時間の増加を ［００５７］ 【表７】 （表７） に示す。 このように融合株生産ＡＰＣはＢＨＫ生産ＡＰＣと同等
以上の活性を有していた。 ［００５８］

【実施例４１】融合株クローン４のサスペンション培養
を行なった。 ［００５９］培養液には基礎培地として、ＲＰＭ１１６
４０培地、ハム←Ｆ１−２培地及びダルベツコ変法イー
グル培地を２：１：１で混合したものにアミノ酸、グル
コース等をさらに増強したもの（以下、ｅ−ＲＤＦと称
する）を用い、増殖因子としてインスリン、トランスフ
ェリン、エタノールアミン、亜セレン酸（ＩＴＥＳ）を
加えた。インスリンの添加量は９μｇ／ｌｌ１ｌ、トラ
ンスフェリンは１０μｇ／ｍｌ、エタノールアミンは１
０μＭ、亜セレン酸（ま２０ｎＮｉであった。 ［００６０１培養には（図１）に示す培養システムを使
用した。培養槽は（図１）のように外壁の内側に隔壁に
よって仕切られたセトリングゾーンがもうけられ、その
上部には培養液の排出口を有しており、正味培養容積は
約２００ｍ１である。酸素は外径４ｍｍφの多孔性テフ
ロンチューブによって供給した。あらかじめオートクレ
ーブ滅菌した前記培養槽に正味培養容積が約２００ｍ１
になるように培養液を送入し、これにＢＨＫ］、２ＤＡ
ＩＡ］と２９３の融合株クローン４をｌＸ１０８個／ｍ
ｌとなるように播種した。 ［００６１１培養槽気層には酸素ガスが（溶存酸素が３
ｐｐｍとなるように）吹込みノズルを通して自動的にコ
ントロールされて送入された。培養槽中の培養液は３７
℃に保持された。培蓋槽中にはマリン型撹拌翼が取付け
られており、撹拌速度は４０ｒｐｍであった。 ［００６２］播種後１日間は回分培養を行ない、この後
パーヒユージョンを開始した。 ［００６３］融合株クローン４のサスペンション培養結
果を（表８）に示す。 ［００６４］

【表８】 ［００６５］

【比較例４１　ＢＨＫ１２ＤＡＩＡ１株を用いた以外は
実施例４と同様にＢＨＫＡＩＡ１株のサスペンション培
養を行なった。 ［００６６］　ＢＨＫＡＩＡ１株のサスペンション培養
結果を（表９）に示す。 ［００６７］ 【表９】

【図面の簡単な説明】

図１は実施例４で使用し培養システムを示す。

【符号の説明】

１　酸素 ２　新鮮培地 ３　溶存酸素電極 ４　多孔性テフロンチューブ ５　使用済培地

【図１】

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】低凝集性動物細胞Ｃ１およびγ−カルボキ
   シル化活性を有する動物細胞Ｃ２のどちらか一方に、分
   子内にＧｌａドメインを有するタンパク質をコードする
   遺伝子を導入して得られた形質転換体ともう一方の動物
   細胞とを細胞融合し、Ｇｌａドメインがカルボキシル化
   したタンパク質を効率的に生産する細胞を選択する動物
   細胞の育種方法。
2. 【請求項２】低凝集性動物細胞Ｃ１およびγ−カルボキ
   シル化活性を有する動物細胞Ｃ２とを細胞融合して得ら
   れた融合細胞に、分子内にＧｌａドメインを有するタン
   パク質をコードする遺伝子を導入し、Ｇｌａドメインが
   カルボキシル化したタンパク質を効率的に生産する細胞
   を選択する動物細胞の育種方法。
3. 【請求項３】低凝集性動物細胞Ｃ１およびγ−カルボキ
   シル化活性を有する動物細胞Ｃ２のどちらか一方に、分
   子内にＧｌａドメインを有するタンパク質をコードする
   遺伝子を導入して得られた形質転換体ともう一方の動物
   細胞とを細胞融合し、Ｇｌａドメインがカルボキシル化
   したタンパク質を効率的に生産する細胞を選択すること
   により得られるＧｌａ化率５０％以上の動物細胞。