JPH04211363A - 二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体 - Google Patents
二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体Info
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- JPH04211363A JPH04211363A JP3010777A JP1077791A JPH04211363A JP H04211363 A JPH04211363 A JP H04211363A JP 3010777 A JP3010777 A JP 3010777A JP 1077791 A JP1077791 A JP 1077791A JP H04211363 A JPH04211363 A JP H04211363A
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- plasminogen activator
- tissue plasminogen
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は二重特異性を有するハイ
ブリッドモノクローナル抗体に関する。さらに詳しくは
二重特異性の一方がティッシュプラスミノーゲンアクチ
ベータ（以下、ＴＰＡと略記することがある）に対し、
他方がＴＰＡの診断を可能にする物質、特に酵素、蛍光
性物質または放射線核種に対するハイブリッドモノクロ
ーナル抗体を産生するポリドーマおよびその産生するモ
ノクローナル抗体（以下、ＭｏＡｂと略記することがあ
る）に関する。本発明はまた、上記のハイブリッドＭｏ
Ａｂを用いてＴＰＡを迅速、簡便かつ特異的に測定する
免疫学的測定法に関する。ＴＰＡはプラスミノーゲンを
活性化してプラスミンに変換するセリンプロテアーゼの
１種で、ウロキナーゼ（以下、ＵＫと略記することがあ
る）やストレプトキナーゼと異なりフィブリンに対する
親和性が高いことから、出血傾向の少ない血栓溶解剤と
して注目されている。特に最近では遺伝子組換え技術を
利用することによって大量生産の途が開かれたことから
、臨床への応用も盛んである〔Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ
ｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ ｆｏｒ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｙｐｅ
Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ランセ
ット（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ），８４２（１９８５）〕
。 また、さらに効果的な血栓溶解剤の研究・開発がなされ
、修飾ＴＰＡやＵＫあるいはプロＵＫとＴＰＡとのハイ
ブリッド蛋白などが作製された。修飾ＴＰＡに関しては
、半減期の短い原因と考えられる糖鎖構造を一部欠失し
たＴＰＡムテインを遺伝子工学的に作成し、肝細胞など
の糖鎖レセプターによる捕捉を避け、血中動態の改善を
はかっている。またＵＫ−ＴＰＡのハイブリッド蛋白で
はＵＫの強い血栓溶解性とＴＰＡのフィブリン親和性と
を併用し、投与量の軽減を目指している。これらの血栓
溶解剤は従来のものと比べ出血傾向の減少をもたらすと
期待されている。このように血栓溶解剤としてＴＰＡや
その誘導体の開発が幅広く実施されるにつれ、又その生
理学的意義のより詳細な解明のため、ＴＰＡの高感度微
量測定法が重要な課題となった。現在ＴＰＡの測定法と
しては、（１）その酵素活性を合成基質を用いて直接に
測定する方法、（２）プラスミノーゲンの活性化を通じ
て観察されるフィブリン溶解斑を測定する方法、そして
（３）抗ＴＰＡ抗体を用いる放射免疫測定法あるいは酵
素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡと略記することがある
）がある。（１）の測定法は簡便で短時間での測定が可
能であるが、感度が低い。（２）の測定法は血栓溶解作
用との相関を見る上で重要であるが、やや煩雑で必ずし
も感度が高くない。（３）の測定法はＴＰＡの生物活性
を必ずしも反映していないが、比較的簡便でしかも高感
度なため、繁用されている。とくにＥＬＩＳＡは特別の
機器を必要とすることなく約５〜２０時間のアッセイで
、血清など体液中の微量のＴＰＡを測定出来る。この場
合、２種の抗体を用いて被検液中のＴＰＡをはさみ結合
させるサンドイッチ（以下、ＳＷと略記することがある
）法が有利に用いられている。しかしかかる方法ではい
ずれかの抗体にマーカー、例えば酵素、蛍光性物質また
は放射性核種などを標識する操作が必要となる。この操
作はいずれも化学結合法により実施されるが、多くの場
合抗体の抗原結合能の低下、凝集性の増大（巨大分子の
産生）およびアッセイで用いる固相への非特異的吸着等
を伴い、また標識抗体の安定性にも限界があった。また
このＳＷ法においては、まず被検液中のＴＰＡを固相の
抗ＴＰＡ抗体に結合させ洗浄後、次にマーカーを結合し
た標識抗体を添加して再び洗浄、そしてマーカー測定と
いうように少なくとも２回の結合反応、洗浄操作を要し
、必ずしも簡便な方法といえない面を有している。一方
、最近のハイブリドーマ作成技術は新しいタイプのトリ
オーマ、テトラオーマといったポリドーマの出現を可能
にし〔Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ら ：ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、３０５， ５３７（１９８３）， Ｍ．Ｒ
．Ｓｕｒｅｓｈ ら ：プロシージング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス、ユーエスエー（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）
、８３， ７９８９（１９８６）〕、新しい機能をもっ
た二重特異性を有する抗体の作製を可能にした〔特開昭
６３−１２２７６号（ハイブリテック社）、米国特許明
細書第４，７１４，６８１号（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｔｅｘ
ａｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）〕
。
ブリッドモノクローナル抗体に関する。さらに詳しくは
二重特異性の一方がティッシュプラスミノーゲンアクチ
ベータ（以下、ＴＰＡと略記することがある）に対し、
他方がＴＰＡの診断を可能にする物質、特に酵素、蛍光
性物質または放射線核種に対するハイブリッドモノクロ
ーナル抗体を産生するポリドーマおよびその産生するモ
ノクローナル抗体（以下、ＭｏＡｂと略記することがあ
る）に関する。本発明はまた、上記のハイブリッドＭｏ
Ａｂを用いてＴＰＡを迅速、簡便かつ特異的に測定する
免疫学的測定法に関する。ＴＰＡはプラスミノーゲンを
活性化してプラスミンに変換するセリンプロテアーゼの
１種で、ウロキナーゼ（以下、ＵＫと略記することがあ
る）やストレプトキナーゼと異なりフィブリンに対する
親和性が高いことから、出血傾向の少ない血栓溶解剤と
して注目されている。特に最近では遺伝子組換え技術を
利用することによって大量生産の途が開かれたことから
、臨床への応用も盛んである〔Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ
ｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ ｆｏｒ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｙｐｅ
Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ランセ
ット（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ），８４２（１９８５）〕
。 また、さらに効果的な血栓溶解剤の研究・開発がなされ
、修飾ＴＰＡやＵＫあるいはプロＵＫとＴＰＡとのハイ
ブリッド蛋白などが作製された。修飾ＴＰＡに関しては
、半減期の短い原因と考えられる糖鎖構造を一部欠失し
たＴＰＡムテインを遺伝子工学的に作成し、肝細胞など
の糖鎖レセプターによる捕捉を避け、血中動態の改善を
はかっている。またＵＫ−ＴＰＡのハイブリッド蛋白で
はＵＫの強い血栓溶解性とＴＰＡのフィブリン親和性と
を併用し、投与量の軽減を目指している。これらの血栓
溶解剤は従来のものと比べ出血傾向の減少をもたらすと
期待されている。このように血栓溶解剤としてＴＰＡや
その誘導体の開発が幅広く実施されるにつれ、又その生
理学的意義のより詳細な解明のため、ＴＰＡの高感度微
量測定法が重要な課題となった。現在ＴＰＡの測定法と
しては、（１）その酵素活性を合成基質を用いて直接に
測定する方法、（２）プラスミノーゲンの活性化を通じ
て観察されるフィブリン溶解斑を測定する方法、そして
（３）抗ＴＰＡ抗体を用いる放射免疫測定法あるいは酵
素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡと略記することがある
）がある。（１）の測定法は簡便で短時間での測定が可
能であるが、感度が低い。（２）の測定法は血栓溶解作
用との相関を見る上で重要であるが、やや煩雑で必ずし
も感度が高くない。（３）の測定法はＴＰＡの生物活性
を必ずしも反映していないが、比較的簡便でしかも高感
度なため、繁用されている。とくにＥＬＩＳＡは特別の
機器を必要とすることなく約５〜２０時間のアッセイで
、血清など体液中の微量のＴＰＡを測定出来る。この場
合、２種の抗体を用いて被検液中のＴＰＡをはさみ結合
させるサンドイッチ（以下、ＳＷと略記することがある
）法が有利に用いられている。しかしかかる方法ではい
ずれかの抗体にマーカー、例えば酵素、蛍光性物質また
は放射性核種などを標識する操作が必要となる。この操
作はいずれも化学結合法により実施されるが、多くの場
合抗体の抗原結合能の低下、凝集性の増大（巨大分子の
産生）およびアッセイで用いる固相への非特異的吸着等
を伴い、また標識抗体の安定性にも限界があった。また
このＳＷ法においては、まず被検液中のＴＰＡを固相の
抗ＴＰＡ抗体に結合させ洗浄後、次にマーカーを結合し
た標識抗体を添加して再び洗浄、そしてマーカー測定と
いうように少なくとも２回の結合反応、洗浄操作を要し
、必ずしも簡便な方法といえない面を有している。一方
、最近のハイブリドーマ作成技術は新しいタイプのトリ
オーマ、テトラオーマといったポリドーマの出現を可能
にし〔Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ら ：ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、３０５， ５３７（１９８３）， Ｍ．Ｒ
．Ｓｕｒｅｓｈ ら ：プロシージング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス、ユーエスエー（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）
、８３， ７９８９（１９８６）〕、新しい機能をもっ
た二重特異性を有する抗体の作製を可能にした〔特開昭
６３−１２２７６号（ハイブリテック社）、米国特許明
細書第４，７１４，６８１号（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｔｅｘ
ａｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）〕
。
【０００２】
【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる技術
的背景のもとに研究を重ね、従来の免疫測定法では必須
であったマーカーと、抗体もしくは抗原との化学結合操
作を不要にし、かつ操作性の簡便化・操作時間の短縮化
を可能にするハイブリッド ＭｏＡｂを開発し、それを
用いたＴＰＡの免疫学的診断法を完成した。すなわち本
発明は、二重特異性の一方がＴＰＡに対し、他方がＴＰ
Ａの診断を可能にする物質、例えば酵素、蛍光性物質ま
たは放射性核種などに対している二重特異性を有するハ
イブリッドＭｏＡｂ、およびそのハイブリッドＭｏＡｂ
を産生するポリドーマに関するものである。
的背景のもとに研究を重ね、従来の免疫測定法では必須
であったマーカーと、抗体もしくは抗原との化学結合操
作を不要にし、かつ操作性の簡便化・操作時間の短縮化
を可能にするハイブリッド ＭｏＡｂを開発し、それを
用いたＴＰＡの免疫学的診断法を完成した。すなわち本
発明は、二重特異性の一方がＴＰＡに対し、他方がＴＰ
Ａの診断を可能にする物質、例えば酵素、蛍光性物質ま
たは放射性核種などに対している二重特異性を有するハ
イブリッドＭｏＡｂ、およびそのハイブリッドＭｏＡｂ
を産生するポリドーマに関するものである。
【０００３】また本発明は、抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリ
ドーマと抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰ
と略記することがある）抗体産生ハイブリドーマとを融
合して得られるテトラオーマより産生される二重特異性
を有するハイブリッド ＭｏＡｂに関するものであり、
さらにこのハイブリッド ＭｏＡｂを用いて得られる迅
速・簡便でかつ特異的なＴＰＡの免疫学的診断法に関す
るものである。
ドーマと抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰ
と略記することがある）抗体産生ハイブリドーマとを融
合して得られるテトラオーマより産生される二重特異性
を有するハイブリッド ＭｏＡｂに関するものであり、
さらにこのハイブリッド ＭｏＡｂを用いて得られる迅
速・簡便でかつ特異的なＴＰＡの免疫学的診断法に関す
るものである。
【０００４】本発明の二重特異性を有するハイブリッド
ＭｏＡｂ産生ポリドーマの作製にあたっては、例えば
ＴＰＡと結合活性の高い抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドー
マのいずれをも用いることができる。このためにまず、
免疫原であるＴＰＡを動物に接種し抗ＴＰＡ抗体の産生
を促す。この場合、ＴＰＡとしては天然型あるいは組換
え型いずれのものでもよく、組換え型ＴＰＡについても
各種のＴＰＡムテインが使用できる。このような免疫原
の一例としてヒトメラノーマ細胞より抽出・精製した天
然型ＴＰＡ〔 Ｄ．Ｃ．Ｒｉｊｋｅｎ ら：ジャーナル
・オブ・バイオロジカルケミストリー（ Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ． ），２５６，７０３５（１９８１）〕あ
るいは各種の動物細胞で発現された組換え型Ｎ末端欠損
ＴＰＡ〔 Ｋ．Ｗｉｋｓｔｒｏｍ ら：スロンボーシス
・アンド・ヘモスターシス（ Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ
ｏｓｔａｓ．），６２，３０４（１９８９）〕が挙げら
れる。接種動物としては、例えばウサギ、ラット、マウ
ス、モルモットなどが用いられるが、ＭｏＡｂ製造の場
合にはマウスが特に好ましく用いられる。
ＭｏＡｂ産生ポリドーマの作製にあたっては、例えば
ＴＰＡと結合活性の高い抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドー
マのいずれをも用いることができる。このためにまず、
免疫原であるＴＰＡを動物に接種し抗ＴＰＡ抗体の産生
を促す。この場合、ＴＰＡとしては天然型あるいは組換
え型いずれのものでもよく、組換え型ＴＰＡについても
各種のＴＰＡムテインが使用できる。このような免疫原
の一例としてヒトメラノーマ細胞より抽出・精製した天
然型ＴＰＡ〔 Ｄ．Ｃ．Ｒｉｊｋｅｎ ら：ジャーナル
・オブ・バイオロジカルケミストリー（ Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ． ），２５６，７０３５（１９８１）〕あ
るいは各種の動物細胞で発現された組換え型Ｎ末端欠損
ＴＰＡ〔 Ｋ．Ｗｉｋｓｔｒｏｍ ら：スロンボーシス
・アンド・ヘモスターシス（ Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ
ｏｓｔａｓ．），６２，３０４（１９８９）〕が挙げら
れる。接種動物としては、例えばウサギ、ラット、マウ
ス、モルモットなどが用いられるが、ＭｏＡｂ製造の場
合にはマウスが特に好ましく用いられる。
【０００５】接種方法としては、通常実施される方法に
従えばよく、例えばマウスに１回１〜 １００μｇ、好
ましくは ５〜２５μｇを等容量（０．１ｍｌ）の生理
食塩水およびフロイントの完全アジュバンドで乳化して
、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜
６回接種する方法がとられる。
従えばよく、例えばマウスに１回１〜 １００μｇ、好
ましくは ５〜２５μｇを等容量（０．１ｍｌ）の生理
食塩水およびフロイントの完全アジュバンドで乳化して
、背部、腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜
６回接種する方法がとられる。
【０００６】これらの免疫動物、例えばマウスから抗体
価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓および
あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生
細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法
に従い実施でき、融合促進剤としてはポリエチレングリ
コール（以下、ＰＥＧと略記することがある）やセンダ
イウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用
いられる。骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓ
Ｐ２／０など、特にＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。例
えば脾臓細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は１：１〜
１０：１で、これに分子量 １，０００ 〜 ９，００
０ のＰＥＧが １０〜８０ ％の濃度で添加され、２
０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で３〜１０分イン
キュベートするのが良い。
価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓および
あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生
細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法
に従い実施でき、融合促進剤としてはポリエチレングリ
コール（以下、ＰＥＧと略記することがある）やセンダ
イウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用
いられる。骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓ
Ｐ２／０など、特にＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。例
えば脾臓細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は１：１〜
１０：１で、これに分子量 １，０００ 〜 ９，００
０ のＰＥＧが １０〜８０ ％の濃度で添加され、２
０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で３〜１０分イン
キュベートするのが良い。
【０００７】抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマのスクリ
ーニングには種々の方法が使用できるが、例えばＴＰＡ
を吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上
清を添加し、次にＨＲＰ標識した抗マウス免疫グロブリ
ン抗体を加え、プレート固相に結合した抗ＴＰＡ抗体を
検出するＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。ＨＡＴ（ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン）添加培地で選
別、育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは直ちに
クローニングに供されるが、通常これは限界希釈法など
で容易に実施される。クローン化されたハイブリドーマ
培養上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価
の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、目的と
するモノクローナルな抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマ
を取得することができる。
ーニングには種々の方法が使用できるが、例えばＴＰＡ
を吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上
清を添加し、次にＨＲＰ標識した抗マウス免疫グロブリ
ン抗体を加え、プレート固相に結合した抗ＴＰＡ抗体を
検出するＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。ＨＡＴ（ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン）添加培地で選
別、育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは直ちに
クローニングに供されるが、通常これは限界希釈法など
で容易に実施される。クローン化されたハイブリドーマ
培養上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価
の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、目的と
するモノクローナルな抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマ
を取得することができる。
【０００８】以上のような製造法に従って作製した抗Ｔ
ＰＡ抗体産生ハイブリドーマの例として、後述の実施例
１に示したマウスハイブリドーマＴＰＡ１−３９が挙げ
られる。
ＰＡ抗体産生ハイブリドーマの例として、後述の実施例
１に示したマウスハイブリドーマＴＰＡ１−３９が挙げ
られる。
【０００９】また本発明におけるＴＰＡの診断を可能に
する物質としては、酵素、蛍光性物質、放射性核種ある
いはそのキレート化合物などであればいずれでもよい。 これらの例として、ＨＲＰ、β−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、フルオレセイン、テトラメチ
ルロダミン、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）
などが挙げられ、特に感度・安全性・取扱易さなどの点
から酵素類が好ましく、さらに好ましくはＨＲＰなどが
用いられる。
する物質としては、酵素、蛍光性物質、放射性核種ある
いはそのキレート化合物などであればいずれでもよい。 これらの例として、ＨＲＰ、β−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、フルオレセイン、テトラメチ
ルロダミン、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）
などが挙げられ、特に感度・安全性・取扱易さなどの点
から酵素類が好ましく、さらに好ましくはＨＲＰなどが
用いられる。
【００１０】かかる抗体産生ハイブリドーマの作製につ
いては、前記した抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマの場
合と同様の手順で実施できる。またそれらのハイブリド
ーマのスクリーニングについても、例えば抗ＨＲＰ抗体
を検出する場合では、抗マウス免疫グロブリン抗体を吸
着させたマイクロプレートに被検ハイブリドーマ培養上
清を添加し、プレートにマウス免疫グロブリンを結合さ
せ、次いで遊離のＨＲＰを添加して特異抗ＨＲＰ抗体を
ＨＲＰ酵素活性を介して検出するＥＬＩＳＡなどが用い
られる。このようにして作製された抗ＨＲＰ ＭｏＡｂ
産生ハイブリドーマの例として、後述の実施例３に示し
たマウスハイブリドーマＨＲ１−３２が挙げられる。
いては、前記した抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマの場
合と同様の手順で実施できる。またそれらのハイブリド
ーマのスクリーニングについても、例えば抗ＨＲＰ抗体
を検出する場合では、抗マウス免疫グロブリン抗体を吸
着させたマイクロプレートに被検ハイブリドーマ培養上
清を添加し、プレートにマウス免疫グロブリンを結合さ
せ、次いで遊離のＨＲＰを添加して特異抗ＨＲＰ抗体を
ＨＲＰ酵素活性を介して検出するＥＬＩＳＡなどが用い
られる。このようにして作製された抗ＨＲＰ ＭｏＡｂ
産生ハイブリドーマの例として、後述の実施例３に示し
たマウスハイブリドーマＨＲ１−３２が挙げられる。
【００１１】本発明の二重特異性を有するハイブリッド
ＭｏＡｂを産生するポリドーマの作製にはいくつかの
手法があり〔例、新本洋士ら：蛋白質・核酸・酵素，３
３，２１７（１９８８）など〕，いずれの方法を用いて
もよいが、例えば■上記のＨＡＴ抵抗性の抗ＴＰＡ抗体
産生ハイブリドーマを、５−ブロモデオキシウリジン（
以下、５−ＢｒｄＵと略記することがある）添加の培養
液に段階的に馴化させ、チミジンキナーゼ欠損株をクロ
ーン化しＨＡＴ感受性とする。同様にＨＡＴ抵抗性の抗
ＨＲＰ抗体産生ハイブリドーマを８−アザグアニン（以
下、８−ＡＺＧと略記することがある）耐性とし、ヒポ
キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ欠損株をクローン化しＨＡＴ感受性とする。次いで
常法に従い両者を融合して得られるテトラオーマをＨＡ
Ｔ添加培地で選別後、ＴＰＡおよびＨＲＰの両者に結合
能を有するハイブリッド ＭｏＡｂを分泌するテトラオ
ーマをクローン化する，■抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリド
ーマをフルオレセイン・イソチオシアネート（以下、Ｆ
ＩＴＣと略記することがある）で標識し、もう一方の抗
ＨＲＰ抗体産生ハイブリドーマをテトラメチル・ロダミ
ン・イソチオシアネート（以下、ＴＲＩＴＣと略記する
ことがある）で標識後、常法に従い両者を融合する。得
られた細胞懸濁液をフルオレセイン・アクティベイティ
ッド・セルソーター（以下、ＦＡＣＳと略記することが
ある）に供し、ＦＩＴＣの緑色およびＴＲＩＴＣの赤色
の蛍光を同時に有するテトラオーマを選別・クローン化
するなどの方法が挙げられる。又両親株のマーカーを全
く逆にして使用し、テトラオーマを選別・クローン化す
ることも可能である。
ＭｏＡｂを産生するポリドーマの作製にはいくつかの
手法があり〔例、新本洋士ら：蛋白質・核酸・酵素，３
３，２１７（１９８８）など〕，いずれの方法を用いて
もよいが、例えば■上記のＨＡＴ抵抗性の抗ＴＰＡ抗体
産生ハイブリドーマを、５−ブロモデオキシウリジン（
以下、５−ＢｒｄＵと略記することがある）添加の培養
液に段階的に馴化させ、チミジンキナーゼ欠損株をクロ
ーン化しＨＡＴ感受性とする。同様にＨＡＴ抵抗性の抗
ＨＲＰ抗体産生ハイブリドーマを８−アザグアニン（以
下、８−ＡＺＧと略記することがある）耐性とし、ヒポ
キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ欠損株をクローン化しＨＡＴ感受性とする。次いで
常法に従い両者を融合して得られるテトラオーマをＨＡ
Ｔ添加培地で選別後、ＴＰＡおよびＨＲＰの両者に結合
能を有するハイブリッド ＭｏＡｂを分泌するテトラオ
ーマをクローン化する，■抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリド
ーマをフルオレセイン・イソチオシアネート（以下、Ｆ
ＩＴＣと略記することがある）で標識し、もう一方の抗
ＨＲＰ抗体産生ハイブリドーマをテトラメチル・ロダミ
ン・イソチオシアネート（以下、ＴＲＩＴＣと略記する
ことがある）で標識後、常法に従い両者を融合する。得
られた細胞懸濁液をフルオレセイン・アクティベイティ
ッド・セルソーター（以下、ＦＡＣＳと略記することが
ある）に供し、ＦＩＴＣの緑色およびＴＲＩＴＣの赤色
の蛍光を同時に有するテトラオーマを選別・クローン化
するなどの方法が挙げられる。又両親株のマーカーを全
く逆にして使用し、テトラオーマを選別・クローン化す
ることも可能である。
【００１２】これらの操作における細胞融合に当っては
センダイウィルス、ＰＥＧなどの融合促進剤やあるいは
電気刺激などの方法が用いられる。好ましくはＰＥＧが
用いられ、以下にその一例を挙げるが、もちろんこの方
法に限定されるものではない。すなわち、分子量約 １
，０００〜 ９，０００、濃度約 １０〜８０ ％等の
ＰＥＧが用いられ、処理時間は約 ０．５〜３０分であ
るが、好ましい条件の一例として、約３５〜５５ ％の
ＰＥＧ ６，０００を約４〜１０ 分間、３７℃で細胞
と接触させ、効率よく融合させることができる。
センダイウィルス、ＰＥＧなどの融合促進剤やあるいは
電気刺激などの方法が用いられる。好ましくはＰＥＧが
用いられ、以下にその一例を挙げるが、もちろんこの方
法に限定されるものではない。すなわち、分子量約 １
，０００〜 ９，０００、濃度約 １０〜８０ ％等の
ＰＥＧが用いられ、処理時間は約 ０．５〜３０分であ
るが、好ましい条件の一例として、約３５〜５５ ％の
ＰＥＧ ６，０００を約４〜１０ 分間、３７℃で細胞
と接触させ、効率よく融合させることができる。
【００１３】ポリドーマの選択は、上記のＨＡＴ添加培
地などで実施できるが、このため８−ＡＺＧ、６−チオ
グアニン（６−ＴＧ）あるいは５−ＢｒｄＵなどの薬剤
馴化法により、それぞれの薬物耐性株が取得される。ま
た新しいマーカーの融合細胞への導入により、種々の選
択培地が用いられる。このような例として、ネオマイシ
ンやハイグロマイシンＢ添加培地などが挙げられる〔Ｂ
． Ｓｕｇｄｅｎ．ら：モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．）
，５，４１０（１９８５）〕。
地などで実施できるが、このため８−ＡＺＧ、６−チオ
グアニン（６−ＴＧ）あるいは５−ＢｒｄＵなどの薬剤
馴化法により、それぞれの薬物耐性株が取得される。ま
た新しいマーカーの融合細胞への導入により、種々の選
択培地が用いられる。このような例として、ネオマイシ
ンやハイグロマイシンＢ添加培地などが挙げられる〔Ｂ
． Ｓｕｇｄｅｎ．ら：モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．）
，５，４１０（１９８５）〕。
【００１４】さらに前記したように、異なった蛍光色素
で標識したハイブリドーマを融合し、ＦＡＣＳで二重標
識されたハイブリッド・ハイブリドーマをソーティング
する方法もある〔Ｌ． Ｋａｒａｗａｊｅｗ ら：
ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），９６，２６５（１９
８７）〕。
で標識したハイブリドーマを融合し、ＦＡＣＳで二重標
識されたハイブリッド・ハイブリドーマをソーティング
する方法もある〔Ｌ． Ｋａｒａｗａｊｅｗ ら：
ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），９６，２６５（１９
８７）〕。
【００１５】ハイブリッド抗体産生ポリドーマのスクリ
ーニングには種々の方法が使用できる。例えば、■前述
した抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマと抗ＨＲＰ抗体産
生ハイブリドーマのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡ
の併用，■ＴＰＡ結合マイクロプレートに被検培養上清
を添加し、つぎに遊離のＨＲＰを加えて二重特異性を有
するハイブリッド抗体検出のためのＥＬＩＳＡ、あるい
は抗ＴＰＡ抗体と異なるサブクラスに属する抗ＨＲＰ抗
体を用いる場合は，■ＴＰＡ結合マイクロプレートに被
検培養上清を添加し、つぎにＨＲＰ標識した該抗マウス
ＩｇＧサブクラス特異抗体を加えて二重特異性抗体を検
出するＥＬＩＳＡ、およびこれらの変法などを適宜組み
合わせて用いることができる。
ーニングには種々の方法が使用できる。例えば、■前述
した抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマと抗ＨＲＰ抗体産
生ハイブリドーマのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡ
の併用，■ＴＰＡ結合マイクロプレートに被検培養上清
を添加し、つぎに遊離のＨＲＰを加えて二重特異性を有
するハイブリッド抗体検出のためのＥＬＩＳＡ、あるい
は抗ＴＰＡ抗体と異なるサブクラスに属する抗ＨＲＰ抗
体を用いる場合は，■ＴＰＡ結合マイクロプレートに被
検培養上清を添加し、つぎにＨＲＰ標識した該抗マウス
ＩｇＧサブクラス特異抗体を加えて二重特異性抗体を検
出するＥＬＩＳＡ、およびこれらの変法などを適宜組み
合わせて用いることができる。
【００１６】ハイブリッド抗体活性陽性のポリドーマは
直ちにクローニングに供されるが、これは通常限界希釈
法などで容易に実施される。クローン化されたポリドー
マの培養上清については、上記の方法でその抗体価を測
定し、安定的に力価の高い抗体を産生するポリドーマを
選択することにより、目的とするモノクローナルなハイ
ブリッド抗体産生ポリドーマを取得することができる。
直ちにクローニングに供されるが、これは通常限界希釈
法などで容易に実施される。クローン化されたポリドー
マの培養上清については、上記の方法でその抗体価を測
定し、安定的に力価の高い抗体を産生するポリドーマを
選択することにより、目的とするモノクローナルなハイ
ブリッド抗体産生ポリドーマを取得することができる。
【００１７】上記した本発明のポリドーマの培養は通常
、液体培地中、または動物の腹腔内（例えば、マウス等
哺乳動物の腹腔内）で公知の方法により実施できる。 培養液および腹水中の抗体の精製については公知の生化
学的手法を組み合わせて用いることによりできる。例え
ば、細胞培養液もしくは腹水を遠心分離し、上清を取り
出し、塩析（通常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナト
リウムを用いる）を実施する。得られたタンパク沈殿物
を適当な溶液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフィ
ー（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、プロテインＡ
カラム、ヒドロキシアパタイトカラム等）に付し、目的
とする抗体を分離精製することができる。以上のような
分離精製操作により、例えば１リットルの培養上清から
タンパク重量比で８０％以上の純度のハイブリッドＭｏ
Ａｂを約１〜５ｍｇ得ることができる。また、２０ｍｌ
の腹水液からは同様の抗体が５〜２０ｍｇ得られる。
、液体培地中、または動物の腹腔内（例えば、マウス等
哺乳動物の腹腔内）で公知の方法により実施できる。 培養液および腹水中の抗体の精製については公知の生化
学的手法を組み合わせて用いることによりできる。例え
ば、細胞培養液もしくは腹水を遠心分離し、上清を取り
出し、塩析（通常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナト
リウムを用いる）を実施する。得られたタンパク沈殿物
を適当な溶液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフィ
ー（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、プロテインＡ
カラム、ヒドロキシアパタイトカラム等）に付し、目的
とする抗体を分離精製することができる。以上のような
分離精製操作により、例えば１リットルの培養上清から
タンパク重量比で８０％以上の純度のハイブリッドＭｏ
Ａｂを約１〜５ｍｇ得ることができる。また、２０ｍｌ
の腹水液からは同様の抗体が５〜２０ｍｇ得られる。
【００１８】以上のようにして得られたハイブリッドＭ
ｏＡｂを蛋白分解酵素（ペプシンなど）処理などにより
、ＴＰＡおよびＴＰＡの診断を可能にする物質に対する
結合能を保持するＦ（ａｂ´）２ 断片などを得ること
ができ、これらは本発明のハイブリッドＭｏＡｂと同様
の目的で用いることができる。
ｏＡｂを蛋白分解酵素（ペプシンなど）処理などにより
、ＴＰＡおよびＴＰＡの診断を可能にする物質に対する
結合能を保持するＦ（ａｂ´）２ 断片などを得ること
ができ、これらは本発明のハイブリッドＭｏＡｂと同様
の目的で用いることができる。
【００１９】以上のような製造法に従って作製したハイ
ブリッド抗体産生ポリドーマの例として、後述の実施例
４に示したトリオーマＨＴ２−２６３が挙げられる。な
お、本発明のハイブリッドＭｏＡｂを産生するポリドー
マとして、抗ＴＰＡＭｏＡｂ産生ハイブリドーマとＴＰ
Ａの診断を可能にする物質に対するＭｏＡｂ産生ハイブ
リドーマとのテトラオーマの例を挙げたが、一方のＭｏ
Ａｂを産生するハイブリドーマと他方のＭｏＡｂを産生
する細胞とのトリオーマ、あるいはそれぞれのＭｏＡｂ
を産生する細胞をエプスタイン・バー・ウイルスなどに
より不死化後、細胞融合して得られたハイブリドーマな
どであっても、本発明のハイブリッドＭｏＡｂを産生す
るものであれば、上記テトラオーマと同様の目的で用い
ることができる。
ブリッド抗体産生ポリドーマの例として、後述の実施例
４に示したトリオーマＨＴ２−２６３が挙げられる。な
お、本発明のハイブリッドＭｏＡｂを産生するポリドー
マとして、抗ＴＰＡＭｏＡｂ産生ハイブリドーマとＴＰ
Ａの診断を可能にする物質に対するＭｏＡｂ産生ハイブ
リドーマとのテトラオーマの例を挙げたが、一方のＭｏ
Ａｂを産生するハイブリドーマと他方のＭｏＡｂを産生
する細胞とのトリオーマ、あるいはそれぞれのＭｏＡｂ
を産生する細胞をエプスタイン・バー・ウイルスなどに
より不死化後、細胞融合して得られたハイブリドーマな
どであっても、本発明のハイブリッドＭｏＡｂを産生す
るものであれば、上記テトラオーマと同様の目的で用い
ることができる。
【００２０】本発明のＴＰＡの免疫学的測定法において
は、種々のアッセイ系が用いられる。例えば、■未知量
のＴＰＡを含有する被検液に、一定量の本発明のハイブ
リッド抗体、酵素および固相に結合したＴＰＡを加え、
固相に結合した酵素の活性を測定することによって検液
中のＴＰＡを測定する方法（競争結合法）、および■本
発明のハイブリッド抗体と抗原決定基を互いに重複しな
い抗ＴＰＡ抗体を結合した固相にＴＰＡ含有検液と一定
量の本発明ハイブリッド抗体および酵素を加え、固相に
結合した酵素の活性を測定することにより検液中のＴＰ
Ａを測定する方法（サンドイッチ法）などがある。いず
れの方法においても、従来の測定法に比べて簡便で短時
間での測定が可能である。例えば、■および■の方法で
は１〜２時間以内にＴＰＡ濃度を測定することができる
。また酵素などを予め抗体や抗原に化学結合させる必要
がなく、用時、遊離の酵素を使用できる。しかもこの場
合、精製酵素標品を必ずしも用いる必要がない。本発明
のアッセイで用いられる被検試料としては、血清・血漿
・尿・組織抽出液などいずれのものでも測定可能である
。
は、種々のアッセイ系が用いられる。例えば、■未知量
のＴＰＡを含有する被検液に、一定量の本発明のハイブ
リッド抗体、酵素および固相に結合したＴＰＡを加え、
固相に結合した酵素の活性を測定することによって検液
中のＴＰＡを測定する方法（競争結合法）、および■本
発明のハイブリッド抗体と抗原決定基を互いに重複しな
い抗ＴＰＡ抗体を結合した固相にＴＰＡ含有検液と一定
量の本発明ハイブリッド抗体および酵素を加え、固相に
結合した酵素の活性を測定することにより検液中のＴＰ
Ａを測定する方法（サンドイッチ法）などがある。いず
れの方法においても、従来の測定法に比べて簡便で短時
間での測定が可能である。例えば、■および■の方法で
は１〜２時間以内にＴＰＡ濃度を測定することができる
。また酵素などを予め抗体や抗原に化学結合させる必要
がなく、用時、遊離の酵素を使用できる。しかもこの場
合、精製酵素標品を必ずしも用いる必要がない。本発明
のアッセイで用いられる被検試料としては、血清・血漿
・尿・組織抽出液などいずれのものでも測定可能である
。
【００２１】■のアッセイ系で用いられる固相抗ＴＰＡ
抗体としては、本発明のハイブリッド抗体と互いに抗原
決定部位を重複しないものであれば、いずれのものでも
よいが、ＴＰＡを免疫原として作成したＴＰＡ中和活性
を有するウサギＰｏＡｂあるいはマウスＭｏＡｂが好ま
しく用いられる。このような抗ＴＰＡ抗体の例として後
述の実施例１に示したマウスＭｏＡｂ ＴＰＡ１−７０
などが挙げられる。また遊離のＴＰＡとは反応するが、
ＴＰＡとプラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビタ
ー１（以下、ＰＡＩ−１と略記することがある）との複
合体には反応しないマウスＭｏＡｂを固相抗体として用
いた時には被検試料中の遊離のＴＰＡを選択的に検出で
き、遊離型と複合体型のＴＰＡの分別定量が可能となる
。このような抗ＴＰＡ抗体の例として後述の実施例１に
示したマウスＭｏＡｂ ＴＰＡ２−１４（特願平２−１
７２９３５号明細書参照）などが挙げられる。
抗体としては、本発明のハイブリッド抗体と互いに抗原
決定部位を重複しないものであれば、いずれのものでも
よいが、ＴＰＡを免疫原として作成したＴＰＡ中和活性
を有するウサギＰｏＡｂあるいはマウスＭｏＡｂが好ま
しく用いられる。このような抗ＴＰＡ抗体の例として後
述の実施例１に示したマウスＭｏＡｂ ＴＰＡ１−７０
などが挙げられる。また遊離のＴＰＡとは反応するが、
ＴＰＡとプラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビタ
ー１（以下、ＰＡＩ−１と略記することがある）との複
合体には反応しないマウスＭｏＡｂを固相抗体として用
いた時には被検試料中の遊離のＴＰＡを選択的に検出で
き、遊離型と複合体型のＴＰＡの分別定量が可能となる
。このような抗ＴＰＡ抗体の例として後述の実施例１に
示したマウスＭｏＡｂ ＴＰＡ２−１４（特願平２−１
７２９３５号明細書参照）などが挙げられる。
【００２２】
【発明の効果】以上のように、本発明の二重特異性を有
するハイブリッド抗体はＴＰＡを簡便・迅速、しかも特
異的に測定できる意味でＴＰＡの臨床診断にきわめて有
用であり、従来のＭｏＡｂに比べて優れた特性を有する
。
するハイブリッド抗体はＴＰＡを簡便・迅速、しかも特
異的に測定できる意味でＴＰＡの臨床診断にきわめて有
用であり、従来のＭｏＡｂに比べて優れた特性を有する
。
【００２３】
【実施例】以下に参考例・実施例により本発明を具体的
に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもので
ないことはいうまでもない。なお、実施例で用いられて
いる動物細胞は、以下の表１に示すように寄託が行われ
ている。 表
１
（ＩＦＯ） （Ｆ
ＲＩ） 動物細胞
ＩＦＯ Ｎｏ． ＦＥＲＭ
Ｎｏ．マウスハイブリドーマ
５０２３３ ＢＰ−２８１９
ＴＰＡ １−３９ マウスハイブリドーマ
５０１７９ ＢＰ−２０８６
ＴＰＡ １−７０ マウスハイブリドーマ
５０１９４ ＢＰ−２５１９
ＴＰＡ ２−１４
マウスハイブリドーマ
５０２３４ ＢＰ−２８１８
ＨＲ １−３２ マウスハイブリッドハイブリドーマ ５０２３５
ＢＰ−２８１７ ＨＴ ２
−２６３
Ｉ
ＦＯ：財団法人発酵研究所（大阪） ＦＲ
Ｉ：通商産業省微生物工業技術研究所。
に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもので
ないことはいうまでもない。なお、実施例で用いられて
いる動物細胞は、以下の表１に示すように寄託が行われ
ている。 表
１
（ＩＦＯ） （Ｆ
ＲＩ） 動物細胞
ＩＦＯ Ｎｏ． ＦＥＲＭ
Ｎｏ．マウスハイブリドーマ
５０２３３ ＢＰ−２８１９
ＴＰＡ １−３９ マウスハイブリドーマ
５０１７９ ＢＰ−２０８６
ＴＰＡ １−７０ マウスハイブリドーマ
５０１９４ ＢＰ−２５１９
ＴＰＡ ２−１４
マウスハイブリドーマ
５０２３４ ＢＰ−２８１８
ＨＲ １−３２ マウスハイブリッドハイブリドーマ ５０２３５
ＢＰ−２８１７ ＨＴ ２
−２６３
Ｉ
ＦＯ：財団法人発酵研究所（大阪） ＦＲ
Ｉ：通商産業省微生物工業技術研究所。
【００２４】参考例１．抗ＴＰＡ抗体測定用ＥＬＩＳＡ
ＴＰＡ ５μｇ／ｍｌ溶液を９６穴マイクロプレートに
１００μｌずつ分注し、４℃で一昼夜放置後、さらに２
％カゼイン，０．０１％チメロサール含有リン酸食塩液
（以下、ＰＢＳと略記することがある） １５０μｌを
添加して感作プレートを作製した。上記の液を除去し０
．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸食塩緩衝液（以下
、ＰＢＳ−Ｔｗと略記することがある）で洗浄後、被検
ハイブリドーマ培養上清１００μｌを添加し室温で２時
間反応させた。再びＰＢＳ−Ｔｗでプレートを洗浄後、
ホースラデイッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウ
サギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、室温で２時間反応さ
せた。洗浄後、酵素基質としてオルソフェニレンジアミ
ンおよびＨ２Ｏ２を含有する０．１Ｍクエン酸緩衝液を
各ウェルに加え、室温で酵素反応を実施した。１Ｎ硫酸
で反応停止後、マルチスキャン（フロー社製）を用いて
波長４９２ｎｍで発色色素量を測定した。
ＴＰＡ ５μｇ／ｍｌ溶液を９６穴マイクロプレートに
１００μｌずつ分注し、４℃で一昼夜放置後、さらに２
％カゼイン，０．０１％チメロサール含有リン酸食塩液
（以下、ＰＢＳと略記することがある） １５０μｌを
添加して感作プレートを作製した。上記の液を除去し０
．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸食塩緩衝液（以下
、ＰＢＳ−Ｔｗと略記することがある）で洗浄後、被検
ハイブリドーマ培養上清１００μｌを添加し室温で２時
間反応させた。再びＰＢＳ−Ｔｗでプレートを洗浄後、
ホースラデイッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウ
サギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、室温で２時間反応さ
せた。洗浄後、酵素基質としてオルソフェニレンジアミ
ンおよびＨ２Ｏ２を含有する０．１Ｍクエン酸緩衝液を
各ウェルに加え、室温で酵素反応を実施した。１Ｎ硫酸
で反応停止後、マルチスキャン（フロー社製）を用いて
波長４９２ｎｍで発色色素量を測定した。
【００２５】参考例２．抗ＨＲＰ抗体測定用ＥＬＩＳＡ
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体５μｇ／ｍｌ溶液を９６穴マ
イクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で一昼夜
放置後、さらに２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有Ｐ
ＢＳを添加して感作プレートを作製した。ＥＬＩＳＡ測
定時には、上記の液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、被検ハ
イブリドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応させ
た。 次いでＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰを添加し、さらに室温で
２時間反応させた。以下、参考例１に記載の方法で酵素
反応を実施し、抗体価を測定した。
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体５μｇ／ｍｌ溶液を９６穴マ
イクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で一昼夜
放置後、さらに２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有Ｐ
ＢＳを添加して感作プレートを作製した。ＥＬＩＳＡ測
定時には、上記の液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、被検ハ
イブリドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応させ
た。 次いでＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰを添加し、さらに室温で
２時間反応させた。以下、参考例１に記載の方法で酵素
反応を実施し、抗体価を測定した。
【００２６】
参考例３．ハイブリッド抗体測定用ＥＬＩＳＡ参考例１
で作成したＴＰＡ感作プレートに被検ハイブリドーマ培
養上清を添加し、室温で２時間反応させた。次いでＰＢ
Ｓで洗浄後、ＨＲＰを添加し、さらに室温で２時間反応
させた。以下、参考例１に記載の方法で酵素反応を実施
し、抗体価を測定した。
で作成したＴＰＡ感作プレートに被検ハイブリドーマ培
養上清を添加し、室温で２時間反応させた。次いでＰＢ
Ｓで洗浄後、ＨＲＰを添加し、さらに室温で２時間反応
させた。以下、参考例１に記載の方法で酵素反応を実施
し、抗体価を測定した。
【００２７】参考例４．フィブリン溶解反応中和試験Ｔ
ＰＡ溶液（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）に被検ＭｏＡｂ溶
液を添加し、３７℃で１時間反応後、反応混液をフィブ
リンアガロースプレートの１ウェル当り５μｌ注入した
。 ３７℃で２〜６時間後にフィブリンの溶解斑（直径）を
測定し、ＴＰＡの酵素活性に対するＭｏＡｂの中和能を
測定した。
ＰＡ溶液（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）に被検ＭｏＡｂ溶
液を添加し、３７℃で１時間反応後、反応混液をフィブ
リンアガロースプレートの１ウェル当り５μｌ注入した
。 ３７℃で２〜６時間後にフィブリンの溶解斑（直径）を
測定し、ＴＰＡの酵素活性に対するＭｏＡｂの中和能を
測定した。
【００２８】
参考例５．ＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体の調製ＰＡＩ−１
（アメリカン・ダイアグノスティックス販売）を８Ｍグ
アニジン・塩酸溶液で３７℃、３０分間処理して活性化
後、半量のＴＰＡを添加してさらに３７℃、３０分間イ
ンキュベートすることにより複合体を調製した。得られ
た複合体溶液を参考例４に記載のフィブリン溶解反応に
供したところ、ＴＰＡ活性はほぼ１００％失われていた
。
（アメリカン・ダイアグノスティックス販売）を８Ｍグ
アニジン・塩酸溶液で３７℃、３０分間処理して活性化
後、半量のＴＰＡを添加してさらに３７℃、３０分間イ
ンキュベートすることにより複合体を調製した。得られ
た複合体溶液を参考例４に記載のフィブリン溶解反応に
供したところ、ＴＰＡ活性はほぼ１００％失われていた
。
【００２９】実施例１．マウス抗ＴＰＡモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマの作製 ■免疫 市販の１本鎖ＴＰＡ（中央科学工業Ｋ．Ｋ．販売）２０
０μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に等量のフロイント完全ア
ジュバントを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（
♀，２０μｇ／０．２ｍｌ／マウス）に腹腔および背部
皮下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を実施した。３回
の追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した個体
について、ＴＰＡの抗原液（５０μｇ／０．１ｍｌ生理
食塩水／マウス）を静脈内投与した。
抗体産生ハイブリドーマの作製 ■免疫 市販の１本鎖ＴＰＡ（中央科学工業Ｋ．Ｋ．販売）２０
０μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に等量のフロイント完全ア
ジュバントを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（
♀，２０μｇ／０．２ｍｌ／マウス）に腹腔および背部
皮下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を実施した。３回
の追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した個体
について、ＴＰＡの抗原液（５０μｇ／０．１ｍｌ生理
食塩水／マウス）を静脈内投与した。
【００３０】■細胞融合
最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０８個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個を添加し、ＰＥＧ ６００
０を用いてケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ），２５６， ４９５（１９７５）〕に
準じて細胞融合に供した。融合終了後、細胞混液をヒポ
キサンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む、い
わゆるＨＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。以後
は、親細胞の選択が終了次第、ＨＡＴ培地からアミノプ
テリンを除いたＨＴ培地に代え培養を続けた。
により調製した（約１０８個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個を添加し、ＰＥＧ ６００
０を用いてケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ），２５６， ４９５（１９７５）〕に
準じて細胞融合に供した。融合終了後、細胞混液をヒポ
キサンチン・アミノプテリンおよびチミジンを含む、い
わゆるＨＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。以後
は、親細胞の選択が終了次第、ＨＡＴ培地からアミノプ
テリンを除いたＨＴ培地に代え培養を続けた。
【００３１】
■ハイブリドーマの選択およびクローニング融合１０〜
２０日後にハイブリドーマの出現を認めたのでＴＰＡ結
合マイクロプレートを用いる参考例１記載のＥＬＩＳＡ
でハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定した。 特に強い抗体活性を示したハイブリドーマについては、
限界希釈法によるクローニングに供した。クローン化し
たハイブリドーマの培養上清を同様に参考例１のＥＬＩ
ＳＡのスクリーニングに供し、ＴＰＡ結合能の強い３種
の抗ＴＰＡ抗体産生マウスハイブリドーマ ＴＰＡ １
−３９，ＴＰＡ １−７０，ＴＰＡ ２−１４を取得し
た。 これらの免疫グロブリンクラス，サブクラスはオクタロ
ニー法による測定でいずれもＩｇＧ１であった。
２０日後にハイブリドーマの出現を認めたのでＴＰＡ結
合マイクロプレートを用いる参考例１記載のＥＬＩＳＡ
でハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定した。 特に強い抗体活性を示したハイブリドーマについては、
限界希釈法によるクローニングに供した。クローン化し
たハイブリドーマの培養上清を同様に参考例１のＥＬＩ
ＳＡのスクリーニングに供し、ＴＰＡ結合能の強い３種
の抗ＴＰＡ抗体産生マウスハイブリドーマ ＴＰＡ １
−３９，ＴＰＡ １−７０，ＴＰＡ ２−１４を取得し
た。 これらの免疫グロブリンクラス，サブクラスはオクタロ
ニー法による測定でいずれもＩｇＧ１であった。
【００３２】■モノクローナル抗体の作製予め０．５ｍ
ｌ鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスに５×１０
６個の抗ＴＰＡＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを腹腔内接
種した。約１０〜１５日後に腹水の貯溜が見られた。抗
体の精製は常法により、４５〜５０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画後、ＤＥＡＥ−セルロースおよびプロテイン
Ａカラムクロマトグラフィーに供し実施し、マウスハイ
ブリドーマ ＴＰＡ １−３９，ＴＰＡ １−７０およ
びＴＰＡ ２−１４からそれぞれ抗ＴＰＡ ＭｏＡｂ
ＴＰＡ １−３９，ＴＰＡ １−７０およびＴＰＡ２−
１４を取得した。
ｌ鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスに５×１０
６個の抗ＴＰＡＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを腹腔内接
種した。約１０〜１５日後に腹水の貯溜が見られた。抗
体の精製は常法により、４５〜５０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画後、ＤＥＡＥ−セルロースおよびプロテイン
Ａカラムクロマトグラフィーに供し実施し、マウスハイ
ブリドーマ ＴＰＡ １−３９，ＴＰＡ １−７０およ
びＴＰＡ ２−１４からそれぞれ抗ＴＰＡ ＭｏＡｂ
ＴＰＡ １−３９，ＴＰＡ １−７０およびＴＰＡ２−
１４を取得した。
【００３３】実施例２．抗ＴＰＡモノクローナル抗体の
ＴＰＡフィブリン溶解能に対する中和活性実施例１−■
で作製した抗ＴＰＡ ＭｏＡｂを、参考例４に記載のフ
ィブリンアガロースプレートを用いるフィブリン溶解反
応中和試験に供し、ＴＰＡに対する中和活性を測定した
。結果は表２に示した通りであった。抗体ＴＰＡ １−
３９は弱い中和活性を、抗体ＴＰＡ １−７０は強い中
和活性を示したが、抗体ＴＰＡ ２−１４は全く中和活
性を示さなかった。 表２
抗体濃度 ％フィブリン溶解活性
抗ＴＰＡモノクローナル抗体
（ｎｇ／ｍｌ）
ＴＰＡ１−３９ ＴＰＡ１−
７０ ＴＰＡ２−１４ ０
．０１２ １００ ８６
１００
０．１２ ８６
３０ ８６
１．２ ８６
８ １００
１ ２ ６３
０ １１６
実施例３．マウス抗ＨＲＰモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマの作製 ■免疫 市販の１本鎖ＨＲＰ（生化学工業株式会社販売）２００
μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に等量のフロイント完全アジ
ュバントを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀
，２０μｇ／０．２ｍｌ／マウス）に腹腔および背部皮
下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を実施した。３回の
追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した個体に
ついて、ＨＲＰの抗原液（５０μｇ／０．１ｍｌ生理食
塩水／マウス）を静脈内投与した。 ■細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し脾臓細胞を調製し、以下
実施例１−■と同様の方法で細胞融合を実施した。
ＴＰＡフィブリン溶解能に対する中和活性実施例１−■
で作製した抗ＴＰＡ ＭｏＡｂを、参考例４に記載のフ
ィブリンアガロースプレートを用いるフィブリン溶解反
応中和試験に供し、ＴＰＡに対する中和活性を測定した
。結果は表２に示した通りであった。抗体ＴＰＡ １−
３９は弱い中和活性を、抗体ＴＰＡ １−７０は強い中
和活性を示したが、抗体ＴＰＡ ２−１４は全く中和活
性を示さなかった。 表２
抗体濃度 ％フィブリン溶解活性
抗ＴＰＡモノクローナル抗体
（ｎｇ／ｍｌ）
ＴＰＡ１−３９ ＴＰＡ１−
７０ ＴＰＡ２−１４ ０
．０１２ １００ ８６
１００
０．１２ ８６
３０ ８６
１．２ ８６
８ １００
１ ２ ６３
０ １１６
実施例３．マウス抗ＨＲＰモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマの作製 ■免疫 市販の１本鎖ＨＲＰ（生化学工業株式会社販売）２００
μｇ／ｍｌ生理食塩水溶液に等量のフロイント完全アジ
ュバントを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀
，２０μｇ／０．２ｍｌ／マウス）に腹腔および背部皮
下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を実施した。３回の
追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した個体に
ついて、ＨＲＰの抗原液（５０μｇ／０．１ｍｌ生理食
塩水／マウス）を静脈内投与した。 ■細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し脾臓細胞を調製し、以下
実施例１−■と同様の方法で細胞融合を実施した。
【００３４】
■ハイブリドーマの選択およびクローニング融合１０〜
２０日後に出現するハイブリドーマの培養上清を、抗マ
ウスＩｇＧ抗体感作プレートを用いる参考例２に記載の
ＥＬＩＳＡに供し、抗ＨＲＰ抗体価を測定した。特に強
い抗体活性を示したハイブリドーマについて限界希釈法
によるクローニングに供した。クローン化したハイブリ
ドーマの培養上清を参考例２に記載のＥＬＩＳＡに供し
、ＨＲＰ結合能が強くＨＲＰ酵素活性を中和しない抗Ｈ
ＲＰ抗体産生マウスハイブリドーマＨＲ１−３２を取得
した。産生する抗体はＩｇＧ１であった。
２０日後に出現するハイブリドーマの培養上清を、抗マ
ウスＩｇＧ抗体感作プレートを用いる参考例２に記載の
ＥＬＩＳＡに供し、抗ＨＲＰ抗体価を測定した。特に強
い抗体活性を示したハイブリドーマについて限界希釈法
によるクローニングに供した。クローン化したハイブリ
ドーマの培養上清を参考例２に記載のＥＬＩＳＡに供し
、ＨＲＰ結合能が強くＨＲＰ酵素活性を中和しない抗Ｈ
ＲＰ抗体産生マウスハイブリドーマＨＲ１−３２を取得
した。産生する抗体はＩｇＧ１であった。
【００３５】実施例４．抗ＴＰＡ−抗ＨＲＰ二重特異性
を有するハイブリッドモノクローナル抗体の作製■細胞
融合 実施例１で取得した抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマＴ
ＰＡ１−３９および実施例３で取得した抗ＨＲＰ抗体産
生ハイブリドーマＨＲ１−３２を、それぞれ０．５μｇ
／ｍｌ ＦＩＴＣおよび１．５μｇ／ｍｌ ＴＲＩＴＣ
含有イスコフ−ハムＦ・１２混合培地で３７℃，３０分
間インキュベートし、蛍光染色した。次いで、ＬＳＭ溶
液（和光純薬工業Ｋ．Ｋ．販売）を添加し死細胞を除去
した後、両ハイブリドーマを１：１の割合で混じ、ＰＥ
Ｇ６０００を用いて実施例１−■に記載の方法で細胞融
合した。３７℃で２時間インキュベート後、ＦＡＣＳに
供することによりフルオレセインおよびローダミンで二
重染色された細胞２５０００個を分取し、次にフィーダ
ーとしてマウス胸腺細胞を５×１０５個／ウェル播種し
た９６穴マイクロプレートに上記の二重染色細胞を１０
個／ウェルの割合で播種し培養した。
を有するハイブリッドモノクローナル抗体の作製■細胞
融合 実施例１で取得した抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマＴ
ＰＡ１−３９および実施例３で取得した抗ＨＲＰ抗体産
生ハイブリドーマＨＲ１−３２を、それぞれ０．５μｇ
／ｍｌ ＦＩＴＣおよび１．５μｇ／ｍｌ ＴＲＩＴＣ
含有イスコフ−ハムＦ・１２混合培地で３７℃，３０分
間インキュベートし、蛍光染色した。次いで、ＬＳＭ溶
液（和光純薬工業Ｋ．Ｋ．販売）を添加し死細胞を除去
した後、両ハイブリドーマを１：１の割合で混じ、ＰＥ
Ｇ６０００を用いて実施例１−■に記載の方法で細胞融
合した。３７℃で２時間インキュベート後、ＦＡＣＳに
供することによりフルオレセインおよびローダミンで二
重染色された細胞２５０００個を分取し、次にフィーダ
ーとしてマウス胸腺細胞を５×１０５個／ウェル播種し
た９６穴マイクロプレートに上記の二重染色細胞を１０
個／ウェルの割合で播種し培養した。
【００３６】■ハイブリッドハイブリドーマの選択およ
びクローニング 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウェルの培養上清
を、それぞれ参考例３に記載のＥＬＩＳＡに供し抗体活
性を測定した。高いハイブリッド抗体活性を示したウェ
ルについて限界希釈法によるクローニングを実施し、目
的の二重特異性抗体産生マウスハイブリッド ハイブリ
ドーマ（テトラオーマ）ＨＴ２−２６３を取得した。
びクローニング 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウェルの培養上清
を、それぞれ参考例３に記載のＥＬＩＳＡに供し抗体活
性を測定した。高いハイブリッド抗体活性を示したウェ
ルについて限界希釈法によるクローニングを実施し、目
的の二重特異性抗体産生マウスハイブリッド ハイブリ
ドーマ（テトラオーマ）ＨＴ２−２６３を取得した。
【００３７】■ハイブリッド抗体の精製予め、０．５ｍ
ｌ鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウス６匹に５×
１０６個／マウスのマウス ハイブリツド ハイブリド
ーマ（テトラオーマ）ＨＴ２−２６３を腹腔内接種した
。約１０〜２０日後に貯溜がみられた腹水を２３ｍｌ採
取し、さらに５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析してＩ
ｇＧ画分を得た。次いで２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５
）で透析後、ＨＲＰ結合セルロファインカラムに供し、
ｐＨ３．０の０．２Ｍグリシン・塩酸緩衝液で溶出した
。酸溶出画分をＰＢＳで透析後、さらにＴＰＡセファロ
ース４Ｂカラムに供し、ｐＨ２．３の０．２Ｍグリシン
・塩酸緩衝液で溶出した。ＰＢＳで透析することにより
二重特異性抗体ＨＴ２−２６３ １２．３ｍｇを得た。 得られた抗体を参考例３に記載のＥＬＩＳＡに供し、そ
の二重特異性抗体の希釈曲線を作製した。結果は図１に
示した通りであった。
ｌ鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウス６匹に５×
１０６個／マウスのマウス ハイブリツド ハイブリド
ーマ（テトラオーマ）ＨＴ２−２６３を腹腔内接種した
。約１０〜２０日後に貯溜がみられた腹水を２３ｍｌ採
取し、さらに５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析してＩ
ｇＧ画分を得た。次いで２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５
）で透析後、ＨＲＰ結合セルロファインカラムに供し、
ｐＨ３．０の０．２Ｍグリシン・塩酸緩衝液で溶出した
。酸溶出画分をＰＢＳで透析後、さらにＴＰＡセファロ
ース４Ｂカラムに供し、ｐＨ２．３の０．２Ｍグリシン
・塩酸緩衝液で溶出した。ＰＢＳで透析することにより
二重特異性抗体ＨＴ２−２６３ １２．３ｍｇを得た。 得られた抗体を参考例３に記載のＥＬＩＳＡに供し、そ
の二重特異性抗体の希釈曲線を作製した。結果は図１に
示した通りであった。
【００３８】
実施例５．抗ＴＰＡモノクローナル抗体の特異性■固相
性抗体の作製 実施例１−■で作製した３種の抗ＴＰＡ ＭｏＡｂを、
実施例４−■に記載のＴＰＡ結合セファロース４Ｂカラ
ムで精製した。３種の精製抗体それぞれを参考例２のウ
サギ抗マウスＩｇＧの代わりに使用して、抗ＴＰＡ抗体
感作プレートを作製した。 ■ビオチン化抗体の作製 上記■で得た精製抗体それぞれを、市販のＮ−ヒドロシ
キスクシニミドビオチン（フナコシ販売）を用いて常法
に従いビオチン化した〔Ｋ．Ｈｏｆｆｍａｎｎら：ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイティー（
Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．），１００，３５
８５（１９７８）〕。 ■特異性の検索 ■で作製した抗ＴＰＡ抗体感作プレートにＴＰＡ２５ｎ
ｇ／５０μｌを添加し室温で２時間反応後、ＰＢＳ−Ｔ
ｗで洗浄した。次いで、■で作製したビオチン化抗体５
０μｌを添加し、さらに３７℃で１．５時間反応後ＰＢ
Ｓ−Ｔｗで洗浄した。ＨＲＰ標識アビジンＤの５００倍
希釈液（フナコシ販売）５０μｌを添加し、３７℃で３
０分間反応後ＰＢＳ−Ｔｗで洗浄し、以下参考例１に記
載の方法で酵素反応を実施した。結果は表３に示した通
りであった。３種の抗ＴＰＡ抗体ＴＰＡ１−３９，１−
７０および２−１４はいずれも互いに抗原認識部位を重
複しない抗体と判定された。
性抗体の作製 実施例１−■で作製した３種の抗ＴＰＡ ＭｏＡｂを、
実施例４−■に記載のＴＰＡ結合セファロース４Ｂカラ
ムで精製した。３種の精製抗体それぞれを参考例２のウ
サギ抗マウスＩｇＧの代わりに使用して、抗ＴＰＡ抗体
感作プレートを作製した。 ■ビオチン化抗体の作製 上記■で得た精製抗体それぞれを、市販のＮ−ヒドロシ
キスクシニミドビオチン（フナコシ販売）を用いて常法
に従いビオチン化した〔Ｋ．Ｈｏｆｆｍａｎｎら：ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイティー（
Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．），１００，３５
８５（１９７８）〕。 ■特異性の検索 ■で作製した抗ＴＰＡ抗体感作プレートにＴＰＡ２５ｎ
ｇ／５０μｌを添加し室温で２時間反応後、ＰＢＳ−Ｔ
ｗで洗浄した。次いで、■で作製したビオチン化抗体５
０μｌを添加し、さらに３７℃で１．５時間反応後ＰＢ
Ｓ−Ｔｗで洗浄した。ＨＲＰ標識アビジンＤの５００倍
希釈液（フナコシ販売）５０μｌを添加し、３７℃で３
０分間反応後ＰＢＳ−Ｔｗで洗浄し、以下参考例１に記
載の方法で酵素反応を実施した。結果は表３に示した通
りであった。３種の抗ＴＰＡ抗体ＴＰＡ１−３９，１−
７０および２−１４はいずれも互いに抗原認識部位を重
複しない抗体と判定された。
【００３９】
表３
固相に結合し
た酵素活性〔吸光度（４９２ｎｍ）〕 ビオチン
固 相 抗 体
化抗
体 ＴＰＡ１−３９ ＴＰＡ１−７０
ＴＰＡ２−１４ ＴＰＡ１−３９
０．１ ２．７ ２
．６ ＴＰＡ１−７０ ２．６
０．１ ２．７
ＴＰＡ２−１４ ２．２
２．７ ０．０
実施例６．ＴＰＡ定量用ＥＬＩＳＡの設定実施
例５−■で作製した抗ＴＰＡ抗体ＴＰＡ２−１４感作プ
レートに各種濃度のＴＰＡを室温で２時間反応させ、Ｐ
ＢＳ−Ｔｗで洗浄した。次いで実施例４で取得した二重
特異性抗体ＨＴ２−２６３（１μｇ／ｍｌ）を市販のＨ
ＲＰ溶液（１００μｇ／ｍｌ）とあらかじめ混合し、こ
れを上記のプレートに添加して室温で２時間反応させた
。ＰＢＳ−Ｔｗで洗浄後、参考例１に記載の方法で酵素
反応を実施しＴＰＡ標準曲線を作製した。結果は図２に
示した通りであった。１ｎｇ／ｍｌ以下のＴＰＡが定量
可能であった。
表３
固相に結合し
た酵素活性〔吸光度（４９２ｎｍ）〕 ビオチン
固 相 抗 体
化抗
体 ＴＰＡ１−３９ ＴＰＡ１−７０
ＴＰＡ２−１４ ＴＰＡ１−３９
０．１ ２．７ ２
．６ ＴＰＡ１−７０ ２．６
０．１ ２．７
ＴＰＡ２−１４ ２．２
２．７ ０．０
実施例６．ＴＰＡ定量用ＥＬＩＳＡの設定実施
例５−■で作製した抗ＴＰＡ抗体ＴＰＡ２−１４感作プ
レートに各種濃度のＴＰＡを室温で２時間反応させ、Ｐ
ＢＳ−Ｔｗで洗浄した。次いで実施例４で取得した二重
特異性抗体ＨＴ２−２６３（１μｇ／ｍｌ）を市販のＨ
ＲＰ溶液（１００μｇ／ｍｌ）とあらかじめ混合し、こ
れを上記のプレートに添加して室温で２時間反応させた
。ＰＢＳ−Ｔｗで洗浄後、参考例１に記載の方法で酵素
反応を実施しＴＰＡ標準曲線を作製した。結果は図２に
示した通りであった。１ｎｇ／ｍｌ以下のＴＰＡが定量
可能であった。
【００４０】
実施例７．遊離ＴＰＡ定量用ＥＬＩＳＡの設定実施例５
−■で作製した抗ＴＰＡ抗体ＴＰＡ１−７０およびＴＰ
Ａ２−１４感作プレートに各種濃度のＴＰＡ溶液あるい
は参考例５で作製したＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体溶液５
０μｌを添加し、さらに実施例６に記載の二重特異性抗
体ＨＴ２−２６３とＨＲＰとの免疫複合体溶液５０μｌ
を添加して室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗで洗
浄後、参考例１に記載の方法で酵素反応を実施し、ＴＰ
ＡおよびＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体の標準曲線を作製し
た。結果は図３に示した通りであった。ＴＰＡ２−１４
抗体感作プレートを用いるＥＬＩＳＡでは遊離のＴＰＡ
のみが定量可能で、ＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体はほとん
ど検出されなかった。
−■で作製した抗ＴＰＡ抗体ＴＰＡ１−７０およびＴＰ
Ａ２−１４感作プレートに各種濃度のＴＰＡ溶液あるい
は参考例５で作製したＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体溶液５
０μｌを添加し、さらに実施例６に記載の二重特異性抗
体ＨＴ２−２６３とＨＲＰとの免疫複合体溶液５０μｌ
を添加して室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗで洗
浄後、参考例１に記載の方法で酵素反応を実施し、ＴＰ
ＡおよびＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体の標準曲線を作製し
た。結果は図３に示した通りであった。ＴＰＡ２−１４
抗体感作プレートを用いるＥＬＩＳＡでは遊離のＴＰＡ
のみが定量可能で、ＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体はほとん
ど検出されなかった。
【００４１】実施例８．ＴＰＡの血中動態ＴＰＡ（０．
１５ｍｇ／ｋｇ）をウサギに静脈投与し、経時的に採血
した。次いでウサギの血漿中のＴＰＡ濃度を実施例７に
記載のＴＰＡ１−７０およびＴＰＡ２−１４抗体感作プ
レートを用いるＥＬＩＳＡで測定した。結果は図４に示
した通りであった。ＴＰＡ２−１４抗体を用いる遊離Ｔ
ＰＡ測定用ＥＬＩＳＡでは、ＴＰＡ１−７０抗体を用い
る総ＴＰＡ測定用ＥＬＩＳＡで得られる値の１／４−１
／２の測定値を示した。
１５ｍｇ／ｋｇ）をウサギに静脈投与し、経時的に採血
した。次いでウサギの血漿中のＴＰＡ濃度を実施例７に
記載のＴＰＡ１−７０およびＴＰＡ２−１４抗体感作プ
レートを用いるＥＬＩＳＡで測定した。結果は図４に示
した通りであった。ＴＰＡ２−１４抗体を用いる遊離Ｔ
ＰＡ測定用ＥＬＩＳＡでは、ＴＰＡ１−７０抗体を用い
る総ＴＰＡ測定用ＥＬＩＳＡで得られる値の１／４−１
／２の測定値を示した。
【００４２】
実施例９．ＴＰＡ産生細胞培養上清中のＴＰＡ量ヒトさ
い帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ、ヒト繊維芽細胞ＩＭＲ−
９０、ヒトメラノーマ細胞Ｇ−３６１をウシ胎児血清含
有培地で培養し、その培養上清を実施例７記載のＴＰＡ
２−１４抗体を用いる遊離ＴＰＡ−ＥＬＩＳＡ、および
ＴＰＡ１−７０抗体を用いる総ＴＰＡ−ＥＬＩＳＡに供
した。結果は表４に示した通りであった。各種ヒトＴＰ
Ａ産生細胞の培養中ではＴＰＡはそのほとんど、あるい
はその１部が複合体として存在することが明らかとなっ
た。
表４
細胞
遊離ＴＰＡ（ｎｇ／ｍｌ） 総ＴＰＡ
（ｎｇ／ｍｌ） ＨＵＶＥＣ
＜ １．０
６．４ ＩＭＲ−４０
２．３
９．８ Ｇ−３６１
５．５ ２８．
２
い帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ、ヒト繊維芽細胞ＩＭＲ−
９０、ヒトメラノーマ細胞Ｇ−３６１をウシ胎児血清含
有培地で培養し、その培養上清を実施例７記載のＴＰＡ
２−１４抗体を用いる遊離ＴＰＡ−ＥＬＩＳＡ、および
ＴＰＡ１−７０抗体を用いる総ＴＰＡ−ＥＬＩＳＡに供
した。結果は表４に示した通りであった。各種ヒトＴＰ
Ａ産生細胞の培養中ではＴＰＡはそのほとんど、あるい
はその１部が複合体として存在することが明らかとなっ
た。
表４
細胞
遊離ＴＰＡ（ｎｇ／ｍｌ） 総ＴＰＡ
（ｎｇ／ｍｌ） ＨＵＶＥＣ
＜ １．０
６．４ ＩＭＲ−４０
２．３
９．８ Ｇ−３６１
５．５ ２８．
２
【図１】実施例４に記載の二重特異性抗体ＨＴ２−２６
３を参考例３に記載のＥＬＩＳＡに供した時の希釈曲線
を表す（実施例４参照）。
３を参考例３に記載のＥＬＩＳＡに供した時の希釈曲線
を表す（実施例４参照）。
【図２】実施例１に記載の抗ＴＰＡ抗体（ＴＰＡ２−１
４）を固相抗体、実施例４に記載の二重特異性抗体ＨＴ
２−２６３を標識抗体として用いるＥＬＩＳＡで作製し
たＴＰＡ標準曲線を表す（実施例６参照）。
４）を固相抗体、実施例４に記載の二重特異性抗体ＨＴ
２−２６３を標識抗体として用いるＥＬＩＳＡで作製し
たＴＰＡ標準曲線を表す（実施例６参照）。
【図３】実施例１に記載の抗ＴＰＡ抗体ＴＰＡ１−７０
（○，●）およびＴＰＡ２−１４（□，△）を固相抗体
、実施例４に記載の二重特異性抗体ＨＴ２−２６３を標
識抗体として用いるＥＬＩＳＡで作製した遊離ＴＰＡ（
○，□）およびＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体（●，△）の
標準曲線を表す（実施例７参照）。
（○，●）およびＴＰＡ２−１４（□，△）を固相抗体
、実施例４に記載の二重特異性抗体ＨＴ２−２６３を標
識抗体として用いるＥＬＩＳＡで作製した遊離ＴＰＡ（
○，□）およびＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体（●，△）の
標準曲線を表す（実施例７参照）。
【図４】ＴＰＡ投与ウサギの血漿を、抗ＴＰＡ抗体ＴＰ
Ａ１−７０（●）およびＴＰＡ２−１４（○）をそれぞ
れ固相抗体として用いる実施例７に記載のＥＬＩＳＡに
供した時の血中動態曲線を表わす（実施例８参照）。
Ａ１−７０（●）およびＴＰＡ２−１４（○）をそれぞ
れ固相抗体として用いる実施例７に記載のＥＬＩＳＡに
供した時の血中動態曲線を表わす（実施例８参照）。
Claims (9)
- 【請求項１】二重特異性の一方がティッシュプラスミノ
ーゲンアクチベータに対し、他方がティッシュプラスミ
ノーゲンアクチベータの診断を可能にする酵素、螢光性
物質または放射線核種に対するものである、二重特異性
を有するハイブリッドモノクローナル抗体を産生するポ
リドーマ。 - 【請求項２】酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである
請求項１記載のポリドーマ。 - 【請求項３】抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体産生ハ
イブリドーマと抗ティッシュプラスミノーゲンアクチベ
ータ抗体産生ハイブリドーマとを融合して得られ、１分
子中で西洋ワサビペルオキシダーゼとティッシュプラス
ミノーゲンアクチベータとの両者に結合できる二重特異
性ハイブリッドモノクローナル抗体を生産するテトラオ
ーマである請求項１記載のポリドーマ。 - 【請求項４】抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体産生ハ
イブリドーマがＨＲ１−３２である請求項３記載のテト
ラオーマ。 - 【請求項５】抗ティッシュプラスミノーゲンアクチベー
タ抗体産生ハイブリドーマがＴＰＡ１−３９である請求
項３記載のテトラオーマ。 - 【請求項６】抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体産生ハ
イブリドーマがＨＲ１−３２であり、抗ティッシュプラ
スミノーゲンアクチベータ抗体産生ハイブリドーマがＴ
ＰＡ１−３９であるテトラオーマＨＴ２−２６３である
請求項３記載のテトラオーマ。 - 【請求項７】二重特異性の一方がティッシュプラスミノ
ーゲンアクチベータに対し、他方がティッシュプラスミ
ノーゲンアクチベータの診断を可能にする酵素、螢光性
物質または放射線核種に対するものである、二重特異性
を有するハイブリッドモノクローナル抗体。 - 【請求項８】１分子中で西洋ワサビペルオキシダーゼと
ティッシュプラスミノーゲンアクチベータとの両者に結
合できる二重特異性ハイブリッドモノクローナル抗体Ｈ
Ｔ２−２６３である、請求項７記載の二重特異性を有す
るハイブリッドモノクローナル抗体。 - 【請求項９】二重特異性の一方がティッシュプラスミノ
ーゲンアクチベータに対し、他方がティッシュプラスミ
ノーゲンアクチベータの診断を可能にする酵素、蛍光性
物質または放射線核種に対するものである、二重特異性
を有するハイブリッドモノクローナル抗体を用いること
を特徴とするティッシュプラスミノーゲンアクチベータ
の免疫学的測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3010777A JPH04211363A (ja) | 1990-03-19 | 1991-01-31 | 二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6681090 | 1990-03-19 | ||
| JP2-66810 | 1990-03-19 | ||
| JP3010777A JPH04211363A (ja) | 1990-03-19 | 1991-01-31 | 二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211363A true JPH04211363A (ja) | 1992-08-03 |
Family
ID=26346107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3010777A Pending JPH04211363A (ja) | 1990-03-19 | 1991-01-31 | 二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04211363A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8574925B2 (en) | 2002-09-19 | 2013-11-05 | Hamamatsu Photonics K.K. | Fluorescence analysis method using fluorescent-activating antibodies |
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1991
- 1991-01-31 JP JP3010777A patent/JPH04211363A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8574925B2 (en) | 2002-09-19 | 2013-11-05 | Hamamatsu Photonics K.K. | Fluorescence analysis method using fluorescent-activating antibodies |
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