JPH0542920B2 - - Google Patents
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- JPH0542920B2 JPH0542920B2 JP63074290A JP7429088A JPH0542920B2 JP H0542920 B2 JPH0542920 B2 JP H0542920B2 JP 63074290 A JP63074290 A JP 63074290A JP 7429088 A JP7429088 A JP 7429088A JP H0542920 B2 JPH0542920 B2 JP H0542920B2
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は人トロンボモジユリンに結合すること
を特徴とする新規なモノクローナル抗体、該モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマおよび
該モノクローナル抗体を使用する人トロンボモジ
ユリンの測定方法に関する。本発明のモノクロー
ナル抗体を用いることにより、人トロンボモジユ
リンの機能および構造の解析が可能となる。ま
た、本発明のモノクローナル抗体を使用して血中
または尿中の人トロンボモジユリン含量を測定
し、その動向を把握することは、基礎医学、臨床
医学の領域において非常に重要な意義を持つ。 〔従来技術、発明が解決しようとする問題点〕 トロンボモジユリンは血管内皮細胞の表面に存
在し、トロンビンの受容体として働き、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を著しく促進する
蛋白質として発見された〔Esmon，C.T.＆
Owen，W.G.：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A ．78，
2249−2252（1981）〕。トロンビンはトロンボモジ
ユリンと複合体を形成することにより血液凝固第
因子ならびに血液凝固第因子の活性化、フイ
ブリノーゲンの限定分解、血小板の活性化などの
凝固因子としての性質を失なう〔Esmon，C.T.，
et al.：J.Biol.Chem.257，7944−7947（1982）、，
Esmon，C.T.，et al.：J.Biol.Chem.258，12238
−12242（1983）〕ことが知られている。トロンビ
ンとトロンボモジユリンの複合体によつて活性化
されたプロテインＣは血液凝固因子中の活性型第
因子（Ｆａ）、活性型第因子（Ｆａ）を
不活性化し、強力な抗凝固作用を示す〔Suzuki，
K.，et al.：J.Biol.Chem.258，1914−1920
（1983）．，Vehar，G.A.＆Davie，E.W.：
Biochemistry 19，401−410（1980）〕とともに
血管壁から組織プラスミノーゲンアクチベーター
（tPA）を放出させ、線溶系を促進させる
〔Comp，P.C.＆Esmon，C.T.：J.Clin.Invest.68，
1221−1228（1981）〕ことが知られている。さら
に、トロンボモジユリンは血液凝固第ａ因子の
プロトロンビンを限定分解してトロンビンを形成
する働きを直接阻害することも報告されている
〔Thrompson，E.A.＆Salem.H.H.：J.Clin.
Invest.78，13−17（1986）〕。人胎盤からのトロン
ボモジユリンは還元剤の存在下では105000、非存
在下では75000の分子量を持つ糖蛋白である。ト
ロンボモジユリンは動脈、静脈、毛細管、リンパ
管の内皮細胞に存在し、肺、胎盤に特に多く分布
している。胎盤では合胞体栄養細胞（Syncytio
trophoblast）にもトロンボモジユリンが認めら
れ、この細胞は母体側から胎児側へ血液を媒介に
して栄養を供給する場所にあたり、血液が比較的
渋滞しやすい所であり、トロンボモジユリンは抗
凝固物質として重要な役割を演じている可能性も
考えられる。一方、脳組織にはトロンボモジユリ
ンが認められておらず、脳に血栓が出来やすいこ
とを考え合わせると興味深い。 近年、人トロンボモジユリンに対する抗血清を
用いた放射免疫測定法（Radio immuno assay，
以下RIA）により、人トロンボモジユリンが循環
血液中および尿中にも存在することが示された
〔Ishii，H.＆Majerus，P.W.：J.Clin.Invest.76，
2178−2181（1985）〕。血中と尿中トロンボモジユ
リンの由来、さらに血中トロンボモジユリンの凝
固調節系での役割は不明であるが、血流中でも抗
凝固因子として血栓形成を調節している可能性が
あり、血中のトロンボモジユリンの作用機能を明
らかにすること、血中のトロンボモジユリン含量
を測定し、その動向を把握することができれば、
それは基礎医学、臨床医学の領域において非常に
重要な意味を持つと考えられる。 一方、モノクローナル抗体は単一の抗原決定基
に対して特異的であり、かつ、同一の特異性を有
する抗体を安定的に産生できるという利点から抗
原蛋白質の機能および構造の解析にあるいは免疫
測定に近時一般的に広く利用されるようになつて
きた。特に抗原蛋白質の機能解析、分子解析には
抗原蛋白質の機能に関与する部位を認識する抗体
を見出すことが有力な手段となる。文献
〔Maruyama，I.＆Majerus.P.W.：J.Biol.Chem.
260，15432−15438，（1985）〕には人トロンボモ
ジユリンの、トロンビン結合部位に結合するモノ
クローナル抗体を得、これを用いて人細胞表面の
トロンボモジユリンを測定した報告がある。 しかしながら、血中の人トロンボモジユリンの
測定方法については、先に述べた人トロンボモジ
ユリン抗血清を用いたRIAによる測定方法につい
て報告がなされているが、人トロンボモジユリン
に対する一定の活性を有する抗血清を安定して得
ることが極めて困難であること、得られた抗血清
中には血中の他の蛋白質を認識する抗体が含まれ
ていることが多く、人トロンボモジユリンを特異
的に測定できない危険性が考えられること、さら
に測定操作が複雑であるなどの欠点がある。 前記のような現状において、血液凝固・線溶系
の調節因子として重要な役割を担つている人トロ
ンボモジユリンの機能および構造の解析ならびに
血液および尿のそれぞれの中に存在する人トロン
ボモジユリンの免疫測定に利用し得る人トロンボ
モジユリンにのみ特異的に結合し得る各種のモノ
クローナル抗体ならびに該抗体を安定して産生す
るハイブリドーマの開発が望まれていた。また、
基礎医学、臨床医学の領域において検体中の人ト
ロンボモジユリンを特異的に、かつ、簡便に感度
よく測定する方法の開発が望まれていた。 〔問題を解決するための手段〕 本発明によれば、人トロンボモジユリンに特異
的に結合するモノクローナル抗体、該モノクロー
ナル抗体を安定して産生するハイブリドーマおよ
び該モノクローナル抗体を用いるトロンボモジユ
リンを簡便に感度よく測定できる免疫測定法が提
供される。 本発明のハイブリドーマはケラーとミルシユタ
インの方法〔K″ｏ¨ohler，G.＆Milstein，C.：
Nature，256，495−497（1975）〕として知られた
手法によつて産生される。すなわち、人トロンボ
モジユリンで哺乳動物を免疫した後、この動物の
脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させハイブリド
ーマを得る。人トロンボモジユリンに結合する抗
体を産生するハイブリドーマの検索は、たとえ
ば、ハイブリドーマ上清について人トロンボモジ
ユリンを固定したマイクロプレートを用いる酵素
免疫測定法（Enzyme Immuno Assay 以下
EIAと記す）によつて行なわれる。 抗原に用いる人トロンボモジユリンはサレムら
の方法〔Salem，H.H.，eh al.：J.Biol.Chem.
259，12246−12251（1984）〕に従つて、人胎盤よ
り単離・精製される。 人トロンボモジユリンを免疫する哺乳動物は特
に限定されないが、細胞融合に使用するミエロー
マ細胞の適合性を考慮して選択するのが好まし
く、一般的にはマウス，ラツトなどが使用され
る。 免疫も一般的方法によつて行なわれ、たとえ
ば、人トロンボモジユリンを生理食塩水などで適
当な濃度に希釈し、完全フロイントアジユバント
などとの懸濁液とし、動物に腹腔内注射などによ
つて投与する。投与は通常10〜100μｇの人トロ
ンボモジユリンを２〜４週毎に１〜数回行なう。
最終免疫は通常10〜100μｇの人トロンボモジユ
リンを添加した生理食塩水溶液を静脈注射により
投与して行なわれる。 脾臓細胞としては最終免疫３〜４日後のものを
用いるのが好ましい。 ミエローマ細胞としては、すでに公知の種々の
細胞、たとえば、マウスにおけるSP−２，NS−
１，P3−U1，ラツトにおけるY3.Agl.2.3.などが
使用される。 融合反応は、たとえば、平均分子量1000〜6000
のポリエチレングリコール（PEG）などの融合
促進剤やセンダイウイルス（HVJ）などが使用
される。 脾臓細胞とミエローマ細胞との使用比は、通
常、ミエローマ細胞に対して、脾臓細胞は１〜10
倍程度とされる。 所望のハイブリドーマの分離は、前記の細胞融
合後の細胞を、通常のハイブリドーマ選別用培地
で培養することにより行なわれる。すなわち、前
記のミエローマ細胞はヒポキサンチングアニンホ
スホリボシルトランスフエラーゼ（HGPRT）欠
損株であり、従つて、HAT培地（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）
中では生育できない。従つて、HAT培地中で生
育してくる細胞を選択すればよい。 目的の抗体を産生するハイブリドーマは、通常
の限界希釈法により、目的とする抗体の産生株の
検索および単一クローン化が行なわれる。 かくして得られた本発明のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代
培養でき、また液体窒素中で容易に長期間保存が
可能である。 このようにして得られたハイブリドーマは栄養
培地中で、また、哺乳動物の腹腔内で増殖させる
ことができ、産生した抗体は培養上清またはその
哺乳動物の腹水または血清より精製することがで
きる。一般的には、遠心分離、透析、硫酸アンモ
ニウムによる塩析、DEAEセルロースを用いるカ
ラムクロマトグラフイー、ゲル濾過、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどのような単離法およ
び精製法が挙げられる。 このようにして得られた本発明の人トロンボモ
ジユリンに結合するモノクローナル抗体は、人ト
ロンボモジユリンに強い結合能を有するものであ
る。さらに、本発明の抗体には人トロンボモジユ
リンの異なる抗原部位に結合する数種の抗体が含
まれていた。また、本抗体を用いてEIA、蛍光免
疫測定法（FIA）またはRIAを行なうことにより
微量の人トロンボモジユリンを特異的に、かつ、
正確に測定することが可能となつた。 たとえば、EIAとしては「酵素免疫測定法」
（第２版、石川 栄治 他著、医学書院、1982）
などに記載されているそれ自体公知の方法を用い
ることができる。 ここでは、サンドイツチ法および競合法のそれ
ぞれに基づくEIAについて簡単に説明する。 なお、PIAおよびFIAのそれぞれにおいても、
EIAと同様な原理によるものであることは、いう
までもない。 サンドイツチ法によるEIAでは、抗体（一次抗
体）を固相化しておき、これに抗原（標準または
検体）を加える。その結果、抗原抗体反応が起こ
り、抗原は固相化抗体に結合する。次に、抗原が
結合した固相に、酵素を標識した抗体（二次抗
体）を入れると再び抗原抗体反応が起こり、この
酵素標識抗体は、先に固相化抗体についていた抗
原の上に結合する。抗原に結合しなかつた酵素標
識抗体を除去し、基質を加えて酵素反応を行な
う。既知量の抗原と最終段階での酵素活性との関
係を示す検量線から、検体中の抗原量を求めるこ
とができる。なお、操作を簡単にするため、固相
化抗体に、抗原と酵素標識抗体とを同時に入れて
もよい（一段法サンドイツチ法EIA）。 通常、サンドイツチ法では、一次抗体と二次抗
体とが互いに結合部位の異なる抗体を組み合わせ
て用いられる。この場合に、一次抗体および二次
抗体は、それぞれ、１種でもよく、また、２種以
上の組み合わせでもよい。 競合法によるEIAを説明する。 抗原（標準または検体）と一定量の抗体と抗原
抗体反応を行なわせる。次に、抗原とは結合しな
かつた抗体を固相化抗原と抗原抗体反応を行なわ
せる。固相化抗原に結合した抗体量を酵素標識抗
イムノグロブリン抗体（たとえば、抗体がマウス
イムノグロブリンの場合には、酵素標識抗マウス
イムノグロブリン抗体が用いられる）により測定
する。あるいは、抗原と予め一定量の酵素を標識
した抗体（以下標識抗体という）とで抗原抗体反
応を行なわせた後、抗原とは結合しないで残存し
た標識抗体と固相化抗原とで抗原抗体反応を行な
わせ、その後、固相に結合した酵素量を測定す
る。 酵素量の測定は、通常の方法によることがで
き、いずれの場合も、既知量の標準抗原を用いて
作成した検量線から検体中の抗原量を算出するこ
とができる。 または、一定量の酵素標識抗原と検体との混合
液を固相化抗体と接触させて抗原抗体反応を行わ
せる。標識抗原と非標識抗原とが競合して抗体と
結合する。固相化抗体に結合した酵素標識抗原量
を、酵素の基質を加えて測定する。この場合に、
既知量の標識抗原を用いて作成した検量線から検
体の抗原量を算出することができる。 サンドイツチ法および競合法のそれぞれにおい
て、抗体をペプシンで消化して得られたＦ
（ab′）2、Ｆ（ab′）2を還元して得られたFab′およ
び
抗体をパパインで消化して得られたFabなどの、
抗原に結合する抗体フラグメントを抗体として、
また、これらを標識して標識抗体として使用する
ことができる。またサンドイツチ法において、本
発明のモノクローナル抗体どおしの組み合わせ、
本発明のモノクローナル抗体の既知の抗人トロン
ボモジユリンモノクローナル抗体との組み合わ
せ、および本発明のモノクローナル抗体と抗人ト
ロンボモジユリン抗血清との組み合わせが用いら
れる。 抗体および抗原のそれぞれに標識する酵素とし
ては、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリフオスフアターゼ、グルコースオ
キシダーゼなどが使用でき、標識方法としては、
「単クローン抗体」（岩崎 辰夫 他著、講談社
サイエンテイフイク，1984）、「酵素免疫測定法」
（第２版、石川 栄治 他著、医学書院、1982）
などに記載されている如くそれ自体公知の方法に
よることができる。 一方、固相としてはシリコン、ナイロン、プラ
スチツク、ガラスからなるステイツク、ビーズ、
マイクロプレートもしくは試験管などが利用でき
る。 また、本発明におけるモノクローナル抗体の他
の利用方法としては、たとえば、組織、血液、尿
などからの人トロンボモジユリンの分離精製など
への使用などがある。 以下、本発明の方法を実施例によつてさらに具
体的に説明するが、それらは例示のためのもので
あつて、本発明はこれに限定されるものではな
い。 〔実施例〕 実施例 １ 人トロンボモジユリンに結合するモノクローナ
ル抗体の調製 (1) 免疫に使用される抗原の調製 前記のサレムらの方法に従い、人胎盤２個から
人トロンボモジユリン1.4mgを得た。 (2) 免疫脾細胞の調製 ６〜８週齢の雄Balb／ｃマウスの腹腔内に人
トロンボモジユリン20μgと完全フロイントアジ
ユバンド（Complete Freund′s adjuvant）との
エマルジヨンを投与した。さらに３週後に、人ト
ロンボモジユリン20μｇの生理食塩水溶液を静脈
に投与した。最終免疫の３日後に、マウスを屠殺
し、脾臓を摘出し、細胞融合に用いた。 (3) ハイブリドーマの調製 脾臓をピンセツトでほぐして得られた細胞を、
RPMI−1640培地「ニツスイ」（日水製薬製）
にＬ−グルタミン0.29ｇ／、ピルビン酸0.11
ｇ／、硫酸カナマイシン0.06ｇ／、結晶ペニ
シリンＧ・K0.06ｇ／およびNaHCO31.2ｇ／
を補充した培地（以下RPMI−1640と記す）に懸
濁し、これをナイロンメツシユを通過させること
により単細胞浮遊液を得た。 この単細胞浮遊液中を0.83％塩化アンモニウム
溶液（９容量部）と0.17Mトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン塩酸緩衝液PH7.6（１容量部）
との混液で４℃で２分間処理して、単細胞浮遊液
中の赤血球を破壊し、遠心分離により除去した。 10％ウシ胎仔血清加RPMI−1640（以下10％
FCS−RPMI−1640と記す）中で培養した対数増
殖期のマウスミエローマ細胞SP−２をRPMI−
1640で２回洗浄した。 脾細胞と、このマウスミエローマ細胞とを５：
１の比率でRPMI−1640に懸濁し、培地を遠心分
離により除去した。細胞を水浴中で37℃に加温し
た。 この細胞に、予め37℃に加温した平均分子量
1500の50％ポリエテレングリコール溶液（ベーリ
ンガー・マンハイム山之内社製）1.3mlを１分間
かけて徐々に加え、さらに１分間反応させた。 この反応混合物にRPMI−1640 ９mlを４分間
かけて滴下して細胞融合反応を停止させ、これを
遠心分離して上清を除去して細胞を得た。５×
106細胞／mlの濃度となるように、この細胞を10
％FCS−RPMI−1640に再懸濁した。次いで、96
穴マイクロウエルプレート（コーニング社製）の
各ウエルに、この再懸濁液を100μずつ分注し、
これを5.5％炭酸ガス含有雰囲気中で37℃で１日
培養した後、アミノプテリン（４×10-7M）、チ
ミジン（1.6×10-5M）およびヒポキサンチン
（１×10-4M）を含有する10％FCS−RPMI−
1640（以下HAT培地と記す）100μを各ウエル
に添加した。１日後、各ウエルから半量の培地を
吸引除去し、次いで、HAT培地を100μを添加
した。その後、２日または３日毎に半量の培地を
新たなHAT培地と交換し、培養を続けた。 細胞融合10日後にハイブリドーマ細胞の増殖が
認められた。 (4) 人トロンボモジユリンに結合するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマの選別 ハイブリドーマ培養上清中の人トロンボモジユ
リンに結合する抗体のスクリーニングは、人トロ
ンボモジユリンを固定したマイクロプレートを用
いてEIAにより行なつた。 人トロンボモジユリンの固定は、96穴イムノマ
イクロプレート（ヌンク社製）の各ウエルに0.2μ
ｇ／mlとなるようPBS（0.01Mリン酸緩衝液、PH
7.4，0.15M NaCl以下同様）に溶解した人トロン
ボモジユリン溶液50μを添加し、室温で２時間
吸着させた。このプレートをPBSで３回洗浄後、
各ウエルに、0.2％ウシ血清アルブミンを含む
PBS溶液（以下BSA−PBSと記す）を加え、蛋
白の非特異的吸着が起こらぬようウエルを完全に
ブロツクした。各ウエルに、前記のようにして得
られたハイブリドーマ培養上清のPBSによる希
釈液50μを添加し、室温で１時間インキユベー
トした。 結合した抗体の検出には、ベクタステイン
ABCキツト（ベクターラボラトリーズ社製）を
用いた。すなわち、プレートを0.05％−Tween20
を含むPBS（以下Tween20−PBSと記す）で３回
洗浄後、ビオチン化ヤギ抗マウスイムノグロブリ
ン抗血清を50μ添加して、１時間反応させ、次
いで、Tween20−PBSで洗浄後、50μのアビジ
ン化パーオキシダーゼを添加し、20分間反応させ
た。このプレートをTween20−PBSで３回洗浄
後、各ウエルに0.03％H2O2と、0.8mg／mlのオル
トフエニレンジアミン二塩酸塩の10mMクエン酸
緩衝液（PH5.0）との等量混合液を10μ加え室温
でインキユベートした。 各ウエルに、2N−硫酸を100μ加えて反応を
停止させて、イムノリーダーNJ−2000（インター
メツド社製）を用いて、反応生成液の490nmの吸
光度を測定した。 融合細胞を撤いた合計768のウエルのうち592の
ウエルにハイブリドーマの増殖が認められ、この
うち人トロンボモジユリンに結合する抗体産生陽
性ウエルは126であつた。 まず、特に抗体活性の強く出た16ウエルについ
てハイブリドーマのクローニングを行なつた。 残りの陽性ウエルのうち20ウエルについては、
一旦、細胞を凍結保存し、その後、これを融解し
てクローニングに供した。 (5) 人トロンボモジユリンに結合するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマのクローニング 人トロンボモジユリンに結合する抗体活性をも
つハイブリドーマの培養液を、Balb／ｃマウス
の胸線細胞をフイーダー層（１×107細胞／ml）
とした24穴平底マイクロプレート（コーニング社
製）に移した。 増殖してきたハイブリドーマを、Balb／ｃマ
ウスの胸線細胞をフイーダー層（１×107細胞／
ml）とした96穴マイクロプレートを用いて限界希
釈法によりクローニングした。 クローニング操作を２回行ない、合計17株のク
ローンを得た。 (6) 人トロンボモジユリンに結合するモノクロー
ナル抗体の精製 10日前および３日前に各々の0.5mlのプリスタ
ンを腹腔内に投与されたBalb／ｃマウスの腹腔
内に、前記(5)で得られたハイブリドーマの細胞２
〜５×106個を移植した。 約１週間後、マウスの腹腔より腹水を採取し、
その腹水からモノクローナル抗体を50％飽和硫酸
アンモニウム溶液により塩析して単離した。 さらに、この単離されたモノクローナル抗体を
少量のPBSに溶解した溶液から、アフイゲルプ
ロテインＡ−MAPSキツト（バイオラツド社製）
に用いて抗体を単離した。この抗体溶液を、さら
にPBSに透析して、４℃であるいは凍結して保
存した。 腹水１mlあたり0.5〜10mgの精製抗体を得た。 実施例 ２ 人トロンボモジユリンに結合するモノクローナ
ル抗体の特性 (1) モノクローナル抗体の免疫グロブリンサブク
ラスの同定 精製した抗体の免疫グロブリンのサブクラスを
羊マウスイムノグロブリンクラス特異的抗血清
（メロイラボラトリー社製）を用いてオクタロー
ニー法で同定した。結果を表１に示す。 【表】 (2) モノクローナル抗体の人トロンボモジユリン
の結合部位の異同 抗体の人トロンボモジユリンの結合部位の異同
を決定するため、それぞれの抗体を西洋ワサビパ
ーオキシダーゼ（以下HRPと記す）で標識し、
人トロンボモジユリンに対して各非標識抗体と競
合反応を行なわせ、阻害の有無からそれぞれの抗
体の人トロンボモジユリンへの結合部位の異同を
調べた。 抗体へのHRPの標識は過よう素酸酸化法（単
クローン抗体、岩崎 辰夫 他著，講談社サイエ
ンテイフイク、1984）を用いて行なつた。すなわ
ち、４mgのHRP（東洋紡製）を１mlの蒸留水に溶
かした溶液に、200μの0.1M過よう素酸ナトリ
ウムを加え、室温20分間で反応させた。 次いで、この反応生成液を、1mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液（PH4.4）に対して４℃で１晩透析を
行なつた。 この透析内液に0.2M炭酸ナトリウム20μを加
えてPHを9.0に調整し、これに0.01M炭酸ナトリ
ウム緩衝液（PH9.5）で濃度５mg／mlに調製した
抗体液１mlを直ちに加え、室温で２時間撹拌し
た。この反応液を氷冷し、これに0.1mlのNaBH4
液を加え、４℃で２時間反応させた。 この反応生成液を、PBSに対して４℃で１晩
透析し、この透析内液をPBSで平衡化したスー
パーローズ12カラム（フアルマシア製）でゲル濾
過を行い、未反応のHRPおよび抗体を標識抗体
から分離し、280nmと403nmとの両方に吸収を有
する標識抗体画分を得た。 いずれの抗体も同様に標識され、人トロンボモ
ジユリンに対する結合活性は維持されていた。 競合反応は以下の如く行なつた。すなわち、イ
ムノマイクロプレートの各ウエルに、人トロンボ
モジユリンのPBS溶液（0.2μｇ／ml）を100μ添
加し、室温で２時間吸着させた。このプレートを
PBSで３回洗浄後、各ウエルにBSA−PBSを加
え、ウエルへの蛋白の非特異的吸着を抑えた。 各ウエルへはHRPで標識した抗体の一定量と、
0.2％BSAを含むTween20−PBS（以下BSA−
Tween20−PBSと記す）で段階希釈した非標識
抗体（０〜１mg／ml）を同時に加えた。室温で１
時間抗原抗体反応を行なつた後、このプレートを
Tween20−PBSで４回洗浄した。 各ウエルに100μのオルトフエニレンジアミ
ン含有基質（H2O2とオルトフエニレンジアミン
二塩酸塩とを、それぞれの濃度が0.015％および
0.4mg／mlとなるように50mMクエン酸緩衝液
（PH5.0）に溶解した液 以下同様）を添加し、室
温で反応を行なわせた。 各ウエルに、2N硫酸100μを添加して、反応
を停止させた。 イムノリーダーNJ−2000により、反応生成液
の490nmの吸光度を測定した。結果を表２−１お
よび表２−２のそれぞれに示す。 【表】 −：阻害なし
【表】 【表】 ＋：阻害あり
−：阻害なし
前記の結果から、（TMmAb7，TMmAb11）、
（TMmAb3，TMmAb8，TMmAb33）、
（TMmAb10，TMmAb20，TMmAb24，
TMmAb28）および（TMmAb2，TMmAb12，
TMmAb15）のグループ化ができ、それぞれの
グループ間では抗原認識部位が異なるものと考え
られた。また、それぞれのグループ内の抗体は同
じか、または非常に近接した抗原部位を認識して
いる抗体と思われる。 (3) 人トロンボモジユリンのプロテインＣ活性化
に対するモノクローナル抗体の阻害 人トロンボモジユリンとトロンビンとの複合体
によるプロテインＣ活性化に対するモノクローナ
ル抗体の阻害作用は、以下のようにして測定され
た。 すなわち、5μの精製モノクローナル抗体
（200nｇ）と10μの人トロンボモジユリン
（0.43pmole）とを、0.5％BSA、1.35mMCaCl2，
0.1MNaClを添加した20mMトリス塩酸緩衝液
（PH7.4）70μの中で、室温で15分間反応させた。 次に、この反応生成液に5μのウシトロンビ
ン（0.45μM）と10μのプロテインＣ（2.13μM）
とを添加して、37℃で30分反応させた。 この反応生成液に150μのヒルジン（1.7U／
ml）を加え、トロンビンを不活性化した後、これ
に、250μの合成蛍光基質（100μM Boc−Leu
−Ser−Thr−Arg−MCA (株)ペプチド研究社
製）を加えて、30℃で10分間反応させた。生成し
た活性型プロテインＣが基質を加水分解した時に
生じた蛍光を分光蛍光光度計（日立製、650−10
形）を用いて測定した（励起：380nm、発光：
460nm）。抗体無添加でのプロテインＣの活性を
100％として抗体による活性の阻害率を求めた。
結果を表３に示す。 【表】 検討した10種の抗体のうち、本実施例の反応条
件下で、TMmAb8、TMmAb20および
TMmAb33はそれぞれプロテインＣの活性化を
著しく阻害した。TMmAb2，TMmAb7，
TMmAb11，TMmAb12およびTMmAb15は、
いずれも、プロテインＣの活性化のほとんどある
いは全く阻害しなかつた。 (4) モノクローナル抗体によるトロンビン・トロ
ンボモジユリン複合体形成の阻害 モノクローナル抗体によるトロンビンと人トロ
ンボモジユリンとの複合体形成の阻害効果は、抗
体とトロンビンを人トロンボモジユリンに対して
競合させて検討した。 精製抗体と精製ウシトロンビン（持田製薬製）
とを、濃度がそれぞれ20nｇ／ml、1.7μｇ／mlと
なるようにBSA−Tween20−PBSに添加した。 次に実施例２(2)におけると同様に、人トロンボ
モジユリンを固定化した96穴イムノマイクロプレ
ートを用いてEIAを行ない、人トロンボモジユリ
ンに結合する抗体量を測定した。トロンビン無添
加の吸光度を100％として得られた結果を表４に
示す。 【表】 検討した10種の抗体のうちTMmAb20，
TMmAb24，およびTMmAb28は、それぞれト
ロンビンとの競合で人トロンボモジユリンへの結
合が著しく阻害されたが、その他はほとんど影響
を受けなかつた。 本発明のモノクローナル抗体を用いて行なつた
実施例２(3)、同(4)の結果から、少なくとも次の特
性をもつた抗体が作製されたことは明らかであ
る。 すなわち、１）人トロンボモジユリンのトロン
ビン結合部またはその近くに結合し、人トロンボ
モジユリンへのトロンビンの結合を阻害し、結果
としてプロテインＣの活性化を阻害する抗体、
２）人トロンボモジユリンへのトロンビンの結合
を阻害しない部位に結合し、トロンビン・トロン
ボモジユリン複合体によるプロテインＣの活性化
を阻害しない抗体および３）人トロンボモジユリ
ンへのトロンビンの結合は阻害しないが、トロン
ビン・トロンボモジユリン複合体によるプロテイ
ンＣの活性化を阻害する部位に結合する抗体であ
る。 実施例 ３ 人トロンボモジユリンに結合するモノクローナ
ル抗体を用いた人トロンボモジユリンの測定 (1) サンドイツチ法に基づくEIA サンドイツチ法において、モノクローナル抗体
を一次抗体（固相へ結合する抗体）と二次抗体
（酵素標識抗体）との両方に用いる場合に、通常、
同じ抗体同士または抗原への結合部位が類似して
いる抗体同士の組み合わせでは、実質的に測定不
能である。 実施例２(2)の抗体の競合阻害実験の結果より、
使用可能な抗体の組み合わせが判定できる。 以下には、一次抗体としてTMmAb20および
二次抗体としてHRPで標識したTMmAb11をそ
れぞれ使用した例ならびに一次抗体として
TMmAb20および二次抗体としてHRPで標識し
たTMmAb2のFab′フラグメントを用いた例を示
す。 この他の抗体の組合せでも、同様にして人トロ
ンボモジユリンの測定は可能であつた。 (a) 二段法サンドイツチEIA TMmAb20をPBSで5μｇ／mlに調製しイムノ
マイクロプレートの各ウエルに100μづつ添加
して、室温で２時間吸着させた後、PBSで３回
洗浄し、このウエルを、非特異的吸着が起こらな
いように、BSA−PBSで、室温で１時間ブロツ
キングした。 次に、このウエルに、BSA−Tween20−PBS
で希釈した精製人トロンボモジユリン100μを
加え、室温で１時間反応させた。このプレートを
Tween20−PBSで３回洗浄した後、各ウエルに、
実施例２(2)と同様にしてHRPで標識した
TMmAb11 100μを加え、室温で１時間反応さ
せ、次いで、Tween20−PBSで３回洗浄した。 これに100μのオルトフエニレンジアミン含
有基質を加え、室温で５分間反応させた。 このウエルに、2N H2SO4を100μ加え、反応
を停止させ、イムノリーダーNJ−2000を用いて、
反応生成液の490nmの吸光度を測定した。結果を
第１図に示す。 この第１図から、人トロンボモジユリンの濃度
と吸光度との関係が、直線関係になることがわか
る。 この検量線から、健常人血漿検体および24時間
蓄尿検体中のそれぞれのトロンボモジユリン量を
算出し、表５および表６のそれぞれに示した。 【表】 【表】 【表】 (b) 一段法サンドイツチEIA 固相に結合する一次抗体としてTMmAb20、
二次抗体としてHRPで標識したTMmAb2のペプ
シン消化Fab′フラグメント（以下HRP標識
Fab′と記す）をそれぞれ使用した人トロンボモ
ジユリンの一段法サンドイツチ免疫測定法の例を
示す。 HRP標識Fab′の調製 TMmAb2の濃度が２mg／mlのTMmAb2の
PBS溶液10mlを、1Mクエン酸緩衝液（PH3.2）を
添加してPH4.0に調整した。 これに250μｇのブタ胃粘膜ペプシン（シグマ
社製）を添加し、37℃で12時間インキユベートし
て抗体を消化させた。 これに3Mトリス塩酸緩衝液（PH8.6）を加えて
PH7.0とし、２mlに濃縮した後、この濃縮液を
0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化したスーパ
ーローズ12HR16／50カラム（フアルマシア社
製）に通し、Ｆ（ab′）2画分を得た。回収されたＦ
（ab′）2の量は5.5mgであつた。 Ｆ（ab′）2画分を２mlに濃縮して、これに２−メ
ルカプトエチルアミンおよびEDTAをそれぞれ
10mMおよび0.5mMとなるように添加し、37℃
で90分間インキユベートしてＦ（ab′）を還元し
た。 これを5mMEDTAを含有する0.1Mリン酸緩衝
液（PH6.0）で平衡化したスーパーローズ
12HR16／50カラムに通して、Fab′画分を得た。
4.8mgのFab′が回収された。 HRPへのマレイミド基の導入は、10mgのHRP
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した後、こ
れに、10mgのＮ−（ε−マレイミドカプロイルオ
キシ）−スクシンイミドを１mlのＮ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドに溶解した溶液150μを添加し
て、30℃で60分間反応させることにより行なつ
た。 この反応生成液を0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）
で平衡化したPD10カラム（フアルマシア社製）
に通して、マレイミド基を導入したHRP画分を
得た。 前記によつて調製された濃度1.5mg／mlの
Fab′溶液３mlに、濃度が3.6mg／mlのマレイミド
基を導入したHRP液1.1ml加えて、30℃で60分間
反応させた。 この反応生成液を２mlに濃縮し、この濃縮液を
0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）で平衡化したスーパ
ーローズ12HR16／50カラムに通して、12mlの
HRP標識Fab′画分を得た。 なお、調製されたHRP標識Fab′において、
HRPとFab′との結合モル比は、ほぼ１：１であ
つた。 一段法サンドイツチEIA TMmAb20を50mM炭酸緩衝液（PH9.5）で10μ
ｇ／mlに調製し、これをイムノマイクロプレート
の各ウエルに200μづつ添加した。 室温で２時間かけて吸着させた後、このイムノ
マイクロプレートをPBSで３回洗浄し、各ウエ
ルにBSA−PBSを満たして室温で１時間ブロツ
キングし、抗体固定プレートを作製した。 前記のようにして調製されたHRP標識Fab′を
BSA−Tween20−PBSで200倍希釈し、これを各
ウエルに150μ添加した。さらに各ウエルに
BSA−Tween20−PBSで段階希釈した精製人ト
ロンボモジユリン溶液を50μ添加して、室温で
１時間放置した。 このプレートをTween20−PBSで３回洗浄し
た後、200μのオルトフエニレンジアミン含有
基質を添加して、室温で20分間反応させた。 このプレートに、2N H2SO4を100μ加えて反
応を停止させ、イムノリーダーNJ−2000を用い
て、反応生成液の490nmの吸光度を測定した。 トロンボモジユリン濃度と490nmの吸光度との
関係を第２図に示す。 (2) 競合法に基づくEIA (a) 検体として既知量の精製人胎盤トロンボモジ
ユリンをBSA−Tween20−PBSで段階釈した溶
液150μと、TMmAb11の20ngとを添加した
BSA−Tween20−PBS 150μとを試験管に入
れて、室温で１時間反応させた。 また、濃度を0.2μg／mlになるように人トロン
ボモジユリンをPBSで溶解した人トロンボモジ
ユリン溶液200μで、室温で２時間かけて、人
トロンボモジユリンを固定し、さらに非特異的吸
着を抑えるためにBSA−PBSでブロツキングし
たプレートを予め作製した。 このマイクロプレートの各ウエルに、前記の反
応液200μを添加して、室温で１時間反応させ
た。 このマイクロプレートをTween20−PBSで３
回洗浄した後、ベクタステインABCキツト（ベ
クターラボラトリーズ社）を用いて、プレートに
結合した抗体を検出した。すなわち、このマイク
ロプレートの各ウエルに、ビオチン化ヤギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体200μを添加して、室
温で１時間反応させ、次いで、Tween20−PBS
で３回洗浄した後、各ウエルに200μのアビジ
ン化パーオキシダーゼを添加して、室温で20分間
反応させた。 このマイクロプレートをTween20−PBSで３
回洗浄した後、各ウエルに100μオルトフエニ
レンジアミン含有基質を加えて、室温で５分間反
応させた。 各ウエルに100μの2N硫酸を加えて反応を停
止させ、イムノリーダーNJ−2000（日本インター
メツド社）を用いて、反応生成液の490nmの吸光
度を測定した。結果を第３図に示す。 前記の測定条件での人トロンボモジユリンの測
定範囲は、２〜100ng／mlであつた。 (b) 既知量の人トロンボモジユリンをBSA−
Tween20−PBSで段階希釈した液150μと、実
施例３(1)(b)と同様にして調製されたHRPで標識
したTMmAb2溶液のFab′フラグメント（HRP標
識Fab′）のBSA−Tween20−PBS溶液150μと
を試験管に加えて、室温で１時間反応させた。 この反応生成液200μを、実施例３(2)(b)と同
様にして調製された人トロンボモジユリンを固定
したプレートの各ウエルに添加して、室温で１時
間反応させた。このプレートをTween20−PBS
で３回洗浄し、各ウエルに200μのオルトフエ
ニレンジアミン含有量基質を添加して、室温で15
分間反応を行なつた。 各ウエルに100μの2N硫酸を加えて反応を停
止させ、イムノリーダーNJ−2000（日本インター
メツド社）を用いて、反応生成液の490nmの吸光
度をそれぞれ測定した。なお、HRP標識Fab′は、
前記の測定条件で、人トロンボモジユリンを添加
していないBSA−Tween20−PBSを用いた場合
の490nmの吸光度が1.0〜1.5の範囲になるように
希釈したものを用いた。結果を第４図に示す。 この第４図によれば、人トロンボモジユリンの
量を正確に測定することができるのは明らかであ
る。 (c) 検体としてのBSA−Tween20−PBSで段階
希釈した精製人胎盤トロンボモジユリン100μ
と、TMmAb20 10ngを添加したBSA−
Tween20−PBSPBS 100μとを試験管に加え
て、室温で１時間反応させた。この反応生成液
100μを、100μの精製人トロンボモジユリン
（0.2μg／ml）を室温で２時間固化し、BSA−
PBSでブロツキングしたマイクロプレートの各
ウエルに添加して、室温で１時間反応させた後、
Tween20−PBSで３回洗浄した。 次に、ベクタステインABCキツト（ベクター
ラボラトリーズ社製）を用いて、結合した抗体を
検出した。すなわち、この抗体を結合させたウエ
ルに、ビチオン化ヤギ抗マウスイムノグロブリン
抗血清100μを添加し、１時間反応させた。 このマイクロプレートを、Tween20−PBSで
洗浄した後、各ウエルに100μのアビジン化パ
ーオキシダーゼを添加し、20分間反応させた。こ
のマイクロプレートをTween20−PBSで３回洗
浄した後、各ウエルに100μのオルトフエニレ
ンジアミン含有基質を加え、室温で６分間反応さ
せた。 このウエルに、100μの2N硫酸を加えて反応
を停止させ、イムノリーダーNJ−2000（日本イン
ターメツド社）を用いて、反応生成液の490nmの
吸光度を測定した。結果を第５図に示す。 前記の測定条件で検体中の精製人胎盤トロンボ
モジユリンの測定可能範囲は5ng／ml〜100ng／
mlであつた。 (d) 検体としてのBSA−Tween20−PBSで段階
希釈した精製トロンボモジユリン100μと、実
施例２(2)と同様にして調製されたHRP標識
TMmAb20のBSA−Tween20−PBS溶液100μ
とを試験管に加え、室温で１時間反応させた。 前記(c)と同様にして、この混液100μを、人
トロンボモジユリンの固定化したマイクロプレー
トのウエルに添加して、室温で１時間反応させ
た。 このプレートをTween20−PBSで３回洗浄し
た後、各ウエルに100μのオルトフエニレンジ
アミン含有基質を添加して、室温で６分間反応を
行わせた。 各ウエルに100μの2N硫酸を加えて反応を停
止させ、イムノリーダーNJ−2000（日本インター
メツド社）を用いて、反応生成液の490nmの吸光
度をそれぞれ測定した。 〔発明の効果〕 本発明において、人トロンボモジユリンに結合
する新規なモノクローナル抗体およびこのモノク
ローナル抗体を安定して産生するハイブリドーマ
が得られ、このモノクローナル抗体を使用して、
たとえば、血液および尿などの検体中の微量の人
トロンボモジユリンを、簡便に、しかも、正確に
測定することができる免疫測定が可能となつた。
を特徴とする新規なモノクローナル抗体、該モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマおよび
該モノクローナル抗体を使用する人トロンボモジ
ユリンの測定方法に関する。本発明のモノクロー
ナル抗体を用いることにより、人トロンボモジユ
リンの機能および構造の解析が可能となる。ま
た、本発明のモノクローナル抗体を使用して血中
または尿中の人トロンボモジユリン含量を測定
し、その動向を把握することは、基礎医学、臨床
医学の領域において非常に重要な意義を持つ。 〔従来技術、発明が解決しようとする問題点〕 トロンボモジユリンは血管内皮細胞の表面に存
在し、トロンビンの受容体として働き、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を著しく促進する
蛋白質として発見された〔Esmon，C.T.＆
Owen，W.G.：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A ．78，
2249−2252（1981）〕。トロンビンはトロンボモジ
ユリンと複合体を形成することにより血液凝固第
因子ならびに血液凝固第因子の活性化、フイ
ブリノーゲンの限定分解、血小板の活性化などの
凝固因子としての性質を失なう〔Esmon，C.T.，
et al.：J.Biol.Chem.257，7944−7947（1982）、，
Esmon，C.T.，et al.：J.Biol.Chem.258，12238
−12242（1983）〕ことが知られている。トロンビ
ンとトロンボモジユリンの複合体によつて活性化
されたプロテインＣは血液凝固因子中の活性型第
因子（Ｆａ）、活性型第因子（Ｆａ）を
不活性化し、強力な抗凝固作用を示す〔Suzuki，
K.，et al.：J.Biol.Chem.258，1914−1920
（1983）．，Vehar，G.A.＆Davie，E.W.：
Biochemistry 19，401−410（1980）〕とともに
血管壁から組織プラスミノーゲンアクチベーター
（tPA）を放出させ、線溶系を促進させる
〔Comp，P.C.＆Esmon，C.T.：J.Clin.Invest.68，
1221−1228（1981）〕ことが知られている。さら
に、トロンボモジユリンは血液凝固第ａ因子の
プロトロンビンを限定分解してトロンビンを形成
する働きを直接阻害することも報告されている
〔Thrompson，E.A.＆Salem.H.H.：J.Clin.
Invest.78，13−17（1986）〕。人胎盤からのトロン
ボモジユリンは還元剤の存在下では105000、非存
在下では75000の分子量を持つ糖蛋白である。ト
ロンボモジユリンは動脈、静脈、毛細管、リンパ
管の内皮細胞に存在し、肺、胎盤に特に多く分布
している。胎盤では合胞体栄養細胞（Syncytio
trophoblast）にもトロンボモジユリンが認めら
れ、この細胞は母体側から胎児側へ血液を媒介に
して栄養を供給する場所にあたり、血液が比較的
渋滞しやすい所であり、トロンボモジユリンは抗
凝固物質として重要な役割を演じている可能性も
考えられる。一方、脳組織にはトロンボモジユリ
ンが認められておらず、脳に血栓が出来やすいこ
とを考え合わせると興味深い。 近年、人トロンボモジユリンに対する抗血清を
用いた放射免疫測定法（Radio immuno assay，
以下RIA）により、人トロンボモジユリンが循環
血液中および尿中にも存在することが示された
〔Ishii，H.＆Majerus，P.W.：J.Clin.Invest.76，
2178−2181（1985）〕。血中と尿中トロンボモジユ
リンの由来、さらに血中トロンボモジユリンの凝
固調節系での役割は不明であるが、血流中でも抗
凝固因子として血栓形成を調節している可能性が
あり、血中のトロンボモジユリンの作用機能を明
らかにすること、血中のトロンボモジユリン含量
を測定し、その動向を把握することができれば、
それは基礎医学、臨床医学の領域において非常に
重要な意味を持つと考えられる。 一方、モノクローナル抗体は単一の抗原決定基
に対して特異的であり、かつ、同一の特異性を有
する抗体を安定的に産生できるという利点から抗
原蛋白質の機能および構造の解析にあるいは免疫
測定に近時一般的に広く利用されるようになつて
きた。特に抗原蛋白質の機能解析、分子解析には
抗原蛋白質の機能に関与する部位を認識する抗体
を見出すことが有力な手段となる。文献
〔Maruyama，I.＆Majerus.P.W.：J.Biol.Chem.
260，15432−15438，（1985）〕には人トロンボモ
ジユリンの、トロンビン結合部位に結合するモノ
クローナル抗体を得、これを用いて人細胞表面の
トロンボモジユリンを測定した報告がある。 しかしながら、血中の人トロンボモジユリンの
測定方法については、先に述べた人トロンボモジ
ユリン抗血清を用いたRIAによる測定方法につい
て報告がなされているが、人トロンボモジユリン
に対する一定の活性を有する抗血清を安定して得
ることが極めて困難であること、得られた抗血清
中には血中の他の蛋白質を認識する抗体が含まれ
ていることが多く、人トロンボモジユリンを特異
的に測定できない危険性が考えられること、さら
に測定操作が複雑であるなどの欠点がある。 前記のような現状において、血液凝固・線溶系
の調節因子として重要な役割を担つている人トロ
ンボモジユリンの機能および構造の解析ならびに
血液および尿のそれぞれの中に存在する人トロン
ボモジユリンの免疫測定に利用し得る人トロンボ
モジユリンにのみ特異的に結合し得る各種のモノ
クローナル抗体ならびに該抗体を安定して産生す
るハイブリドーマの開発が望まれていた。また、
基礎医学、臨床医学の領域において検体中の人ト
ロンボモジユリンを特異的に、かつ、簡便に感度
よく測定する方法の開発が望まれていた。 〔問題を解決するための手段〕 本発明によれば、人トロンボモジユリンに特異
的に結合するモノクローナル抗体、該モノクロー
ナル抗体を安定して産生するハイブリドーマおよ
び該モノクローナル抗体を用いるトロンボモジユ
リンを簡便に感度よく測定できる免疫測定法が提
供される。 本発明のハイブリドーマはケラーとミルシユタ
インの方法〔K″ｏ¨ohler，G.＆Milstein，C.：
Nature，256，495−497（1975）〕として知られた
手法によつて産生される。すなわち、人トロンボ
モジユリンで哺乳動物を免疫した後、この動物の
脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させハイブリド
ーマを得る。人トロンボモジユリンに結合する抗
体を産生するハイブリドーマの検索は、たとえ
ば、ハイブリドーマ上清について人トロンボモジ
ユリンを固定したマイクロプレートを用いる酵素
免疫測定法（Enzyme Immuno Assay 以下
EIAと記す）によつて行なわれる。 抗原に用いる人トロンボモジユリンはサレムら
の方法〔Salem，H.H.，eh al.：J.Biol.Chem.
259，12246−12251（1984）〕に従つて、人胎盤よ
り単離・精製される。 人トロンボモジユリンを免疫する哺乳動物は特
に限定されないが、細胞融合に使用するミエロー
マ細胞の適合性を考慮して選択するのが好まし
く、一般的にはマウス，ラツトなどが使用され
る。 免疫も一般的方法によつて行なわれ、たとえ
ば、人トロンボモジユリンを生理食塩水などで適
当な濃度に希釈し、完全フロイントアジユバント
などとの懸濁液とし、動物に腹腔内注射などによ
つて投与する。投与は通常10〜100μｇの人トロ
ンボモジユリンを２〜４週毎に１〜数回行なう。
最終免疫は通常10〜100μｇの人トロンボモジユ
リンを添加した生理食塩水溶液を静脈注射により
投与して行なわれる。 脾臓細胞としては最終免疫３〜４日後のものを
用いるのが好ましい。 ミエローマ細胞としては、すでに公知の種々の
細胞、たとえば、マウスにおけるSP−２，NS−
１，P3−U1，ラツトにおけるY3.Agl.2.3.などが
使用される。 融合反応は、たとえば、平均分子量1000〜6000
のポリエチレングリコール（PEG）などの融合
促進剤やセンダイウイルス（HVJ）などが使用
される。 脾臓細胞とミエローマ細胞との使用比は、通
常、ミエローマ細胞に対して、脾臓細胞は１〜10
倍程度とされる。 所望のハイブリドーマの分離は、前記の細胞融
合後の細胞を、通常のハイブリドーマ選別用培地
で培養することにより行なわれる。すなわち、前
記のミエローマ細胞はヒポキサンチングアニンホ
スホリボシルトランスフエラーゼ（HGPRT）欠
損株であり、従つて、HAT培地（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）
中では生育できない。従つて、HAT培地中で生
育してくる細胞を選択すればよい。 目的の抗体を産生するハイブリドーマは、通常
の限界希釈法により、目的とする抗体の産生株の
検索および単一クローン化が行なわれる。 かくして得られた本発明のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代
培養でき、また液体窒素中で容易に長期間保存が
可能である。 このようにして得られたハイブリドーマは栄養
培地中で、また、哺乳動物の腹腔内で増殖させる
ことができ、産生した抗体は培養上清またはその
哺乳動物の腹水または血清より精製することがで
きる。一般的には、遠心分離、透析、硫酸アンモ
ニウムによる塩析、DEAEセルロースを用いるカ
ラムクロマトグラフイー、ゲル濾過、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどのような単離法およ
び精製法が挙げられる。 このようにして得られた本発明の人トロンボモ
ジユリンに結合するモノクローナル抗体は、人ト
ロンボモジユリンに強い結合能を有するものであ
る。さらに、本発明の抗体には人トロンボモジユ
リンの異なる抗原部位に結合する数種の抗体が含
まれていた。また、本抗体を用いてEIA、蛍光免
疫測定法（FIA）またはRIAを行なうことにより
微量の人トロンボモジユリンを特異的に、かつ、
正確に測定することが可能となつた。 たとえば、EIAとしては「酵素免疫測定法」
（第２版、石川 栄治 他著、医学書院、1982）
などに記載されているそれ自体公知の方法を用い
ることができる。 ここでは、サンドイツチ法および競合法のそれ
ぞれに基づくEIAについて簡単に説明する。 なお、PIAおよびFIAのそれぞれにおいても、
EIAと同様な原理によるものであることは、いう
までもない。 サンドイツチ法によるEIAでは、抗体（一次抗
体）を固相化しておき、これに抗原（標準または
検体）を加える。その結果、抗原抗体反応が起こ
り、抗原は固相化抗体に結合する。次に、抗原が
結合した固相に、酵素を標識した抗体（二次抗
体）を入れると再び抗原抗体反応が起こり、この
酵素標識抗体は、先に固相化抗体についていた抗
原の上に結合する。抗原に結合しなかつた酵素標
識抗体を除去し、基質を加えて酵素反応を行な
う。既知量の抗原と最終段階での酵素活性との関
係を示す検量線から、検体中の抗原量を求めるこ
とができる。なお、操作を簡単にするため、固相
化抗体に、抗原と酵素標識抗体とを同時に入れて
もよい（一段法サンドイツチ法EIA）。 通常、サンドイツチ法では、一次抗体と二次抗
体とが互いに結合部位の異なる抗体を組み合わせ
て用いられる。この場合に、一次抗体および二次
抗体は、それぞれ、１種でもよく、また、２種以
上の組み合わせでもよい。 競合法によるEIAを説明する。 抗原（標準または検体）と一定量の抗体と抗原
抗体反応を行なわせる。次に、抗原とは結合しな
かつた抗体を固相化抗原と抗原抗体反応を行なわ
せる。固相化抗原に結合した抗体量を酵素標識抗
イムノグロブリン抗体（たとえば、抗体がマウス
イムノグロブリンの場合には、酵素標識抗マウス
イムノグロブリン抗体が用いられる）により測定
する。あるいは、抗原と予め一定量の酵素を標識
した抗体（以下標識抗体という）とで抗原抗体反
応を行なわせた後、抗原とは結合しないで残存し
た標識抗体と固相化抗原とで抗原抗体反応を行な
わせ、その後、固相に結合した酵素量を測定す
る。 酵素量の測定は、通常の方法によることがで
き、いずれの場合も、既知量の標準抗原を用いて
作成した検量線から検体中の抗原量を算出するこ
とができる。 または、一定量の酵素標識抗原と検体との混合
液を固相化抗体と接触させて抗原抗体反応を行わ
せる。標識抗原と非標識抗原とが競合して抗体と
結合する。固相化抗体に結合した酵素標識抗原量
を、酵素の基質を加えて測定する。この場合に、
既知量の標識抗原を用いて作成した検量線から検
体の抗原量を算出することができる。 サンドイツチ法および競合法のそれぞれにおい
て、抗体をペプシンで消化して得られたＦ
（ab′）2、Ｆ（ab′）2を還元して得られたFab′およ
び
抗体をパパインで消化して得られたFabなどの、
抗原に結合する抗体フラグメントを抗体として、
また、これらを標識して標識抗体として使用する
ことができる。またサンドイツチ法において、本
発明のモノクローナル抗体どおしの組み合わせ、
本発明のモノクローナル抗体の既知の抗人トロン
ボモジユリンモノクローナル抗体との組み合わ
せ、および本発明のモノクローナル抗体と抗人ト
ロンボモジユリン抗血清との組み合わせが用いら
れる。 抗体および抗原のそれぞれに標識する酵素とし
ては、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリフオスフアターゼ、グルコースオ
キシダーゼなどが使用でき、標識方法としては、
「単クローン抗体」（岩崎 辰夫 他著、講談社
サイエンテイフイク，1984）、「酵素免疫測定法」
（第２版、石川 栄治 他著、医学書院、1982）
などに記載されている如くそれ自体公知の方法に
よることができる。 一方、固相としてはシリコン、ナイロン、プラ
スチツク、ガラスからなるステイツク、ビーズ、
マイクロプレートもしくは試験管などが利用でき
る。 また、本発明におけるモノクローナル抗体の他
の利用方法としては、たとえば、組織、血液、尿
などからの人トロンボモジユリンの分離精製など
への使用などがある。 以下、本発明の方法を実施例によつてさらに具
体的に説明するが、それらは例示のためのもので
あつて、本発明はこれに限定されるものではな
い。 〔実施例〕 実施例 １ 人トロンボモジユリンに結合するモノクローナ
ル抗体の調製 (1) 免疫に使用される抗原の調製 前記のサレムらの方法に従い、人胎盤２個から
人トロンボモジユリン1.4mgを得た。 (2) 免疫脾細胞の調製 ６〜８週齢の雄Balb／ｃマウスの腹腔内に人
トロンボモジユリン20μgと完全フロイントアジ
ユバンド（Complete Freund′s adjuvant）との
エマルジヨンを投与した。さらに３週後に、人ト
ロンボモジユリン20μｇの生理食塩水溶液を静脈
に投与した。最終免疫の３日後に、マウスを屠殺
し、脾臓を摘出し、細胞融合に用いた。 (3) ハイブリドーマの調製 脾臓をピンセツトでほぐして得られた細胞を、
RPMI−1640培地「ニツスイ」（日水製薬製）
にＬ−グルタミン0.29ｇ／、ピルビン酸0.11
ｇ／、硫酸カナマイシン0.06ｇ／、結晶ペニ
シリンＧ・K0.06ｇ／およびNaHCO31.2ｇ／
を補充した培地（以下RPMI−1640と記す）に懸
濁し、これをナイロンメツシユを通過させること
により単細胞浮遊液を得た。 この単細胞浮遊液中を0.83％塩化アンモニウム
溶液（９容量部）と0.17Mトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン塩酸緩衝液PH7.6（１容量部）
との混液で４℃で２分間処理して、単細胞浮遊液
中の赤血球を破壊し、遠心分離により除去した。 10％ウシ胎仔血清加RPMI−1640（以下10％
FCS−RPMI−1640と記す）中で培養した対数増
殖期のマウスミエローマ細胞SP−２をRPMI−
1640で２回洗浄した。 脾細胞と、このマウスミエローマ細胞とを５：
１の比率でRPMI−1640に懸濁し、培地を遠心分
離により除去した。細胞を水浴中で37℃に加温し
た。 この細胞に、予め37℃に加温した平均分子量
1500の50％ポリエテレングリコール溶液（ベーリ
ンガー・マンハイム山之内社製）1.3mlを１分間
かけて徐々に加え、さらに１分間反応させた。 この反応混合物にRPMI−1640 ９mlを４分間
かけて滴下して細胞融合反応を停止させ、これを
遠心分離して上清を除去して細胞を得た。５×
106細胞／mlの濃度となるように、この細胞を10
％FCS−RPMI−1640に再懸濁した。次いで、96
穴マイクロウエルプレート（コーニング社製）の
各ウエルに、この再懸濁液を100μずつ分注し、
これを5.5％炭酸ガス含有雰囲気中で37℃で１日
培養した後、アミノプテリン（４×10-7M）、チ
ミジン（1.6×10-5M）およびヒポキサンチン
（１×10-4M）を含有する10％FCS−RPMI−
1640（以下HAT培地と記す）100μを各ウエル
に添加した。１日後、各ウエルから半量の培地を
吸引除去し、次いで、HAT培地を100μを添加
した。その後、２日または３日毎に半量の培地を
新たなHAT培地と交換し、培養を続けた。 細胞融合10日後にハイブリドーマ細胞の増殖が
認められた。 (4) 人トロンボモジユリンに結合するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマの選別 ハイブリドーマ培養上清中の人トロンボモジユ
リンに結合する抗体のスクリーニングは、人トロ
ンボモジユリンを固定したマイクロプレートを用
いてEIAにより行なつた。 人トロンボモジユリンの固定は、96穴イムノマ
イクロプレート（ヌンク社製）の各ウエルに0.2μ
ｇ／mlとなるようPBS（0.01Mリン酸緩衝液、PH
7.4，0.15M NaCl以下同様）に溶解した人トロン
ボモジユリン溶液50μを添加し、室温で２時間
吸着させた。このプレートをPBSで３回洗浄後、
各ウエルに、0.2％ウシ血清アルブミンを含む
PBS溶液（以下BSA−PBSと記す）を加え、蛋
白の非特異的吸着が起こらぬようウエルを完全に
ブロツクした。各ウエルに、前記のようにして得
られたハイブリドーマ培養上清のPBSによる希
釈液50μを添加し、室温で１時間インキユベー
トした。 結合した抗体の検出には、ベクタステイン
ABCキツト（ベクターラボラトリーズ社製）を
用いた。すなわち、プレートを0.05％−Tween20
を含むPBS（以下Tween20−PBSと記す）で３回
洗浄後、ビオチン化ヤギ抗マウスイムノグロブリ
ン抗血清を50μ添加して、１時間反応させ、次
いで、Tween20−PBSで洗浄後、50μのアビジ
ン化パーオキシダーゼを添加し、20分間反応させ
た。このプレートをTween20−PBSで３回洗浄
後、各ウエルに0.03％H2O2と、0.8mg／mlのオル
トフエニレンジアミン二塩酸塩の10mMクエン酸
緩衝液（PH5.0）との等量混合液を10μ加え室温
でインキユベートした。 各ウエルに、2N−硫酸を100μ加えて反応を
停止させて、イムノリーダーNJ−2000（インター
メツド社製）を用いて、反応生成液の490nmの吸
光度を測定した。 融合細胞を撤いた合計768のウエルのうち592の
ウエルにハイブリドーマの増殖が認められ、この
うち人トロンボモジユリンに結合する抗体産生陽
性ウエルは126であつた。 まず、特に抗体活性の強く出た16ウエルについ
てハイブリドーマのクローニングを行なつた。 残りの陽性ウエルのうち20ウエルについては、
一旦、細胞を凍結保存し、その後、これを融解し
てクローニングに供した。 (5) 人トロンボモジユリンに結合するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマのクローニング 人トロンボモジユリンに結合する抗体活性をも
つハイブリドーマの培養液を、Balb／ｃマウス
の胸線細胞をフイーダー層（１×107細胞／ml）
とした24穴平底マイクロプレート（コーニング社
製）に移した。 増殖してきたハイブリドーマを、Balb／ｃマ
ウスの胸線細胞をフイーダー層（１×107細胞／
ml）とした96穴マイクロプレートを用いて限界希
釈法によりクローニングした。 クローニング操作を２回行ない、合計17株のク
ローンを得た。 (6) 人トロンボモジユリンに結合するモノクロー
ナル抗体の精製 10日前および３日前に各々の0.5mlのプリスタ
ンを腹腔内に投与されたBalb／ｃマウスの腹腔
内に、前記(5)で得られたハイブリドーマの細胞２
〜５×106個を移植した。 約１週間後、マウスの腹腔より腹水を採取し、
その腹水からモノクローナル抗体を50％飽和硫酸
アンモニウム溶液により塩析して単離した。 さらに、この単離されたモノクローナル抗体を
少量のPBSに溶解した溶液から、アフイゲルプ
ロテインＡ−MAPSキツト（バイオラツド社製）
に用いて抗体を単離した。この抗体溶液を、さら
にPBSに透析して、４℃であるいは凍結して保
存した。 腹水１mlあたり0.5〜10mgの精製抗体を得た。 実施例 ２ 人トロンボモジユリンに結合するモノクローナ
ル抗体の特性 (1) モノクローナル抗体の免疫グロブリンサブク
ラスの同定 精製した抗体の免疫グロブリンのサブクラスを
羊マウスイムノグロブリンクラス特異的抗血清
（メロイラボラトリー社製）を用いてオクタロー
ニー法で同定した。結果を表１に示す。 【表】 (2) モノクローナル抗体の人トロンボモジユリン
の結合部位の異同 抗体の人トロンボモジユリンの結合部位の異同
を決定するため、それぞれの抗体を西洋ワサビパ
ーオキシダーゼ（以下HRPと記す）で標識し、
人トロンボモジユリンに対して各非標識抗体と競
合反応を行なわせ、阻害の有無からそれぞれの抗
体の人トロンボモジユリンへの結合部位の異同を
調べた。 抗体へのHRPの標識は過よう素酸酸化法（単
クローン抗体、岩崎 辰夫 他著，講談社サイエ
ンテイフイク、1984）を用いて行なつた。すなわ
ち、４mgのHRP（東洋紡製）を１mlの蒸留水に溶
かした溶液に、200μの0.1M過よう素酸ナトリ
ウムを加え、室温20分間で反応させた。 次いで、この反応生成液を、1mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液（PH4.4）に対して４℃で１晩透析を
行なつた。 この透析内液に0.2M炭酸ナトリウム20μを加
えてPHを9.0に調整し、これに0.01M炭酸ナトリ
ウム緩衝液（PH9.5）で濃度５mg／mlに調製した
抗体液１mlを直ちに加え、室温で２時間撹拌し
た。この反応液を氷冷し、これに0.1mlのNaBH4
液を加え、４℃で２時間反応させた。 この反応生成液を、PBSに対して４℃で１晩
透析し、この透析内液をPBSで平衡化したスー
パーローズ12カラム（フアルマシア製）でゲル濾
過を行い、未反応のHRPおよび抗体を標識抗体
から分離し、280nmと403nmとの両方に吸収を有
する標識抗体画分を得た。 いずれの抗体も同様に標識され、人トロンボモ
ジユリンに対する結合活性は維持されていた。 競合反応は以下の如く行なつた。すなわち、イ
ムノマイクロプレートの各ウエルに、人トロンボ
モジユリンのPBS溶液（0.2μｇ／ml）を100μ添
加し、室温で２時間吸着させた。このプレートを
PBSで３回洗浄後、各ウエルにBSA−PBSを加
え、ウエルへの蛋白の非特異的吸着を抑えた。 各ウエルへはHRPで標識した抗体の一定量と、
0.2％BSAを含むTween20−PBS（以下BSA−
Tween20−PBSと記す）で段階希釈した非標識
抗体（０〜１mg／ml）を同時に加えた。室温で１
時間抗原抗体反応を行なつた後、このプレートを
Tween20−PBSで４回洗浄した。 各ウエルに100μのオルトフエニレンジアミ
ン含有基質（H2O2とオルトフエニレンジアミン
二塩酸塩とを、それぞれの濃度が0.015％および
0.4mg／mlとなるように50mMクエン酸緩衝液
（PH5.0）に溶解した液 以下同様）を添加し、室
温で反応を行なわせた。 各ウエルに、2N硫酸100μを添加して、反応
を停止させた。 イムノリーダーNJ−2000により、反応生成液
の490nmの吸光度を測定した。結果を表２−１お
よび表２−２のそれぞれに示す。 【表】 −：阻害なし
【表】 【表】 ＋：阻害あり
−：阻害なし
前記の結果から、（TMmAb7，TMmAb11）、
（TMmAb3，TMmAb8，TMmAb33）、
（TMmAb10，TMmAb20，TMmAb24，
TMmAb28）および（TMmAb2，TMmAb12，
TMmAb15）のグループ化ができ、それぞれの
グループ間では抗原認識部位が異なるものと考え
られた。また、それぞれのグループ内の抗体は同
じか、または非常に近接した抗原部位を認識して
いる抗体と思われる。 (3) 人トロンボモジユリンのプロテインＣ活性化
に対するモノクローナル抗体の阻害 人トロンボモジユリンとトロンビンとの複合体
によるプロテインＣ活性化に対するモノクローナ
ル抗体の阻害作用は、以下のようにして測定され
た。 すなわち、5μの精製モノクローナル抗体
（200nｇ）と10μの人トロンボモジユリン
（0.43pmole）とを、0.5％BSA、1.35mMCaCl2，
0.1MNaClを添加した20mMトリス塩酸緩衝液
（PH7.4）70μの中で、室温で15分間反応させた。 次に、この反応生成液に5μのウシトロンビ
ン（0.45μM）と10μのプロテインＣ（2.13μM）
とを添加して、37℃で30分反応させた。 この反応生成液に150μのヒルジン（1.7U／
ml）を加え、トロンビンを不活性化した後、これ
に、250μの合成蛍光基質（100μM Boc−Leu
−Ser−Thr−Arg−MCA (株)ペプチド研究社
製）を加えて、30℃で10分間反応させた。生成し
た活性型プロテインＣが基質を加水分解した時に
生じた蛍光を分光蛍光光度計（日立製、650−10
形）を用いて測定した（励起：380nm、発光：
460nm）。抗体無添加でのプロテインＣの活性を
100％として抗体による活性の阻害率を求めた。
結果を表３に示す。 【表】 検討した10種の抗体のうち、本実施例の反応条
件下で、TMmAb8、TMmAb20および
TMmAb33はそれぞれプロテインＣの活性化を
著しく阻害した。TMmAb2，TMmAb7，
TMmAb11，TMmAb12およびTMmAb15は、
いずれも、プロテインＣの活性化のほとんどある
いは全く阻害しなかつた。 (4) モノクローナル抗体によるトロンビン・トロ
ンボモジユリン複合体形成の阻害 モノクローナル抗体によるトロンビンと人トロ
ンボモジユリンとの複合体形成の阻害効果は、抗
体とトロンビンを人トロンボモジユリンに対して
競合させて検討した。 精製抗体と精製ウシトロンビン（持田製薬製）
とを、濃度がそれぞれ20nｇ／ml、1.7μｇ／mlと
なるようにBSA−Tween20−PBSに添加した。 次に実施例２(2)におけると同様に、人トロンボ
モジユリンを固定化した96穴イムノマイクロプレ
ートを用いてEIAを行ない、人トロンボモジユリ
ンに結合する抗体量を測定した。トロンビン無添
加の吸光度を100％として得られた結果を表４に
示す。 【表】 検討した10種の抗体のうちTMmAb20，
TMmAb24，およびTMmAb28は、それぞれト
ロンビンとの競合で人トロンボモジユリンへの結
合が著しく阻害されたが、その他はほとんど影響
を受けなかつた。 本発明のモノクローナル抗体を用いて行なつた
実施例２(3)、同(4)の結果から、少なくとも次の特
性をもつた抗体が作製されたことは明らかであ
る。 すなわち、１）人トロンボモジユリンのトロン
ビン結合部またはその近くに結合し、人トロンボ
モジユリンへのトロンビンの結合を阻害し、結果
としてプロテインＣの活性化を阻害する抗体、
２）人トロンボモジユリンへのトロンビンの結合
を阻害しない部位に結合し、トロンビン・トロン
ボモジユリン複合体によるプロテインＣの活性化
を阻害しない抗体および３）人トロンボモジユリ
ンへのトロンビンの結合は阻害しないが、トロン
ビン・トロンボモジユリン複合体によるプロテイ
ンＣの活性化を阻害する部位に結合する抗体であ
る。 実施例 ３ 人トロンボモジユリンに結合するモノクローナ
ル抗体を用いた人トロンボモジユリンの測定 (1) サンドイツチ法に基づくEIA サンドイツチ法において、モノクローナル抗体
を一次抗体（固相へ結合する抗体）と二次抗体
（酵素標識抗体）との両方に用いる場合に、通常、
同じ抗体同士または抗原への結合部位が類似して
いる抗体同士の組み合わせでは、実質的に測定不
能である。 実施例２(2)の抗体の競合阻害実験の結果より、
使用可能な抗体の組み合わせが判定できる。 以下には、一次抗体としてTMmAb20および
二次抗体としてHRPで標識したTMmAb11をそ
れぞれ使用した例ならびに一次抗体として
TMmAb20および二次抗体としてHRPで標識し
たTMmAb2のFab′フラグメントを用いた例を示
す。 この他の抗体の組合せでも、同様にして人トロ
ンボモジユリンの測定は可能であつた。 (a) 二段法サンドイツチEIA TMmAb20をPBSで5μｇ／mlに調製しイムノ
マイクロプレートの各ウエルに100μづつ添加
して、室温で２時間吸着させた後、PBSで３回
洗浄し、このウエルを、非特異的吸着が起こらな
いように、BSA−PBSで、室温で１時間ブロツ
キングした。 次に、このウエルに、BSA−Tween20−PBS
で希釈した精製人トロンボモジユリン100μを
加え、室温で１時間反応させた。このプレートを
Tween20−PBSで３回洗浄した後、各ウエルに、
実施例２(2)と同様にしてHRPで標識した
TMmAb11 100μを加え、室温で１時間反応さ
せ、次いで、Tween20−PBSで３回洗浄した。 これに100μのオルトフエニレンジアミン含
有基質を加え、室温で５分間反応させた。 このウエルに、2N H2SO4を100μ加え、反応
を停止させ、イムノリーダーNJ−2000を用いて、
反応生成液の490nmの吸光度を測定した。結果を
第１図に示す。 この第１図から、人トロンボモジユリンの濃度
と吸光度との関係が、直線関係になることがわか
る。 この検量線から、健常人血漿検体および24時間
蓄尿検体中のそれぞれのトロンボモジユリン量を
算出し、表５および表６のそれぞれに示した。 【表】 【表】 【表】 (b) 一段法サンドイツチEIA 固相に結合する一次抗体としてTMmAb20、
二次抗体としてHRPで標識したTMmAb2のペプ
シン消化Fab′フラグメント（以下HRP標識
Fab′と記す）をそれぞれ使用した人トロンボモ
ジユリンの一段法サンドイツチ免疫測定法の例を
示す。 HRP標識Fab′の調製 TMmAb2の濃度が２mg／mlのTMmAb2の
PBS溶液10mlを、1Mクエン酸緩衝液（PH3.2）を
添加してPH4.0に調整した。 これに250μｇのブタ胃粘膜ペプシン（シグマ
社製）を添加し、37℃で12時間インキユベートし
て抗体を消化させた。 これに3Mトリス塩酸緩衝液（PH8.6）を加えて
PH7.0とし、２mlに濃縮した後、この濃縮液を
0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化したスーパ
ーローズ12HR16／50カラム（フアルマシア社
製）に通し、Ｆ（ab′）2画分を得た。回収されたＦ
（ab′）2の量は5.5mgであつた。 Ｆ（ab′）2画分を２mlに濃縮して、これに２−メ
ルカプトエチルアミンおよびEDTAをそれぞれ
10mMおよび0.5mMとなるように添加し、37℃
で90分間インキユベートしてＦ（ab′）を還元し
た。 これを5mMEDTAを含有する0.1Mリン酸緩衝
液（PH6.0）で平衡化したスーパーローズ
12HR16／50カラムに通して、Fab′画分を得た。
4.8mgのFab′が回収された。 HRPへのマレイミド基の導入は、10mgのHRP
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した後、こ
れに、10mgのＮ−（ε−マレイミドカプロイルオ
キシ）−スクシンイミドを１mlのＮ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドに溶解した溶液150μを添加し
て、30℃で60分間反応させることにより行なつ
た。 この反応生成液を0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）
で平衡化したPD10カラム（フアルマシア社製）
に通して、マレイミド基を導入したHRP画分を
得た。 前記によつて調製された濃度1.5mg／mlの
Fab′溶液３mlに、濃度が3.6mg／mlのマレイミド
基を導入したHRP液1.1ml加えて、30℃で60分間
反応させた。 この反応生成液を２mlに濃縮し、この濃縮液を
0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）で平衡化したスーパ
ーローズ12HR16／50カラムに通して、12mlの
HRP標識Fab′画分を得た。 なお、調製されたHRP標識Fab′において、
HRPとFab′との結合モル比は、ほぼ１：１であ
つた。 一段法サンドイツチEIA TMmAb20を50mM炭酸緩衝液（PH9.5）で10μ
ｇ／mlに調製し、これをイムノマイクロプレート
の各ウエルに200μづつ添加した。 室温で２時間かけて吸着させた後、このイムノ
マイクロプレートをPBSで３回洗浄し、各ウエ
ルにBSA−PBSを満たして室温で１時間ブロツ
キングし、抗体固定プレートを作製した。 前記のようにして調製されたHRP標識Fab′を
BSA−Tween20−PBSで200倍希釈し、これを各
ウエルに150μ添加した。さらに各ウエルに
BSA−Tween20−PBSで段階希釈した精製人ト
ロンボモジユリン溶液を50μ添加して、室温で
１時間放置した。 このプレートをTween20−PBSで３回洗浄し
た後、200μのオルトフエニレンジアミン含有
基質を添加して、室温で20分間反応させた。 このプレートに、2N H2SO4を100μ加えて反
応を停止させ、イムノリーダーNJ−2000を用い
て、反応生成液の490nmの吸光度を測定した。 トロンボモジユリン濃度と490nmの吸光度との
関係を第２図に示す。 (2) 競合法に基づくEIA (a) 検体として既知量の精製人胎盤トロンボモジ
ユリンをBSA−Tween20−PBSで段階釈した溶
液150μと、TMmAb11の20ngとを添加した
BSA−Tween20−PBS 150μとを試験管に入
れて、室温で１時間反応させた。 また、濃度を0.2μg／mlになるように人トロン
ボモジユリンをPBSで溶解した人トロンボモジ
ユリン溶液200μで、室温で２時間かけて、人
トロンボモジユリンを固定し、さらに非特異的吸
着を抑えるためにBSA−PBSでブロツキングし
たプレートを予め作製した。 このマイクロプレートの各ウエルに、前記の反
応液200μを添加して、室温で１時間反応させ
た。 このマイクロプレートをTween20−PBSで３
回洗浄した後、ベクタステインABCキツト（ベ
クターラボラトリーズ社）を用いて、プレートに
結合した抗体を検出した。すなわち、このマイク
ロプレートの各ウエルに、ビオチン化ヤギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体200μを添加して、室
温で１時間反応させ、次いで、Tween20−PBS
で３回洗浄した後、各ウエルに200μのアビジ
ン化パーオキシダーゼを添加して、室温で20分間
反応させた。 このマイクロプレートをTween20−PBSで３
回洗浄した後、各ウエルに100μオルトフエニ
レンジアミン含有基質を加えて、室温で５分間反
応させた。 各ウエルに100μの2N硫酸を加えて反応を停
止させ、イムノリーダーNJ−2000（日本インター
メツド社）を用いて、反応生成液の490nmの吸光
度を測定した。結果を第３図に示す。 前記の測定条件での人トロンボモジユリンの測
定範囲は、２〜100ng／mlであつた。 (b) 既知量の人トロンボモジユリンをBSA−
Tween20−PBSで段階希釈した液150μと、実
施例３(1)(b)と同様にして調製されたHRPで標識
したTMmAb2溶液のFab′フラグメント（HRP標
識Fab′）のBSA−Tween20−PBS溶液150μと
を試験管に加えて、室温で１時間反応させた。 この反応生成液200μを、実施例３(2)(b)と同
様にして調製された人トロンボモジユリンを固定
したプレートの各ウエルに添加して、室温で１時
間反応させた。このプレートをTween20−PBS
で３回洗浄し、各ウエルに200μのオルトフエ
ニレンジアミン含有量基質を添加して、室温で15
分間反応を行なつた。 各ウエルに100μの2N硫酸を加えて反応を停
止させ、イムノリーダーNJ−2000（日本インター
メツド社）を用いて、反応生成液の490nmの吸光
度をそれぞれ測定した。なお、HRP標識Fab′は、
前記の測定条件で、人トロンボモジユリンを添加
していないBSA−Tween20−PBSを用いた場合
の490nmの吸光度が1.0〜1.5の範囲になるように
希釈したものを用いた。結果を第４図に示す。 この第４図によれば、人トロンボモジユリンの
量を正確に測定することができるのは明らかであ
る。 (c) 検体としてのBSA−Tween20−PBSで段階
希釈した精製人胎盤トロンボモジユリン100μ
と、TMmAb20 10ngを添加したBSA−
Tween20−PBSPBS 100μとを試験管に加え
て、室温で１時間反応させた。この反応生成液
100μを、100μの精製人トロンボモジユリン
（0.2μg／ml）を室温で２時間固化し、BSA−
PBSでブロツキングしたマイクロプレートの各
ウエルに添加して、室温で１時間反応させた後、
Tween20−PBSで３回洗浄した。 次に、ベクタステインABCキツト（ベクター
ラボラトリーズ社製）を用いて、結合した抗体を
検出した。すなわち、この抗体を結合させたウエ
ルに、ビチオン化ヤギ抗マウスイムノグロブリン
抗血清100μを添加し、１時間反応させた。 このマイクロプレートを、Tween20−PBSで
洗浄した後、各ウエルに100μのアビジン化パ
ーオキシダーゼを添加し、20分間反応させた。こ
のマイクロプレートをTween20−PBSで３回洗
浄した後、各ウエルに100μのオルトフエニレ
ンジアミン含有基質を加え、室温で６分間反応さ
せた。 このウエルに、100μの2N硫酸を加えて反応
を停止させ、イムノリーダーNJ−2000（日本イン
ターメツド社）を用いて、反応生成液の490nmの
吸光度を測定した。結果を第５図に示す。 前記の測定条件で検体中の精製人胎盤トロンボ
モジユリンの測定可能範囲は5ng／ml〜100ng／
mlであつた。 (d) 検体としてのBSA−Tween20−PBSで段階
希釈した精製トロンボモジユリン100μと、実
施例２(2)と同様にして調製されたHRP標識
TMmAb20のBSA−Tween20−PBS溶液100μ
とを試験管に加え、室温で１時間反応させた。 前記(c)と同様にして、この混液100μを、人
トロンボモジユリンの固定化したマイクロプレー
トのウエルに添加して、室温で１時間反応させ
た。 このプレートをTween20−PBSで３回洗浄し
た後、各ウエルに100μのオルトフエニレンジ
アミン含有基質を添加して、室温で６分間反応を
行わせた。 各ウエルに100μの2N硫酸を加えて反応を停
止させ、イムノリーダーNJ−2000（日本インター
メツド社）を用いて、反応生成液の490nmの吸光
度をそれぞれ測定した。 〔発明の効果〕 本発明において、人トロンボモジユリンに結合
する新規なモノクローナル抗体およびこのモノク
ローナル抗体を安定して産生するハイブリドーマ
が得られ、このモノクローナル抗体を使用して、
たとえば、血液および尿などの検体中の微量の人
トロンボモジユリンを、簡便に、しかも、正確に
測定することができる免疫測定が可能となつた。
第１図乃至第６図は、それぞれ、本発明の実施
例における、検体中の人トロンボモジユリンの濃
度と吸光度との関係を示すグラフである。
例における、検体中の人トロンボモジユリンの濃
度と吸光度との関係を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 人トロンボモジユリンに対するモノクローナ
ル抗体で、該モノクローナル抗体の人トロンボモ
ジユリンへの結合がトロンビンの人トロンボモジ
ユリンへの結合を阻害しないことを特徴とするモ
ノクローナル抗体および人トロンボモジユリンに
結合する該抗体フラグメント。 ２ 人トロンボモジユリンに対するモノクローナ
ル抗体で、該モノクローナル抗体の人トロンボモ
ジユリンへの結合がトロンビンの人トロンボモジ
ユリンへの結合を阻害しないモノクローナル抗体
を産生し、且つ人トロンボモジユリンで免疫した
マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との細
胞融合によつて得られることを特徴とするハイブ
リドーマ。 ３ 人トロンボモジユリンに対するモノクローナ
ル抗体で、該モノクローナル抗体の人トロンボモ
ジユリンへの結合がトロンビンの人トロンボモジ
ユリンへの結合を阻害しないモノクローナル抗体
または人トロンボモジユリンに結合する該抗体フ
ラグメントを使用することを特徴とする人トロン
ボモジユリンの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63074290A JPS6447391A (en) | 1987-04-01 | 1988-03-30 | Monoclonal antibody and use thereof |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7750787 | 1987-04-01 | ||
| JP63074290A JPS6447391A (en) | 1987-04-01 | 1988-03-30 | Monoclonal antibody and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6447391A JPS6447391A (en) | 1989-02-21 |
| JPH0542920B2 true JPH0542920B2 (ja) | 1993-06-30 |
Family
ID=13635877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63074290A Granted JPS6447391A (en) | 1987-04-01 | 1988-03-30 | Monoclonal antibody and use thereof |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0285511B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6447391A (ja) |
| DE (1) | DE3876124T2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2008044631A1 (en) | 2006-10-06 | 2008-04-17 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Therapeutic and/or ameliorating agent for disseminated intravascular coagulation |
| WO2013073545A1 (ja) | 2011-11-15 | 2013-05-23 | 旭化成ファーマ株式会社 | 敗血症の治療及び／又は改善のための医薬 |
| WO2013179910A1 (ja) | 2012-05-31 | 2013-12-05 | 学校法人近畿大学 | 抗癌剤に起因する末梢性神経障害性疼痛の予防及び／又は治療剤 |
| WO2020067389A1 (ja) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | 旭化成ファーマ株式会社 | 抗悪性腫瘍剤による末梢神経障害の症状軽減及び／又は発症抑制のための医薬 |
| WO2020084853A1 (ja) | 2018-10-22 | 2020-04-30 | 旭化成ファーマ株式会社 | 凝固異常を伴う敗血症の治療及び／又は改善のための医薬 |
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-
1988
- 1988-03-29 EP EP88400761A patent/EP0285511B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-29 DE DE19883876124 patent/DE3876124T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-30 JP JP63074290A patent/JPS6447391A/ja active Granted
Non-Patent Citations (3)
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|---|
| JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION=1985 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0285511A2 (en) | 1988-10-05 |
| DE3876124T2 (de) | 1993-05-06 |
| JPS6447391A (en) | 1989-02-21 |
| EP0285511B1 (en) | 1992-11-25 |
| EP0285511A3 (en) | 1988-12-28 |
| DE3876124D1 (en) | 1993-01-07 |
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