JPH04211378A - ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのクローニングおよび製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレ
アーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組み換えＤＮＡ
と、当該組み換えＤＮＡからこれらの酵素を製造する方
法とに関する。

【０００２】制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中に
見られる酵素の一群である。制限エンドヌクレアーゼを
夾雑する他の細菌成分から精製すると、それらは実験室
でＤＮＡ分子を切断して各々相応する正確なフラグメン
トを形成するのに用いることができる。この特質の故に
、ＤＮＡ分子は１つずつ独自に同定することができ、ま
た分画してその構成遺伝子を単離することができる。 制限エンドヌクレアーゼは、現代の遺伝子研究にとって
不可欠の道具であることが立証されている。制限エンド
ヌクレアーゼは生化学的な「ハサミ」であり、これを用
いて遺伝子工学や遺伝子解析が実施される。

【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上
の特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、
そこに結合することによって作用する。これらの酵素は
ＤＮＡ分子に一旦結合すると、その認識配列の内部また
はその一端でＤＮＡ分子を切断する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼは、それぞれ異なる認識配列に対して親和
性を持つ。今日まで調べられた何百種もの細菌の中から
、百を越える数の異なる制限エンドヌクレアーゼが同定
されている。

【０００４】細菌は、一菌種当りごく少数の制限エンド
ヌクレアーゼしか含まないことが多い。制限エンドヌク
レアーゼは、通常、それの由来となった細菌に因んで命
名される。例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａｅｇｙ
ｐｔｉｕｓ　菌種は三つの異なる制限エンドヌクレアー
ゼを合成するが、これらは、ＨａｅＩ，　ＨａｅＩＩ　
および　ＨａｅＩＩＩ　と命名されている。これらの酵
素は、それぞれ配列　（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ），　Ｐ
ｕＧＣＧＣＰｙおよび　ＧＧＣＣ　を認識して切断する
。一方、大腸菌　ＲＹ１３　は、ただ一つの制限酵素　
ＥｃｏＲＩを合成するだけであり、この酵素は配列　Ｇ
ＡＡＴＴＣ　を認識する。

【０００５】理論によって拘束されるつもりはないが、
自然界では、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の増殖
において防衛的な役割を演じていると考えられる。これ
らの酵素によって、細菌は、これらの細菌を破壊したり
またはこれらに寄生したりするウィルスやプラスミドの
ような外来ＤＮＡ分子による感染を防ぐことができる。 制限エンドヌクレアーゼは、感染している外来ＤＮＡ分
子の長さを走査し、認識配列が現われる度ごとにそれら
を切断することによって、細菌に抵抗性を付与する。こ
れによって生じた破壊の結果、感染外来ＤＮＡの多くを
不能にし、さらに、このＤＮＡを非特異的エンドヌクレ
アーゼによって分解しやすくする。

【０００６】細菌の防衛系のもう一つの成分として、修
飾メチラーゼがある。これらの酵素は制限エンドヌクレ
アーゼと相補的であり、細菌が外来の感染性ＤＮＡから
自身のＤＮＡを防御し区別できるようにする手段を提供
する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレア
ーゼのものと同じヌクレオチド認識配列を認識してそれ
に結合するが、このＤＮＡを破壊する代わりに、メチル
基を付加することによってその配列内のヌクレオチドの
いずれかを化学的に修飾する。メチル化されると、認識
配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって結合され
ないし、また切断もされない。細菌細胞のＤＮＡはその
修飾メチラーゼの活性によって、常に完全に修飾されて
おり、従って、自身の内因性制限エンドヌクレアーゼの
存在に対して完全に非感受性となっている。制限エンド
ヌクレアーゼの認識と攻撃に対して感受性を持つものは
、修飾されていないＤＮＡ、従って外来のものであるこ
とが確認できるＤＮＡのみである。この制限エンドヌク
レアーゼと修飾メチラーゼは、一緒になって、いわゆる
制限−修飾系（「Ｒ−Ｍ系」）を形成する。

【０００７】遺伝子工学技術の出現によって、現在では
、遺伝子をクローン化し、それらの遺伝子によってコー
ドされる蛋白質や酵素を従来の精製技術で入手可能な量
よりももっと多量に生産することが可能である。制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に決定
的に重要なことは、そのようなクローンの出現頻度が１
０−３〜１０−４程度に低い場合、複雑な「ライブラリ
ー」、すなわち「ショットガン」法によって得られたク
ローン集団の中で目的とするクローンを同定するための
簡単で信頼性の高い方法を開発することである。好まし
くは、その方法は選択性が高く、望まないクローンの大
多数は破壊され、好ましい希なクローンは生存させるよ
うなものであることが好ましい。

【０００８】ＩＩ型Ｒ−Ｍ系は次第に高い頻度でクロー
ン化されるようになっている。最初にクローン化された
系では、制限エンドヌクレアーゼクローンの同定または
選択の手段として、バクテリオファージ感染が用いられ
た（ＥｃｏＲＩＩ：Ｋｏｓｙｋｈら、Ｍｏｌｅｃ．ｇｅ
ｎ．　Ｇｅｎｅｔ　１７８：　７１７−７１９，　（１
９８０）；　ＨｈａＩＩ：Ｍａｎｎら、　Ｇｅｎｅ　３
：　９７−１１２，（１９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄ
ｅｒ　ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ
．　７８：　１５０３−１５０７，　（１９８１）　）
。細菌中にＲ−Ｍ系が存在することによって、細菌はバ
クテリオファージによる感染に対して抵抗することがで
きるので、クローン化されたＲ−Ｍ遺伝子を保有する形
質転換された宿主細胞は、原理的には、ファージに暴露
されたライブラリーからの生き残りとして選択的に分離
され得る。しかしながら、この方法は、あまり有効では
ないことが判明した。特に、クローン化されたＲ−Ｍ遺
伝子は、選択的な生き残りを可能にするほどに十分なフ
ァージ耐性を常に示すとは限らないことが判明した。

【０００９】もう一つのクローニング法の場合、最初プ
ラスミド由来とされていた系を　Ｅ．　ｃｏｌｉのクロ
ーニングプラスミド中に組み込む（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕ
ｇｕｅｌｅｒｅｔら、Ｎｕｃｌ．　ＡｃｉｄＲｅｓ．　
１２：　３６５９−３６７６，　（１９８４）；　Ｐａ
ｅＲ７：　Ｇｉｎｇｅｒａｓと　Ｂｒｏｏｋｓ，　Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８
０：　４０２−４０６，　（１９８３）；　Ｔｈｅｒｉ
ａｕｌｔ　と　Ｒｏｙ，　Ｇｅｎｅ　１９：　３５５−
３５９　（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：　Ｂｌｕｍｅｎｔ
ｈａｌ　ら、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１６４：　
５０１−５０９，　（１９８５））。

【００１０】第三の方法として多くの系のクローニング
に使用されている方法は、活性メチラーゼ遺伝子につい
て選択することによってクローン化することを含む（例
えば、１９８６年９月３日公開の　ＥＰＯ　Ｎｏ．　１
９３，４１３と、ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら、Ｎｕｃｌ．
　Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．　１３：　６４０３−６４２１，
　（１９８５）を参照）。簡単に言うと、メチラーゼ選
択は、形質転換した宿主由来のＤＮＡを対応する制限エ
ンドヌクレアーゼに暴露することによって、メチラーゼ
クローンについてスクリーニングすることを含む。おそ
らく宿主のＤＮＡは修飾されており、制限エンドヌクレ
アーゼによる攻撃に対して感受性を持たないために、生
存物がメチラーゼ遺伝子の存在を示している。制限遺伝
子と修飾遺伝子とは近接して結合していることが多いの
で、同時に両方の遺伝子がクローン化されることがよく
ある。しかしながら、メチラーゼ選択は必ずしも常に完
全な制限系を生成するとは限らず、むしろメチラーゼ遺
伝子しか生成しないことがある（例えば、ＢｓｐＲＩ：
Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｌｉら、Ｇｅｎｅ　１０：　２１９
−２２５，　（１９８０）；Ｂｃｎ　Ｉ：　Ｊａｎｕｌ
ａｉｔｉｓ　ら、　Ｇｅｎｅ　２０：　１９７−２０４
　（１９８２）；　ＢｓｕＲＩ：　Ｋｉｓｓ　と　Ｂａ
ｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ　２１：１１１−１１９，　（１
９８３）；　Ｍｓｐ　Ｉ：　Ｗａｌｄｅｒら、Ｊ．　Ｂ
ｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５８：　１２３５−１２４１
，（１９８３）を参照。また、Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｇｅｎ
ｅ　７４：　２８１−２８９，　（１９８８）；　Ｓｌ
ａｔｋｏら、Ｇｅｎｅ　７４：４５−５０，　（１９８
８）；　Ｌｕｎｎｅｎ　ら、Ｇｅｎｅ　７４：　２５−
３２，　（１９８８）；　ＶａｎＣｏｔｔ　ら、　Ｇｅ
ｎｅ　７４：５５−５９，　（１９８８）を参照）。

【００１１】このようにメチラーゼ選択法においてすら
遺伝子工学が直面している上記の不備および様々な潜在
的障害に対して多数の可能な説明がされている。ある系
の場合、クローニングの問題は、まだ修飾によって保護
されていない宿主の中にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導
入しようとする際に存するだろう。もし、メチラーゼ遺
伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とが共通のＤＮＡフラ
グメント上に導入されるとするならば、メチラーゼ遺伝
子は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主のゲノムを切断
する前に、宿主を修飾ないし保護しなければならない。

【００１２】このような系をＥ．　ｃｏｌｉ　中でクロ
ーン化する際に見られるもう一つの障害が、各種メチラ
ーゼをクローン化する過程で発見された。例えば、Ｅ．
　ｃｏｌｉ　株の多くは（通常クローニングに使用され
るものを含めて）、メチル化を含むＤＮＡの導入に対し
て抵抗する系を持っている。（Ｒａｌｅｉｇｈ　とＷｉ
ｌｓｏｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，　ＵＳＡ　８３：　９０７０−９０７４，　（１
９８６）　参照）。したがって、クローニングにどのＥ
．ｃｏｌｉ　株を使用するかについては、慎重に考慮す
る必要がある。

【００１３】高純度の制限エンドヌクレアーゼは、実験
室でＤＮＡの特性を明らかにしたり、ＤＮＡを再構成す
るのに有用な道具である。また、それほどではないけれ
ども、修飾メチラーゼも同様の目的のために役立つ。そ
のため、組み換えＤＮＡ技術によって、上記酵素を大量
に合成する細菌株を得ようとする活発な商業的な動きが
ある。もしそのような細菌株が見つかれば、それは商業
的に有用な量を生産する手段を提供するばかりでなく、
精製作業を単純化するという意味でも、有用であろう。

【００１４】

【発明の概要】本発明により、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　（ＡＴＣＣ　１５０５１）
から入手可能な、ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼと修
飾メチラーゼをコードする組み換えＤＮＡが提供され、
また、前記組み換えＤＮＡをクローン化するための関連
方法が提供される。本発明はまた、前記組み換えＤＮＡ
を含むベクターおよび形質転換宿主細胞、前記　Ｓｆｉ
Ｉ　組み換えＤＮＡから産生された組み換え　ＳｆｉＩ
　修飾制限エンドヌクレアーゼおよび組み換え　Ｓｆｉ
Ｉ　修飾メチラーゼ、並びに前記酵素の製造方法に関す
る。

【００１５】ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼは、Ｄ
ＮＡ配列　５′−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ−３′を
認識してＮ４　とＮ５ヌクレオチドの間で切断し、３塩
基３′のオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を残す酵
素である。Ｑｉａｎｇ，　Ｂ．−Ｑ．とＳｃｈｉｌｄｋ
ｒａｕｔ，Ｉ．（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．　１２，　４５０７−４５１５　を参照さ
れたい。その開示内容を参照として本明細書に取り入れ
るものとする。

【００１６】ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系をクローン化するのに
好ましい方法は、ライブラリーの作製に適切なベクター
を構築すること、Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　由来の
ＤＮＡを含む多数のライブラリーを形成すること、　Ｓ
ｆｉＩ　修飾メチラーゼをコードするＤＮＡを含むクロ
ーンを分離すること、ＳｆｉＩ　修飾メチラーゼ遺伝子
近傍の染色体ＤＮＡを分離すること、および　ＳｆｉＩ
　制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡのために
、メチラーゼ遺伝子を含むすべてのＤＮＡをスクリーニ
ングすることを含む。　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレア
ーゼに関する選択はそのエンドヌクレアーゼのアミノ末
端をコードするＤＮＡを含むクローンをスクリーニング
することによって実施するのが好ましい。そして、この
選択は、好ましくは、Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　由
来の　ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼを精製し、アミノ
末端のアミノ酸残基の配列を決定し、得られたアミノ酸
配列に相当するＤＮＡオリゴマーを作製し、このＤＮＡ
オリゴマーとハイブリダイズするクローンをスクリーニ
ングすることによって実現される。

【００１７】本発明に基づいて製造される　ＳｆｉＩ　
メチラーゼと制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋
であり、従来の方法（例えば、上記　ＱｉａｎｇとＳｃ
ｈｉｌｄｋｒａｕｔ　参照）に基づいて産生された制限
エンドヌクレアーゼに通常見られる夾雑物質を含まない
。

【００１８】

【発明の詳細】本発明は、８塩基ヌクレオチド配列を認
識するＲ−Ｍ系について、満足できる成果をもたらした
最初のクローニング法を提供する。従来のクローニング
系は、４塩基ないし６塩基系であった。　ＳｆｉＩ　制
限エンドヌクレアーゼは特に有用な酵素である。なぜな
ら、　ＳｆｉＩ　認識配列は、ゲノム内に比較的希にし
か見られない、特に、ヒト染色体のようなＡＴの豊富な
ゲノムでは希であるからである。特に、　ＳｆｉＩ　部
位はヒトＤＮＡでは２００，０００塩基対ごとに僅かに
約１回出現すると考えられる。したがって、本発明に従
って産生された組み換え　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレ
アーゼは、ヒト・ゲノムをマップ化する際に特に有効で
あろう。

【００１９】Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　由来の　Ｓ
ｆｉＩ　Ｒ−Ｍ遺伝子をＥ．　ｃｏｌｉ　中でクローン
化することは、多くの理由によりきわめて困難であるこ
とを立証した。これまでにクローン化された他のＲ−Ｍ
系と違って、　ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼとメチラ
ーゼ遺伝子は、Ｅ．　ｃｏｌｉ　中で十分発現しないこ
とが判明した。　ＳｆｉＩ　メチラーゼ遺伝子に対する
内因性プロモーターはＥ．　ｃｏｌｉ　の転写因子によ
って認識されないと考えられている。さらに、Ｅ．　ｃ
ｏｌｉ翻訳因子は、　ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系と十分な相互
作用を持たないようである。

【００２０】おまけに、　ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系をうまく
クローン化するには、先に引用したＥＰＯ出願公開第　
１９３，４１３号に記載されたメチラーゼ選択法の多数
の修正法および変法を必要とした。後に述べるように、
メチラーゼ選択は、次の場合を除き、メチラーゼクロー
ンを産生することができないと結論された。その例外的
な場合とは、メチラーゼ遺伝子の開始コドンがクローニ
ングベクター上のプロモーターと十分近く、かつ、それ
と直線的に配列しているように、メチラーゼ遺伝子が十
分小さいＤＮＡフラグメント上にクローン化されている
場合である。このような場合では、メチラーゼ遺伝子は
発現され、かつ、そのクローンはメチラーゼ選択、すな
わちＳｆｉＩ消化に抵抗して生き残る能力に基づいたメ
チラーゼクローンの同定、において生き残ることができ
る。　ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系のクローニングを成功裡に実
現するために、合計１６種の、異なる制限エンドヌクレ
アーゼを用いて５４個のライブラリーを作製した。ＡＴ
に富む配列を認識するエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ，　ＥｃｏＲＩ，　ＸｂａＩおよびＮｓｉ
Ｉは、　ＳｆｉＩ　染色体ＤＮＡの切断に対しては非効
率的であることが判明した。ＢｃｌＩで成功裡にクロー
ン化した後で、実施例Ｉに記載した　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
　ブロットデータから、ＡＴに富む配列を認識するエン
ドヌクレアーゼが有効なクローン化を行なうのに十分な
大きさのフラグメントを産生することが判明した。

【００２１】ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系をクローン化するに当
り、メチラーゼ選択の初期の試みとして多くの異なる温
度で宿主細胞の形質転換を行なったが不成功であった。 例えば、ｐＵＣ１９　をベースとしたライブラリーのあ
るものについて、３０℃での増殖を用いてみた。これは
、ｐＵＣ１９　誘導体はそれより高温では不安定になる
傾向があるからである。ある好ましい宿主、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ　の増殖にとって最適の温度は３７℃である。しかし
ながら、初期の試みは不成功であったので、Ｅ．　ｃｏ
ｌｉ　を４２℃で増殖させることをやってみた。　Ｓｆ
ｉＩ　制限エンドヌクレアーゼの至適温度は５０℃であ
るから、メチラーゼについても同様であろうと考えられ
た。　ＳｆｉＩＲ−Ｍ系のクローン化に成功した後で、
最初のメチラーゼクローンを４２℃で獲得することがで
きたけれども、Ｅ．　ｃｏｌｉ　のｉｎ　ｖｉｖｏ　の
メチラーゼ活性の至適温度は３７℃であり、ｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏの至適温度は４０℃であると決定された。

【００２２】ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系をクローン化する試み
の中で、５種の異なるベクターを構築した。具体的に述
べると、２個のｐＢＲ３２２誘導体、２個の　ｐＵＣ１
９誘導体、１個の　ｐＢＲ３２８　誘導体を構築した。 　ｐＢＲ３２８　ベクター（以下にさらに詳しく述べる
）が、唯一、活性　ＳｆｉＩ　メチラーゼクローンを生
成した。　ｐＢＲ３２８　によるクローン化が成功した
のは、　ｐＢＲ３２８　が安定なプラスミド　ｐＢＲ３
２２　よりも高いコピー数を持っていること、およびき
わめて高いコピー数を持つプラスミド　ｐＵＣ１９より
も高い安定性を持つこと（特により高温では、すなわち
約３６℃よりも高い温度では、安定性が優れていた）に
よると思われる。コピー数の高いプラスミドを使用する
と、目的の組み換えＤＮＡのコピー数は増加し、従って
、ＤＮＡのメチル化を増す。しかしながら、上に述べた
ように、コピー数が高ければ高いほど、ｐＵＣ１９　の
ようなベクターの不安定性は増す。これは、高温では特
にそうである。　ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系については、　ｐ
ＢＲ３２８　に若干の変形を施したものが正当なバラン
スを持つことが判明した。　ｐＢＲ３２８　の変形につ
いてさらに具体的に述べると、以下にさらに論ずる筈で
あるが、次の通りであった。プラスミドの抗生物質耐性
遺伝子をプラスミド起源の複製物から分離することによ
って、メチラーゼ選択の効率が最大になるような位置に
、　ＳｆｉＩ　部位を挿入することであった。

【００２３】ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系をクローン化するため
のメチラーゼ選択工程を改善するために、クローニング
ベクター以下の大きさを持つすべてのプラスミドを、調
製したライブラリーの最終グループから取り除いた。挿
入ＤＮＡフラグメントを欠くプラスミドを除去すると、
非メチラーゼクローン生存物の全数は低下するから、メ
チラーゼクローンを見出す確率は向上する。

【００２４】非メチラーゼクローンの破壊を促進するた
めに、メチラーゼ選択後処理としていくつかの異なる処
理を行なった。　ＳｆｉＩ　によって切断されたＤＮＡ
から５′燐酸を取り除くために、仔牛腸フォスファター
ゼおよび細菌のアルカリフォスファターゼを用いた。　
ＳｆｉＩ　によって切断されたＤＮＡから全ヌクレオチ
ドを取り除くために、エキソヌクレアーゼ　ＩＩＩ、　
Ｂａｌ−３１　ヌクレアーゼを用いた。この処理によっ
て、　ＳｆｉＩによって切断された（非メチラーゼ）プ
ラスミドが再結合して生き残る確率はさらに減少した。

【００２５】２種の宿主細胞株（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＲＲＩ
およびＫ８０２）を用いた。これは、ＳｆｉＩ−メチラ
ーゼ含有プラスミドによる形質転換がどちらか一方に致
命的である場合に備えたものである。　ＳｆｉＩ　Ｒ−
Ｍ系をクローン化するには、ＲＲＩが好ましい宿主細胞
であることが判明した。

【００２６】先に引用したＥＰＯ出願公開第　１９３，
４１３号に対する上記変更を、様々の組み合わせで用い
た。これは、制限エンドヌクレアーゼを形成する１６種
の異なるライブラリー合計５４個のライブラリーを構築
しかつスクリーニングするためであった。以下に論ずる
ように、これらのライブラリーのうちただ一つ、すなわ
ち　ｐＥＶ３２８−８−６　の　ＢｃｌＩ　ライブラリ
ーだけがメチラーゼクローンを生成した。

【００２７】この遺伝子の両側のメチラーゼ遺伝子とＤ
ＮＡをクローン化し分析して始めて、なぜ構築されたラ
イブラリーの大部分が　ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍクローンを生
成することができなかったのか、その理由を推量するこ
とが可能になった。理論に拘束されるつもりはないが、
ＢｇｌＩＩ，　ＫｐｎＩ，　ＰｓｔＩ，　ＳａｃＩ，　
ＳａｌＩ，　ＳｐｈＩ　および　ＸｈｏＩ　のようなラ
イブラリー形成エンドヌクレアーゼはメチラーゼ遺伝子
の遥か上流を切断するために、プラスミドプロモーター
がメチラーゼ遺伝子をコントロールすることができない
と考えられる。したがって、プラスミドプロモーターの
コントロールが無ければ、　ＳｆｉＩ　メチラーゼは発
現しないために、これらのライブラリーからのクローン
は、メチラーゼ選択において生き残ることができなかっ
たのであろう。さらに、ＢｇｌＩＩ　および　ＳａｃＩ
　はまたメチラーゼ遺伝子内部を切断し、活性メチラー
ゼを獲得する確率をさらに低下させることが結論された
。

【００２８】他の２種のクローニングエンドヌクレアー
ゼ（ＢａｍＨＩ，　ＸｍａＩ　）は、プラスミドプロモ
ーターによって発現されるメチラーゼ遺伝子を含むフラ
グメントを生成したが、このフラグメントはあまりに大
きすぎて（２０　ｋｂ　）、効率的にクローン化するこ
とができなかった。 大フラグメントは、一般的に、クローニングベクター中
にきわめて結合しにくい。（注−実施例１、工程１６参
照。　ＳｆｉＩ　メチラーゼをクローン化し、特徴を明
らかにした後、ゲル精製した多量のライブラリーを用い
て２０　ｋｂ　ＢａｍＨｌ　フラグメントを成功裡に分
離した）。

【００２９】残る６種のクローニングエンドヌクレアー
ゼ（ＨｉｎＰｌ，　ＨｐａＩ，　ＮａｒＩ，　Ｓａｕ３
ＡＩ，　　ＴａｑＩ，　ＸｈｏＩ　（ＢｓｔＹＩ））は
　ＳｆｉＩ　染色体をあまりに小片に切断しすぎたため
、所期のメチラーゼ遺伝子を保有させることができなか
った。したがって、その染色体の部分消化物からライブ
ラリーを構築したが、　ＳｆｉＩ　メチラーゼクローン
は全く得られなかった。上に論じたように、また、実施
例１の工程１７−１８でさらに詳細に述べるように、こ
の部分消化物は、その一端近くに　ＳｆｉＩ　メチラー
ゼＤＮＡの５′末端を保有するフラグメントを生成しな
かったと考えられる。従って、そのようなプラスミドは
メチラーゼ選択において生き残ることはできなかった。

【００３０】一旦、　ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍクローンを入手
できたとしても、ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼ遺伝子
に関しては、エンドヌクレアーゼの発現はさらに非効率
的なものであった。他の多くのＲ−Ｍ系由来のメチラー
ゼクローンを、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイを用いて制限
エンドヌクレアーゼ活性についてスクリーニングするこ
とができる。通常、制限遺伝子が存在するならば、ｉｎ
　ｖｉｔｒｏ制限エンドヌクレアーゼ活性は検出できる
。

【００３１】逆に、エンドヌクレアーゼ活性は、　Ｓｆ
ｉＩ　メチラーゼクローンに関する上に引用したＥＰＯ
出願公開第　１９３，４１３号記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ
アッセイによっては検出されなかった。また、粗抽出物
のフォスフォセルロースカラム濃縮によっても、この陰
性結果は改善されなかった。このように制限酵素活性が
見られなかったことについて、最初は、制限遺伝子がメ
チラーゼ遺伝子に結合していないか、あるいは、結合し
ているがメチラーゼ遺伝子と無傷のままクローン化され
ていないか、あるいは、無傷でクローン化されてはいる
が発現していないか、のいずれかであることが示された
。

【００３２】上記三つの可能性のどれが実際の状況に当
てはまるのかを決定するために、クローン化した　Ｓｆ
ｉＩ　フラグメントについて制限マッピングを行い、さ
らに欠失解析を行い、メチラーゼ遺伝子がクローン化フ
ラグメント内のどこに位置するのかを決定した。次に、
このようにして得られた情報を用いて、このメチラーゼ
遺伝子のどちらか一方の側に、もしメチラーゼ遺伝子と
エンドヌクレアーゼ制限遺伝子が結合した場合、無傷の
エンドヌクレアーゼ制限遺伝子をコードするのに十分な
ＤＮＡがあるかどうかを決定した。

【００３３】ＢｃｌＩ　クローンの場合、右側には（約
　２　ｋｂ　）おそらく十分な余地があるが、左側の　
０．６　ｋｂ　は遺伝子をコードするには不十分と判断
された。従って、より多くのＤＮＡのクローニングを試
みて、制限エンドヌクレアーゼ活性の欠落は、制限遺伝
子がそのクローン内部に存在していないためであるとい
う可能性を調べた。 特に、メチラーゼ遺伝子の一部を　ＳｆｉＩ　染色体の
消化物をプローブするために用い、クローン化したメチ
ラーゼＤＮＡの境界部を越えて延びている領域のゲノム
マップを作成した。このデータから、Ｒ−Ｍ領域を個々
のフラグメントに切断するエンドヌクレアーゼ遺伝子が
いくつか特定された。このフラグメントはメチラーゼ遺
伝子およびそれよりも多量の隣接ＤＮＡを保有している
。このようなエンドヌクレアーゼによって生成されるフ
ラグメントの正確な大きさも、このデータから得られた
。もし制限遺伝子と修飾遺伝子が結合しているならば、
このようなフラグメントも制限遺伝子をコードしている
だろうと考えた。次に、フラグメントのクローン化を、
メチラーゼ遺伝子の両側に少なくとも　３−４　ｋｂ　
ＤＮＡがクローン化するまで続けた。フラグメントの一
端近くにメチラーゼ遺伝子の５′末端を持ち、かつメチ
ラーゼ遺伝子の３′末端から下流に付加的ＤＮＡを持つ
メチラーゼ遺伝子を保有するフラグメントは、ベクター
プロモーターと並んでクローニングベクター内に結合さ
れると、メチラーゼを発現できることが判明した。従っ
て、メチラーゼ選択によりこのようなフラグメントを分
離することができた。さらに、メチラーゼ遺伝子の５′
末端から下流に付加的ＤＮＡを持つメチラーゼ遺伝子を
保有するフラグメントは、クローニングベクター内に結
合されると、メチラーゼを発現できないことが分かった
。この種のフラグメントがメチラーゼを発現できなかっ
たのは、ベクタープロモーターがメチラーゼ遺伝子から
遠すぎて、発現を促進することができなかったためと考
えられる。実際、これらのフラグメントは、メチラーゼ
選択によって分離されなかった。代わりに、これらのフ
ラグメントは、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ブロットを用いる
と分離された。これは、　ＢｃｌＩ　クローン中のＤＮ
Ａ配列と同一のＤＮＡ配列を持つプラスミドを個別に同
定する方法である。

【００３４】４種の異なるメチラーゼ遺伝子含有クロー
ンの中で、メチラーゼ遺伝子のいずれか一方の側にある
少なくとも　３−４　ｋｂ　が一旦クローン化されると
、もしメチラーゼ遺伝子と制限遺伝子が結合しているな
らば、この４種の異なるメチラーゼクローンの少なくと
も１個に制限遺伝子が存在すると推定された。そのクロ
ーン各々について、　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアー
ゼ活性を測定した。活性が検出されなかったので、制限
遺伝子が　ＳｆｉＩ　メチラーゼ遺伝子に結合していな
いか、あるいは結合していてメチラーゼクローン中に存
在するが発現しないか、のいずれかであると推定された
。

【００３５】制限遺伝子はメチラーゼクローン中にある
が発現しないという可能性を求めて、さらに　ＳｆｉＩ
　メチラーゼクローンのスクリーニングを行い、　Ｓｆ
ｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子があるかどうか調
べてみた。Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　から　Ｓｆｉ
Ｉ　エンドヌクレアーゼの超純粋標本を調製し、エンド
ヌクレアーゼ蛋白質のアミノ末端のアミノ酸配列を決定
する必要があった。次に、このエンドヌクレアーゼのア
ミノ酸配列に対応するＤＮＡオリゴマーを合成した。次
に、このＤＮＡオリゴマーとのハイブリダイゼーション
について、メチラーゼクローンをスクリーニングした。 このようにして、制限遺伝子が４種の異なるメチラーゼ
クローンのうちの２種に存在することが判明した。従っ
て、制限遺伝子は、たとえクローン中にあっても、Ｅ．
　ｃｏｌｉ　中では発現しないのであった。

【００３６】ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
むクローンのＤＮＡ配列および詳細なマッピングデータ
を得、これに基づいて、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の発現レベルを増大する方法を考案した。

【００３７】本明細書に記載する方法は、　ＳｆｉＩ　
Ｒ−Ｍ系を好ましいやり方でクローン化し、発現する方
法であるが、これを図１および図２に示す。これはまた
次の工程を含む。

【００３８】１．Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　ＤＮＡ
を既知の方法を用いて精製する。

【００３９】２．このＤＮＡを、　ＢｃｌＩ　のような
制限エンドヌクレアーゼによって完全にまた部分的に消
化する。このエンドヌクレアーゼは、全　ＳｆｉＩ　メ
チラーゼ遺伝子を切断してフラグメントにするが、この
フラグメントは、その一端にまたはその近傍にメチラー
ゼ遺伝子の５′末端を保有している。このフラグメント
は約１．５−１３ｋｂであることが好ましい。

【００４０】３．　ＳｆｉＩ　部位を含むクローニング
ベクターを、ｐＵＣ１９，　ｐＢＲ３２２　およびｐＢ
Ｒ３２８から誘導して構築した。好ましいベクターは　
ｐＢＲ３２８　誘導体である。もっとも好ましいベクタ
ーは　ｐＥＶ３２８−８−６　誘導体であり、その構築
物を実施例１の工程３に記載する。

【００４１】４．工程２から得た消化ＤＮＡを、工程３
のクローニングベクターに結合する。それによって生じ
た混合物を用いて、適当な宿主の形質転換を行なう。こ
の宿主はＥ．　ｃｏｌｉ　株　ＲＲ１または　Ｋ８０２
　細胞が好ましい（それぞれ、ＡＴＣＣ　３１３４３お
よびＡＴＣＣ　３３５２６）。もっとも好ましい宿主細
胞は　ＲＲ１である。

【００４２】５．ＤＮＡ細胞混合物を、形質転換細胞を
選択する抗生物質添加培地上にプレーティングする。こ
の培地は、例えば、アンピシリンまたはクロラムフェニ
コールを含むものである。インキュベーション後、形質
転換細胞コロニーをプールし、一次細胞ライブラリーを
形成する。

【００４３】６．組み換えプラスミドを一次細胞ライブ
ラリーからまるごと精製し、一次プラスミドライブラリ
ーを作製する。

【００４４】７．非組み換えプラスミドの数を減らすた
めに、好ましくは、このライブラリーをアガロースゲル
で電気泳動し、クローニングベクター自身を越える大き
さのプラスミドのみを選んで、その後の分析に用いる。

【００４５】８．次に、ゲル精製したプラスミドライブ
ラリーを、　ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼによって
、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで完全に消化する。このエンドヌク
レアーゼは、　Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ細胞から調
製される。　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ消化に
よって、非修飾、メチラーゼ非含有クローンの選択的破
壊が起こり、その結果、　ＳｆｉＩ　メチラーゼ保有ク
ローンの相対的頻度が増加する。この消化物にエキソヌ
クレアーゼおよび／またはフォスファターゼを加えても
よく、これは、非メチラーゼクローンの破壊を強化する
ためである。

【００４６】９．　ＳｆｉＩ　メチラーゼクローンの同
定：消化されたプラスミドライブラリーＤＮＡを、再び
適当な宿主（例えば、Ｅ．　ｃｏｌｉ　株の　ＲＲ１ま
たはＫ８０２）に戻して形質転換を行ない、抗生物質添
加プレート上にプレーティングして再び形質転換コロニ
ーを得る。これらのコロニーを取り上げ、そのＤＮＡを
、次の様にして、ＳｆｉＩ修飾遺伝子の存在に関して分
析する。すなわち、プラスミドＤＮＡを精製し、ｉｎｖ
ｉｔｒｏで　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼと一緒
にインキュベートし、　ＳｆｉＩ　による消化に対する
抵抗性を確かめる。プラスミドＤＮＡは、この消化に対
して完全にもしくは実質的に抵抗性を持っていなければ
ならない。

【００４７】上に述べたように、前に引用したＥＰＯ出
願公開第　１９３，４１３号に記載した方法を用いて、
クローンの全細胞ＤＮＡ（染色体ＤＮＡおよび、プラス
ミド）も精製し、この方法のこの段階で、　ＳｆｉＩ　
制限エンドヌクレアーゼと一緒にインキュベートした。 しかしながら、Ｅ．　ｃｏｌｉ　染色体は、切断するに
はごく少数の　ＳｆｉＩ　部位しか含んでいないので、
通常のアガロースゲル上では検出できない。代わりに、
　ＳｆｉＩメチラーゼ遺伝子がクローン化されたことを
さらに証拠づけるには、挿入部を欠失し、残ったベクタ
ーについて無傷の　ＳｆｉＩ　部位の存在を分析し、ク
ローンからの細胞粗抽出物について　ＳｆｉＩ　メチラ
ーゼのｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性を測定する必要があった。 これは、後に、実施例１の工程１１に述べる通りである
。

【００４８】１０．メチラーゼ遺伝子がクローン化され
たことを確かめてから、クローンについて、　ＳｆｉＩ
　制限エンドヌクレアーゼ活性をアッセイする。もし活
性が検出されなければ、メチラーゼクローンをマップ化
し、欠失分析に掛け、クローン化されたフラグメント内
のメチラーゼ遺伝子の位置を決定する。Ｓ．　ｆｉｍｂ
ｒｉａｔｕｓ　染色体の、　ＳｆｉＩ　メチラーゼ領域
の制限マップが得られた。このマップから、　ＳｆｉＩ
　メチラーゼと、付加的なもっと大きいＤＮＡ片とを含
む制限フラグメントが同定された。 本発明に従えば、制限遺伝子とメチラーゼ遺伝子とは結
合していることが判明しているので、比較的大きいメチ
ラーゼ含有フラグメントは制限遺伝子もコードしている
筈である。

【００４９】１１．メチラーゼ遺伝子に富むライブラリ
ーは、工程１０に記載したＤＮＡフラグメントをゲル精
製し、それらを適当なベクター、例えば、　ｐＥＶ３２
８−８−６　（ｐＢＲ３２８　の誘導体で、その構築に
ついては実施例１、工程３に記載する）中に結合させて
、構築してもよい。メチラーゼ遺伝子の下流にＤＮＡを
保有するクローンは、メチラーゼ選択によって分離でき
る。上流にＤＮＡを保有するクローン、または両側にＤ
ＮＡを持つクローンは発現しないが、Ｇｒｕｎｓｔｅｉ
ｎ　ブロットを用いて分離できる（図４および５参照）
。

【００５０】１２．制限遺伝子クローンの同定：Ｓｆｉ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を保有するクローンは
、前に引用したＥＰＯ出願公開第　１９３，４１３号に
記載された細胞粗抽出物アッセイでは同定できなかった
。その理由はおそらく、Ｅ．　ｃｏｌｉ　中のＳｆｉＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現が低レベルだからであ
ろう。従って、　ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼをＳ．
　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　からできるだけ均質に近い状
態で精製し、最初の２０−４０個のアミノ酸配列を決定
する。この配列情報から、縮重オリゴマーＤＮＡプロー
ブを設計し、放射性標識を行なう。同時に、制限エンド
ヌクレアーゼ蛋白質の大きさを蛋白質ゲルで定量したと
ころ、約　３２ｋＤであった。これは、エンドヌクレア
ーゼ遺伝子をコードするのに必要なＤＮＡ量が　Ｓｆｉ
Ｉ　については約　１　ｋｂ　であることを示す。Ｓｆ
ｉＩ　制限エンドヌクレアーゼを保有するクローンは、
制限遺伝子ＤＮＡプローブとハイブリダイズし、ハイブ
リダイゼーション位置に隣接する少なくとも　１　ｋｂ
　のＤＮＡを保有するものと同定された。好ましくは、
ハイブリダイゼーション位置の両側に隣接して少なくと
も　１　ｋｂ　のＤＮＡがあるのがよい。ハイブリダイ
ゼーション位置のＤＮＡ配列が決定されれば、制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子の、ハイブリダイゼーション位置
に対する相対的位置を決めることができよう。

【００５１】１３．過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ）：制限遺伝子を含むクローンは、多数ある技術
の内いずれを用いても過剰発現させることができる。こ
れについては、実施例２にさらに詳しく述べる通りであ
る。　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を最大
に発現させるには、これらの技術を個々に用いてもよい
し、あるいは併用してもよい。

【００５２】例えば、Ｅ．　ｃｏｌｉ　によって確実に
認識される、ラムダ　ｐＬ　のようなプロモーターを、
　ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点のすぐ
上流に挿入する。この組み込みは、適切な制限エンドヌ
クレアーゼを用いて行なってもよい。好ましくは、この
制限遺伝子は、プロモーターに、約　０．５　ｋｂ　よ
りも接近しているのがよい。

【００５３】ＳｆｉＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現
を増大させる第二の方法は、その遺伝子の上流に強力な
リボソーム結合部位を挿入することを含む（Ｓｈｉｎｅ
　とＤａｌｇａｒｎｏ，１９７４，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａ
ｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７１，　１３
４２−１３４６）。この開示内容を参照として本明細書
に取り入れるものとする。

【００５４】ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼ遺伝子の発
現を増大する第三の方法は、部位特異的突然変異誘発に
よって、または、Ｅ．　ｃｏｌｉ　中でより効率的に利
用できるようなコドンを使えるように遺伝子そのものを
再合成することによって、その遺伝子のＤＮＡ配列を変
えることを含む。

【００５５】ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼ遺伝子の発
現はまた、ポリメラーゼ連鎖反応や、この遺伝子の５′
および３′の両末端にハイブリダイズさせた合成プライ
マーを用いて増幅させることもできる。

【００５６】１４．生産：　ＳｆｉＩ　メチラーゼまた
はエンドヌクレアーゼは、適当な培地を含む発酵槽中で
増殖させることにより、　ＳｆｉＩ　修飾遺伝子および
過剰発現の制限遺伝子を保有するクローンから生産して
もよい。その後、遠心分離によって細胞を回収し、超音
波処理によってこれを破壊して、　ＳｆｉＩ　メチラー
ゼおよび制限エンドヌクレアーゼ活性を含む細胞粗抽出
物を生産する。

【００５７】１５．精製：　ＳｆｉＩ　メチラーゼおよ
びエンドヌクレアーゼを含む細胞粗抽出物を、既知の蛋
白質精製技術によって精製する。この精製技術としては
、例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたはイ
オン交換クロマトグラフィーがある。

【００５８】上述した概略工程は、本発明を実施するに
あたって、好ましい方法を表わしたものではあるが、当
業者にとっては、前述の方法はこの分野で既知の技術に
従って変更することができることは明白であろう。

【００５９】下記の実施例は、本発明を実施するにあた
り現在好ましいとされる実施態様を説明するために挙げ
たものである。この実施例はあくまでも例示であって、
本発明は、添付のクレームに示した場合を除き、この実
施例に限定されるものではない。

【００６０】

【実施例】

実施例　　１　　ＳｆｉＩ修飾メチラーゼ遺伝子および
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング １．ＤＮＡ精製：ライソゾームをトリトンＸ−１００で
溶解し、その後にフェノール／クロロホルム抽出と透析
を行なうことにより、少量のＳ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕ
ｓ　ＤＮＡを得た。Ｓｆｉ　細胞は、Ｒ−Ｍ系を保有す
る他の多くの細菌細胞よりも溶解するのが難しいことが
分かった。溶解に対する抵抗性は、他のＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ菌株や近縁のＮｏｒｃａｄｉａ菌株、例えば
、ＮａｅＩ，　ＮｃｏＩ，　ＮａｒＩに共通の性質のよ
うである。ライソゾーム処理中に、細胞の溶解を促進す
るために、凍結−解凍操作を加えると、大量のＤＮＡが
生成されるが、回収率は比較的低かった。しかし、この
ＤＮＡを用いて、ライブラリーを構築することができた
。

【００６１】Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　ＤＮＡを分
離するのにもっと好ましい方法は、以下に述べるもので
ある。　２．５ｇの細胞ペーストを、０．１Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，　０．１　Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　７．６の
１０ｍｌ中に再懸濁した。この懸濁液を乳鉢に移し、乳
棒で穏やかに混合すると、ＤＮＡ収量は大きく向上した
。 この懸濁液を、　５．０ｍｌずつ２つに分けた。これら
の各々に、０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　０．１　
Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　７．６　にライソゾームを　１．
７ｍｇ／ｍｌの割合で溶かした溶液　７．０ｍｌを加え
、各々３７℃で９０分間インキュベートし、さらに、４
℃で一晩インキュベートした。ＳＤＳを加え、最終濃度
１％にし、プロテイナーゼＫを０．１３　ｍｇ／ｍｌに
なるように加え、さらに各々を３７℃で２２分間インキ
ュベートした。１０％ＳＤＳと８％ザルコシルの溶液　
０．８ｍｌを各々に加え、インキュベーションを５５℃
で４２分間継続して行った。次に、二つの部分を一緒に
し、２４時間にＤＮＡバッファー（１０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　８．０）を
４回変えて透析した。透析したＤＮＡ液の全容量をＤＮ
Ａバッファーで８０ｍｌに増して、塩化セシウム−臭化
エチヂウム平衡密度勾配遠心用に調製し、このＤＮＡ溶
液を２０ｍｌずつ４つに分け、その各々に塩化セシウム
２０グラムと５　ｍｇ／ｍｌ臭化エチヂウムの　０．２
ｍｌを加えた。 このＤＮＡ溶液を、　４４，０００　ｒｐｍ　で４８時
間遠心し、それによって生じたＤＮＡバンドを、等量の
氷冷した水飽和Ｎ−ブタノールで４回抽出して取り出し
た。塩化セシウムは透析で除去した。次に、　０．５Ｍ
となるまで　ＮａＣｌ　を加え、最上部に　０．５５　
容量のイソプロピルアルコールを重層して、このＤＮＡ
を沈澱させた。沈澱したＤＮＡをガラス棒に巻き付けた
。このＤＮＡを３　ｍｌの　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　
１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ　８）　に最終濃度約　１７
００　ｇ／ｍｌになるよう溶解した。

【００６２】工程２−１０に関する注記：前述したよう
に、全部で１６種の異なるエンドヌクレアーゼの各々を
用いて、Ｓｆｉ　染色体を消化し、５４個のライブラリ
ーを構築しスクリーニングした。メチラーゼ遺伝子は、
ＢｃｌＩライブラリーを除いては、いずれの場合も選択
において生き残るほど十分な発現を示さなかったので、
ＢｃｌＩライブラリーの詳細についてのみ述べることに
する。

【００６３】２．完全および部分消化：精製ＤＮＡを、
次のようにして、　ＢｃｌＩ　エンドヌクレアーゼによ
って切断した。１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　７．５，
　１０　ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　，　５０　ｍＭ　ＮａＣ
ｌ，１０　ｍＭ　メルカプトエタノールのバッファーに
１７００μｇ／ｍｌの割合で溶かしたＤＮＡ液２１μｌ
　を、１００　μｌ　アリコート１個、５０μｌ　アリ
コート５個に分注した。１００　μｌ　試験管に１０単
位のＢｃｌＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，　Ｂｅｖｅｒｌｙ，　Ｍａｓｓ
ａｃｈｕｓｅｔｔｓ　）を加え、ＤＮＡ　１μｇ　あた
り酵素１単位となるようにした。第１の試験管から５０
μｌ　を抜取り、第２の試験管に移し入れ、ＤＮＡ　１
μｇ　あたり　ＢｃｌＩ　０．５単位となるようにした
。 以下、同じ工程に従って、後続の試験管の各々に、直前
の試験管の　ＢｃｌＩ　含有量の半分を加える。これら
の試験管を３７℃で１時間インキュベートし、次に、７
２℃で１５分間熱処理し、それぞれから１５μｌ　を取
り、これをアガロースゲル電気泳動によって分析した。 中程度で、不完全な消化を示す試験管を、クローニング
用の部分消化フラグメントのソースとして選び、完全に
消化されたＤＮＡは、別に、一緒に混ぜ合わせた。（部
分消化試験管は０．２５　ｕ／μｇ，　０．１２　ｕ／
μｇ，　０．０６　ｕ／μｇ　および　０．０３　ｕ／
μｇ　の試験管であり、一方、１．０　ｕ／μｇ　およ
び　０．５　ｕ／μｇ　が完全消化試験管であった。こ
れらの溶液を互いに混ぜ合わせ、下記の工程４に記載す
るやり方に従って用いた。）３．　ｐＥＶ３２８−８−
６　の構築：　ｐＢＲ３２８　ＤＮＡ（ＡＴＣＣ　３７
５１７）を、　ＳｓｐＩ　エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，　Ｂｅｖｅｒｌｙ
，　　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、部分的
に消化した。この消化を、ＳｓｐＩバッファー（１００
　ｍＭ　ＮａＣｌ，　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　
ｐＨ７．５，　１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　，　１０　ｍ
Ｍ　ベータ−メルカプトエタノール）に溶解した８０μ
ｇ／ｍｌのｐＢＲ３２８セシウム精製ＤＮＡ　１００μ
ｌ　を調製して行なった。６単位のＳｓｐＩエンドヌク
レアーゼを加え、その混合物を直ちに３７℃に置いた。 ３７℃で、１．５、２．５、３．５、４．５、５．５お
よび６．５分後に１５μｌ　のアリコートを取出した。 　ＳｓｐＩ　消化物を直ちに７２℃で１５分間加熱する
ことにより分解を停止させた。各アリコートからの　１
０　μｌ　をアガロースゲル電気泳動によって分析した
。直線状ＤＮＡの最大量および未切断、超螺旋状のＤＮ
Ａの最小量を示したものは、　４．５分および　５．５
分のサンプルであった。これらの試験管を次の工程、す
なわち　ＳｆｉＩ　リンカーの　ｐＢＲ３２８　への挿
入のために選んだ。　０．６μｇ　のＳｓｐＩ部分消化
　ｐＢＲ３２８　ＤＮＡ（４．５　分試験管から　５μ
ｌ，　５．５分試験管から　２．５μｌ　）、９μｌ　
の蒸留水、２μｌ　の１０Ｘ結合バッファー（下記の工
程４参照）、１．５　μｌ　の　４００ｕ／μｌ　Ｔ４
　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａｂｓ，　Ｂｅｖｅｒｌｙ，　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ
ｔｓ）　、４μｌ　の、リン酸化していない　２００μ
ｇ／ｍｌ　ＳｆｉＩ　リンカー（ＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧ
ＧＣＣ　とＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣ）を一緒に混合
し、室温で一晩インキュベートした。　５μｌ　を　Ｅ
．　ｃｏｌｉＲＲＩ細胞に形質転換し、クロラムフェニ
コールプレート上にプレーティングした（下記の工程４
参照）。１４個の生存細胞のＤＮＡを、ミニプレパレー
ション法によって分析した（下記の工程９参照）。３個
の生存細胞において、ＳｆｉＩリンカーが　ｐＢＲ３２
８　の最初の　ＳｓｐＩ　部位に挿入されていることが
判明し、この細胞を　ｐＥＶ３２８−８　と命名した。

【００６４】ｐＥＶ３２８−８の　ＥｃｏＲＶ部位に第
二のリンカーを挿入するために、２０単位のＥｃｏＲＶ
　エンドヌクレアーゼを含む　ＥｃｏＲＶバッファー（
１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ　ｐＨ８．０，　６　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　，　６　ｍ
Ｍベータ−メルカプトエタノール）中の８０μｇ／ｍｌ
　ｐＥＶ３２８−８　５０μｌ　を３７℃で２時間イン
キュベートした。　０．６μｇ　の完全に消化されたＤ
ＮＡを、前記のように、０．８　μｇ　のリンカーと結
合させた。調べた８個の形質転換体のうち６個が、　ｐ
ＥＶ３２８−８　のＥｃｏＲＶ部位にリンカーを含んで
いることが判明し、これを　ｐＥＶ３２８−８−６　と
命名した。ｐＥＶ３２８−８−６の１サンプルは、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ　に　ＡＴＣＣ　手得番号第　６３２１７号で寄
託されている。

【００６５】４．結合：工程２から得たＤＮＡフラグメ
ントを、次のようにしてｐＥＶ３２８−８−６に結合し
た。ＢｃｌＩで完全に消化したＳ．　ｆｉｍｂｒｉａｔ
ｕｓ　ＤＮＡ（６０μｌ　）　６μｇ　と、ＢｃｌＩ　
で部分的に消化したＳ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　ＤＮ
Ａ（６０μｌ　）　６μｇ　とをそれぞれＢａｍＨＩ　
で切断し、脱リン酸化した３．０　μｇ　の　ｐＥＶ３
２８−８−６　（７．５μｌ）と混合した。２０μｌ　
の１０Ｘ結合用混合液（５００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　ｐ
Ｈ　７．５，　１００　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　，　１００
　ｍＭ　　ＤＴＴ，　５ｍＭ　ＡＴＰ）を加え、さらに
　１１０．５μｌ　の滅菌蒸留水を加え、最終容量を　
１９８μｌ　とした。１．８７５　μｌ　の濃厚な　Ｔ
４　ＤＮＡ　リガーゼ（２×１０６　ｕ／ｍｌ）　を加
え、混合液を１６℃で４時間インキュベートし、次いで
、１０μｌ　のクロロホルムを加えて滅菌した。 結合ＤＮＡ約　１２５μｌ　を用いて、次のようにして
、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＲＲ１株の形質転換を行なった。こ
のＤＮＡを　１．０　ｍｌ　のＳＳＣ／ＣａＣｌ２　（
５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　５　ｍＭクエン酸ナトリウム
、６７　ｍＭ　ＣａＣｌ２　）と氷上で混合し、氷冷Ｅ
．　ｃｏｌｉ　ＲＲ１のコンピテント細胞（ｈｓｄ　Ｒ
−　Ｍ−　，　ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　３１３４３）　２．
０　ｍｌを添加した。４２℃で５分間インキュベートし
た後、細胞にルリア−ブロス（Ｌ−ブロス）を８ｍｌ加
えて希釈し、次いで、これを３７℃で１時間インキュベ
ートした。

【００６６】５．一次細胞ライブラリー：形質転換を行
なった細胞培養物を簡単に遠心し、上清を捨て、細胞を
　１．０　ｍｌ　のＬ−ブロス中に再懸濁した。２００
　μｌ　ずつの分液を、１００　μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むルリア−アガ−（Ｌ−アガ−）プレートにプ
レーティングし、３７℃で一晩インキュベーションした
後、これらのプレートをそれぞれ、１０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ，　ｐＨ　７．５，　１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　の　
２．５　ｍｌ　で浸潤させ、形質転換を行なったコロニ
ーを一つにかき集めて、これを一次細胞ライブラリーと
した。

【００６７】６．一次プラスミドライブラリー：一次プ
ラスミドライブラリーの調製は以下のようにして行なっ
た。２．５　ｍｌの一次細胞ライブラリーを、１００　
μｇ／ｍｌアンピシリンを含む、５００　ｍｌのＬ−ブ
ロス中に接種した。 この培養物を３７℃で一晩振盪し、次に　４０００　ｒ
ｐｍ　で５分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを
２５％スクロース、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　ｐＨ　８
．０　１０　ｍｌ中に再懸濁した。０．２５Ｍ　ＥＤＴ
Ａ，　ｐＨ　８．０　５ｍｌを加え、その後、０．２５
　Ｍ　Ｔｒｉｓ，　ｐＨ　８．０　に　１０　ｍｇ／ｍ
ｌ　で溶解したライソゾーム３　ｍｌを加えた。この溶
液を氷上に３時間放置し、この中に溶解用混合液（１％
　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ，
　ｐＨ　８．０，　６７　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）　１２　
ｍｌを強制的にピペット注入し、細胞懸濁液を穏やかに
撹拌し、完全に溶解した。

【００６８】溶解後、混合液を５０　ｍｌ　のプラスチ
ック製遠心管に移し、　１７０００　ｒｐｍ，　４℃で
、４５分間遠心した。上清をピペットで取出した。２０
．０　ｇｍ　の固体　ＣｓＣｌ　を秤量し、５０　ｍｌ
　のねじ込みキャップ付きプラスチック管に投じ、２２
．０　ｇｍ　の上清をこの試験管にピペットで注入し、
混合した。臭化エチジウム液（１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
，　ｐＨ８．０，　１ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１００　ｍＭ
　ＮａＣｌ中に、臭化エチジウムを　５　ｍｇ／ｍｌの
割合で溶解したもの）１．０　ｍｌをこの混合液に加え
た。この溶液を、２個の、５／８インチ×３インチのポ
リアロマー製遠心管に移し、密閉した。次ぎにこれらの
管を、ＢｅｃｋｍａｎＴｉ７０ローターで、４４０００
　ｒｐｍ，１７℃で４２時間遠心した。プラスミドを回
収するために、この管の頂上をメスで貫き、２つの蛍光
性ＤＮＡバンドのうち低い方のバンドを紫外線下で注射
器を使って回収した。両方の管の、低い方のバンドをま
とめて、ねじ込みふた付きガラス管に投じ、臭化エチジ
ウムを等量の水飽和氷冷Ｎ−ブタノールで４回抽出する
ことによって除去した。

【００６９】抽出液を透析チューブに移し、ＤＮＡバッ
ファーを４回変えて、２４時間透析した。次に、透析し
たＤＮＡ溶液をあらかじめ秤量しておいた　５０　ｍｌ
の滅菌遠心管に移し、その容量を測定した。５　Ｍ　Ｎ
ａＣｌを最終濃度が　０．４　Ｍになるように加え、次
に２倍容量のイソプロパノールを加えて、混合した。こ
の溶液を−２０℃で一晩保存し、ＤＮＡを沈澱させた。 沈澱後、溶液を　１５０００　ｒｐｍ，　０℃で１５分
間遠心し、上清を捨てた。この管を実験台に放置し、１
５分間空気乾燥し、次にＤＮＡペレットを　５００μｌ
　のＤＮＡバッファーに溶解し、−２０℃で保存した。 このようにして調製したプラスミドのＤＮＡ濃度は、１
００−２００　μｇ／ｍｌであった。

【００７０】７．工程６で得たプラスミドライブラリー
　１０８μｌ　（１００μｇ）　を、０．０１％　ＳＤ
Ｓ　を含む　１％アガロースゲル中で４時間電気泳動し
た。長波長ＵＶを用いてゲルを視覚化し、親ベクターよ
りも移動の遅いプラスミド（例えば、−２．８　ｋｂマ
ーカー（この位置を　ｐＥＶ３２８−８−６　超螺旋状
プラスミドが移動する）の上部にあるものはすべて）を
ゲルから切断し、清潔なカミソリの刃を用いて細かく切
り刻んだ。この混合液を、２２ゲージ注射器によって、
０．０１％　ＳＤＳ　を含む５　ｍｌの１×アガロース
ゲルバッファー中に強制注入し、１７０００　ｒｐｍ　
で４５分間遠心した。０．５　ｍｌの　５Ｍ　ＮａＣｌ
と　１．１　ｍｌ　のイソプロパノールを加え、−２０
℃で一晩かけてこの上清を沈澱させた。このＤＮＡを１
５０００　ｒｐｍ　で１５分間遠心し、ペレット化した
。このペレットを、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　８，
　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　５００μｌ　に再懸濁し、フェ
ノール／クロロホルム抽出し、クロロホルム抽出を３回
行い、４８μｌ　の　５Ｍ　ＮａＣｌと１１００μｌ　
のイソプロパノールを加え、再び−２０℃で３時間かけ
て沈澱させた。このペレットを７０％イソプロパノール
ですすぎ、空気乾燥し、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８
，　１ｍＭ　ＥＤＴＡの最終容量１００μｌ　中に再懸
濁した。

【００７１】８．プラスミドプールの消化：ゲル精製し
た一次プラスミドプールを下記にしたがって消化し、非
　ＳｆｉＩ　メチラーゼクローンを破壊した。プラスミ
ドＤＮＡを、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　８．０，　１
０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　，　１０　ｍＭ　メルカプトエ
タノール、５０　ｍＭ　ＮａＣｌに溶解して、５０μｇ
／ｍｌまで希釈した。総計　１２０μｌ　を調製した。 ８　ｕ／μｇ　のＳｆｉＩを加え、その混合液を５０℃
で２時間インキュベートした。

【００７２】９．形質転換：各試験管から１２．５μｌ
　のサンプルを取り、これをＥ．　ｃｏｌｉ　ＲＲ１を
形質転換するのに用いた。３分間加熱し、ルリア−ブロ
ス中で３７℃で４５分間増殖した後、この細胞／ＤＮＡ
混合液を、２００　μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを
含むＬ−アガ−プレートにプレーティングした。３７℃
で一晩インキュベーションした後、プレートを調べた。 　ＳｆｉＩ　を含むプラスミドライブラリーの消化によ
って、形質転換体の数は約１０３　のファクターまで減
少することが判明した。コロニーを個別にプレートから
取り上げた。各コロニーを、ミニ培養物を調製するため
に、クロラムフェニコールを含むＬ−ブロス　１０　ｍ
ｌに接種した。また、クロラムフェニコールを含むＬ−
アガ−レート上に線条接種した。これは、マスター保存
液を調製するためである。

【００７３】１０．生存個体の分析：工程９で得た生存
コロニーのうち１０個を、１０　ｍｌ　培養液中で増殖
し、それらのコロニーが保有するプラスミドを、下記の
ミニプレパレーション精製法によって調製した。この精
製法はＢｉｒｎｂｏｉｎと　Ｄｏｌｙ　の方法に習った
ものである（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　
７：　１５１３　（１９７９）　）。

【００７４】ミニプレパレーション法：各培養物を　８
０００　ｒｐｍ　で５分間遠心し、上清を捨て、細胞ペ
レットを、１ｍｇ／ｍｌライソゾームを含む　２５　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ，　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　５０　ｍＭ
グルコース、ｐＨ　８．０中に再懸濁した。室温で１０
分放置後、各試験管に、０．２Ｍ　ＮａＯＨ，１％　Ｓ
ＤＳの　２．０　ｍｌ　を加え、試験管を振盪して細胞
を溶解し、氷上に置いた。一旦溶液を澄明にした後、１
．５　ｍｌの　３Ｍ　酢酸ナトリウム、ｐＨ　４．８を
各試験管に加え、振とうした。ここに形成された沈澱を
、　１５０００　ｒｐｍ，　４℃で、１０分間遠心分離
した。各上清を３　ｍｌのイソプロパノールを含む遠心
管に注ぎ、混合した。室温で１０分間放置後、各管を再
び　１５０００　ｒｐｍで１０分管遠心し、沈澱した核
酸のペレットを得た。上清を捨て、ペレットを室温で３
０分間空気乾燥した。

【００７５】一旦乾燥したら、そのペレットを、１０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０　　
８５０μｌ　に再懸濁した。７５μｌ　の　５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌを各懸濁液に加え、その溶液を、　５７５μｌ　の
イソプロパノールを含むエッペンドルフ管に移し、再び
１０分間室温で沈澱させた。次に、この管を微小遠心器
で４５秒管遠心し、上清を捨て、ペレットを空気乾燥し
た。次にペレットを　１００μｇ／ｍｌの　ＲＮａｓｅ
を含む　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ
，　ｐＨ８．０　　５００μｌ　に溶解し、３７℃で１
時間インキュベートし、ＲＮＡを消化した。５０μｌ　
の　５　Ｍ　ＮａＣｌ　を加え、さらにその後　３５０
μｌ　のイソプロパノールを加えて、ＤＮＡをもう一度
沈澱させた。室温で１０分間放置後、ＤＮＡを４５秒間
遠心し、上清を捨て、ペレットを、　１５０μｌ　の１
０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　ｐＨ　
８．０　最終溶液に再び溶かした。次いで、プラスミド
ミニプレパレーションを　ＳｆｉＩ　で消化して分析し
た。

【００７６】１１．メチラーゼ遺伝子クローン（ｐＥＶ
１２３ＲＭ６１２−１６と命名）。９個のプラスミドが
　ＳｆｉＩ　に抵抗性を示し、３．９ｋｂ　ＢｃｌＩ　
フラグメントを保有していることが判明した（図３参照
）。いずれの場合も、フラグメントは、プラスミドのテ
トラサイクリン耐性遺伝子プロモーターに関して同一方
向にあった。次ぎに、これら９個のプラスミドは　Ｓｆ
ｉＩ　修飾メチラーゼ遺伝子を保有することが分かった
。これは次のようにして証明された。すなわち、以下に
示すように、　ＢｃｌＩ　挿入物を欠失し、残余のベク
ターに、無傷の切断可能な　ＳｆｉＩ　部位があるかど
うかチェックすることによって、さらにはまた、Ｅ．　
ｃｏｌｉ　から調製した抽出物について、　ｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ　で修飾メチラーゼアッセイを実施することによ
って、確かめた。 但し、このＥ．　ｃｏｌｉ　中には、形質転換によって
プラスミドを移入した。

【００７７】テストするクローンの　５００　ｍｌ　培
養液を、１００　μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブ
ロス中で、３７℃で一晩増殖させ、この細胞を、４００
０　ｒｐｍで、５分間遠心してペレットにした。上清は
捨て、ペレットを　７．５　ｍｌ　の超音波処理用バッ
ファー（２０ｍＭ　　Ｋ３　ＰＯ４　　ｐＨ　７．４，
　１０　ｍＭベータ−メルカプトエタノール）に再懸濁
した。 一旦再懸濁したら、細胞を１５秒間ずつ３回超音波処理
して、細胞を破砕した。超音波処理細胞を１０，０００
　ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を細胞抽出物として用
いた。この抽出物を、下記のように、１　ｍｌのフォス
フォセルロースカラムで、４℃で精製した。すなわち、
０．４　ｍｌの　２Ｍ　ＫＣｌ　を抽出物に加え、最終
濃度が０．１Ｍ　ＫＣｌとなるようにした。カラムは、
３−４　ｍｌの０．１Ｍ　ＫＣｌ，　２０ｍＭ　Ｋ３　
ＰＯ４　　ｐＨ　７．４，　１０ｍＭ　ベータ−メルカ
プトエタノール、５％グリセロールで平衡化させた。抽
出物をこのカラムにロードし、溶出液を５滴ずつの画分
として収集した。カラムを３．５　ｍｌの前記バッファ
ーで洗浄し、次いで、０．３Ｍ濃度の　ＫＣｌを含む前
記バッファー３．５ｍｌで、さらに０．５Ｍ濃度の　Ｋ
Ｃｌを含む前記バッファーで、最後に、０．７Ｍ濃度の
　ＫＣｌを含む前記バッファーで、洗浄した。各５滴画
分の電気伝導度を記録し、どの画分がＫＣｌ濃度の最初
の増加を含むものかを決めた。これらの試験管について
、下記のようにして、メチラーゼ活性をアッセイした。 １μｌ　のカラム画分を、メチラーゼバッファー（５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５，　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ
，　５ｍＭベータ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ
　Ｓ−アデノシルメチオニン）に　Ｔ４　ＤＮＡ　を　
５０　μｇ／ｍｌの割合で溶かした溶液５０μｌ　に加
えた。３７℃で１時間放置後、下記の混合物の５０μｌ
　を、各試験管に加えた。その混合物の成分は、５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ，　ｐＨ　８．０，　４０ｍＭ　ＭｇＣｌ
２　，５ｍＭ　ベータ−メルカプトエタノール、８０　
ｕｎｉｔｓ／ｍｌの　ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼ、
１００ｍＭ　ＮａＣｌである。それぞれ　１００μｌ　
を含む試験管を、５０℃で１時間インキュベートした。 各試験管から２５μｌ　のサンプルを取り、これをゲル
電気泳動によって分析した。０．３Ｍと　０．５Ｍ　Ｋ
Ｃｌ　を含む試験管は、１ｍｌ当り約　２５００　単位
の力価に相当するメチラーゼ活性を含んでいることが分
かった。これは湿潤細胞ペースト１グラム当り約　６０
００　単位のＳｆｉＩ　メチラーゼに相当する。（図６
参照）。

【００７８】１２．この抽出物についてさらに制限エン
ドヌクレアーゼ活性もアッセイした。それには、各カラ
ム画分　１μｌ　に、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，　
５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　，１０ｍ
Ｍベータ−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌ　Ｔ
４　ＤＮＡ　の３５μｌ　を加え、これを５０℃で１時
間インキュベートした。２５μｌ　のサンプルを電気泳
動で分析したが、制限エンドヌクレアーゼ活性の証拠は
見られなかった。

【００７９】１３．３．９　ｋｂ　ＢｃｌＩ　挿入物内
のメチラーゼ遺伝子の位置：　ＳｆｉＩ　メチラーゼク
ローンを多数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、クロ
ーン化ＤＮＡの制限マップを得た。このマップを用い、
挿入物内の様々の領域を欠失して、その結果がメチル化
にどのような影響を及ぼすかを測定した。次ぎに、３．
９　ｋｂ挿入物内の約１ｋｂメチラーゼ遺伝子の位置を
決め、さらにこの遺伝子のいずれか一方の側のクローン
化ＤＮＡの長さが約　０．６　ｋｂ　と約　２　ｋｂ　
であることを明らかにした。メチラーゼクローンは、メ
チラーゼ遺伝子の左側には結合した制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡ（０．６　ｋ
ｂ）を含んでおらず、またその右側にも十分なＤＮＡ（
約　２　ｋｂ　）を恐らく含んではいないようであった
。というのは、この２遺伝子間の距離、これら遺伝子の
正確な大きさ、および両遺伝子が結合しているのか否か
が不明だからである（図４参照）。このクローンに　Ｓ
ｆｉＩ　エンドヌクレアーゼ活性が見られないことから
、制限遺伝子はクローン中に存在しないか、または存在
はしているが発現しないか、のどちらかであることが明
らかとなった。制限遺伝子が存在しているが、発現しな
い場合、メチラーゼクローンのＤＮＡ配列および蛋白質
配列決定を行い、クローン中に制限遺伝子の一部がある
のか、全部があるのか、全部が無いのかを決定した。こ
れを、工程１９−２１に記載するやり方に従って行なっ
た。制限遺伝子全部が無い場合、メチラーゼ遺伝子に隣
接するＤＮＡの大領域のクローニングを、工程１４−１
８に記載するやり方に従って実施した。

【００８０】１４．隣接領域のゲノムマップを、メチラ
ーゼクローンの一部をプローブとして用い、Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎブロット技術によって決定した（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ，　Ｅ．，　１９７５，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ
．，　９８：５０３　）。プローブには特に、あらかじ
めゲル精製し、アルファ３２Ｐ−ＡＴＰ　でニックトラ
ンスレーションした約　１．７　ｋｂ　ＢａｍＨＩ−Ｋ
ｐｎＩフラグメントを用いた。ゲル精製は、工程７に記
載してある。ゲル精製プローブのニックトランスレーシ
ョンは次のようにして行なった。５μｌ　（０．５μｇ
）のＤＮＡ，　１．５μｌ　のバッファー（５００ｍＭ
　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　７．５，　１０ｍＭ　ベータ−メル
カプトエタノール、　５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　），　１
μｌ　のＧＴＣ　（５００　ｐｍｏｌｅｓ／μｌ），　
５　μｌ　のアルファ−３２Ｐ−ｄＡＴＰ−（１００　
ｐｍｏｌｅｓ，　８００キュリー／ミリモル）、２　μ
ｌ　のＤＮＡポリメラーゼＩ（２０単位）および１　μ
ｌ　のＤＮａｓｅ　Ｉ（１　μｇ／ｍｌ）を混合し、１
６℃で２時間インキュベートした。次にこの混合物を１
０分間煮沸し、その直後に氷上に置いた。

【００８１】Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ブロットの調製は次の
ようにして行なった。Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　Ｄ
ＮＡを別々に次の制限エンドヌクレアーゼによって消化
した。その制限エンドヌクレアーゼとは、ＡｓｅＩ，　
ＢａｍＨＩ，　ＢｃｌＩ，　ＣｌａＩ，　ＤｒａＩ，　
ＥｃｏＲＩ，　ＥｃｏＲＶ，　ＮｃｏＩ，　ＮｄｅＩ，
　ＮｈｅＩ，　ＮｏｔＩ，　ＰｓｔＩ，　ＰｖｕＩＩ，
　ＳａｌＩ，　ＳｃａＩ，　ＳｍａＩ，　ＳｐｅＩ，　
ＳｐｈＩ，　ＸｈｏＩである。消化物を１．０％アガロ
ースゲル上で電気泳動した。このゲルを、０．２５Ｍ　
ＨＣｌ　に１０分間、０．４Ｍ　ＮａＯＨ，　０．８Ｍ
　ＮａＣｌに３０分間、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　
ｐＨ　７．５，　１．５Ｍ　ＮａＣｌ　に３０分間、浸
潤した。ニトロセルロース紙を短時間水に浸し、次に　
５×ＳＳＣ　（０．７５ＭＮａＣｌ，　７５ｍＭクエン
酸ナトリウム）に浸した。このゲルを、３００　ｍｌの
２０×ＳＳＣ　（３ＭＮａＣｌ，　０．３Ｍ　クエン酸
ナトリウム）に浸したクロマトグラフィー紙（Ｗｈａｔ
ｍａｎ）　の１／２インチ厚積層の最上部に置いた。 この時、バッファーの水位を、積層紙の高さのすぐ下に
来るようにした。ニトロセルロース紙をゲルの最上部に
置き、クロマトグラフィー紙（Ｗｈａｔｍａｎ）　を重
ね吸い取り紙として作用するようにした。このサンドイ
ッチに重石をかけ、室温で一晩放置して、ゲル内容物が
ニトロセルロース紙に移動するようにした。次に、この
ニトロセルロース紙を、　１×ＳＳＣ　中で１０分間す
すぎ、真空オーブン中で、８０℃で１．５　時間乾燥し
、ニトロセルロースに移動したＤＮＡフラグメントを固
定した。この紙を、次の組成を持つ溶液１５ｍｌを含む
プラスチック製袋に移した。その溶液組成は、３　ｍｌ
の　１０　ｇ／ｌ　Ｆｉｃｏｌｌ，１０　ｇ／ｌポリビ
ニルピロリドン、１０　ｇ／ｌ牛血清アルブミン、　４
．５　ｍｌ　の２０×ＳＳＣ　、１．５　ｍｌの　１０
％　ＳＤＳ，　３　ｍｌの硫酸デキストラン、３　ｍｌ
の水である。次いで、振とうしながら６５℃で３時間イ
ンキュベートしてハイブリダイゼーション前処理を行っ
た。７　μｌ　の放射性標識プローブを袋に加え、６５
℃で振盪しながら一晩インキュベーションを続けた。次
ぎに、ニトロセルロース紙を、０．３Ｍ　ＮａＣｌ，　
３０ｍＭ　クエン酸ナトリウムにより、室温で５分間ず
つ３回洗浄した。また、０．５％　ＳＤＳを含む同じバ
ッファーを用いて、６５℃で２０分間の洗浄を１回行な
った。次にこの紙を空気乾燥し、一晩オートラジオグラ
フィー処理をした。

【００８２】Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロットデータから、メ
チラーゼをコードしている６個のフラグメントの正確な
大きさが判明した。ＮｃｏＩ，　ＰｓｔＩ，　ＰｖｕＩ
Ｉ　および　ＳａｌＩ　フラグメントはメチラーゼ遺伝
子の左側にＤＮＡを保有している。 一方、ＢａｍＨＩ　および　ＳｍａＩ　は右側にＤＮＡ
を保有している（図５）。このプローブは、ＰｓｔＩ消
化物およびＮｃｏＩ消化物中の単一の　６　ｋｂ　バン
ド、ＳａｌＩ消化物中の　８　ｋｂ　バンド、ＰｖｕＩ
Ｉ　消化物中の５．５　ｋｂバンド、並びにＢａｍＨＩ
　消化物および　ＳｍａＩ　消化物中の２０　ｋｂバン
ドにハイブリダイズした。他のバンドは、クローン化す
るには大きすぎると判断された。

【００８３】１５．　６個のライブラリー（ＢａｍＨＩ
，　ＮｃｏＩ，　ＰｓｔＩ，　ＰｖｕＩＩ，　ＳａｌＩ
，　ＳｍａＩ）は、工程２−６、８−１０と同一の方法
によって構築されおよび選択された（工程７は行なわな
かった）。ただし、工程２と４については、次の修正を
施した。３０μｌ（３０　μｇ）の　ＳｆｉＩ　染色体
ＤＮＡを、過剰の　ＢａｍＨＩ　（１５０　単位）を含
む、３００　μｌ　の　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　７
．５，　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　，　１５０ｍＭ　Ｎａ
Ｃｌ，　１０ｍＭメルカプトエタノール中で、３７℃で
３時間インキュベートして完全に消化した。全容量を、
０．０１％　ＳＤＳ　を含む　１％アガロースゲル中で
５時間電気泳動した。長波長のＵＶを用いてゲルを視覚
化し、メチラーゼ遺伝子を保有するフラグメントの既知
の大きさの範囲内にあるフラグメントをゲルから切り出
し、清浄なカミソリの刃で細切した。このフラグメント
を、工程７と同じ方法に従って精製した。１５μｌ　（
０．８μｇ）を、１２００単位の　Ｔ４　ＤＮＡ　リガ
ーゼを含む　１　Ｘ結合用バッファー　７０　μｌ　中
で、１６℃で４時間インキュベートし、２　μｌ　（０
．８μｇ）の、ＢａｍＨＩ　により切断され脱リン酸化
された　ｐＥＶ３２８−８−６　に結合した。７０μｌ
　すべてがＲＲ１に形質転換した。

【００８４】１６．メチラーゼ遺伝子から下流のＤＮＡ
大領域を保有する新しい　ＢａｍＨＩメチラーゼクロー
ンの同定（ｐＥＶ１２３ＲＭ６０３−２と命名）　：工
程１５において得られた１５個の生存菌は、ＢａｍＨＩ
　ライブラリー由来のものであり、その内の一つは、　
ＳｆｉＩ　メチラーゼ遺伝子をコードする　２０ｋｂ　
ＢａｍＨＩ　フラグメントを保有していることが判明し
た。このクローンは、図５に示したように、もとのＢｃ
ｌＩクローンと重複しており、また約　１　ｋｂ　の制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子を、もしそれがメチラーゼ
遺伝子の下流で結合されるとしたならば、コードするの
に十分な長さのＤＮＡを保有していた。メチラーゼ遺伝
子の上流のＤＮＡをクローン化するために構築した４個
のライブラリーに対するメチラーゼ選択はうまく行かず
（ＰｓｔＩ，　ＰｖｕＩＩ，ＳａｌＩ，　ＮｃｏＩ　）
、メチラーゼ遺伝子の上流側はまだクローン化されない
ままであった（後述するように、後になって、この原因
は発現不能によることが判明した）。

【００８５】１７．メチラーゼ遺伝子の上流にＤＮＡ大
領域を保有する新しいメチラーゼクローンの手得（Ｐｓ
ｔＩクローンをｐＥＶ１２３ＲＭ６０４−１９と命名し
、ＰｖｕＩＩ　クローンを　ｐＥＶ１２３ＲＭ６２５−
１１　と命名した）：新しい　ＢａｍＨＩクローンはエ
ンドヌクレアーゼ活性を示さなかったので、メチラーゼ
遺伝子の上流部をクローン化しようという試みをさらに
追求した。古いライブラリーのみならず、新しいが不成
功に終わっていたライブラリーについてもメチラーゼを
用いてプローブし、これらのライブラリーの中に所期の
フラグメントがクローン化されているのか、それとも存
在しないのか、を調べた。予期しないメチラーゼ遺伝子
を保有するクローンを分離するために、次の工程に記載
するように、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ブロットを用いた。

【００８６】１８．　Ｍａｎｉａｔｉｓ　らの記載した
ものと同じプロトコルを用いて、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　
ブロットによる　ＰｓｔＩ　および　ＰｖｕＩＩライブ
ラリーの内から、合計約　３２００　個のコロニーを個
別に調べた。この場合も、プローブとして、ニックトラ
ンスレーションした　ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ　フラグメ
ントを用いた（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．ら，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ，　１９８２，　ｐ．　３１３；　Ｇｒｕ
ｎｓｔｅｉｎ，　Ｍ．と　Ｄ．　Ｈｏｇｎｅｓｓ，１９
７５，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ
．　　７２：　３９６１）。その開示内容を参照として
本明細書に取り入れるものとする。細菌コロニーを接触
プリントによってニトロセルロースフィルターに移動さ
せた。フィルターを、０．５Ｍ　ＮａＯＨ，２Ｍ　Ｎａ
Ｃｌに３０秒間、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ
　７．５，　３Ｍ　ＮａＣｌに１分間、０．３Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ，　０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、　０．１％Ｓ
ＤＳ　に５秒間、０．３Ｍ　ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエ
ン酸ナトリウムに１０秒間、浸した。フィルターを空気
乾燥し、次ぎに、真空オーブンで、８０℃で３０分間乾
燥した。このフィルターをハイブリダイゼーション前処
理し、次ぎに、前記の方法を用いて、１．７　ｋｂ　Ｓ
ｆｉＩ　メチラーゼ遺伝子プローブとハイブリダイズさ
せた。フィルターを空気乾燥し、一晩オートラディオグ
ラフィー処理をした。

【００８７】メチラーゼ遺伝子とＤＮＡを予期した通り
左側に保有するクローンを、ＰｓｔＩ，ＰｖｕＩＩ　両
ライブラリーから分離した。これらクローンは実際、メ
チラーゼ活性をほとんど、あるいは全く示さなかった。 すなわち、メチラーゼ遺伝子は、どのベクタープロモー
ターからも離れすぎていたからである。これらのクロー
ンと、ＢａｍＩＩ，　ＢｃｌＩ　クローンとの重複部分
を図５に示す。

【００８８】１９．新しいクローンを回収すると、メチ
ラーゼ遺伝子の両側には、制限エンドヌクレアーゼが結
合されているとした場合、結合遺伝子がどちらの側にコ
ードされるかに関わりなく、制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子をコードするのに十分なクローン化ＤＮＡが備わっ
ていた。しかしながら、どのクローンも制限エンドヌク
レアーゼ活性を示さなかった。２個の　ＳｆｉＩ　Ｒ−
Ｍ遺伝子が結合しているという証拠は依然として得られ
なかったので、　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼを
できるだけ均質に近い状態に精製し、これを下記のよう
に蛋白質配列決定に用いた。

【００８９】３０８　ｇのＳ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ
　から得た１リットルの細胞粗抽出物を、下記のカラム
に、下記の順序にしたがって載せた。すなわち、カラム
処理は、ヘパリン、ＤＥＡＥ−セルロース、アフィ−ゲ
ルブルー、ｍｏｎｏＱ　ＨＰＬＣ，　ｍｏｎｏＳ　ＨＰ
ＬＣの順序で行い、これによって９５％以上の純度の　
ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼを得た。

【００９０】１００　μｌ　（２．５μｇ）の精製　Ｓ
ｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼを用いて、　Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４７０
Ａ　気相蛋白質シークエンサーにより、アミノ末端蛋白
質の配列決定を行なった。最初の２８個のアミノ酸残基
は次のような配列を持っていた。

【００９１】メチオニン−ヒスチジン−グルタミン−ア
スパラギン酸−チロシン−アルギニン−グルタミン酸−
ロイシン−未定−ロイシン−アスパラギン酸−グルタミ
ン酸−ロイシン−グルタミン酸−未定−バリン−グルタ
ミン酸−リジン−グルタミン−スレオニン−ロイシン−
アルギニン−未定−イソロイシン−バリン−グルタミン
−アラニン−ロイシン。

【００９２】２０．制限遺伝子クローンの同定：前記配
列に基づいて、８倍の縮重を持つ１４ｍｅｒ　ＤＮＡオ
リゴプローブを構築した。

【００９３】 ＡＴＧＣＡ（Ｔ，Ｃ）ＣＡ（Ｇ，Ａ）ＧＡ（Ｃ，Ｔ）Ｔ
Ａ最初の５個のアミノ酸残基だけを選び、これをＤＮＡ
配列の翻訳用とした。これは、ＤＮＡ長を増すことはハ
イブリダイゼーションの特異性を増すことになるけれど
も、この場合は、縮重をも増すことになり特異性を低下
させるからである。もとのＢｃｌＩクローン、もとのク
ローンの上流に重複ＤＮＡを保有するその後のＢａｍＨ
Ｉ　クローン、もとのクローンの上流に重複ＤＮＡを保
有する　ＰｓｔＩ　クローンを、各種制限エンドヌクレ
アーゼによって消化し、前記の操作法（工程１４）に従
ってニトロセルロース上にブロットした。ＤＮＡ　１４
　ｍｅｒ　を２６μｌ　中で下記のようにキナーゼ処理
した。２．５　μｌ　１０×キナーゼバッファー（７０
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６，　１００ｍＭ　
ＭｇＣｌ２　，　５０ｍＭ　ＤＴＴ，　２．６ｍＭ　　
５′−ｈｙｄｒｏｘｙｌ　末端を持つサケ精子ＤＮＡ）
，５μｌ　のガンマ３２ＰＡＴＰ（５０μＣｉ），　１
μｌ　キナーゼ（１０単位）で、室温で、１．３時間処
理した。この全容量をハイブリダイゼーション前処理し
たブロットに加え、室温で一晩振とうした。ブロットを
洗浄し、工程１４に記載したやり方に従って暴露した。 その結果から、このオリゴマーは、ＢｃｌＩ，　Ｂａｍ
ＨＩ　クローンの特定位置にハイブリダイズするが、Ｐ
ｓｔＩクローンにはハイブリダイズしないこと、　Ｓｆ
ｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始の正確な位
置がメチラーゼクローンの特定の２００塩基対領域内に
特定されること（図５参照）、が分かった。これは、　
ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ遺伝子が結合されて、ＢａｍＨＩ　ク
ローン上では完全にともにクローン化され、　ＢｃｌＩ
　クローン上では少なくとも部分的にともにクローン化
されることを示す、間接的ではあるが、確実な証拠であ
る（工程２１から、ＢｃｌＩクローンも完全なＲ−Ｍ遺
伝子を含むことが明らかになった）。

【００９４】２１．この領域のＤＮＡ配列の決定によっ
て、制限遺伝子の存在が確かめられ、その方向が明らか
にされ、下記の実施例２に示すように、Ｅ．ｃｏｌｉ　
中にクローン化された制限遺伝子の発現を誘発するため
の、組み換えプラスミドを後で操作する際の基礎となる
データを得ることができた。

【００９５】 実施例　　２　　　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子の過剰発現 この領域のＤＮＡ配列決定、詳細なマッピングおよび欠
失データは、多数の方法で、クローン化された　Ｓｆｉ
Ｉ　制限エンドヌクレアーゼの最大発現を実現するのに
用いることができるであろう。

【００９６】そのような方法の一つは、Ｅ．　ｃｏｌｉ
　が強く認識するプロモーター、例えば、ラムダ　ｐＬ
　を　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始
点の間近に挿入することを含む。強力なプロモーターは
、既知の方法を用いて、適当なベクターに挿入してもよ
い。このような適切なベクターの一つとして　ｐＧＷ７
　（ＡＴＣＣ　４０１６６）がある。強力なプロモータ
ーの挿入は、制限遺伝子の両末端近傍にある都合のよい
制限標的と、ベクター上のプロモーター近傍の共存可能
な制限標的を特定することによって達成されるし、また
、強力なプロモーターの翻訳コントロール下に入るよう
な方向性を持つように、制限遺伝子をベクター中に組み
込むことによって達成されよう。

【００９７】制限遺伝子の開始点からラムダ　ｐＬ　プ
ロモーター　０．５　ｋｂ　を含む　ＳｆｉＩ　エンド
ヌクレアーゼのサブクローンは、予期したようなエンド
ヌクレアーゼの増幅発現を示さなかった。従って、本発
明に従って、本実施態様を構築しながら、クローン化さ
れた　ＳｆｉＩ　を過剰発現させるためには、制限遺伝
子を遺伝子操作して、それがラムダ　ｐＬ　プロモータ
ーの下流　０．５　ｋｂ　以内にあるようにしなければ
ならない。

【００９８】制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現レベ
ルは、工程１１−１２に記載されたように、既知の方法
を用いて決定することができる。

【００９９】遺伝子の発現を増大させるよう、　Ｓｆｉ
Ｉ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の上流に置かれた強
力なリボソーム結合部位を利用することによって、Ｓｆ
ｉＩを過剰発現させてもよい。Ｓｈｉｎｅ　と　Ｄａｌ
ｇａｒｎｏ，　（１９７４）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　７１，１３４２−１
３４６　を参照せよ。この開示内容は参照として本明細
書に取り入れるものとする。

【０１００】ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の発現を増大する第三の方法は、部位特異的突然変異誘
発あるいは再合成によって、その遺伝子のＤＮＡ配列を
変え、それによって、Ｅ．　ｃｏｌｉ　の中でより効率
的に利用される開始コドンを含むようにするやり方であ
る。

【０１０１】ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
の発現を増大するさらに別の方法は、ＤＮＡ配列に基づ
いて、　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の両
側にハイブリダイゼーション用にオリゴヌクレオチドプ
ライマーを設計するやり方である。これは、ＤＮＡポリ
メラーゼ連鎖反応を利用して、制限遺伝子を増幅するの
である。 増幅されたフラグメントを、ｐＧＷ７　（ＡＴＣＣ　４
０１６６）　あるいは　ｐＥＴ３Ａ（Ｗｉｌｌｉａｍ　
Ｓｔｕｄｉｅｒ　から入手、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｎ
ａｔ．　Ｌａｂ．，　Ｕｐｔｏｎ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
　）のような発現ベクターに挿入する。両ベクターとも
強力なプロモーターとリボソーム結合部位を含んでいる
。

【０１０２】ＳｆｉＩ　修飾メチラーゼまたはエンドヌ
クレアーゼは、発酵槽中の、適当な抗生物質を含む富裕
培養液中で増殖させることにより、　ＳｆｉＩ　修飾遺
伝子と過剰発現制限遺伝子とを保有するクローンから生
産できる。 その後、細胞を遠心分離によって採集し、超音波処理に
よって破砕し、　ＳｆｉＩ　メチラーゼおよび制限エン
ドヌクレアーゼ活性を含む細胞粗抽出物を得る。

【０１０３】ＳｆｉＩ　メチラーゼとエンドヌクレアー
ゼを含むこの細胞粗抽出物は、標準的な生成物精製技術
、例えば、アフィニティークロマトグラフィーやイオン
交換クロマトグラフィーによって精製される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ
をクローン化および製造するのに好ましい方法を決める
ために採用された方法を示す。

【図２】図２は、図１に示した実際の結果に基づき、　
ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼをクローン化および
製造するための好ましい方法を示す。クローニング計画
の当初においては、　ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系をクローニン
グするのにどのエンドヌクレアーゼやどの条件が成功に
導くのか、またそのクローン内のどこに制限遺伝子や修
飾遺伝子があるのかが不明であった。クローニング結果
、その後のＤＮＡ配列の決定、マッピング、並びに図１
および実施例１に記載したクローンの特性の明示によっ
て、　ＳｆｉＩ　Ｒ−Ｍ系をクローン化および発現する
ための、以前には知られていなかった直接経路を明らか
にすることができた。

【図３】図３は、４．９　ｋｂのクローニングベクター
、　ｐＥＶ３２８−８−６　のマップである。ｐＥＶ３
２８−８−６　は、　ｐＢＲ３２８　の誘導体である。 ｐＢＲ３２８　ＥｃｏＲＶ部位と最初のｐＢＲ３２８Ｓ
ｓｐｌ部位に挿入された　ＳｆｉＩ　リンカー（ＧＧＣ
ＣＧＣａ／ｔＧＣＧＧＣＣ　）をもつ。これは、クロラ
ムフェニコール（ｃｍ）耐性であり、アンピシリン（ａ
ｐ）耐性であり、テトラサイクリン（ｔｃ）感受性を持
つ。

【図４】図４は、　ＳｆｉＩ　メチラーゼとエンドヌク
レアーゼをコードする、もとの　３．９　ｋｂ　Ｂｃｌ
Ｉ挿入物の制限マップである。

【図５】図５は、クローン化されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　ＤＮＡの約２３ｋｂ（
全体）の制限マップである。

【図６】図６は、ｐＥＶ１２３ＲＭ　６１２−１６　の
細胞抽出物から得られた　ＳｆｉＩ　修飾メチラーゼ活
性を示すアガロースゲルの写真である。５０μｇ／ｍｌ
の　ｐＥＶ３２８−８−６　　２５０μｌ　を１×メチ
ラーゼバッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ　７．
５，　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　５　ｍＭ　ＢＭＥ，　
０．１　ｍＭ　ＡｄｏＭｅｔ　）に溶解して調製した。 ５０μｌ　を４本の試験管の各々に入れた。２５μｌ　
を２本の試験管の各々に入れ、コントロールとして用い
た。　１μｌ　のカラム画分を、最初の５０μｌ　管に
加え、混合した。 ２５μｌ　を第２の５０μｌ　管に入れ、混合した。第
２の５０μｌ　管から２５μｌ　を取り、第３の５０μ
ｌ　管に移し、混合した。次に、第３の５０μｌ　から
２５μｌ　を取り、第４の５０μｌ　管に移し、混合し
た。全ての試験管を３７℃で１時間インキュベートした
。下記の混合物　２５０μｌ　を調製した。すなわち、
　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，　ｐＨ　８．０，　４０ｍＭ　
　ＭｇＣｌ２　，　５ｍＭ　ＢＭＥ，　２００単位の　
ＳｆｉＩ　エンドヌクレアーゼ。この混合物の等容量を
、各管に加え（未切断の　ｐＥＶ３２８−８−６　コン
トロール管を除く）、５０℃で１時間インキュベートし
た。各管から２５μｌ　を取り、これをゲル電気泳動に
より分析した（ゲル写真参照）。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　から入
   手可能な、　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
   をコードするＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】　　さらに　ＳｆｉＩ　メチラーゼ遺伝子
   をコードするＤＮＡを含む請求項１記載のＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】　　請求項１または２記載のＤＮＡ配列を
   含むベクター。
4. 【請求項４】　　ベクターが　ｐＥＶ１２３ＲＭ６１２
   −１６　から成る請求項３記載のベクター。
5. 【請求項５】　　Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　から入
   手可能な、　ＳｆｉＩ　メチラーゼ遺伝子をコードする
   ＤＮＡ配列。
6. 【請求項６】　　請求項５記載の配列を含むベクター。
7. 【請求項７】　　請求項１、２、５または６記載のベク
   ターによって形質転換された微生物宿主。
8. 【請求項８】　　ＤＮＡ配列　ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧ
   ＣＣを認識して４番目のＮと５番目のＮの間の配列を切
   断する、Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　から入手可能な
   組み換え制限エンドヌクレアーゼ。
9. 【請求項９】　　請求項８記載の制限エンドヌクレアー
   ゼによる消化からＤＮＡを保護する、Ｓ．　ｆｉｍｂｒ
   ｉａｔｕｓ　から入手可能な組み換え修飾メチラーゼ。
10. 【請求項１０】　　　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアー
    ゼ遺伝子のクローニング方法であって、 （ａ）　　Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　由来のゲノム
    ＤＮＡからライブラリーを形成すること、 （ｂ）　　ＳｆｉＩ修飾メチラーゼをコードする遺伝子
    を含むクローンを単離すること、 （ｃ）　　メチラーゼ遺伝子と、そのメチラーゼ遺伝子
    に隣接するＤＮＡとを保有するフラグメントを決定し、
    およびそれらのフラグメントをクローン化すること、（
    ｄ）　　制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を精製して最初
    のアミノ酸残基の配列を決め、およびその配列に基づい
    たＤＮＡプローブを作製すること、 （ｅ）　　メチラーゼクローンのうち、（ｄ）のプロー
    ブとハイブリダイゼーションし、かつ、そのハイブリダ
    イゼーション位置のいずれか一方の側に少なくとも１ｋ
    ｂを保有しているクローンを同定することによって、制
    限エンドヌクレアーゼ遺伝子をさらに保有しているクロ
    ーンを決定すること、 （ｆ）　　Ｒ−Ｍ遺伝子領域のＤＮＡを配列決定し、工
    程（ｃ）からのマッピングと欠失データとを組み合わせ
    て、前記制限遺伝子の過剰発現法を決めること、を含む
    方法。
11. 【請求項１１】　　前記ライブラリーが、下記の工程、
    即ち （ａ）　　ＳｆｉＩ部位を含むクローニングベクターを
    構築する工程、 （ｂ）　　Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　由来のＤＮＡ
    を精製する工程、（ｃ）　　精製したＤＮＡを消化して
    、ＤＮＡフラグメントを形成する工程、 （ｄ）　　前記フラグメントをクローニングベクター中
    に結合する工程、 （ｅ）　　工程（ｄ）の組み換えクローニングベクター
    を持つ宿主細胞を形質転換し、細胞ライブラリーを形成
    する工程、および （ｆ）　　細胞ライブラリーから組み換えベクターを精
    製し、プラスミドライブラリーを形成する工程によって
    形成される請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】　　クローニングベクターが　ｐＥＶ３
    ２８−８−６　である請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】　　微生物宿主がＥ．　ｃｏｌｉ　株ｈ
    ｓｄＲ−　である請求項１１記載の方法。
14. 【請求項１４】　　　ＳｆｉＩ　修飾遺伝子を含むクロ
    ーンを、プラスミドライブラリーを電気泳動し、ゲルか
    ら組み換えベクターのみを精製し、ゲル精製したプラス
    ミドライブラリーを　ＳｆｉＩ　で消化して消化プール
    を形成し、この消化プールを微生物宿主内に形質転換し
    、前記修飾遺伝子を含むクローンを選択することによっ
    て分離する請求項１２記載の方法。
15. 【請求項１５】　　請求項１または２記載の遺伝子を発
    現させることを含むＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼの
    製造方法。
16. 【請求項１６】　　　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアー
    ゼの製造方法であって、 （ａ）　　Ｓ．　ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ　からＤＮＡを
    精製すること、（ｂ）　　精製したＤＮＡを適切な制限
    エンドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡフラグメントを形
    成すること、（ｃ）　　　ＳｆｉＩ　部位を含むクロー
    ニングベクターを構築すること、 （ｄ）　　フラグメントを組み換えクローニングベクタ
    ー中に結合してＤＮＡ混合物を形成すること、（ｅ）　
    　工程（ｃ）のＤＮＡ混合物によって宿主細胞を形質転
    換し、ライブラリーを形成すること、（ｆ）　　　Ｓｆ
    ｉＩ　修飾メチラーゼ遺伝子を含むクローンを分離する
    こと、 （ｇ）　　　ＳｆｉＩ　修飾メチラーゼ遺伝子を含むク
    ローンをスクリーニングし、ＳｆｉＩ制限エンドヌクレ
    アーゼ遺伝子を含むクローンを分離すること、 （ｈ）　　　ＳｆｉＩ　制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
    を過剰発現させ、前記遺伝子が、Ｅ．　ｃｏｌｉ　中で
    機能できるようにすること、 （ｉ）　　工程（ｈ）のクローンを含む宿主細胞を培養
    すること、および （ｊ）　　前記培養物から　ＳｆｉＩ　制限エンドヌク
    レアーゼを回収すること、を含む方法。
17. 【請求項１７】　　クローニングベクターがプラスミド
    またはウィルスＤＮＡ分子である請求項１６記載の方法
    。
18. 【請求項１８】　　プラスミドが　ｐＥＶ３２８−８−
    ６　である請求項１７記載の方法。