JPH04211391A - ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター - Google Patents
ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクターInfo
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- JPH04211391A JPH04211391A JP3056714A JP5671491A JPH04211391A JP H04211391 A JPH04211391 A JP H04211391A JP 3056714 A JP3056714 A JP 3056714A JP 5671491 A JP5671491 A JP 5671491A JP H04211391 A JPH04211391 A JP H04211391A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｅ．コリー分泌型突然
変異体からヒルジン誘導体を得る方法並びにＮ−末端ア
ミノ酸配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを
有するヒルジン誘導体に関する。
変異体からヒルジン誘導体を得る方法並びにＮ−末端ア
ミノ酸配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを
有するヒルジン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒルジンは、６５のアミノ酸を有するポ
リペプチドであり、ヒル（Ｈｉｒｕｄｏｍｅｄｉｃｉｎ
ａｌｉｓ）から単離された。これは、トロンビンに対す
る高特異的な抑制剤としての作用をし、この際、これは
トロンビンと安定な錯体を形成し、従って、多くの治療
的使用可能性、殊に、抗凝血治療のための用途を有する
（ Ｆ． Ｍａｒｋｑｕａｒｄｔ， Ｂｉｏｍｅｄ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｃｔａ ４４（１９８５
）、１００７〜１０１３参照）。
リペプチドであり、ヒル（Ｈｉｒｕｄｏｍｅｄｉｃｉｎ
ａｌｉｓ）から単離された。これは、トロンビンに対す
る高特異的な抑制剤としての作用をし、この際、これは
トロンビンと安定な錯体を形成し、従って、多くの治療
的使用可能性、殊に、抗凝血治療のための用途を有する
（ Ｆ． Ｍａｒｋｑｕａｒｄｔ， Ｂｉｏｍｅｄ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｃｔａ ４４（１９８５
）、１００７〜１０１３参照）。
【０００３】ヒルジンの完全なアミノ酸配列の開示（Ｊ
．Ｄｏｄｔ 等によるＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ
１６５（２）、（１９８４）、１８０〜１８４）の後に
、組換えＤＮＡ−技術及び微生物中での表現によるヒル
ジンの製造に関する前提が示された。
．Ｄｏｄｔ 等によるＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ
１６５（２）、（１９８４）、１８０〜１８４）の後に
、組換えＤＮＡ−技術及び微生物中での表現によるヒル
ジンの製造に関する前提が示された。
【０００４】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第１５８５６４号（
Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）明細書は、宿主細胞殊にバクテリ
ア細胞内でのヒルジン又はヒルジン類縁体の表現のため
のクローニングベクターを開示している。ここでは、ヒ
ルジンに関してコードする遺伝子が、ヒルからのｍＲＮ
Ａから出発してｃＤＮＡ−合成により得られる。殊に、
Ｎ−末端配列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
を有するヒルジン誘導体並びにその取得法が記載されて
いる。
Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）明細書は、宿主細胞殊にバクテリ
ア細胞内でのヒルジン又はヒルジン類縁体の表現のため
のクローニングベクターを開示している。ここでは、ヒ
ルジンに関してコードする遺伝子が、ヒルからのｍＲＮ
Ａから出発してｃＤＮＡ−合成により得られる。殊に、
Ｎ−末端配列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
を有するヒルジン誘導体並びにその取得法が記載されて
いる。
【０００５】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第１６８３４２号（
Ｃｉｂａ Ｇｅｉｇｙ）明細書中には、ヒルジンの天
然アミノ酸配列に関してコードするＤＮＡ−配列が開示
されており、ここでＮ−末端アミノ酸配列は、Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ｔｈｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐである。ヒルジンの表
現は、微生物Ｅ．コリー及びサッカロミセス・セレヴィ
ジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）の細胞内で起こる。
Ｃｉｂａ Ｇｅｉｇｙ）明細書中には、ヒルジンの天
然アミノ酸配列に関してコードするＤＮＡ−配列が開示
されており、ここでＮ−末端アミノ酸配列は、Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ｔｈｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐである。ヒルジンの表
現は、微生物Ｅ．コリー及びサッカロミセス・セレヴィ
ジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）の細胞内で起こる。
【０００６】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第１７１０２４号（
Ｈｏｅｃｈｓｔ ＡＧ）明細書中には、殊にＥ．コリ
ー細胞内でのヒルジン活性を有するポリペプチドの遺伝
子技術による製法が開示されており、これによれば、細
胞を溶解させ、その細胞抽出物からヒルジン活性を有す
るポリペプチドを取得する。場合により存在する融合蛋
白質分は、蛋白質分解又は化学的分解により分離除去で
き、遊離されたヒルジン分子を精製することができる。
Ｈｏｅｃｈｓｔ ＡＧ）明細書中には、殊にＥ．コリ
ー細胞内でのヒルジン活性を有するポリペプチドの遺伝
子技術による製法が開示されており、これによれば、細
胞を溶解させ、その細胞抽出物からヒルジン活性を有す
るポリペプチドを取得する。場合により存在する融合蛋
白質分は、蛋白質分解又は化学的分解により分離除去で
き、遊離されたヒルジン分子を精製することができる。
【０００７】西ドイツ特許出願公開（ＤＥ−ＯＳ）第３
４４５５７１号（ＧＥＮ−ＢＩＯ−ＴＥＣ）の目的は、
ヒルジンの生物学的活性を有する蛋白質に関してコード
するＤＮＡ−配列並びに適当な組換えベクターで形質転
換されているようなＥ．コリー細胞からの細胞のリシス
（Ｌｙｓｉｓ）による蛋白質の取得法である。
４４５５７１号（ＧＥＮ−ＢＩＯ−ＴＥＣ）の目的は、
ヒルジンの生物学的活性を有する蛋白質に関してコード
するＤＮＡ−配列並びに適当な組換えベクターで形質転
換されているようなＥ．コリー細胞からの細胞のリシス
（Ｌｙｓｉｓ）による蛋白質の取得法である。
【０００８】ベルクマン（Ｂｅｒｇｍａｎｎ）等による
論文（Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ Ｓ
ｅｙｌｅｒ ３６７（１９８６）、７３１〜７４０頁
）にも、Ｅ．コリー中でのヒルジン合成が記載されてい
る。この細胞からのヒルジンの遊離を、トルオールでの
処理により行なっており、この際、細胞のＡ５７８単位
約５００ｎｇ／ｌの僅かな収量のみが達成される。
論文（Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ Ｓ
ｅｙｌｅｒ ３６７（１９８６）、７３１〜７４０頁
）にも、Ｅ．コリー中でのヒルジン合成が記載されてい
る。この細胞からのヒルジンの遊離を、トルオールでの
処理により行なっており、この際、細胞のＡ５７８単位
約５００ｎｇ／ｌの僅かな収量のみが達成される。
【０００９】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第２００６５５号（
Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、同第２５２８５４号（Ｔｒａｎ
ｓｇｅｎｅ）及び同第２２５６３３号（Ｃｉｂａ Ｇ
ｅｉｇｙ）明細書には、分泌により真核性宿主微生物殊
に酵母からヒルジン活性を有する蛋白質を取得すること
が開示されており、ここでは、構造遺伝子の上流に１個
の信号ペプチドを有するＤＮＡ−配列を有するベクター
上での表現を行なっている。酵母中のＮ−末端配列Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ並びにＮ−末端配
列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒ
ルジン誘導体の分泌が開示されている。この際、１００
ｍｇ／ｌまでの収量が示されている。
Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、同第２５２８５４号（Ｔｒａｎ
ｓｇｅｎｅ）及び同第２２５６３３号（Ｃｉｂａ Ｇ
ｅｉｇｙ）明細書には、分泌により真核性宿主微生物殊
に酵母からヒルジン活性を有する蛋白質を取得すること
が開示されており、ここでは、構造遺伝子の上流に１個
の信号ペプチドを有するＤＮＡ−配列を有するベクター
上での表現を行なっている。酵母中のＮ−末端配列Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ並びにＮ−末端配
列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒ
ルジン誘導体の分泌が開示されている。この際、１００
ｍｇ／ｌまでの収量が示されている。
【００１０】西ドイツ特許出願公開（ＤＥ−ＯＳ）第３
９００６２６号（Ｈｏｅｃｈｓｔ ＡＧ）明細書中に
は、Ｎ−末端配列Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｐを有するヒルジン誘導体が記載されている。この表
現は、有利に、酵母中で認められ、この際、酵母−フェ
ロモン遺伝子ＭＦαのプロモータ及び信号配列がヒルジ
ン誘導体の表現及び分泌のために使用される。
９００６２６号（Ｈｏｅｃｈｓｔ ＡＧ）明細書中に
は、Ｎ−末端配列Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｐを有するヒルジン誘導体が記載されている。この表
現は、有利に、酵母中で認められ、この際、酵母−フェ
ロモン遺伝子ＭＦαのプロモータ及び信号配列がヒルジ
ン誘導体の表現及び分泌のために使用される。
【００１１】しかしながら、前記の全てのヒルジン誘導
体の製法は欠点を有する。例えば宿主微生物として酵母
を使用し、培地中でのヒルジンの分泌を用いる際に、比
較的高い収量が得られるが、酵母細胞の培養は、細菌例
えばＥ．コリーのそれよりも時間がかかり、困難が多い
。これに反して、Ｅ．コリー細胞中では、収量が比較的
僅かでかつ／又は細胞の溶解時に複雑な単離法が必要で
ある。
体の製法は欠点を有する。例えば宿主微生物として酵母
を使用し、培地中でのヒルジンの分泌を用いる際に、比
較的高い収量が得られるが、酵母細胞の培養は、細菌例
えばＥ．コリーのそれよりも時間がかかり、困難が多い
。これに反して、Ｅ．コリー細胞中では、収量が比較的
僅かでかつ／又は細胞の溶解時に複雑な単離法が必要で
ある。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、細胞の溶解を必要としない方法で、バクテリア細胞
から高収量でヒルジン誘導体を取得することのできる簡
単な方法を開発することであった。
は、細胞の溶解を必要としない方法で、バクテリア細胞
から高収量でヒルジン誘導体を取得することのできる簡
単な方法を開発することであった。
【００１３】
【課題を解決する手段】本発明の目的は、Ｅ．コリー分
泌型突然変異体からヒルジン誘導体を得る方法であり、
この方法は、 （１） バクテリア信号ペプチドをコードするＤＮＡ
−フラグメントの後にヒルジン誘導体に関してコードす
る遺伝子を有する組換えベクターを形成し、（２）
工程（１）で形成された組換えベクターを用いてＥ．コ
リー分泌型突然変異体を用いて形質転換させ、（３）
この形質転換された細胞を培地中で培養し、（４）
この培地からヒルジン誘導体を取得することより成る
。
泌型突然変異体からヒルジン誘導体を得る方法であり、
この方法は、 （１） バクテリア信号ペプチドをコードするＤＮＡ
−フラグメントの後にヒルジン誘導体に関してコードす
る遺伝子を有する組換えベクターを形成し、（２）
工程（１）で形成された組換えベクターを用いてＥ．コ
リー分泌型突然変異体を用いて形質転換させ、（３）
この形質転換された細胞を培地中で培養し、（４）
この培地からヒルジン誘導体を取得することより成る
。
【００１４】本発明によるヒルジン誘導体とは、ヒルか
ら誘導され、トロンビン抑制剤としての作用をし、最低
１００００ＡＴ−Ｕ（抗トロンビン単位）／ｍｇの特異
活性を有する蛋白質（ Ｄｏｄｔ 等の Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ，３６６
（１９８５）、３７９〜３８５頁）である。ヒルジン誘
導体の概念には、約５０のアミノ酸の長さのＮ−末端融
合分を有し、蛋白質分解又は化学的分解により部分的に
又は完全に除去できる融合蛋白質をも包含し、この際、
分解生成物として最低１００００ＴＡ−Ｕ／ｍｇの特異
活性を有するヒルジン誘導体が生じる。
ら誘導され、トロンビン抑制剤としての作用をし、最低
１００００ＡＴ−Ｕ（抗トロンビン単位）／ｍｇの特異
活性を有する蛋白質（ Ｄｏｄｔ 等の Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ，３６６
（１９８５）、３７９〜３８５頁）である。ヒルジン誘
導体の概念には、約５０のアミノ酸の長さのＮ−末端融
合分を有し、蛋白質分解又は化学的分解により部分的に
又は完全に除去できる融合蛋白質をも包含し、この際、
分解生成物として最低１００００ＴＡ−Ｕ／ｍｇの特異
活性を有するヒルジン誘導体が生じる。
【００１５】有利に、本発明の方法により、次のＮ−末
端アミノ酸配列を有するヒルジン誘導体が得られる：（
Ｘ）ｍ−Ｚ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ［ここで
ｍ＝０〜５０、Ｘは同一又は異なる遺伝子コード化可能
なアミノ酸であり、ＺはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｖａ
ｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｙｒの群からの遺伝子
コード化可能なアミノ酸を表わす］。
端アミノ酸配列を有するヒルジン誘導体が得られる：（
Ｘ）ｍ−Ｚ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ［ここで
ｍ＝０〜５０、Ｘは同一又は異なる遺伝子コード化可能
なアミノ酸であり、ＺはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｖａ
ｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｙｒの群からの遺伝子
コード化可能なアミノ酸を表わす］。
【００１６】ｍが０より大きい場合には、配列Ｘは特に
その末端に蛋白質分解又は化学的分解−位置を有するこ
とが有利である。例えば、配列Ｘの最後のアミノ酸がＡ
ｒｇ−基である場合は、融合配列Ｘは、典型的な消化（
Ａｒｇへの分解）により、離脱させ、活性のヒルジン誘
導体を精製することができる。しかしながら、融合分の
離脱は、同様に、他の公知の蛋白質分解酵素又は化学的
分解試薬によって実施することができる。例えば、Ｘの
アミノ酸配列が末端にＭｅｔ−基を有する場合は、シア
ン化ハロゲン分解（ Ｅ． Ｇｒｏｓｓ 及び Ｂ
． Ｗｉｔｔｋｏｐ 、 Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．８２（１９６１）、１５１０〜１５１７）によ
り、融合蛋白質を分解することができる。例えば、Ｘの
Ｃ−末端アミノ酸配列が、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含有する場合は、因子Ｘａを用いる
分解を行なうことができる（欧州特許ＥＰ−Ａ第２５１
９０号及び同第１６１９７３号参照）。
その末端に蛋白質分解又は化学的分解−位置を有するこ
とが有利である。例えば、配列Ｘの最後のアミノ酸がＡ
ｒｇ−基である場合は、融合配列Ｘは、典型的な消化（
Ａｒｇへの分解）により、離脱させ、活性のヒルジン誘
導体を精製することができる。しかしながら、融合分の
離脱は、同様に、他の公知の蛋白質分解酵素又は化学的
分解試薬によって実施することができる。例えば、Ｘの
アミノ酸配列が末端にＭｅｔ−基を有する場合は、シア
ン化ハロゲン分解（ Ｅ． Ｇｒｏｓｓ 及び Ｂ
． Ｗｉｔｔｋｏｐ 、 Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．８２（１９６１）、１５１０〜１５１７）によ
り、融合蛋白質を分解することができる。例えば、Ｘの
Ｃ−末端アミノ酸配列が、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含有する場合は、因子Ｘａを用いる
分解を行なうことができる（欧州特許ＥＰ−Ａ第２５１
９０号及び同第１６１９７３号参照）。
【００１７】本発明の方法でｍ＝０である場合には、Ｚ
はＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＡｓｎ特にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ
又はＡｓｎであるのが有利である。ｍが０でＺがＡｌａ
であるヒルジン誘導体が最も有利である。
はＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＡｓｎ特にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ
又はＡｓｎであるのが有利である。ｍが０でＺがＡｌａ
であるヒルジン誘導体が最も有利である。
【００１８】従って、本発明の目的物の１つは、Ｎ−末
端配列Ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ここでＡ
はＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＡｓｎ特にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ
又はＡｓｎを表わす）を有するヒルジン誘導体である。 Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
を有する誘導体が最も有利である。このヒルジン誘導体
から、Ｅ．コリー分泌型突然変異体の培養上澄み中に、
意想外にも、２ｇ／ｌ（培地）より多い活性ヒルジンを
得ることができた。
端配列Ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ここでＡ
はＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＡｓｎ特にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ
又はＡｓｎを表わす）を有するヒルジン誘導体である。 Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
を有する誘導体が最も有利である。このヒルジン誘導体
から、Ｅ．コリー分泌型突然変異体の培養上澄み中に、
意想外にも、２ｇ／ｌ（培地）より多い活性ヒルジンを
得ることができた。
【００１９】本発明方法のもう１つの利点は、細胞培地
内へのヒルジン誘導体の分泌により、ヒルジンのジサル
ファイド橋が、培地の酸化条件下に正当に形成されるこ
とである。
内へのヒルジン誘導体の分泌により、ヒルジンのジサル
ファイド橋が、培地の酸化条件下に正当に形成されるこ
とである。
【００２０】本発明におけるＥ．コリー分泌型突然変異
体とは、培地中で、多量の蛋白質分泌を示すＥ．コリー
菌株である。この分泌型突然変異体の製法は、欧州特許
（ＥＰ−Ａ）第３３８４１０号明細書中に開示されてい
る。適当なＥ．コリー分泌型突然変異体の取得時には、
殊にＥ．コリーＤＳ４１０（ＤＳＭ４５１３）又はＥ．
コリーＢＷ７２６１（ＤＳＭ５２３１）から出発するこ
とができる。それぞれのＥ．コリー菌株を、まず、分泌
可能な蛋白質に関してコードするＤＮＡ−配列を含有す
るプラスミドを用いて形質転換させる。引続きこの形質
転換されたＥ．コリー菌株をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いる処理により突然変異
生成を行なわせる。次いで、適当な分泌型突然変異菌株
の選択を行なう。分泌可能な蛋白質として例えばα−シ
クロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを使用
すると、分泌型突然変異体は、細胞壁活性物質Ｄ−サイ
クロセリンに対する耐性により認識できる。更に、α−
サイクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（
ＣＧＴアーゼ）の分泌は、周囲の培地（これはアミロペ
クチン−アズール−培地の使用の際に、分泌型突然変異
体に関する付加的な選択可能性を与える）中のデンプン
を加水分解する作用をする。
体とは、培地中で、多量の蛋白質分泌を示すＥ．コリー
菌株である。この分泌型突然変異体の製法は、欧州特許
（ＥＰ−Ａ）第３３８４１０号明細書中に開示されてい
る。適当なＥ．コリー分泌型突然変異体の取得時には、
殊にＥ．コリーＤＳ４１０（ＤＳＭ４５１３）又はＥ．
コリーＢＷ７２６１（ＤＳＭ５２３１）から出発するこ
とができる。それぞれのＥ．コリー菌株を、まず、分泌
可能な蛋白質に関してコードするＤＮＡ−配列を含有す
るプラスミドを用いて形質転換させる。引続きこの形質
転換されたＥ．コリー菌株をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いる処理により突然変異
生成を行なわせる。次いで、適当な分泌型突然変異菌株
の選択を行なう。分泌可能な蛋白質として例えばα−シ
クロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを使用
すると、分泌型突然変異体は、細胞壁活性物質Ｄ−サイ
クロセリンに対する耐性により認識できる。更に、α−
サイクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（
ＣＧＴアーゼ）の分泌は、周囲の培地（これはアミロペ
クチン−アズール−培地の使用の際に、分泌型突然変異
体に関する付加的な選択可能性を与える）中のデンプン
を加水分解する作用をする。
【００２１】本発明のための組換えベクターとしては、
Ｅ．コリーゲノム中に集積できるベクター（例えばバク
テリオファージλ）又は形質転換されたＥ．コリー細胞
内に染色体外で存在するベクター（例えばプラスミド）
が好適である。プラスミドを使用するのが有利である。
Ｅ．コリーゲノム中に集積できるベクター（例えばバク
テリオファージλ）又は形質転換されたＥ．コリー細胞
内に染色体外で存在するベクター（例えばプラスミド）
が好適である。プラスミドを使用するのが有利である。
【００２２】信号蛋白質及びヒルジン−誘導体より成る
蛋白質に関してコードする組換えベクター上のこの遺伝
子構成は、有利に、誘導可能なプロモータ特にｔｒｐ−
ｌａｃ−融合プロモータ（これは、ラクトース−又はイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−
添加により誘導可能である）の制御（Ｋｏｎｔｒｏｌｌ
ｅ）下に存在する。このベクター上には、更に、選択マ
ーカー遺伝子及び場合によりｌａｃ−リプレッサー遺伝
子が存在する。
蛋白質に関してコードする組換えベクター上のこの遺伝
子構成は、有利に、誘導可能なプロモータ特にｔｒｐ−
ｌａｃ−融合プロモータ（これは、ラクトース−又はイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−
添加により誘導可能である）の制御（Ｋｏｎｔｒｏｌｌ
ｅ）下に存在する。このベクター上には、更に、選択マ
ーカー遺伝子及び場合によりｌａｃ−リプレッサー遺伝
子が存在する。
【００２３】ヒルジン誘導体の分泌を可能とするバクテ
リア信号配列としては、原則的に、Ｅ．コリー細胞の膜
の侵入を許容する全ての周知信号蛋白質が好適である。 従って、グラム陰性菌からの信号蛋白質、例えば次のＥ
．コリーの蛋白質の信号蛋白質を使用するのも有利であ
る：細胞膜外蛋白質ＯｍｐＡ（ＤｉＲｉｅｎｚｏ 等の
１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，４
８１〜５３２）、アルカリホスファターゼＰｈｏＡ（Ｉ
ｎｏｕｙｅ 等の１９８２、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
． １４９，４３４〜４３９）、ＬａｍＢ−蛋白質（
Ｈｅｄｇｐｅｔｈ 等の１９８０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，２６２１〜
２６２５）、マルトース結合蛋白質Ｍａ１Ｅ（Ｂｅｄｏ
ｕｅｌｌｅ Ｈ． 等の１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２
８５：７８〜８１）。
リア信号配列としては、原則的に、Ｅ．コリー細胞の膜
の侵入を許容する全ての周知信号蛋白質が好適である。 従って、グラム陰性菌からの信号蛋白質、例えば次のＥ
．コリーの蛋白質の信号蛋白質を使用するのも有利であ
る：細胞膜外蛋白質ＯｍｐＡ（ＤｉＲｉｅｎｚｏ 等の
１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，４
８１〜５３２）、アルカリホスファターゼＰｈｏＡ（Ｉ
ｎｏｕｙｅ 等の１９８２、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
． １４９，４３４〜４３９）、ＬａｍＢ−蛋白質（
Ｈｅｄｇｐｅｔｈ 等の１９８０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，２６２１〜
２６２５）、マルトース結合蛋白質Ｍａ１Ｅ（Ｂｅｄｏ
ｕｅｌｌｅ Ｈ． 等の１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２
８５：７８〜８１）。
【００２４】特にα−ＣＧＴアーゼ−信号蛋白質を使用
するのが有利である。
するのが有利である。
【００２５】本発明の方法に好適なベクターは、例えば
プラスミドｐＣＭ７０５（図１参照）であり、これは、
欧州特許（ＥＰ−Ａ）第３８３４１０号明細書に記載の
プラスミドｐＣＭ７０３から、約１ｋｂの長さのＮｒｕ
Ｉ−フラグメントの除去により入手される。このベクタ
ーは、アンピシリン−耐性遺伝子、ｌａｃ−リプレッサ
ーに関する遺伝子及び信号蛋白質に関してコードする断
片を５′−末端に有するＣＧＴアーゼ−遺伝子を有する
。ヒルジン誘導体に関してコードする遺伝子は、ベクタ
ーｐＣＭ７０５内に集めると、細胞内で、そのＮ−末端
にα−ＣＧＴアーゼの信号蛋白質を有する先駆分子が生
じる。この遺伝子構造は、ｔａｃ−プロモーターの制御
下にある。この方法で得られるプラスミドを用いて、Ｅ
．コリー分泌型突然変異体が形質転換されうる。
プラスミドｐＣＭ７０５（図１参照）であり、これは、
欧州特許（ＥＰ−Ａ）第３８３４１０号明細書に記載の
プラスミドｐＣＭ７０３から、約１ｋｂの長さのＮｒｕ
Ｉ−フラグメントの除去により入手される。このベクタ
ーは、アンピシリン−耐性遺伝子、ｌａｃ−リプレッサ
ーに関する遺伝子及び信号蛋白質に関してコードする断
片を５′−末端に有するＣＧＴアーゼ−遺伝子を有する
。ヒルジン誘導体に関してコードする遺伝子は、ベクタ
ーｐＣＭ７０５内に集めると、細胞内で、そのＮ−末端
にα−ＣＧＴアーゼの信号蛋白質を有する先駆分子が生
じる。この遺伝子構造は、ｔａｃ−プロモーターの制御
下にある。この方法で得られるプラスミドを用いて、Ｅ
．コリー分泌型突然変異体が形質転換されうる。
【００２６】ポジチブに形質転換されたクローンを振動
フラスコ中又は培養器中で培養する。約１の光学密度（
ＯＤ６００）の達成時にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド）又はラクトースによる誘導を行
なう。
フラスコ中又は培養器中で培養する。約１の光学密度（
ＯＤ６００）の達成時にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド）又はラクトースによる誘導を行
なう。
【００２７】次いで、トロンビン−不活性化試験（Ｇｒ
ｉｅｓｂａｃｈ 等のＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ３７、（１９８５）、３４７〜３５０）を用い
て、ヒルジン誘導体の生産の経過を測定する。融合蛋白
質の蓄積をＨＰＬＣ−クロマトグラフィ（逆相）により
分析する。融合蛋白質のプレ分（Ｐｒａｅａｎｔｅｉｌ
）は、分解することができ、生じる活性ヒルジン誘導体
を精製することができる。
ｉｅｓｂａｃｈ 等のＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ３７、（１９８５）、３４７〜３５０）を用い
て、ヒルジン誘導体の生産の経過を測定する。融合蛋白
質の蓄積をＨＰＬＣ−クロマトグラフィ（逆相）により
分析する。融合蛋白質のプレ分（Ｐｒａｅａｎｔｅｉｌ
）は、分解することができ、生じる活性ヒルジン誘導体
を精製することができる。
【００２８】
【実施例】次の実施例につき、図１〜図５を用いて本発
明を詳説する。
明を詳説する。
【００２９】図面は次のものを示している：図１
プラスミドｐＣＭ７０５ 図２ ｐＫ１５２からの合成ヒルジン遺伝子のＤ
ＮＡ−配列 図３ オリゴヌクレオチドＨＩＲ１、ＨＩＲ２及
びＨＩＲ３の配列 図４ プラスミドｐＣＭ７０５１図５ プ
ラスミドｐＣＭ７０５３例 １ 分泌ベクターの形成 プラスミドｐＫ１５２は、その配列が欧州特許（ＥＰ−
Ａ）第０１７１０２４号明細書中に記載されている合成
ヒルジン遺伝子を有する。このプラスミドから出発して
、アガロース−ゲル電気泳動により、約２００ｂｐの大
きさのＨｉｎｆＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ−プ
ラグメント（これはヒルジンに関してコードするＤＮＡ
配列の大部分を有する）（図２）を単離した。欠失５′
−末端配列を、新合成オリゴヌクレオチド（ＨＩＲ１）
により再生させる。このオリゴヌクレオチドのこのコー
ドする配列は図３中に示されている。Ｈｉｎｆ Ｉ−
末端の融合により、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジン誘導体が生じる。
プラスミドｐＣＭ７０５ 図２ ｐＫ１５２からの合成ヒルジン遺伝子のＤ
ＮＡ−配列 図３ オリゴヌクレオチドＨＩＲ１、ＨＩＲ２及
びＨＩＲ３の配列 図４ プラスミドｐＣＭ７０５１図５ プ
ラスミドｐＣＭ７０５３例 １ 分泌ベクターの形成 プラスミドｐＫ１５２は、その配列が欧州特許（ＥＰ−
Ａ）第０１７１０２４号明細書中に記載されている合成
ヒルジン遺伝子を有する。このプラスミドから出発して
、アガロース−ゲル電気泳動により、約２００ｂｐの大
きさのＨｉｎｆＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ−プ
ラグメント（これはヒルジンに関してコードするＤＮＡ
配列の大部分を有する）（図２）を単離した。欠失５′
−末端配列を、新合成オリゴヌクレオチド（ＨＩＲ１）
により再生させる。このオリゴヌクレオチドのこのコー
ドする配列は図３中に示されている。Ｈｉｎｆ Ｉ−
末端の融合により、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジン誘導体が生じる。
【００３０】プラスミドｐＣＭ７０５（図１）をＰｓｔ
Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて切断する。双方
の切断位置は、ＣＧＴアーゼの遺伝子に関するコード化
範囲内にあり、これにより、約１ｋｂの大きさのＤＮＡ
−片が切り出される。Ｐｓｔ Ｉは、信号ペプチダー
ゼ切断位置に関してコードする範囲内で正確に切断する
。
Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて切断する。双方
の切断位置は、ＣＧＴアーゼの遺伝子に関するコード化
範囲内にあり、これにより、約１ｋｂの大きさのＤＮＡ
−片が切り出される。Ｐｓｔ Ｉは、信号ペプチダー
ゼ切断位置に関してコードする範囲内で正確に切断する
。
【００３１】フラグメントｐＣＭ７０５ Ｐｓｔ
Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ６．３ｋｂ、ｐＫ１５２
Ｈｉｎｆ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ０．２ｋｂ
及びオリゴヌクレオチドＨＩＲ１は相互に連結され、こ
れにより、プラスミドｐＣＭ７０５１が生じる（図４）
。この連結バッチを用いて、Ｅ．コリー菌株ＨＢ１０１
（ＤＳＭ１６０７）を形質転換させる。アミロペクチン
アズール（着色されたアミロペクチン）を有する選択培
地上でデンプン分解暈を示さず、従ってα−ＣＧＴアー
ゼ−表現を示さないコロニーを単離し、単一になるまで
精製する。多数の精製されたクローンから、プラスミド
−ＤＮＡを単離し、制限分析により特徴付ける。ヒルジ
ン−インサートを有する２個のプラスミドで、融合領域
の配列分析を実施する。
Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ６．３ｋｂ、ｐＫ１５２
Ｈｉｎｆ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ０．２ｋｂ
及びオリゴヌクレオチドＨＩＲ１は相互に連結され、こ
れにより、プラスミドｐＣＭ７０５１が生じる（図４）
。この連結バッチを用いて、Ｅ．コリー菌株ＨＢ１０１
（ＤＳＭ１６０７）を形質転換させる。アミロペクチン
アズール（着色されたアミロペクチン）を有する選択培
地上でデンプン分解暈を示さず、従ってα−ＣＧＴアー
ゼ−表現を示さないコロニーを単離し、単一になるまで
精製する。多数の精製されたクローンから、プラスミド
−ＤＮＡを単離し、制限分析により特徴付ける。ヒルジ
ン−インサートを有する２個のプラスミドで、融合領域
の配列分析を実施する。
【００３２】正確なヒルジン−遺伝子構造を有するプラ
スミド−ＤＮＡを、Ｎｒｕ Ｉ及びＮｄｅ Ｉを用
いて切断し、アガロースゲル電気泳動により５．１８ｋ
ｂの大きさのフラグメントを単離する。
スミド−ＤＮＡを、Ｎｒｕ Ｉ及びＮｄｅ Ｉを用
いて切断し、アガロースゲル電気泳動により５．１８ｋ
ｂの大きさのフラグメントを単離する。
【００３３】Ｎｄｅ Ｉ切断により突出する配列のク
レノフ−酵素での充填の後に、このフラグメントをリゲ
ーションにより環状化させる。生じたプラスミドをｐＣ
Ｍ７０５３と称する（図５）。
レノフ−酵素での充填の後に、このフラグメントをリゲ
ーションにより環状化させる。生じたプラスミドをｐＣ
Ｍ７０５３と称する（図５）。
【００３４】このプラスミドｐＣＭ７０５３を用いて、
分泌型突然変異体Ｅ．コリーＷＣＭ１００（これは、欧
州特許ＥＰ−Ａ第０３３８４１０号明細書に記載の方法
で得られた）を形質転換させる。
分泌型突然変異体Ｅ．コリーＷＣＭ１００（これは、欧
州特許ＥＰ−Ａ第０３３８４１０号明細書に記載の方法
で得られた）を形質転換させる。
【００３５】
例 ２
振動フラスコ実験でのヒルジンの分泌の試験アンピシリ
ン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−培地１０ｍｌに、
ＷＣＭ１００ｐＣＭ７０５３の新製１晩培養物を光学密
度ＯＤ４２０＝０．１まで接種した。この培養物を３０
℃で振動させる。光学密度ＯＤ４２０＝１．０に達した
ら直ちに、インダクターラクトースを１％の最終濃度ま
で添加する。４８時間後に、培養物から試料を取り出し
、細胞を遠心分離し、上澄み中のヒルジン濃度を測定す
る。この測定は、トロンビン失活試験を用いて行なう。 ４０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌ（抗トロンビン単位）までの収
量が測定された（∧２５０ｍｇ／ｌ）。
ン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−培地１０ｍｌに、
ＷＣＭ１００ｐＣＭ７０５３の新製１晩培養物を光学密
度ＯＤ４２０＝０．１まで接種した。この培養物を３０
℃で振動させる。光学密度ＯＤ４２０＝１．０に達した
ら直ちに、インダクターラクトースを１％の最終濃度ま
で添加する。４８時間後に、培養物から試料を取り出し
、細胞を遠心分離し、上澄み中のヒルジン濃度を測定す
る。この測定は、トロンビン失活試験を用いて行なう。 ４０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌ（抗トロンビン単位）までの収
量が測定された（∧２５０ｍｇ／ｌ）。
【００３６】
例 ３
１０ｌ醗酵槽内でのヒルジン生産
アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するミニマル培地
（Ｍｉｎｉｍａｌｍｅｄｉｕｍ）７ｌに、ＷＣＭ１００
ｐＣＭ７０５３の新製１晩培養物を、光学密度ＯＤ６０
０＝０．１になるまで接種する。
（Ｍｉｎｉｍａｌｍｅｄｉｕｍ）７ｌに、ＷＣＭ１００
ｐＣＭ７０５３の新製１晩培養物を、光学密度ＯＤ６０
０＝０．１になるまで接種する。
【００３７】
醗酵条件は次のとおりである：
温度 ：３０℃
撹拌速度：４５０〜９５０ｒ．ｐ．ｍ．通気 ：
０．５〜１．５Ｖｖｍ ｐＨ値 ：７．０±０．１ 光学密度ＯＤ６００＝１．０の達成時に、ＩＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）０．５ｍＭを
添加する。
０．５〜１．５Ｖｖｍ ｐＨ値 ：７．０±０．１ 光学密度ＯＤ６００＝１．０の達成時に、ＩＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）０．５ｍＭを
添加する。
【００３８】ＩＰＴＧ添加後４０時間に、上澄み中で３
６０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌが測定できた（∧２．２５ｇ／
ｌ）。
６０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌが測定できた（∧２．２５ｇ／
ｌ）。
【００３９】
例 ４
Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジンの分泌例１
と同様に実施するが、オリゴヌクレオチドＨＩＲ１の代
りにオリゴヌクレオチドＨＩＲ２（図３）を用いると、
信号ペプチドの離脱の後にＮ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを
有するヒルジン融合蛋白質が得られる。上澄み中でのこ
の融合蛋白質の蓄積を、逆相条件の使用下（Ｃ１８−ク
ロマトグラフィカラム）でＨＰＬＣ−分析により測定す
る。この遺伝子構造を有する菌株ＷＣＭ１００の醗酵は
、融合蛋白質２５ｍｇ／ｌの収量をもたらした。
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジンの分泌例１
と同様に実施するが、オリゴヌクレオチドＨＩＲ１の代
りにオリゴヌクレオチドＨＩＲ２（図３）を用いると、
信号ペプチドの離脱の後にＮ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを
有するヒルジン融合蛋白質が得られる。上澄み中でのこ
の融合蛋白質の蓄積を、逆相条件の使用下（Ｃ１８−ク
ロマトグラフィカラム）でＨＰＬＣ−分析により測定す
る。この遺伝子構造を有する菌株ＷＣＭ１００の醗酵は
、融合蛋白質２５ｍｇ／ｌの収量をもたらした。
【００４０】トリプシン−分解により、Ｎ−末端配列Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有する活性ヒ
ルジンを得ることができる。
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有する活性ヒ
ルジンを得ることができる。
【００４１】
例 ５
分泌型突然変異体ＷＣＭ８８を用いるヒルジンの分泌同
様に欧州特許ＥＰ−Ａ第０３３８４１０号明細書に記載
の方法で得られた分泌型突然変異体ＷＣＭ８８を、プラ
スミドｐＣＭ７０５３を用いて形質転換させる（例１参
照）。培地中での分泌によるヒルジンの生産を、振動フ
ラスコ実験及び醗酵により試験する。
様に欧州特許ＥＰ−Ａ第０３３８４１０号明細書に記載
の方法で得られた分泌型突然変異体ＷＣＭ８８を、プラ
スミドｐＣＭ７０５３を用いて形質転換させる（例１参
照）。培地中での分泌によるヒルジンの生産を、振動フ
ラスコ実験及び醗酵により試験する。
【００４２】
ａ） 振動フラスコ実験
例２と同様に、菌株ＷＣＭ８８ｐＣＭ７０５３を培養す
る。４８時間後に、培養液の上澄み中のヒルジン濃度を
測定する。１８００ＡＴ−Ｕ／ｍｌまでの収量が得られ
た（∧１１０ｍｇ／ｌ）。
る。４８時間後に、培養液の上澄み中のヒルジン濃度を
測定する。１８００ＡＴ−Ｕ／ｍｌまでの収量が得られ
た（∧１１０ｍｇ／ｌ）。
【００４３】
ｂ） １０ｌ醗酵槽内での生産
例３の記載と同様に、菌株の醗酵を行なう。ＩＰＴＧの
添加４５時間後に、上澄み中で２１０００ＡＴ−Ｕ／ｍ
ｌが測定できた（∧１．３ｇ／ｌ）。
添加４５時間後に、上澄み中で２１０００ＡＴ−Ｕ／ｍ
ｌが測定できた（∧１．３ｇ／ｌ）。
【００４４】
例 ６
テトラサイクリン耐性遺伝子を有する分泌ベクターの形
成 プラスミドｐＢＲ３２２（Ｆ． Ｂｏｌｉｖｅｒ 等
の Ｇｅｎｅ ２、９５〜１１３（１９７７））の１
．１ｋｂ Ｎｒｕ Ｉ−フラグメンを単離し、Ｎｒ
ｕ Ｉ−分解により線状化されたプラスミドｐＣＭ７
０５１（図４参照）と連結させた。この連結混合物を用
いてＥ．コリーＨＢ１０１を形質転換させた。形質転換
物をそのテトラサイクリン耐性に基づき選択した。選択
されたクローンのプラスミド−ＤＮＡを再単離し、Ｎｄ
ｅ Ｉ及びＡｖａ Ｉを用いて切断した。ＤＮＡ−
フラグメントをアガロースゲル−電気泳動で分離した。 大きいフラグメントを単離し、突出１本鎖にクレノフ酵
素を充填し、連結させた。
成 プラスミドｐＢＲ３２２（Ｆ． Ｂｏｌｉｖｅｒ 等
の Ｇｅｎｅ ２、９５〜１１３（１９７７））の１
．１ｋｂ Ｎｒｕ Ｉ−フラグメンを単離し、Ｎｒ
ｕ Ｉ−分解により線状化されたプラスミドｐＣＭ７
０５１（図４参照）と連結させた。この連結混合物を用
いてＥ．コリーＨＢ１０１を形質転換させた。形質転換
物をそのテトラサイクリン耐性に基づき選択した。選択
されたクローンのプラスミド−ＤＮＡを再単離し、Ｎｄ
ｅ Ｉ及びＡｖａ Ｉを用いて切断した。ＤＮＡ−
フラグメントをアガロースゲル−電気泳動で分離した。 大きいフラグメントを単離し、突出１本鎖にクレノフ酵
素を充填し、連結させた。
【００４５】生成プラスミドはｐＣＭＴ２０３であった
。
。
【００４６】
例 ７
分泌ベクターｐＣＭＴ２０３の使用下でのヒルジンの分
泌 分泌型突然変異体ＷＣＭ１００（例１参照）を、プラス
ミドｐＣＭＴ２０３を用いて形質転換させた。生じる菌
株を１０ｌ醗酵槽内で培養した。ＩＰＴＧ添加の４５時
間後に、ヒルジン４２０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌが測定され
る（∧２．６３ｇ／ｌ）。
泌 分泌型突然変異体ＷＣＭ１００（例１参照）を、プラス
ミドｐＣＭＴ２０３を用いて形質転換させた。生じる菌
株を１０ｌ醗酵槽内で培養した。ＩＰＴＧ添加の４５時
間後に、ヒルジン４２０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌが測定され
る（∧２．６３ｇ／ｌ）。
【図１】プラスミドｐＣＭ７０５を示す図
【図２】ｐＫ
１５２からの合成ヒルジン遺伝子のＤＮＡ−配列を示す
図
１５２からの合成ヒルジン遺伝子のＤＮＡ−配列を示す
図
【図３】オリゴヌクレオチドＨＩＲ１、ＨＩＲ２及びＨ
ＩＲ３の配列を示す図
ＩＲ３の配列を示す図
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｅ．コリー分泌型突然変異体からヒル
ジン誘導体を得る方法において、 （１） バクテリア信号ペプチドに関してコードする
ＤＮＡ−断片の直後にヒルジン誘導体に関してコードす
る遺伝子を有する組換えベクターを形成し、（２）
工程（１）で形成された組換えベクターを用いてＥ．コ
リー分泌型突然変異体を形質転換させ、（３） この
形質転換された細胞を培地中で培養し、（４） この
培地からヒルジン誘導体を取得することを特徴とする、
Ｅ．コリー分泌型突然変異体からヒルジン誘導体を取得
する方法。 - 【請求項２】 Ｎ−末端配列： Ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ ［ここでＡはＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ
、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＡｓｎを表わす］を有す
ることを特徴とする、ヒルジン誘導体。 - 【請求項３】 請求項２のヒルジン誘導体に関してコ
ードする組換えＤＮＡ。 - 【請求項４】 バクテリア信号ペプチド及びヒルジン
誘導体より成るペプチドに関してコードする遺伝子構造
のコピー１以上を有することを特徴とする、組換えベク
ター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4009268.2 | 1990-03-22 | ||
| DE4009268A DE4009268A1 (de) | 1990-03-22 | 1990-03-22 | Sekretion von hirudinderivaten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211391A true JPH04211391A (ja) | 1992-08-03 |
| JPH07106157B2 JPH07106157B2 (ja) | 1995-11-15 |
Family
ID=6402843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3056714A Expired - Fee Related JPH07106157B2 (ja) | 1990-03-22 | 1991-03-20 | ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5919895A (ja) |
| EP (1) | EP0448093B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07106157B2 (ja) |
| KR (1) | KR950007510B1 (ja) |
| CN (1) | CN1067104C (ja) |
| AT (1) | ATE135042T1 (ja) |
| AU (1) | AU640212B2 (ja) |
| BR (1) | BR9101104A (ja) |
| CA (1) | CA2038888C (ja) |
| DE (2) | DE4009268A1 (ja) |
| DK (1) | DK0448093T3 (ja) |
| ES (1) | ES2084052T3 (ja) |
| FI (1) | FI100250B (ja) |
| GR (1) | GR3019946T3 (ja) |
| HU (1) | HU214368B (ja) |
| IE (1) | IE71174B1 (ja) |
| IL (1) | IL97323A (ja) |
| NO (1) | NO308543B1 (ja) |
| NZ (2) | NZ237437A (ja) |
| PH (1) | PH30485A (ja) |
| PT (1) | PT97093B (ja) |
| RU (1) | RU2118365C1 (ja) |
| ZA (1) | ZA912013B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003510041A (ja) * | 1999-09-18 | 2003-03-18 | アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 培養液中への大腸菌による分泌によってＬｅｕ−ヒルジンを製造するためのシグナル配列 |
| JP2008104462A (ja) * | 2006-10-25 | 2008-05-08 | Wacker Chemie Ag | Ｄｎａ構築物並びに融合タンパク質の発酵的製造方法 |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| SE9203753D0 (sv) * | 1992-12-11 | 1992-12-11 | Kabi Pharmacia Ab | Expression system for producing apolipoprotein ai-m |
| WO1996032409A1 (en) | 1995-04-12 | 1996-10-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Plant cell growth factor |
| JP3746847B2 (ja) * | 1996-08-02 | 2006-02-15 | 協和醗酵工業株式会社 | 植物細胞増殖因子 |
| DE19915938A1 (de) | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Aventis Pharma Gmbh | Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung |
| DE10033195A1 (de) * | 2000-07-07 | 2002-03-21 | Aventis Pharma Gmbh | Bifunktionale Fusionsproteine aus Hirudin und TAP |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| DE10108211A1 (de) * | 2001-02-20 | 2002-08-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verwendung von Fusionsproteinen, deren N-terminaler Anteil aus einem Hirudinderivat besteht, zur Herstellung rekombinanter Proteine über Sekretion durch Hefen |
| US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
| DE102006004871A1 (de) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismenstamm zur Produktion von rekombinanten Proteinen |
| EP1903105B1 (de) * | 2006-09-22 | 2010-04-21 | Wacker Chemie AG | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Proteinen |
| DK1903115T3 (da) | 2006-09-22 | 2011-05-23 | Wacker Chemie Ag | Fremgangsmåde til fermentativ fremstilling af antistoffer |
| EP1905839B2 (de) * | 2006-09-22 | 2019-07-10 | Wacker Chemie AG | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Proteinen |
| DE102006044841A1 (de) | 2006-09-22 | 2008-04-03 | Wacker Chemie Ag | Signalpeptid zur Produktion von rekombinanten Proteinen |
| DE102008063900A1 (de) | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von heterologen Proteinen mittels Escherichia coli |
| CN103848914B (zh) * | 2012-11-29 | 2018-08-28 | 河北以岭医药研究院有限公司 | 一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途 |
| CN103059130A (zh) * | 2012-12-22 | 2013-04-24 | 浙江工业大学 | 一种水蛭素突变体及重组基因工程菌 |
| CN108220369B (zh) * | 2017-12-04 | 2021-03-12 | 广东双骏生物科技有限公司 | 一种生产重组水蛭素的方法 |
| WO2020020438A1 (de) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Wacker Chemie Ag | Neue bakterielle lpp-mutante und deren verwendung zur sekretorischen herstellung von rekombinanten proteinen |
| CN115572329B (zh) * | 2021-06-21 | 2024-02-06 | 王大勇 | 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 |
| WO2026130658A1 (de) | 2024-12-16 | 2026-06-25 | Wacker Chemie Ag | Sekretorische herstellung von rekombinanten proteinen unter verwendung von bakteriellen fnr-mutanten der familie der enterobacteriaceae |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0352228A2 (en) * | 1988-07-19 | 1990-01-24 | Ciba-Geigy Ag | Novel proteins |
| JPH0235077A (ja) * | 1988-04-19 | 1990-02-05 | Consortium Elektrochem Ind Gmbh | 培地中に多量の蛋白質分泌を行うための大腸菌株、その製法及び蛋白質の製法 |
| EP0356335A1 (fr) * | 1988-08-24 | 1990-02-28 | Sanofi | Peptide signal et séquences d'ADN codant pour celui-ci |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2936543A1 (de) * | 1979-09-10 | 1981-04-09 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| DE3586333T2 (de) * | 1984-03-27 | 1992-12-10 | Transgene Sa | Expressionsvektoren fuer hirudin, transformierte zellen und verfahren zur herstellung von hirudin. |
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| GB8412517D0 (en) * | 1984-05-16 | 1984-06-20 | Nagai K | Recombinant fusion proteins |
| DE3583361D1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-08-08 | Ucp Gen Pharma Ag | Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| US4923808A (en) * | 1985-03-12 | 1990-05-08 | Genentech, Inc. | Method for identifying mutants secreting high levels of heterologous proteins |
| DE3900626A1 (de) * | 1985-04-11 | 1989-07-27 | Hoechst Ag | Hirudin-derivat |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| AU604925B2 (en) * | 1988-02-23 | 1991-01-03 | Schering Aktiengesellschaft | A hirudin derivative |
| JPH0648988B2 (ja) * | 1988-07-26 | 1994-06-29 | 工業技術院長 | トロンビン阻害物質の製造法 |
| GB8826428D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Biopharm Ltd | Antithrombin |
| US5164304A (en) * | 1989-05-04 | 1992-11-17 | Sri International | Method and vectors for stabilizing hirudin and human laminin b1 expression |
| DE69130872T2 (de) * | 1990-11-08 | 1999-08-26 | Japan Energy Corp. | Sekretionsvektor, diesen enthaltene transformierte Mikroorganismen und Herstellung von Produkten durch obigen Mikroorganismus |
-
1990
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1996
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0235077A (ja) * | 1988-04-19 | 1990-02-05 | Consortium Elektrochem Ind Gmbh | 培地中に多量の蛋白質分泌を行うための大腸菌株、その製法及び蛋白質の製法 |
| EP0352228A2 (en) * | 1988-07-19 | 1990-01-24 | Ciba-Geigy Ag | Novel proteins |
| EP0356335A1 (fr) * | 1988-08-24 | 1990-02-28 | Sanofi | Peptide signal et séquences d'ADN codant pour celui-ci |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003510041A (ja) * | 1999-09-18 | 2003-03-18 | アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 培養液中への大腸菌による分泌によってＬｅｕ−ヒルジンを製造するためのシグナル配列 |
| JP2008104462A (ja) * | 2006-10-25 | 2008-05-08 | Wacker Chemie Ag | Ｄｎａ構築物並びに融合タンパク質の発酵的製造方法 |
| US7943341B2 (en) | 2006-10-25 | 2011-05-17 | Wacker Chemie Ag | DNA construct and process for the fermentative production of fusion proteins |
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