JPH0649719B2 - ヒルディン誘導体 - Google Patents
ヒルディン誘導体Info
- Publication number
- JPH0649719B2 JPH0649719B2 JP1044980A JP4498089A JPH0649719B2 JP H0649719 B2 JPH0649719 B2 JP H0649719B2 JP 1044980 A JP1044980 A JP 1044980A JP 4498089 A JP4498089 A JP 4498089A JP H0649719 B2 JPH0649719 B2 JP H0649719B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- hirudin
- yeast
- dna
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ヒルディンの誘導体およびその遺伝子工学的製造方法に
関しては、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第0,171,024号明
細書に開示されている。
関しては、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第0,171,024号明
細書に開示されている。
現在、下記のようなアミノ酸配列のヒルディン誘導体が
多くの利点を有することが明らかになっている。
多くの利点を有することが明らかになっている。
ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書において用いられた番号
をこの配列でも用いた。ヒルディンとその誘導体は、生
物活性が異なっている。これはトロンビンに対する親和
性の相違および／または安定性の相違によると考えられ
る。本発明によるヒルディン誘導体は、驚いたことに、
特異的な活性によって特徴づけられる。
をこの配列でも用いた。ヒルディンとその誘導体は、生
物活性が異なっている。これはトロンビンに対する親和
性の相違および／または安定性の相違によると考えられ
る。本発明によるヒルディン誘導体は、驚いたことに、
特異的な活性によって特徴づけられる。
また、本発明によるヒルディン誘導体は、酵母中でとく
に有利に発現されることも明らかにされた。比較実験に
よって、Ｎ−末端Thr-Tyrまたはlle-Tyrで始まる類似ヒ
ルディン誘導体は、低収量でしか発現されないことが示
された。
に有利に発現されることも明らかにされた。比較実験に
よって、Ｎ−末端Thr-Tyrまたはlle-Tyrで始まる類似ヒ
ルディン誘導体は、低収量でしか発現されないことが示
された。
酵母細胞による発現は、ヒルディン誘導体が分泌される
からだけでなく、とくに、それが実質的に量的に正しく
折り畳まれたかたちで高活性を有するので、有利であ
る。
からだけでなく、とくに、それが実質的に量的に正しく
折り畳まれたかたちで高活性を有するので、有利であ
る。
第１図は、酵母ＭＦα前駆体タンパク質および本発明に
よるヒルディン誘導体をコードする遺伝子構造物を構築
するために有用なクローニングベクターを示す。第２図
は、この遺伝子構造物を含む酵母発現ベクターを示す。
よるヒルディン誘導体をコードする遺伝子構造物を構築
するために有用なクローニングベクターを示す。第２図
は、この遺伝子構造物を含む酵母発現ベクターを示す。
本発明によるヒルディン誘導体は、もちろん、他の方
法、例えば、細菌または昆虫細胞あるいは動物細胞など
の高等真核細胞における発現などによっても製造され
る。しかしながら、酵母系（system）による発現、例え
ばＥＰ−Ａ第0,248,227号明細書に列記された酵母種、
例えばピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ハン
セヌラ・ポリモルフィス（Hansenula polymorphis）、
スキゾサッカロミセス・ボンベ（Schizosaccharomyces
pombe）または好ましくはサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）などを用いる発現は、好
ましい。
法、例えば、細菌または昆虫細胞あるいは動物細胞など
の高等真核細胞における発現などによっても製造され
る。しかしながら、酵母系（system）による発現、例え
ばＥＰ−Ａ第0,248,227号明細書に列記された酵母種、
例えばピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ハン
セヌラ・ポリモルフィス（Hansenula polymorphis）、
スキゾサッカロミセス・ボンベ（Schizosaccharomyces
pombe）または好ましくはサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）などを用いる発現は、好
ましい。
酵母における発現のためのベクターは、例えばＥＰ−Ａ
明細書第0,060,057号、第0,008,632号、第0,116,201
号、第0,121,884号、第0,123,544号および第0,195,691
号に記載のものなど、多数が知られている。本発明によ
るヒルディン誘導体の製造法は、以下に酵母α因子系を
用いて記述されるが、これが単なる例示であることは、
既知の方法によって他の発現系を用いることも可能であ
ることから自明である。
明細書第0,060,057号、第0,008,632号、第0,116,201
号、第0,121,884号、第0,123,544号および第0,195,691
号に記載のものなど、多数が知られている。本発明によ
るヒルディン誘導体の製造法は、以下に酵母α因子系を
用いて記述されるが、これが単なる例示であることは、
既知の方法によって他の発現系を用いることも可能であ
ることから自明である。
酵母フェロモン（pheromone）遺伝子ＭＦαは、Kurjan
およびHerskovitz(Cell 30、933-943、1982）の記述で公
知であるが、ここでは他の遺伝子の発現と遺伝子産生物
の分泌の可能性についても検討されている。この点に関
しては、Brakeら（Proc.Natl.Acad.Sci.81、4642-4646、1
984）の記述も参照されたい。
およびHerskovitz(Cell 30、933-943、1982）の記述で公
知であるが、ここでは他の遺伝子の発現と遺伝子産生物
の分泌の可能性についても検討されている。この点に関
しては、Brakeら（Proc.Natl.Acad.Sci.81、4642-4646、1
984）の記述も参照されたい。
有利に用いられる酵母ベクターは、細菌プラスミドおよ
び酵母プラスミドの複製開始点と両宿主系における選択
のための遺伝子とを有する、いわゆるシャトルベクター
である。さらに、このタイプのベクターは、外来性遺伝
子の発現に必要なプロモーター配列と、必要であれば収
量を上げるためのターミネーター配列を含み、ここには
（適宜分泌シグナルに融合した）異種構造（heterologo
us）の遺伝子がプロモーターとターミネータの間に位置
している。
び酵母プラスミドの複製開始点と両宿主系における選択
のための遺伝子とを有する、いわゆるシャトルベクター
である。さらに、このタイプのベクターは、外来性遺伝
子の発現に必要なプロモーター配列と、必要であれば収
量を上げるためのターミネーター配列を含み、ここには
（適宜分泌シグナルに融合した）異種構造（heterologo
us）の遺伝子がプロモーターとターミネータの間に位置
している。
本発明は、以下の諸例によって詳細に説明される通りで
ある。パーセント表示は、重量パーセントである。
ある。パーセント表示は、重量パーセントである。
例１：発現ベクターの構築 まず、ＤＮＡ配列Ｉ（表１）をホスファイト法にて合成
する。このＤＮＡ配列は、ＭＦα前駆体タンパク質のア
ミノ酸４９〜８０をコードし、実質的には天然の（natu
ral）ＤＮＡ配列に相当する。
する。このＤＮＡ配列は、ＭＦα前駆体タンパク質のア
ミノ酸４９〜８０をコードし、実質的には天然の（natu
ral）ＤＮＡ配列に相当する。
ＤＮＡ配列Ｉは、最初はα因子をコードする遺伝子の単
離のためのプローブとして用いられ、この目的のため
に、32Ｐで標識する。このプローブを用いて遺伝子をゲ
ノムλｇｔ１１酵母遺伝子バンク［例えば、Clontech L
aboratories Inc.(4055 Fabian Way、Palo Alto、CA9430
3）から現在市販されているもの］から単離する。この
目的のために、α因子遺伝子を有するλｇｔ１１ファー
ジをプラークハイブリダイゼーション実験において同定
する。陽性と同定されたプラークからのファージを単離
して増殖させて、ＤＮＡを得る。後者をＥｃｏＲＩにて
切断して０．８％アガロースゲル上で分析する。サザン
トランスファー実験の後、膜を32Ｐ−標識ＤＮＡ配列Ｉ
とハイブリダイズさせる。ＤＮＡ配列Ｉとハイブリダイ
ズする約１．７５kbのフラグメントを有するファージＤ
ＮＡを、再び酵素で切断して、対応するフラグメントを
単離する。ベクターｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで開裂し
て、Ｔ４リガーゼを用いて１．７５kbフラグメントと反
応させる。クローニングベクター１が得られる。
離のためのプローブとして用いられ、この目的のため
に、32Ｐで標識する。このプローブを用いて遺伝子をゲ
ノムλｇｔ１１酵母遺伝子バンク［例えば、Clontech L
aboratories Inc.(4055 Fabian Way、Palo Alto、CA9430
3）から現在市販されているもの］から単離する。この
目的のために、α因子遺伝子を有するλｇｔ１１ファー
ジをプラークハイブリダイゼーション実験において同定
する。陽性と同定されたプラークからのファージを単離
して増殖させて、ＤＮＡを得る。後者をＥｃｏＲＩにて
切断して０．８％アガロースゲル上で分析する。サザン
トランスファー実験の後、膜を32Ｐ−標識ＤＮＡ配列Ｉ
とハイブリダイズさせる。ＤＮＡ配列Ｉとハイブリダイ
ズする約１．７５kbのフラグメントを有するファージＤ
ＮＡを、再び酵素で切断して、対応するフラグメントを
単離する。ベクターｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで開裂し
て、Ｔ４リガーゼを用いて１．７５kbフラグメントと反
応させる。クローニングベクター１が得られる。
表２に列記したクローニングベクターは、全てｐＣＵプ
ラスミドを基礎に構築されたものである。この表はこれ
らベクターのポリリンカー領域のみを通常の５′−３′
の方向で示したものである。ここで、ＭＦα配列を点線
で、ヒルディン配列を破線で示した。実線は、ｐＣＵお
よびリンカー配列を表す。第１図は、これらクローニン
グベクターを模式的に図示したものである（比例尺で示
したものではない）。
ラスミドを基礎に構築されたものである。この表はこれ
らベクターのポリリンカー領域のみを通常の５′−３′
の方向で示したものである。ここで、ＭＦα配列を点線
で、ヒルディン配列を破線で示した。実線は、ｐＣＵお
よびリンカー配列を表す。第１図は、これらクローニン
グベクターを模式的に図示したものである（比例尺で示
したものではない）。
大腸菌（E.coli）７９／０２株をライゲーション反応混
合液にて形質転換させる。白色のコロニーを単離して、
プラスミドＤＮＡをこれらから得て、１．７５kbのＥｃ
ｏＲＩフラグメントを含むプラスミドを同定する。ＭＦ
αの前駆体タンパク質の天然のＤＮＡ配列は、アミノ酸
８〜１０をコードする領域にＰｓｔＩ切断部位を、アミ
ノ酸４８／４９をコードする領域にＴａｑＩ切断部位
を、各々含む。ＭＦα前駆体配列のアミノ酸９〜４８を
コードするフラグメントは、単離されたプラスミドＤＮ
ＡからＰｓｔＩおよびＴａｑＩの反応によってここで単
離される。ベクターｐＣＵ１８をＰｓｔＩおよびＫｐｎ
Ｉによって開裂させ、Ｔ４リガーゼを用いてＰｓｔＩ−
ＴａｑＩフラグメントおよび合成ＤＮＡ配列Ｉと反応さ
せる。大腸菌７９／０２をライゲーション反応混合液で
形質転換させる。形質転換反応混合物をＩＰＴＧ−Ｘｇ
ａｌ−Ａｐプレートにプレーティングする。白色コロニ
ーを単離して、これらクローンのプラスミドＤＮＡを制
限酵素分析によって特徴づけする。このようにして、Ｍ
Ｆα前駆体配列のアミノ酸８〜８０をコードするクロー
ニングベクター２を得る。
合液にて形質転換させる。白色のコロニーを単離して、
プラスミドＤＮＡをこれらから得て、１．７５kbのＥｃ
ｏＲＩフラグメントを含むプラスミドを同定する。ＭＦ
αの前駆体タンパク質の天然のＤＮＡ配列は、アミノ酸
８〜１０をコードする領域にＰｓｔＩ切断部位を、アミ
ノ酸４８／４９をコードする領域にＴａｑＩ切断部位
を、各々含む。ＭＦα前駆体配列のアミノ酸９〜４８を
コードするフラグメントは、単離されたプラスミドＤＮ
ＡからＰｓｔＩおよびＴａｑＩの反応によってここで単
離される。ベクターｐＣＵ１８をＰｓｔＩおよびＫｐｎ
Ｉによって開裂させ、Ｔ４リガーゼを用いてＰｓｔＩ−
ＴａｑＩフラグメントおよび合成ＤＮＡ配列Ｉと反応さ
せる。大腸菌７９／０２をライゲーション反応混合液で
形質転換させる。形質転換反応混合物をＩＰＴＧ−Ｘｇ
ａｌ−Ａｐプレートにプレーティングする。白色コロニ
ーを単離して、これらクローンのプラスミドＤＮＡを制
限酵素分析によって特徴づけする。このようにして、Ｍ
Ｆα前駆体配列のアミノ酸８〜８０をコードするクロー
ニングベクター２を得る。
ＰｓｔＩおよびＫｐｎＩを用いる反応によってクローニ
ングベクター２から該コード配列を切り出して、下記の
ライゲーション反応に導入する。この目的のために、ク
ローニングベクター１をＥｃｏＲＩおよび部分的にＰｓ
ｔＩと反応させて、ＭＦα前駆体配列の最初の８個のア
ミノ酸をコードする配列からなるフラグメントを単離す
る。さらに、ベクターｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩにて開裂させて、前述した二つのフラグメントと
連結させて、クローニングベクター３を得る。後者は、
アミノ酸８０までの完全なＭＦα前駆体配列物をコード
する。
ングベクター２から該コード配列を切り出して、下記の
ライゲーション反応に導入する。この目的のために、ク
ローニングベクター１をＥｃｏＲＩおよび部分的にＰｓ
ｔＩと反応させて、ＭＦα前駆体配列の最初の８個のア
ミノ酸をコードする配列からなるフラグメントを単離す
る。さらに、ベクターｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩにて開裂させて、前述した二つのフラグメントと
連結させて、クローニングベクター３を得る。後者は、
アミノ酸８０までの完全なＭＦα前駆体配列物をコード
する。
ほとんどのヒルディン配列の出発材料は合成遺伝子であ
り、これはＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書に「ＤＮＡ配
列Ｉ」として開示され、本発明においてはＤＮＡ配列IV
として表１に示されている。この配列の制限酵素切断部
位はアンダーラインで強調して示されている。ＡｃｃＩ
はアミノ酸１〜３の領域を切断し、ＢａｍＨＩはアミノ
酸３０／３１の領域を切断し、ＳａｃＩは最後の終止コ
ードンの最初を切断する。ＸｂａＩの突出配列は遺伝子
の５′末端に位置し、ＳａｌＩの突出配列は３′末端に
位置している。この合成遺伝子を二つの部分にサブクロ
ーニングさせた（ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書の第１
および第２図。）これらサブクローニングベクターは２
表のNo.４（ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書第２図に対
応）およびNo.６（ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書第１図
に対応）に示されている。
り、これはＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書に「ＤＮＡ配
列Ｉ」として開示され、本発明においてはＤＮＡ配列IV
として表１に示されている。この配列の制限酵素切断部
位はアンダーラインで強調して示されている。ＡｃｃＩ
はアミノ酸１〜３の領域を切断し、ＢａｍＨＩはアミノ
酸３０／３１の領域を切断し、ＳａｃＩは最後の終止コ
ードンの最初を切断する。ＸｂａＩの突出配列は遺伝子
の５′末端に位置し、ＳａｌＩの突出配列は３′末端に
位置している。この合成遺伝子を二つの部分にサブクロ
ーニングさせた（ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書の第１
および第２図。）これらサブクローニングベクターは２
表のNo.４（ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書第２図に対
応）およびNo.６（ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書第１図
に対応）に示されている。
クローニングベクター４をＨｉｎｃIIおよびＨｉｎｄII
Iで開裂させて、線状になったＤＮＡをＤＮＡ配列II
（表１）に連結させる。このようにして得たクローニン
グベクター５において平滑末端連結（blunt-ended liga
tion）をした部位にＮｃｏＩ切断部位が形成される。
Iで開裂させて、線状になったＤＮＡをＤＮＡ配列II
（表１）に連結させる。このようにして得たクローニン
グベクター５において平滑末端連結（blunt-ended liga
tion）をした部位にＮｃｏＩ切断部位が形成される。
ヒルディンの部分配列をコードするフラグメントを、Ｂ
ａｍＨＩおよびＡｃｃＩを用いる全消化によってクロー
ニングベクター６から切り出す。次いで、このフラグメ
ントを、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで開裂しておいたク
ローニングベクター３とＤＮＡ配列III（表１）とに連
結させる。
ａｍＨＩおよびＡｃｃＩを用いる全消化によってクロー
ニングベクター６から切り出す。次いで、このフラグメ
ントを、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで開裂しておいたク
ローニングベクター３とＤＮＡ配列III（表１）とに連
結させる。
ＤＮＡ配列III中の最後の三つのコードンをＤＮＡ配列I
V（表１）と同様に番号を付す。この結果、ＭＦα前駆
体配列の最初の８０個のアミノ酸および本発明によるヒ
ルディン誘導体の最初の３０個のアミノ酸をコードする
クローニングベクター７が形成される。これをＤＮＡ配
列分析によって確認する。
V（表１）と同様に番号を付す。この結果、ＭＦα前駆
体配列の最初の８０個のアミノ酸および本発明によるヒ
ルディン誘導体の最初の３０個のアミノ酸をコードする
クローニングベクター７が形成される。これをＤＮＡ配
列分析によって確認する。
ヒルディンのアミノ酸３１〜６４をコードするフラグメ
ントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIによってクローニ
ングベクター５から切り出す。このフラグメントを同じ
酵素で開裂させておいたクローニングベクター７に連結
させる。その結果、ＭＦα前駆体配列の最初の８０個の
アミノ酸および本発明によるヒルディン誘導体の完全な
配列をコードするクローニングベクター８が得られる。
このプラスミドの構造を制限酵素分析にて確認する。
ントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIによってクローニ
ングベクター５から切り出す。このフラグメントを同じ
酵素で開裂させておいたクローニングベクター７に連結
させる。その結果、ＭＦα前駆体配列の最初の８０個の
アミノ酸および本発明によるヒルディン誘導体の完全な
配列をコードするクローニングベクター８が得られる。
このプラスミドの構造を制限酵素分析にて確認する。
プラスミドＹｅｐ１３（Broachら：Gene ８、121、197
9）をＢａｍＨＩで開裂して、突出末端をクレノウポリ
メラーゼで埋填する。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ
て、牛アルカリホスファターゼで処理する。
9）をＢａｍＨＩで開裂して、突出末端をクレノウポリ
メラーゼで埋填する。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ
て、牛アルカリホスファターゼで処理する。
ヒルディン誘導体およびＭＦα前駆体配列をコードする
フラグメントをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩでクローニン
グベクター８（表２）から切り出して、突出末端を上記
のようにして埋填する。
フラグメントをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩでクローニン
グベクター８（表２）から切り出して、突出末端を上記
のようにして埋填する。
二つの平滑末端ＤＮＡをともに連結させて、プラスミド
ｐαｆＨｉｒ１７およびｐαｆＨｉｒ１８を構築する
（第２図）。これら二つのプラスミドは、挿入フラグメ
ントの位置方向が異なるのみである。
ｐαｆＨｉｒ１７およびｐαｆＨｉｒ１８を構築する
（第２図）。これら二つのプラスミドは、挿入フラグメ
ントの位置方向が異なるのみである。
ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書に記載されているよう
に、挿入配列の下流にターミネーターを挿入することが
可能である（ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書第４〜６
図）。この目的には、ＮｃｏＩおよび／またはＢａｍＨ
Ｉ切断部位が適している。
に、挿入配列の下流にターミネーターを挿入することが
可能である（ＥＰ−Ａ第0,171,024号明細書第４〜６
図）。この目的には、ＮｃｏＩおよび／またはＢａｍＨ
Ｉ切断部位が適している。
プラスミドＤＮＡを大腸菌ＭＭ２９４中で増殖させた後
に、プラスミドｐαｆＨｉｒ１７にてロイシン要求性
（leucine-dependent）酵母Ｙ７９株（α、ｔｒｐ１−
１、ｌｅｕ２−１）（Cantrellら：Proc.Acad.Nat.Sci.
USA 82、6250,1985）およびＤＭ−６−６株（α／αｌｅ
ｕ２−３、１１２：：ｕｒａ３＋／ｌｅｕ２：：ｌｙｓ
２＋、ｔｒｐ１−／ｔｒｐ１−、ｈｉｓ３−１１、１５
／ｈｉｓ３−１１、１５、ｕｒａ３−／ｕｒａ３−、ｌ
ｙｓ２−／ｌｙｓ２−、ａｒｇ４−１７／ａｒｇ４＋、
ａｄｅ１−／ａｄｅ１＋）（Maya Hanna,Dept.Mol.Bio
l.Massachusetts General Hospital、Boston、USA）をIto
らのリチウム法（Ito,H.ら：J.Bacteriol.153、163、198
3）によって形質転換させる。ロイシン無添加の選択培
地上で増殖することができる単一コロニーを単離する。
酵母ミニマル培地に各々のコロニーを接種して、２８℃
で２４時間培養する。細胞を遠心分離して、上清液をト
ロンビン阻害分析してヒルディン活性を調べる。上清液
がヒルディン活性を示した酵母クローンからのプラスミ
ドＤＮＡを再び単離して、制限酵素分析にて特徴づけを
する。形質転換させた酵母株を次の発現試験に用いる。
に、プラスミドｐαｆＨｉｒ１７にてロイシン要求性
（leucine-dependent）酵母Ｙ７９株（α、ｔｒｐ１−
１、ｌｅｕ２−１）（Cantrellら：Proc.Acad.Nat.Sci.
USA 82、6250,1985）およびＤＭ−６−６株（α／αｌｅ
ｕ２−３、１１２：：ｕｒａ３＋／ｌｅｕ２：：ｌｙｓ
２＋、ｔｒｐ１−／ｔｒｐ１−、ｈｉｓ３−１１、１５
／ｈｉｓ３−１１、１５、ｕｒａ３−／ｕｒａ３−、ｌ
ｙｓ２−／ｌｙｓ２−、ａｒｇ４−１７／ａｒｇ４＋、
ａｄｅ１−／ａｄｅ１＋）（Maya Hanna,Dept.Mol.Bio
l.Massachusetts General Hospital、Boston、USA）をIto
らのリチウム法（Ito,H.ら：J.Bacteriol.153、163、198
3）によって形質転換させる。ロイシン無添加の選択培
地上で増殖することができる単一コロニーを単離する。
酵母ミニマル培地に各々のコロニーを接種して、２８℃
で２４時間培養する。細胞を遠心分離して、上清液をト
ロンビン阻害分析してヒルディン活性を調べる。上清液
がヒルディン活性を示した酵母クローンからのプラスミ
ドＤＮＡを再び単離して、制限酵素分析にて特徴づけを
する。形質転換させた酵母株を次の発現試験に用いる。
例２：発現 １０mlの酵母完全培地に例１で得られた株の選択培地か
らの新鮮な一晩培養液から採取した細胞を接種して、吸
光度ＯＤ600＝０・１になるようにする。培養液を振と
うしながら２８℃で８時間培養し、その後、９０mlの新
鮮培地を加える。さらに振とうしながら２０時間培養を
続ける。細胞を遠心分離して、上清液中のヒルディン活
性を測定する。
らの新鮮な一晩培養液から採取した細胞を接種して、吸
光度ＯＤ600＝０・１になるようにする。培養液を振と
うしながら２８℃で８時間培養し、その後、９０mlの新
鮮培地を加える。さらに振とうしながら２０時間培養を
続ける。細胞を遠心分離して、上清液中のヒルディン活
性を測定する。
例３：精製 例２のようにして得られた上清液を、pH３〜５の酸性に
して、０．１Ｍ酢酸で平衡にしておいたスチレンおよび
ジビニルベンゼンのコポリマーからなる有孔性吸着樹脂
（（Ｒ）ＤＩＡＩＯＮ ＨＰ２０）を含む吸着カラムに
て処理する。トリス−ＨＣｌ（pH８．５）および５０mM
酢酸にて洗浄した後に、３０％強度のイソプロパノール
にて溶出を行う。ヒルディン誘導体を含む画分を集め
て、２０mMピペラジン−ＨＣｌ（pH６）で平衡にしてお
いたＱ−ＳＥＰＨ−ＡＲＯＳＥ（Ｒ）カラムにて精製す
る。この場合の溶出は、０〜０．２５Ｍ ＮａＣｌ濃度
勾配にて行う。ヒルディン誘導体を含む画分を再び集め
て、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーカラム上のＨＰＬＣ
によって精製する。このようにして得られる精製産物
を、次いで自動タンパク質配列分析機にかける。
して、０．１Ｍ酢酸で平衡にしておいたスチレンおよび
ジビニルベンゼンのコポリマーからなる有孔性吸着樹脂
（（Ｒ）ＤＩＡＩＯＮ ＨＰ２０）を含む吸着カラムに
て処理する。トリス−ＨＣｌ（pH８．５）および５０mM
酢酸にて洗浄した後に、３０％強度のイソプロパノール
にて溶出を行う。ヒルディン誘導体を含む画分を集め
て、２０mMピペラジン−ＨＣｌ（pH６）で平衡にしてお
いたＱ−ＳＥＰＨ−ＡＲＯＳＥ（Ｒ）カラムにて精製す
る。この場合の溶出は、０〜０．２５Ｍ ＮａＣｌ濃度
勾配にて行う。ヒルディン誘導体を含む画分を再び集め
て、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーカラム上のＨＰＬＣ
によって精製する。このようにして得られる精製産物
を、次いで自動タンパク質配列分析機にかける。
例４：比較例 例１の同様の操作を行う。ただし、ＤＮＡ配列III（表
１）の代わりに次式の配列を用いる。その結果、酵母培
養液の上清液には微少のヒルディン活性しか検出されな
い。
１）の代わりに次式の配列を用いる。その結果、酵母培
養液の上清液には微少のヒルディン活性しか検出されな
い。
ＤＮＡ配列IIIｂを用いる場合には、クローニングベク
ター７および８（表２）に対応するベクターはＡｃｃＩ
切断部位を含まない。
ター７および８（表２）に対応するベクターはＡｃｃＩ
切断部位を含まない。
【図面の簡単な説明】 第１図は、酵母ＭＦα前駆体タンパク質および本発明に
よるヒルディン誘導体をコードする遺伝子構造物を構築
するために有用なクローニングベクターを示す、説明図
である。 第２図はこの遺伝子構造物を含む酵母発現ベクターを示
す、説明図である。
よるヒルディン誘導体をコードする遺伝子構造物を構築
するために有用なクローニングベクターを示す、説明図
である。 第２図はこの遺伝子構造物を含む酵母発現ベクターを示
す、説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ０７Ｋ 99:00 (56)参考文献 特開 昭61−47198（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−22799（ＪＰ，Ａ)
Claims (4)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するヒルディン誘
導体。 - 【請求項２】請求項１に記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項３】請求項２に記載のＤＮＡ配列を含むベクタ
ー。 - 【請求項４】請求項２に記載のＤＮＡを酵母細胞におい
て発現させることからなる、請求項１に記載のポリペプ
チドの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3805540 | 1988-02-23 | ||
| DE3805540.6 | 1988-02-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH025891A JPH025891A (ja) | 1990-01-10 |
| JPH0649719B2 true JPH0649719B2 (ja) | 1994-06-29 |
Family
ID=6347932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1044980A Expired - Lifetime JPH0649719B2 (ja) | 1988-02-23 | 1989-02-23 | ヒルディン誘導体 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5180668A (ja) |
| JP (1) | JPH0649719B2 (ja) |
| KR (1) | KR970009950B1 (ja) |
| AU (1) | AU604925B2 (ja) |
| CA (1) | CA1339104C (ja) |
| HU (2) | HU210439B (ja) |
| IE (1) | IE65354B1 (ja) |
| NO (2) | NO176915C (ja) |
| NZ (1) | NZ228064A (ja) |
| PH (1) | PH25937A (ja) |
| PT (1) | PT89778B (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| DK0687731T3 (da) * | 1990-11-08 | 1999-09-20 | Japan Energy Corp | Sekretionsvektor, transformerede mikroorganismer indeholdende vektoren og fremstilling af produkter fra denne mikroorganism |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| DE19543737A1 (de) * | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
| DE19544233A1 (de) * | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur Nutzung des Hefe-ADH II-Promotorsystems zur biotechnologischen Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten |
| DE19944870A1 (de) * | 1999-09-18 | 2001-03-29 | Aventis Pharma Gmbh | Signalsequenzen zur Herstellung von Leu-Hirudin über Sekretion durch E. coli in das Kulturmedium |
| US7795205B2 (en) * | 2004-04-12 | 2010-09-14 | Canyon Pharmaceuticals, Inc. | Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3445532A1 (de) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
-
1988
- 1988-06-23 AU AU18284/88A patent/AU604925B2/en not_active Expired
-
1989
- 1989-01-10 US US07/295,422 patent/US5180668A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-21 KR KR89002002A patent/KR970009950B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-21 PH PH38226A patent/PH25937A/en unknown
- 1989-02-21 NZ NZ228064A patent/NZ228064A/en unknown
- 1989-02-22 HU HU89854A patent/HU210439B/hu unknown
- 1989-02-22 CA CA000591790A patent/CA1339104C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-22 IE IE55989A patent/IE65354B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-02-22 NO NO890758A patent/NO176915C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-02-22 PT PT89778A patent/PT89778B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-02-23 JP JP1044980A patent/JPH0649719B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-29 HU HU95P/P00596P patent/HU211828A9/hu unknown
-
1998
- 1998-05-26 NO NO1998016C patent/NO1998016I1/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO1998016I1 (no) | 1998-05-26 |
| NO890758L (no) | 1989-08-24 |
| NO890758D0 (no) | 1989-02-22 |
| US5180668A (en) | 1993-01-19 |
| HUT50502A (en) | 1990-02-28 |
| NO176915C (no) | 1995-06-21 |
| PT89778A (pt) | 1989-10-04 |
| AU604925B2 (en) | 1991-01-03 |
| NZ228064A (en) | 1990-12-21 |
| IE890559L (en) | 1989-08-23 |
| HU211828A9 (en) | 1995-12-28 |
| JPH025891A (ja) | 1990-01-10 |
| IE65354B1 (en) | 1995-10-18 |
| KR970009950B1 (en) | 1997-06-19 |
| NO176915B (no) | 1995-03-13 |
| AU1828488A (en) | 1989-08-24 |
| HU210439B (en) | 1995-04-28 |
| CA1339104C (en) | 1997-07-29 |
| PH25937A (en) | 1991-12-19 |
| PT89778B (pt) | 1994-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3085973B2 (ja) | 組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列として新規ｄｎａ断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方法 | |
| KR100227167B1 (ko) | 인체혈청알부민의 n-말단 단편을 함유하는 융합단백질 | |
| KR0139629B1 (ko) | 미니-프로인슐린, 이의 제조방법 및 용도 | |
| JP2733602B2 (ja) | ヒルジンをコードする発現カセット、プラスミド及び形質転換酵母 | |
| EP0225633B1 (en) | Production of thrombin inhibitors | |
| JPS63313587A (ja) | 微生物宿主細胞による第８因子活性を有するタンパク質の製造法、発現ベクタ−、宿主細胞、抗体 | |
| US6875589B1 (en) | Mini-proinsulin, its preparation and use | |
| DK172350B1 (da) | Hirudin-derivat, DNA, der koder derfor, vektorer, der indeholder en sådan DNA, fremstilling af hirudin-derivatet samt lægemiddel indeholdende dette | |
| JPH04211391A (ja) | ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター | |
| KR100858833B1 (ko) | 효모에 의해 분비되는 재조합 단백질의 제조를 위한,ｎ-말단 부분이 히루딘 유도체인 융합 단백질의 용도 | |
| AU2002247696B2 (en) | Use of supersecretable peptides in processes for their production and for parallel improvement of the exported forms of one or more other polypeptides | |
| JPH0649719B2 (ja) | ヒルディン誘導体 | |
| JPH0213377A (ja) | デスルファトヒルジン化合物の製造方法 | |
| Stetler et al. | Secretion of Active, Full–and Half–Length Human Secretory Leukocyte Protease Inhibitor by Sacchammyces Cerevisiae | |
| JP2730923B2 (ja) | Ｂａｒ１分泌シグナル | |
| US6410272B1 (en) | Production of thrombin inhibitors | |
| AU701136B2 (en) | Novel inhibitor | |
| EP0662514A1 (en) | Hirustasin, an antistasin type serine proteinase inhibitor from Hiruda | |
| JP2623807B2 (ja) | セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子 | |
| PT716705E (pt) | Processo para a preparacao por recombinacao de proteinas na levedura hansenula | |
| Cook et al. | Expression and Purification of Recombinant Tick Anticoagulant Peptide (Y1W/D10R) Double Mutant Secreted bySaccharomyces cerevisiae | |
| DE3900626A1 (de) | Hirudin-derivat | |
| JPH07241196A (ja) | アルブミンおよびヒトアポリポプロテインｅ様遺伝子を有する融合遺伝子、それを挿入したプラスミド並びにその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080629 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090629 Year of fee payment: 15 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090629 Year of fee payment: 15 |