JPH04211395A - 合成ヒト抗体の遺伝子バンクの製造および使用 - Google Patents

合成ヒト抗体の遺伝子バンクの製造および使用

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JPH04211395A
JPH04211395A JP3032216A JP3221691A JPH04211395A JP H04211395 A JPH04211395 A JP H04211395A JP 3032216 A JP3032216 A JP 3032216A JP 3221691 A JP3221691 A JP 3221691A JP H04211395 A JPH04211395 A JP H04211395A
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human antibody
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synthetic human
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メルビン、リトル
Frank Berthold Breitling
フランク、ベルトルト、ブライトリング
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トマス、シーハウス
Stefan Duebel
シュテファン、デューベル
Iris Klewinghaus
イリス、クレウィングハウス
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は合成ヒト抗体（ｈｕＡｂ）又は抗
原結合ドメインを含んだ抗体の一部の遺伝子バンク（「
合成ヒト抗体ライブラリー」）の製造及び使用に関する
。適切なベクター中におけるｈｕＡｂ枠組み構造から出
発して、抗体ｃＤＮＡの超可変領域はほとんど「ランダ
ムに」組合されたオリゴヌクレオチドにより形成される
。ここでは超可変領域で比較的保存されたアミノ酸がオ
リゴヌクレオチド合成における適切なヌクレオチドの選
択に際して考慮され、同様に、用いられるヌクレオチド
の比率もナンセンスコドンがせいぜい８９番目の位置毎
に予想されるように選択される。従って、微生物発現系
、例えば大腸菌における後記ベクターｐＦＭＴ中でのこ
の合成ｈｕＡｂ　　ｃＤＮＡの発現により、選択抗原を
用いてスクリーニングするために包括的レパートリーと
して合成ｈｕＡｂライブラリーをインビトロで用いるこ
とができる。ヒト又は哺乳動物免疫系は概算数で１０６
〜１０８の異なる抗体を含んでいる。この抗体数は、全
自然抗原及び人工抗原の双方に対する体の免疫反応を起
こす上で十分であると思われる。更に、しばしば異なる
抗体が同一抗原と反応することを考慮にいれれば、実際
に異なる抗体のレパートリーはむしろ１０６〜１０７の
範囲であろう。現在までに特異的抗体は、特定抗原での
免疫化、例えば体内への抗原の注入又は脾臓細胞とこの
抗原とのインビトロインキュベーションから出発して常
に得られていた。ポリクローナル抗体の場合において、
免疫グロブリンは従って血清から単離でき、特異的抗体
は例えば吸着法でそこから単離できる。モノクローナル
抗体は、個々のＢリンパ球と融合されてクローニングさ
れた脾臓腫瘍細胞（ハイブリドーマ細胞）の細胞上澄又
は細胞溶解物から単離される。上記方法は、特異的ヒト
抗体又はヒトモノクローナル抗体の製造に関して特に不
適である。
【０００２】したがって、本発明は合成超可変ドメイン
を含んだ特異的ヒトモノクローナル抗体（ｈｕＭＡｂ）
又は抗体の部分を産生させるために一般的に使用可能な
方法を開発するという目的を有している。Ｈ又はＬ鎖の
各可変部分の３つの超可変領域（ＣＤＲ１、２及び３と
称され、ＣＤＲは抗原結合決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅ
ｎｔａｒｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）
　　を意味する）をコードするほとんどランダムに合成
されたオリゴヌクレオチドを用いることで、合成ヒト遺
伝子バンクが生成されうることがここに見出された。次
いで、合成された抗体ＤＮＡは、好ましくはポリメラー
ゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いた増幅後に、好ましくはこの
目的のため特に組立てられた抗体発現ベクター、即ちベ
クターｐＦＭＴに結合された。Ｈ及びＬ鎖の可変ドメイ
ンの合成に用いられるオリゴヌクレオチドは表１で示さ
れている。ここでセットＡはセットＢよりも少ない制限
を有している。ランダムな超可変領域（表４のＣＤＲ領
域参照）の合成下における制限は、第一にある保存され
たアミノ酸に関する配列における位置を考慮し、第二に
停止コドン数を減少させ、第三に新しい制限部位を組込
むため、セットＡにおけるＨ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｌ２、Ｌ
３及びＬ５でなされた。 （ａ）停止コドン出現確率を低下させるため、他の３種
のヌクレオチドの半分量のみが各コドンの第一位におい
てＴで許され、Ａは各場合に各コドンの第三位において
省略された。従って統計平均として、８９番目毎のコド
ンのみが停止コドンとなる。 （ｂ）Ｌ鎖のＣＤＲ１領域における２番目のコドンに関
して、アミノ酸Ｖ、Ａ又はＧをコードするヌクレオチド
のみが許された。 （ｃ）同様に、Ｖ、Ｉ又はＭをコードする組合せのみが
、Ｌ鎖のＣＤＲ１領域における１０番目のコドンに関し
て及びＨ鎖のＣＤＲ１領域における４番目のコドンに関
して許された。 （ｄ）Ｌ鎖のＣＤＲ３領域において、アミノ酸のグルタ
ミンをコードするヌクレオチドのみが１番目のコドンに
関して許された。 （ｅ）Ｈ鎖のＣＤＲ２領域において、アミノ酸のチロシ
ンをコードするヌクレオチドのみが１１番目のコドンに
関して許された。 （ｆ）ＭｌｕＩに関する制限部位を導入するため、Ａが
Ｈ鎖のＣＤＲ２領域における最終コドンの第三位で有利
に組込まれた。 これらのオリゴヌクレオチドのランダム性は、主に１種
又は数種のアミノ酸が生じる位置において好ましくは更
に制限された〔表１のセットＢ、ここでの制限はＫａｂ
ａｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ−Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．　ｏ
ｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃ
ｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎ
ｇ　Ｏｆｆｉｃｅｓ　による表に基づいている〕。コド
ンの組合せに関する対応ヌクレオチド及び簡単な注釈の
リストは表１及び表１の注釈で示されている。等モル量
のオリゴヌクレオチドＨ１〜Ｈ７及びＬ１〜Ｌ５の結合
後、これらは前処理した発現ベクターｐＦＭＴに結合さ
れる。好ましくは、プライマーＨ１及びＨ８又はＬ１及
びＬ６を用いたＰＣＲ段階がＤＮＡ量を増幅させるため
に事前に行われるべきである。適切な制限酵素を用いて
抗体ＤＮＡの末端に適切な制限部位を作った後、ＤＮＡ
が前記と同様の方法で抗体発現ベクターｐＦＭＴに結合
される（例参照）。発現ｐＦＭＴは、細菌（大腸菌）に
おける抗体ｃＤＮＡの発現およびしかる後の発現産物の
分泌を可能にする。そのプラスミドの抗体オペロンは、
抗体のＨ及びＬ鎖双方の可変部分の配列を含んでいる。 細菌タンパク質のアミノ末端部分からの適切なリーダー
配列は、抗体部分の分泌を可能にする。リーダー配列は
分泌過程で細菌酵素により開裂される。抗体ｃＤＮＡ産
物の分泌中に、抗体のＬ及びＨ鎖（隣接する不変ドメイ
ンを含む又は含まない）は会合するようになる。その結
果、いずれかの場合で、機能的抗原結合部位を含む抗体
又は抗体断片を形成する。個々の抗体に関する同様の構
造体も他の著者により記載されている〔Ｂｅｔｔｅｒｅ
ｔ　ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１
０４１及びＳｋｅｒｒａｓ＆　Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ　（
１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０３８　〕。 例えば大腸菌での発現により形成される合成ヒト抗体ラ
イブラリーにおいて、所望のヒト抗体又は抗体部分は、
選択抗原を用いて細菌クローンをスクリーニングするこ
とにより見出される。好ましい態様において、発現産物
がマーカーペプチドに対して確立されたモノクローナル
抗体を用いる簡単な方法で検出されうるように、マーカ
ーペプチド、例えばＴＡＧ配列をコードする付加配列が
組込まれる〔Ｗｅｈｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４
），ＥＭＢＯ　Ｊ．，３，１２９５　〕。前記の例示的
処方及び下記例は説明として理解されるが、本発明を制
限するものではない。
【０００３】したがって本発明は、（１）ランダムベー
スで生成される超可変領域に関するｃＤＮＡ（ここでラ
ンダム配列は条件（ａ）〜（ｅ）、表１のセットＡ又は
セットＢに従い制限される）、（２）好ましくはしかる
後のこれらランダム配列の増幅段階及び（３）適切な発
現ベクター、好ましくはｐＦＭＴへの上記ｃＤＮＡの結
合、好ましい態様におけるマーカーペプチドに関する付
加コード配列の組込みにより得られる合成ｈｕＡｂ又は
その抗原結合部分の遺伝子バンクに関する。本発明は、
前記遺伝子バンクの分離に関する方法並びに特異的抗体
又はその抗原結合部分を分泌するクローンの単離のため
の方法及びその使用にも関する。最後に、本発明は下記
例で詳細に説明されており、特許請求の範囲に含まれて
いる。
【０００４】 〔例〕
【実施例】
例１：抗体発現ベクターの製造 プラスミドｐＫＫ２３３‐２〔Ａｍａｎｎ　及びＢｒｏ
ｓｉｕｓ，（１９８５）　Ｇｅｎｅ，４０；Ｓｔｒａｕ
ｓ　及びＧｉｌｂｅｒｔ，（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，２０１４〕を抗体
発現ベクターの組立て用の基礎ベクターとして選択した
（図１）。抗体オペロンの組込み前に、プラスミドをＳ
ａｌＩ及びＢａｍＨＩで切断し、末端をクレノウポリメ
ラーゼで補充し、結合させた。そうすることで、２つの
制限部位及びそれらの間のＤＮＡを除去した。加えて、
プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ　で開裂し、末端をクレノ
ウポリメラーゼで補充し、ＢａｍＨＩリンカーを用いて
結合させた。この操作により、ＨｉｎｄＩＩＩ　制限部
位を除去し、ＢａｍＨＩ部位を挿入した。抗体ＤＮＡを
この修飾プラスミドに挿入した。ジシストロン（ｄｉｃ
ｉｓｔｒｏｎ）　抗体ｍＲＮＡをコードする抗体オペロ
ンの簡略化構造は表２で示されている。抗体の分泌を可
能にするため、細菌酵素ペクチン酸リアーゼ（ｐｅｃｔ
ａｔｅ　ｌｙａｓｅ）　のリーダー配列を用いた。この
酵素のリーダー配列は、キメラネズミ／ヒト抗体（Ｆａ
ｂ断片；Ｂｅｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，前掲）及び「ヒ
ト化」抗体の可変部分（Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，前掲
；Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ．，前掲）の発現及び分泌のた
めに既に用いられていた。第一リーダー配列に関するＤ
ＮＡ（Ｈ鎖の上流Ｐ１）並びに第二リボソーム結合部位
（ＲＢＳ）及び第二リーダー配列（Ｌ鎖の上流Ｐ２）に
関する配列をいくつかのオリゴヌクレオチドから合成し
た（表３）。ヒト抗体（ＨｕＶｈｌｙｓ又はＨｕＶｌｌ
ｙｓ；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８８
）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０３，８２５　）のＨ
及びＬ鎖の可変領域をコードする抗体ｃＤＮＡをＧ．Ｗ
ｉｎｔｅｒ博士（ケンブリッジ，ＵＫ）から得た。制限
部位ＨｉｎｄＩＩＩ　（ＨｕＶｈｌｙｓ）及びＥｃｏＲ
Ｖ（ＨｕＶｌｌｙｓ）を導入して発現ベクターへの抗体
ｃＤＮＡの挿入を可能にさせた。ＢａｎＩＩ（ＨｕＶｈ
ｌｙｓ）及びＢｓｔＥＩＩ又はＫｐｎＩ（ＨｕＶｌｌｙ
ｓ）のための更なる制限部位を導入して、超可変領域を
一括して交換した。ＨｕＶｈｌｙｓ　　ｃＤＮＡ配列の
末端に停止シグナルを組込んだ。Ｌ鎖におけるＢａｎＩ
Ｉ部位を除去した。これらの改変はバクテリオファージ
Ｍ１３ｍｐ１８での部位特異的変異処理により行った　
（Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．，１００，４６８−５００）。完成された抗体Ｄ
ＮＡの配列は表４で示されている。リーダー配列Ｐ１（
表３）の挿入のために、修飾されたプラスミドｐＫＫ２
３３‐２を制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで消化し、Ｐ
１をこれらの部位間に挿入した（ｐＫＫ２３３‐２‐Ｐ
１）。最後のステップとは別に、更にクローニングのス
テップをプラスミドｐＵＣ１８を用いて行った。 その理由は、発現ベクター中における抗体オペロンの個
々の部分の存在が細菌宿主の増殖に悪影響を与えるから
である。ｐＵＣ１８でのクローニング前に、そのＢａｍ
ＨＩ制限部位は除去されねばならなかった。ＢａｍＨＩ
で消化後、一本鎖末端をクレノウ断片を用いて補充し、
再結合させた。次いでこの修飾プラスミドをＰｓｔＩ及
びＨｉｎｄＩＩＩ　で消化し、Ｐ２＋ＲＢＳを制限部位
間において結合させた（ｐＵＣ１８‐Ｐ２）。この工程
で、プラスミドの原ＨｉｎｄＩＩＩ　制限部位は消失し
、新しいＨｉｎｄＩＩＩ　制限部位が組込まれる。次い
でｐＵＣ１８‐Ｐ２をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ　で
消化し、Ｈ鎖のＤＮＡ（Ｍ１３からのＰｓｔＩ‐Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ　挿入物）をこれらの２部位に結合させた（ｐ
ＵＣ１８‐ＨＰ２）。 次いでこのプラスミドをＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで消
化し、Ｌ鎖のＤＮＡ（Ｍ１３からのＥｃｏＲＶ‐Ｂａｍ
ＨＩ挿入物）を結合させた（ｐＵＣ１８‐ＨＰ２Ｌ）。 次いでＨｉｎｄＩＩＩ　、ＢａｎＩＩ及びＫｐｎＩに関
する制限部位が予め除去された後、ＰｓｔＩ‐ＢａｍＨ
Ｉ挿入物をｐＵＣ１８で再クローニングした。Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ　制限部位をｐＫＫ２３３‐２に関して前記のよ
うに除去したが、しかしながら再結合はＢａｍＨＩリン
カーの挿入なしに起きた。続いて、得られたプラスミド
をＳｍａＩ及びＢａｎＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで突出末端を補充後に再結合させた。ＰｓｔＩ‐
ＢａｍＨＩ制限断片の挿入でｐＵＣ‐ＨＰ２Ｌを得る。 好ましい態様においては、更にＴａｇ配列をＢａｎＩＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挿入した（表３）。Ｔａ
ｇ配列はモノクローナル抗体ＹＬ１／２の認識配列Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ　をコードする〔
Ｗｅｈｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４），ＥＭＢＯ
　Ｊ，，３，１２９５　〕。このペプチドマーカーによ
って、得られるプラスミドｐＵＣ‐ＨＴＰ２Ｌの発現産
物は容易に検出しうる。発現ベクターへのＨＰ２Ｌ又は
ＨＴＰ２Ｌの挿入のために、２つのプラスミドをＰｓｔ
Ｉ及びＢａｍＨＩで切断し、ｐＵＣ‐ＨＰ２ＬからのＰ
ｓｔＩ‐ＢａｍＨＩ　　ＨＰ２Ｌ挿入物又はｐＵＣ‐Ｈ
ＴＰ２ＬからのＨＴＰ２Ｌ挿入物を修飾プラスミドｐＫ
Ｋ２３３‐２‐Ｐ１中のこれら２つの制限部位に結合さ
せた。完成された発現ベクターｐＦＭＴの概略は表５で
示されている。
【０００５】 例２：超可変領域にランダム配列を含む抗体ＤＮＡの合
成 抗体ＤＮＡの可変部分の合成用に合成されたオリゴヌク
レオチドは表１で示されている。超可変領域の合成のた
めに、ほとんどのランダムヌクレオチド配列を用いた。 ランダム性に関する制限は表１で示されている。２種の
異なるセットのオリゴヌクレオチドを合成した。セット
Ａにおいて、超可変領域はほとんど独占的にあるアミノ
酸が生じるわずかな位置を除いて主にランダムである。 セットＢにおいては、主に１種又は数種のアミノ酸が生
じる位置でヌクレオチド配列のランダム性が更に制限さ
れた。オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣクロマトグラフィ
ー又はポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、しか
る後５´‐リン酸化した。
【０００６】 例３：合成オリゴヌクレオチドの結合 表１のオリゴヌクレオチドを抗体ＤＮＡ鋳型上で段階的
に互いに結合させた。この目的のため、多量（約１ｍｇ
）の抗体ＤＮＡ挿入物含有一本鎖Ｍ１３ｍｐ＝１８ＤＮ
Ａを単離した。ベクターから抗体ＤＮＡを分離するため
、２種の適切なオリゴヌクレオチドを用いて２つの末端
で挿入物を二本鎖化し、酵素ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉ　で（Ｈ鎖）又はＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで（Ｌ鎖
）消化した。次いで抗体ＤＮＡを寒天ゲル電気泳動で精
製した。これらのＤＮＡ鋳型に、最初に３種のみのオリ
ゴヌクレオチド、即ちＨ１、ｐＨ２及びｐＨ３（Ｈ鎖）
並びにＬ１、ｐＬ２及びｐＬ３（Ｌ鎖）を結合させ、Ｈ
１及びＬ１は最初それらの５´末端で３２Ｐにより標識
されていた（「ｐ」は５´‐リン酸化を表す）。各オリ
ゴヌクレオチドを１００ｐｍｏｌの量で用いた。ハイブ
リダイズした形成オリゴヌクレオチドを２％アガロース
ゲルで精製し、配列決定ゲルで分析した。量は放射能測
定により調べた。次いで等モル量のｐＨ４及びｐＨ５（
Ｈ鎖）並びにｐＬ４及びｐＬ５（Ｌ鎖）を各特定鋳型に
おいて既に結合されたオリゴヌクレオチドに結合させた
。次いでこれらのＤＮＡを前ステップのように精製し、
操作を等モル量のｐＨ６及びｐＨ７を用いて精製ステッ
プまで繰返した。最後に、結合されたオリゴヌクレオチ
ドを変性ポリアクリルアミドゲルで精製し、好ましくは
、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。代わり
に又は最終精製ステップで起きる損失を回避するため、
オリゴヌクレオチドを最終結合ステップ後に直接ＰＣＲ
で増幅させた。プライマーＨ１及びＨ８（Ｈ鎖）並びに
Ｌ１及びＬ６（Ｌ鎖）をＰＣＲに関する標準条件下で用
いた。増幅された鋳型ＤＮＡをＫｐｎＩ（Ｌ鎖）又はＡ
ｌｕＩ（Ｈ鎖）で選択的に消化した。適切であれば、続
いてＰＣＲを用いて第二増幅ステップを行った。
【０００７】 例４：発現プラスミドへの抗体ＤＮＡの挿入合成された
抗体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＢａｎＩＩＩ　（Ｈ
鎖）並びにＢｓｔＥＩＩ及びＫｐｎＩ（Ｌ鎖）で切断し
た。予想分子量を有するバンドを寒天ゲル電気泳動で精
製し、エタノールで沈降させ、しかる後２つのステップ
で（最初にＬ鎖のＤＮＡ、しかる後Ｈ鎖のＤＮＡ）同様
に切断および精製されたｐＵＣ‐ＨＰ２Ｌ（前記参照）
に結合させた。次いでＨＰ２Ｌ挿入物をプラスミドｐＫ
Ｋ２３３‐２‐Ｐ１（例１参照）の制限部位ＰｓｔＩ及
びＢａｍＨＩに結合させた。同様の方法をＨＴＰ２Ｌ断
片に関して用いた。したがって、抗体ライブラリーは抗
体発現プラスミドで確立される（表６）。ＰＵＣで中間
クローニングする理由は、発現ベクターにおける抗体オ
ペロンの個々の部分の存在が細菌宿主の増殖に悪影響を
与えるからである（前記参照）。
【０００８】 例５：大腸菌における抗体の発現及びスクリーニングコ
ンピテントな大腸菌を挿入抗体ＤＮＡライブラリーを含
有するｐＦＭＴプラスミドでトランスフェクトし、アガ
ロースプレート上で増殖させ、しかる後所望の抗原で被
覆されたニトロセルロースフィルターを用いてインキュ
ベートする。非特異的結合抗体の除去後、活性クローン
を大腸菌から分泌されるヒト免疫グロブリンに対する標
識抗体で同定する。好ましい態様では、Ｔａｇ配列に対
する抗体ＹＬ１／２をこの目的に用いる。
【０００９】
【表１】
【００１０】
【表２】
【００１１】
【表３】
【００１２】
【表４】
【００１３】
【表５】
【００１４】
【表６】
【００１５】
【表７】
【００１６】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】発現ベクターｐＫＫ２３３‐２の制限酵素地図
（Ａｍａｎｎ　及びＢｒｏｓｉｕｓ，前掲）Ｐｔｒｃは
ハイブリッドトリプトファンｌａｃプロモーターを示す
。ＲＢＳはリボソーム結合部位を示す。ｒｒｎＢはリボ
ソームＲＮＡ　　Ｂオペロンを示す。５Ｓは５Ｓ　　Ｒ
ＮＡに関する遺伝子を示す。発現ベクターにおける抗体
ＤＮＡをクローニングする前に、下記の変更が行われた
： １）ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位をそれらの間のＤ
ＮＡと共に除去した。 ２）ＨｉｎｄＩＩＩ　制限部位をＢａｍＨＩ制限部位に
変えた。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】制限（ａ）〜（ｅ）、表１のセットＡ又は
    セットＢによる超可変領域に関するランダム配列の生成
    、しかる後の発現ベクターへの組込みにより得ることが
    できることを特徴とする合成ヒト抗体ライブラリー。
  2. 【請求項２】超可変領域に関して生成されたランダム配
    列が発現ベクターへの組込み前に増幅される、請求項１
    に記載の合成ヒト抗体ライブラリー。
  3. 【請求項３】修飾ベクターＭ１３ｍｐ１８ＨｕＶｈｌｙ
    ｓ及びＭ１３ｍｐ１８ＨｕＶｌｌｙｓが用いられる、請
    求項１又は２に記載の合成ヒト抗体ライブラリー。
  4. 【請求項４】ベクターｐＦＭＴが発現ベクターとして用
    いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の合成抗
    体ライブラリー。
  5. 【請求項５】制限（ａ）〜（ｅ）、表１のセットＡ又は
    セットＢによる超可変領域に関するランダム配列を生成
    させ、しかる後それらを発現ベクターに組込むことを特
    徴とする合成ヒト抗体ライブラリーの製造方法。
  6. 【請求項６】生成されたランダム配列が発現ベクターへ
    の組込み前に増幅される、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】ベクターｐＦＭＴが発現ベクターとして用
    いられる、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 【請求項８】特異的抗原を用いて請求項１〜４のいずれ
    かに記載された合成ヒト抗体ライブラリーをスクリーニ
    ングすることを特徴とする特異的ヒト抗体を分泌するク
    ローンの単離方法。
  9. 【請求項９】マーカーペプチド、好ましくはＴＡＧ配列
    が更に組込まれ、所望のクローンがマーカーペプチドに
    対する抗体を用いて、好ましくは抗体ＹＬ１／２を用い
    て同定される、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】特異的抗体を分泌するクローンを単離す
    るための、請求項１、２又は３に記載された合成ヒト抗
    体ライブラリーの使用。
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