JPH04212061A - 歯周疾患に随伴する微生物のスクリーニングアッセイならびにそれに有用な製品およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、歯周疾患に随伴する
いずれかの微生物、例えば、微生物アクチノバシラス・
アクチノマイセテムコミタンス　（Ａｃｔｉｎｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔ
ａｎｓ）、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ　　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）　およびバク
テロイデス・インターメディウス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ　　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）の存在について生物
学的被検体をスクリーニングするための方法に関する。 また、そのスクリーニング方法で有用な水不溶性製品お
よびキットにも関する。この発明は歯科上の研究および
健康管理に有用である。

【０００２】

【従来の技術】医療、歯科および獣医学上の試験、研究
および診断法において、生物学的流体または被検体中に
存在する生物学的または化学的物質の迅速、かつ正確な
検出または定量に対する依然とした欲求が存在する。た
とえば、ヒトおよび動物の組織、流体および細胞におけ
る各種微生物の存在は、疾患の診断および有効な処置に
とって非常に有用である。

【０００３】特定の微生物は、ヒトや動物の各種歯周疾
患、例えば歯肉炎および歯周炎に対する指標として関連
付けられてきた。これらの疾患の重大性は、特に長生き
している人々のような世代のヒトにとってますます重要
性が増してきたし、その予防は医療上および商業上著し
く重要性が増大してきた。その上、動物の適切な管理（
歯科上の医療を含む）は、われわれの文化における大き
な関心事である。

【０００４】歯周疾患に随伴する微生物の検出は、培養
技法（一般に時間がかかる）、ＤＮＡプローブ法および
各種の免疫学的な手法、例えば凝集アッセイ、エンザイ
ム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）　、免疫蛍光法および免疫沈殿法を用いて行われて
きた。これらの免疫学的な手法は、微生物の抗原部位（
それらから抽出された成分上に存在してもよい）とそれ
に特異的な対応する抗体との免疫反応を伴う。次に、得
られた免疫反応複合体を各種方法で検出することができ
る。

【０００５】アクチノバシラス・アクチノマイセテムコ
ミタンス　（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）　（以下、Ａ
・アクチノマイセテムコミタンスと称する）は、ヘモフ
ィルス　（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属微生物に近似す
る口内グラム陰性の条件的生物である。この生物は、細
菌性心内膜炎、甲状腺膿瘍、尿路感染症、脳膿瘍および
脊椎骨髄炎を初めとする重篤なヒト感染症を引き起こす
可能性がある。それは、一定のタイプの歯周疾患、特に
局所幼年性（ｊｕｖｅｎｉｌｅ）歯肉炎およびある種の
成人の歯肉炎の病原と密接に関連付けられた。Ａ・アク
チノマイセテムコミタンスのヒト分離株は、血清型Ａ，
ＢおよびＣと称される３つの主要な血清群に分類された
。

【０００６】グラム陰性の黒色バクテロイデス　（Ｂａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種は、通常、各種の歯周疾患、歯
牙形成部位の膿腫および歯内病変の病因となる嫌気性杆
状菌である。このような種にはバクテロイデス・インタ
ーメディウス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　　ｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉｕｓ）およびバクテロイデス・ギンギバリス（
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）　
が包含される。本明細書で定義される「歯周疾患」とは
、口腔の歯周で発生するヒトおよび動物の多種多様な疾
患を称し、結合組織、歯槽骨と歯肉の喪失に影響を及ぼ
す疾患を包含する。それは、人生のいろいろな時期、例
えば幼時、青年時代、妊娠期間または老年期に発生しう
る疾患を包含する。Ｂ・インターメディウスおよびＢ・
ギンギバリスは特定の歯周疾患に随伴する。

【０００７】歯肉間隙の流体および歯肉下の歯プラーク
における前記のような細菌に特異的な臨床上のアッセイ
は、歯周疾患の診断、歯周処置の選択および進捗状況の
評価ならびに時後の歯科試験における患者の状態を決定
する上で有用である。このような生物を同定するのに使
用されている標準的な培養法は、時間および経費がかか
り、そして高水準の経験を持つオペレーターが必要であ
る。また、このような試験は搬入および搬出を通じて厳
密な嫌気性条件が必要であるため低いレベルの生物体の
検出用として十分な感度に欠けるきらいもある。

【０００８】上記各種のイムノアッセイが開発され、あ
る程度成功裏に使用されてきた。特に有用であるのは、
ラジオイムノ沈殿アッセイおよび　ＥＬＩＳＡ試験であ
る。米国特許第　４，７４１，９９９号明細書は、Ａ・
アクチノマイセテムコミタンスの抗原に対するモノクロ
ーナル抗体とそれらの　ＥＬＩＳＡアッセイでの使用を
記載する。これらの試験は標準的な培養法を陵駕する改
良を示すものの、目的とする生物体に対するアッセイ感
度を向上させると共にヘモフィルス群のような類似する
他の生物体との交差反応性を低減させるためのさらなる
改良が必要であった。いろいろなバクテロイデス種に対
するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が類
似のアッセイ用として調製されてきた〔例えば、Ｎａｋ
ａｚａｗａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５６（６
），１６４７〜１６５１ページ、１９８８、およびＺａ
ｍｂｏｎら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎ．，５６　（上述）
　、３２〜４０ページ、１９８５、参照〕。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】一般的に、従来のアッ
セイは遅くて時間がかかり、そして単一生物体に向けら
れてきた。多くの場合、アッセイは関連する種と高い交
差反応性を示すので有用性が限定されていた。Ａ・アク
チノマイセテムコミタンス、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ
・インターメディウスを初めとする多くの微生物が各種
の歯周疾患に関連するので、患者が歯周の処置が必要で
あるかを決定しうるにはスクリーニング試験でこれらの
微生物がどれであるか検出する手段を手にすることが開
業医にとって非常に有益であろう。将来このような疾患
を引き起こすものとして他の微生物も関連付けられるか
も知れない。このような試験は、医院で広範にわたる適
用を可能にするにはその使用を安価で単純にする必要が
あろう。従来技術文献に記載されたどのアッセイもこれ
らの重要な配慮が欠けている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】既知のアッセイに付随す
る上記の課題は、下記の工程を含んでなる歯周疾患に随
伴するいずれかの微生物を同時、かつ無差別に検出する
方法によって解決される。 Ａ．歯周疾患に随伴する１種以上の微生物から抽出した
１種以上の抗原を含有することが疑われる被検体を微孔
質支持体と接触し、そしてその１種以上の抗原を歯周疾
患に随伴する複数の微生物に向けた１種以上の抗体と同
時に接触することによって１種以上の免疫複合体を前記
支持体上で形成する工程、ならびに Ｂ．被検体中の前記微生物の抗原少なくとも１種の存在
の指標として支持体上の前記１種以上の複合体の存在を
検出する工程。

【００１１】また、この発明は、第一の外面および反対
側の第二の外面を有し、そして歯周疾患に随伴する複数
の微生物に向けた１種以上の抗体を前記面の少なくとも
１つに無作為に付着した微孔質支持体であって、前記抗
体類が前記第一または第二の外面上に実質的にすべて存
在する微孔質支持体を含んでなる水不溶性製品を提供す
る。

【００１２】さらにまた、この発明はａ．第一の外面お
よび反対側の第二の外面を有し、そして歯周疾患に随伴
する複数の微生物に向けた１種以上の未標識抗体を前記
面の少なくとも１つに無作為に付着した微孔質支持体で
あって、前記抗体類が前記第一または第二の外面上に実
質的にすべて存在する微孔質支持体を含んでなる水不溶
性製品、ならびにｂ．前記付着した抗体類と同一の反応
性を有する検出可能に標識した抗体類であって、それら
を分離した状態または混合した状態で包装した前記標識
した抗体類、を含んでなる歯周疾患に随伴するいずれか
の微生物を同時、かつ無差別に検出するための試験キッ
トも提供する。

【００１３】以下、この発明を具体的に説明する。この
発明の目的では、バクテロイデス・ギンギバリスはポル
フィロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎ
ａｓ　　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）　と同一の微生物とし
て考慮されており、またバクテロイデス（ポルフィロモ
ナス）・ギンギバリス〔Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｏ
ｒｐｈｙｒｏｍａｓ）ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ〕としても
知られている。この発明を使用して歯周疾患に随伴する
１種以上の微生物の存在を迅速かつ感度よくスクリーニ
ングすることができる。限定されるものでないが、この
ような微生物としては、Ａ・アクチノマイセテムコミタ
ンス、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・インターメディウス
が挙げられる。既に歯周疾患と関連付けられてきたか将
来関連付けられる他の微生物も同様であろう。この方法
では、どのような微生物が存在するか、またはどれぐら
い多いいかは重要でない。前記微生物いずれかの何等か
の血清型が存在すればよい。この方法は、検出法で観察
される複合体の量が微生物の相対的な量を示すであろう
が、一般的には定性的である。この方法で検出される抗
原（例えば、リポ多糖類、被膜抗原または膜タンパク質
）は、細胞そのものの一部として検出できるかも知れな
いが、通常、生物学的被検体中に存在する細胞そのもの
から適当な方法で抽出される。限定されるものでないが
、このような被検体としては、咽喉または口に由来する
粘液、涙液、ヒトまたは動物の組織抽出物、歯のプラー
クおよび歯肉間隙の液体が挙げられる。一般的に、前記
生物体は歯のプラーク、唾液または歯肉間隙の液体中に
検出されている。

【００１４】上述のように、この発明は主としてスクリ
ーニング法であり、微生物種や血清型を識別するか、あ
るいは処置の進捗状況をモニターするのに使用される後
のアッセイの一連のアッセイにおける初期のアッセイと
して含めることができる。このような後のアッセイは当
該技術分野で既知の、例えば直接バインディングアッセ
イ、　ＥＬＩＳＡおよびサンドイッチアッセイのいずれ
であってもよい。目的とする微生物のいずれかからの抗
原抽出は、たとえば米国特許第　４，７４１，９９９号
　（上述）　に記載される浸透ショック法〔例えば、Ｄ
ｉｒｉｅｎｚｏらの、Ｉｎｆｅｃｔ．＆　Ｉｍｍｕｎ．
，４７（１）　、３１〜３６ページ、１９８５、参照〕
または音波処理〔例えば、Ｚａｍｂｏｎらの、Ｉｎｆｅ
ｃｔ．＆　Ｉｍｍｕｎ．，４１（１）　、１９〜２７ペ
ージ、１９８３、参照〕のような標準的方法を用いるか
洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコー
ル酸ナトリウムまたはデシル硫酸ナトリウム）を用いる
物理的または化学的手段によって都合よく行われる。

【００１５】抗原物質は、被検体そのものから採取する
ことができるが、場合によって、原被検体を水もしくは
適当な緩衝剤で適切に希釈するか、あるいは異物を除去
しそしてアッセイで抗原と抗体の複合体化を促進するた
めに濾過してもよい。この発明の実施に際して使用され
る抗体類は、モノクローナルまたはポリクローナルであ
ってよい。モノクローナル抗体は、米国特許第　４，７
４１，９９９号明細書に記載されるような標準的な方法
で調製することができる。一方、ポリクローナル抗体は
、例えばＺａｍｂｏｎらのＩｎｆｅｃｔ．＆　Ｉｍｍｕ
ｎ．，４１（１）　、１９〜２７ページ（１９８３）に
記載されるような標準的な方法で調製することができる
。一般的に、哺乳類（例えば、ウサギ）を目的とする適
当量の抗原成分または血清型の細菌細胞そのもので１度
以上感作する。力価が許容できる適当時間後、抗血清を
その哺乳類から採取する。抗体は、必要があれば既知の
方法で抗血清から精製採取することができ、使用するま
で緩衝溶液中で凍結保存することができる。このような
操作のさらなる詳細は、当該技術分野で周知である。

【００１６】一般的に、適当な方法で抗体を調製すると
、必要があれば防腐剤を含み、そして１種以上の適当な
緩衝剤を含む緩衝液を用いて保存することができる。 好ましくは、それらを凍結状態で保存する。緩衝液では
、一般的にｐＨを６〜９、好ましくは６．５〜８．５に
維持する。有用な緩衝剤としては、トリシン、ビシン、
リン酸緩衝溶液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ア
ミノエタンスルホン酸および当業者に自明の他の緩衝剤
が挙げられる。

【００１７】各抗原に対する抗体類は、アッセイまたは
キットで個別に保存して供給することができるが、それ
らの使用前に一緒に混合して保存してもよい。被検体は
複数の微生物についてスクリーニングされるので、通常
、少なくとも２種の異なる抗体が使用され、より好まし
くはさらに多くの抗体が使用される。理想的な状況下で
は、存在すると思われる各微生物に応答する個別の抗体
が利用される。しかし、単一抗体が１種以上の微生物と
反応性を有していてもよい。

【００１８】好ましい態様では、Ａ・アクチノマイセテ
ムコミタンス、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・インターメ
ディウスのスクリーニングに際し、一般的に少なくとも
３種の抗体が使用されるが、一定の抗体類が両バクテロ
イデス抗原と反応してもよい。後者の場合、このスクリ
ーニングアッセイでは２種の抗体類が使用されるにすぎ
ないであろう。上記微生物それぞれには、少なくとも３
種の血清型が存在するので、アッセイで３種以上の抗体
類が使用される可能性がある。当業者は、使用する抗体
の数およびスクリーニングに適するそれぞれの相対濃度
を容易に決定できるであろう。

【００１９】この発明のスクリーニングアッセイは、抽
出された抗原と微孔質支持体上の抗体類との免疫複合体
の形成によって行われる。抗原とすべての抗体の接触は
、個々の抗原とそれらに対応する抗体との間の複合体化
がほぼ同時に起こるように、実質的に同時かつ無差別に
行われる。室温またはより高い温度で短時間インキュベ
ーションすることで検出に必要な複合体化を起こしても
よい。

【００２０】上記微孔質支持体は、一般的に第一の外面
と第二の外面を有し、水不溶性であり、そしてどのよう
な化学反応または生物学的反応にも不活性なものである
。一般的に、試薬を反応させるのに十分な結合性を有す
るか、あるいは形状もしくは機能を喪失することなくそ
れに試薬を付着させうる天然または合成材料１種以上か
らなる。それはまた、その上に形成される複合体から実
質的にすべての未複合体化物質を除去する濾過にとって
十分な多孔度を有する。限定されるものでないが、有用
な材料としては多孔質の天然もしくは合成ポリマー類、
焼結ガラス、ガラスもしくはポリマーフィルムもしくは
ポリマー繊維の膜、セラミック材料、セルロース系材料
ならびに粘着質もしくはバインダー材料を一緒に結合し
た特定の構造体が挙げられる。支持体は、一般的に平坦
で必要があれば一定の曲率を有するが、ある程度の表面
の不規則性は許容できる。当業者は、市販または既知の
方法で調製した他の有用な材料を選ぶことも可能であろ
う。特に有用な材料は、例えばＰａｌｌ　Ｃｏｒｐ．か
ら販売されているような処理もしくは未処理ポリアミド
微孔質膜である。

【００２１】これらの微孔質支持体は、一般的に０．５
〜１０μｍの平均細孔サイズを有するが、外面に形成さ
れた複合体が残存しそして排液に必要以上に時間がかか
らない限り、より細孔が小さくてもより大きくても許容
されるであろう。この微孔質支持体は、アッセイ中に遭
遇する流体および未複合化物質を排出するのに十分な多
孔度を有するように設計される。このような未複合化物
質には、未複合体化抗原、抗体類、細胞残屑および生物
学的被検体由来の他の非粒子状の異物が包含される。し
たがって、微孔質支持体の細孔サイズは、上記物質がそ
の多孔質支持体を通過するようなものでなければならな
い。 さらに、試薬類の一定のものはその細孔内にとり込んで
もよいが、その細孔サイズはこの発明のアッセイに使用
される試薬の重要な部分を一般に収容しない。前記抗体
組成物の実質的にすべてが、微孔質支持体の一の外面上
に存在することが非常に好ましい。「とり込む」とは試
薬全体が膜の細孔内に存在することを意味する。場合に
よって、非特異的な相互作用を低下させることが当該技
術分野で知られているようなタンパク質（例えば、カゼ
インまたはスクシニル化カゼイン）で被覆してもよく、
あるいは迅速な濾過に寄与する界面活性剤またはアッセ
イを促進する他の任意の物質で被覆してもよい。この支
持体は、相互に反対側にある２つの表面をもつ。一般的
に、これらの表面は膜の上面と下面である。このことが
１以上の多孔質隣接層を有する当該技術分野で既知の多
層分析要素と本材料を区別する点である。

【００２２】この微孔質支持体は、アッセイ中に手で持
ったままその上部に複合体化を起こさせ、そして別のコ
ンテナ中に被検体の濾過を行うことができる。しかしな
がら、この支持体は水不溶性フレームまたは支持体を保
持する構造を有する水不溶性製品中に設置または固定す
ることが好ましい。このような製品は、当該技術分野で
「試験デバイス」と称されており、このようなデバイス
の多くの製品が当該技術分野で知られている。特に有用
なデバイスとしては、抗原物質の検出用スレセル　（Ｓ
ｕｒｅｃｅｌｌ、商標）　試験キット（Ｅａｓｔｍａｎ
　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．）　の部品として市販されている
ものが挙げられる。このようなデバイスはヨーロッパ特
許公開第　３０８，２３１号および同　３２１，２６１
号公報に記載されている。

【００２３】より具体的に、好ましい試験デバイスは１
個以上の試験ウェルを有し、その各々が生物学的被検体
試料および適当な試薬類を収容することができる水不溶
性シェルからなる。このシェルは、有用な水不溶性材料
、例えばポリマー材料、セラミック、繊維質、セルロー
ス質および当該技術分野で既知の他の材料から作製する
ことができる。

【００２４】好ましい態様では、試験デバイスは被検体
のスクリーニング結果を提供しそして正対照および負対
照を提供するように設計された３つの試験ウェルを有す
る。各試験ウェルには微孔質支持体を固定した。有用な
試験デバイスの他の変型も当業者が予見可能な範囲内で
あろう。アッセイは、支持体の１箇所以上の分離区画で
実施でき、各区画はその表面の総面積未満である。また
、全表面を使用することもできる。このような区画は、
フリーの抗体をとり囲んだ領域を残したまま表面のある
領域に一定の様式（後述する）で抗体を付着することに
よって提供してもよい。この分離区画は円形のスポット
であることが好ましい。

【００２５】この発明の方法は、１種以上の免疫複合体
が抗体類とそれに対応する抗原との間で形成されるよう
に、抗体類が微孔質支持体上の抗原と接触されるいずれ
かの様式で実施することができる。一の態様では、抗体
が固定された微孔質支持体を抗原に接触させることによ
って前記接触が行われる。接触は、いずれかの適当な方
法で達成できるが、好ましくは、抗原を含有する被検体
を支持体（使い捨て試験デバイス中にあってもよい）上
に滴下または流すことによって達成できる。

【００２６】こうして形成されたいずれかの複合体は、
その後、被検体中の抗原の存在（すなわち、微生物の存
在）の指標としていずれか適当な方法で検出される。検
出法は、実施されるアッセイのタイプおよび使用される
標識のタイプ、さらに該当する場合には適当な試薬およ
び装置の使用によって異なる。好ましい態様は、被検体
中の抗原を微孔質支持体上に直接結合（または捕捉）で
きるいわゆる「直接バインディング」アッセイである。 支持体に付着した後、それらは抗体と接触してその支持
体にバインディングした１種以上の免疫複合体を形成す
る。この複合体は、抗体が標識（例えば、酵素または放
射性同位体によって）されている場合にはそれで検出す
ることができ、あるいは未標識の場合には第一の抗体に
向けられた（対する）抗抗体を加えて検出可能な抗原−
抗体−抗体複合体を支持体上に形成して検出することが
できる。いずれの場合でも検出は、酵素とその基質の存
在下で色素を生ずる組成物を用いることによって可能に
なる。しかしながら、抗体に結合したアビジン、ビオチ
ン、または蛍光源、リン光源もしくは化学発光成分を初
めとする他の標識類も使用できる。

【００２７】好ましい態様では、上記方法は抗原と１種
は不溶化されているか不溶性であり、そして検出にとっ
て適するように標識されたもう一つのセットであるもう
一つの抗体との複合体化を伴う。微孔質支持体に直接付
着されるが、好ましくはポリマー粒子に対する付着（共
有結合または吸着）のような方法によって不溶化されて
いるかまたは不溶性となった抗体類は後述する。標識さ
れた抗体および未標識抗体（不溶性）による複合体化は
、微孔質支持体と接触するかまたはそれに結合すること
によって連続して起こるかまたは同時に起こる。これは
、当該技術分野でイムノメトリックアッセイまたは「サ
ンドイッチ」アッセイとして一般的に知られている。

【００２８】例えば、抽出した抗原を微孔質支持体上に
固定した抗体類と接触し、次いで対応する水溶性標識抗
体と接触することができる。これらの標識抗体は不溶性
抗体類と同じ反応性を有するので、それらは同じ抗原と
反応する。好ましい標識は、ペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアー
ゼまたはβ−ガラクトシダーゼであるが、他の標識（上
述したような）もまた使用可能である。支持体上のサン
ドイッチ複合体の検出は、適当な基質と色素生成試薬を
用いて行うことができる。

【００２９】この態様で有用な固定化または不溶性抗体
類は、これらの抗体を付着した粒状材料を含んでなる水
不溶性試薬の一部として供給できる。このような粒子は
球形であることが好ましいが、その構造および空間配置
は限定的でない。一般的に、粒子の最大寸法は０．０１
〜１０μｍであり、好ましくはその粒子が１〜３μｍの
直径を有する。それらは、抗体を吸着または共有結合で
きるいずれかの天然または合成材料から作製することが
できる。

【００３０】好ましい粒子は、直接的または間接的な抗
体の共有結合に適する反応性基を有する。間接的な共有
結合はアビジン−ビオチン複合体のような特異的なバイ
ンディング反応を介する結合を含むものを意味する。直
接的な共有結合は、抗体の遊離アミノ基またはスルフヒ
ドリル基と反応しうる表面反応性基を用いて達成するこ
とができる。限定されるものでないが、このような基と
しては、カルボキシル基、エポキシ基、アルデヒド基、
活性ハロ原子、活性２−置換エチルスルホニル基および
活性２−置換ビニルスルホニル基が挙げられる。カルボ
キシル基、活性ハロ原子、活性２−置換エチルスルホニ
ル基およびビニルスルホニル基が好ましい。特に有用な
ポリマー粒子としては、ヨーロッパ特許公開第３２３，
６９２号公報に記載されるものが挙げられる。

【００３１】この発明の好ましい態様では、下記の工程
を含んでなる微生物Ａ・アクチノマイセテムコミタンス
、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・インターメディウスのい
ずれかの同時、かつ無差別な検出のためのサンドイッチ
アッセイが挙げられる： Ａ．生物学的被検体中に存在する微生物Ａ・アクチノマ
イセテムコミタンス、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・イン
ターメディウスのいずれかから１種以上の抗原を抽出す
る工程、 Ｂ．１種以上の抽出した抗原を、前記各微生物に由来す
る少なくとも１種の抗原に向けた抗体類を共有結合した
ポリマー粒子を含んでなる水不溶性試薬を実質的にその
一の表面に付着した膜であって、使い捨て試験デバイス
中の微孔質膜と接触して、その膜上に前記抗体と前記１
種以上の抽出した抗原との間で水不溶性免疫複合体を形
成する工程、 Ｃ．前記膜上の水不溶性複合体を、前記各微生物由来の
少なくとも１種の抗原に向けた酵素標識水溶性抗体と接
触して、前記膜上の抗原と前記標識した抗体および水不
溶性抗体の両方との酵素標識した水不溶性サンドイッチ
複合体を形成する工程、 Ｄ．前記膜を通して未複合体化物質を洗浄する工程、な
らびに Ｅ．前記膜上の酵素標識したサンドイッチ複合体を、そ
の酵素の存在下で色素を生成する組成物と接触し、被検
体中の前記いずれかの微生物の指標として１種以上の抗
原の存在を視覚的に表示する工程。

【００３２】この発明の診断試験キットは、この発明の
製品ならびに目的の前記微生物に向けた複数の検出可能
に標識した抗体を含む。これらのキット成分は適当な方
法で包装することができ、前記製品（単独または試験デ
バイス中に）および試薬類のバイアルまたはボトルを区
分けして保持できるある型のキャリヤー中に含めること
ができる。それに加えて、場合によりこのスクリーニン
グ法を実施するのに有用な色素生成組成物、抽出試薬、
洗液、希釈剤および与えられたアッセイホーマットに関
して当業者に既知の他の試薬類１種以上も含めることが
できる。試薬類は乾燥状態または適当な溶液状態で供給
することができる。キットの無反応性成分としては説明
書、混合容器、攪拌手段およびピペットなどを挙げるこ
とができる。

【００３３】ポリクローナル抗体の次の調製法がそれら
の調製にとって好ましい方法である。前記細菌種は、Ｈ
ｏｍｅｒ　Ｓ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＳＵＮＹ　Ｂｕｆｆ
ａｌｏ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ）に
よって生きた培養物として供給された。分離株をヘミン
（５μｇ／ｍｌ）　およびメナジオン　（０．５μｇ／
ｍｌ）　で強化したＣＤＣ嫌気性プレート（ＢＢＬ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．
）で嫌気的に培養した。次に、これらのプレートを嫌気
性チャンバー中３７℃で２４〜４８時間インキュベーシ
ョンした。各菌株に対する凍結保存試料は、白金耳で細
胞コロニーを採取し、スキムミルクで細胞懸濁液を調製
し、次いでこの懸濁液を−７０℃で凍結することによっ
て調製した。凍結保存試料の生存性は、凍結保存試料の
一部をＣＤＣ嫌気性プレート上に置き、そして上記のよ
うにインキュベーションすることによって試験した。生
存性が確認されると、各菌株に対する新鮮な分離株を同
様にして得た。細胞懸濁液は、白金耳でコロニーを採取
し、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、１ｍｌ）　にその白
金耳を置き、次いで約１分間激しく攪拌することによっ
て調製した。

【００３４】細胞懸濁液の濃度は、　６２０ｎｍにおけ
る濁度を測定することによって分光測光的に測定した。 適当な希釈物を調製して光学濃度範囲を０．１〜１にし
た。濃度は１マクファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）
　標準（ＯＤ６２０＝０．１８０　で、約３×１０８　
細胞／ｍｌに相当する）　を用いて測定した。ニュージ
ーランド白色ウサギに、１ｍｌ当たり総生細胞約５×１
０８　個を含有するそれぞれの免疫原のリン酸緩衝溶液
　（ｐＨ７．３）０．５ｍｌを静脈内注射した。これら
の注射は、　ＭｃＣａｒｔｙおよびＬａｎｃｅｆｉｅｌ
ｄ　（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ　．，１０２　，１〜２８ペ
ージ、１９５５）　に示される方法に準じて行った。

【００３５】２度のブースター注射は次のように行った
：最初の注射１週間して各ウサギに再度同量の免疫原を
注射し、さらに１週間後同様な注射を各ウサギにした。 最初の注射後１５日目に開始し、さらに合計１１週間各
ウサギに対し、１週当たり３度の免疫原（５×１０８　
細胞／ｍｌ）１ｍｌのブースター注射をした。ブースタ
ー注射は各７日間を通じて１日おきに間隔をとった。こ
れらのウサギから数度抗血清（各血清型に対する）試料
を集め、その都度抗体の性質を調べた。例えば、抗血清
試料は最初の免疫原注射から３週間、６週間および９週
間間隔で採取した。次に、最初の注射から１３週目にウ
サギを殺し、抗血清を集めた（ウサギ１ワ当たり約　１
００ｍｌ）。

【００３６】次に、最後の血清を硫酸アンモニウム沈殿
によって精製した。４５％飽和が達成されるまで、飽和
硫酸アンモニウム溶液を氷で冷却した各血清試料に攪拌
しながら滴下した。添加後、混合物をさらに１０分間攪
拌し、遠心し、次いで上澄を廃棄した。このペレットを
もとの精製された試料の量に等しい容量のリン酸緩衝溶
液（ｐＨ７．３）に再懸濁した。次に、混合物を透析バ
ッグに移し、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）に対して４
℃で攪拌しながら約１５時間透析した。約　２００〜１
０，０００倍を越える透析緩衝液を使用した。さらに６
時間新鮮な緩衝液で透析を繰り返した。透析バッグから
溶液を取り出し、０．２２μｍのフィルターを通して濾
過した。濾液の一部をリン酸緩衝溶液で１：１０〜１：
１００　の範囲内に希釈し、　２８０ｎｍにおける吸光
度を読み取った。抗体濃度は次の式により決定した： Ａ２８０　÷〔１．４×（希釈）〕＝抗体濃度（ｍｇ／
ｍｌ）次に抗体溶液をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）お
よびマーシオレート　（０．０１重量％）　で２〜４ｍ
ｇ／ｍｌに希釈し、次いで４℃で保存した（少量は４℃
で、一方多量の試料は−７０℃で保存）　。

【００３７】

【実施例】下記の例はこの発明を具体的に説明する目的
で提供するものであって、いずれかの態様にこの発明を
限定することを意図するものでない。すべてのパーセン
デージは、別に指摘しない限り重量基準である。 例１　　直接バインディングアッセイ この例は、生物学的被検体における微生物Ａ・アクチノ
マイセテムコミタンス、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・イ
ンターメディウスのいずれかに対する直接バインディン
グアッセイを具体的に説明する。

【００３８】材料および方法 Ｓｕｒｅｃｅｌｌ　（商標）　使い捨て試験デバイス（
Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．）　を使用し、こ
れはそれぞれ３つの試験ウェルの底部にＢｉｏｄｙｎｅ
（商標）Ａナイロン微孔質膜（５μｍ、Ｐａｌｌ　Ｃｏ
ｒｐ．）　を担持する前記試験ウェルを有する。これら
の膜はＺｏｎｙｌ（商標）ＦＳＮ非イオン界面活性剤　
（０．０５ｇ／ｍ２、ＤｕＰｏｎｔ）　を塗布した。ブ
ロッキング組成物には、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロ
パンスルホン酸緩衝液（０．０１モル濃度、ｐＨ７．５
）中カゼイン（５％）、マーシオレート（０．０１％）
　を含めた。

【００３９】Ａ・アクチノマイセテムコミタンス（血清
型Ａ、ＡＴＣＣ　４３７１７および血清型Ｂ　ＡＴＣＣ
　４３７１８　、Ｂ・ギンギバリス（血清型Ａ、ＡＴＣ
Ｃ　３３２７７；血清型Ｂ、ＡＴＣＣ　５３９７８およ
び血清型Ｃ、ＡＴＣＣ　５３９７７）　ならびにＢ・イ
ンターメディウス（血清型Ａ、ＡＴＣＣ　２５６１１；
血清型Ｂ、ＮＣＴＣ　９３３６　および血清型Ｃ、ＡＴ
ＣＣ　４９０４６）　に対するポリクローナル抗体類は
、上述の一般的な方法に従うウサギの静脈内注射によっ
て得た。ＩｇＧ画分は、硫酸アンモニウム沈殿によって
調製し、リン酸緩衝溶液（０．３〜０．４％）中４℃で
保存した。多量の抗体類は−７０℃で保存した。前記抗
血清を産生するのに用いた細菌株は、Ｈ．Ｓ．Ｒｅｙｎ
ｏｌｄｓ（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ，
ＳＵＮＹ，Ｂｕｆｆａｌｏ）によって生きた培養物とし
て入手した。分離株は上述のように二次培養した。各血
清型に対する酵素−抗体結合物は、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ
　ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１　，３９
５ページ、１９７９）　の方法によって特定のウサギポ
リクローナル抗体類にワサビペルオキシダーゼを共有結
合させることによって調製した。この結合組成物は、ブ
ロッキング組成物１ｍｌ当たり各結合物３μｇを含んで
いた。

【００４０】上記血清型に対応する細菌株由来の抗原類
は、室温中約１分間リン酸緩衝溶液を用いて抽出した。 洗液は、３−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシ−
１−プロパンスルホン酸緩衝剤（０．５モル濃度）、Ｅ
ｍｃｏｌ（商標）ＣＣ−９カチオン界面活性剤　（０．
７５％、Ｗｉｔｃｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）　お
よびマーシオレート　（０．０１％）　を含めた。この
溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム　（０．０５規定）　
を加えることによって１０に調節した。色素生成組成物
は、２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニ
ル）−４，５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾ
ール（０．００８％）　、ポリ　（ビニルピロリドン）
（１％）、リン酸ナトリウム緩衝剤（１０ミリモル濃度
、ｐＨ６．８）、過酸化水素（１０ミリモル濃度）　、
４′−ヒドロキシアセタニリド電子移動剤（２ミリモル
濃度）およびジエチレントリアミン五酢酸キレート剤（
１０マイクロモル濃度）　を含むように調製した。

【００４１】アッセイ 抽出した抗原の溶液　（５０μｌ）を試験デバイスのウ
ェルに加え、その抽出液を膜を通して流がすのにつれて
抗原類がその膜に結合してきた。この操作はほんの２な
いし３分で行った。リン酸緩衝溶液（５０μｌ）を負対
照として一つの試験ウェルに加えた。結合組成物（５０
μｌ）をそれぞれのウェルに加えた後、５分間室温でイ
ンキュベーションして抗原と抗体の複合体化を行った。 洗液（２４０μｌ）を２度それぞれの試験ウェルに加え
、次いで色素生成組成物（５０μｌ）を加えた。２分間
室温でインキュベーションした後、膜上の色素を視覚的
に観察し、反射濃度値について検量カラーチャートと比
較し、次いでＷｉｌｌｉａｍｓ−Ｃｌａｐｐｅｒ変換　
（Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍｅｒ．，４３、　５９５ペ
ージ、１９５３）によって透過率濃度（ＤＴ　）を換算
した。

【００４２】下記表１に示す結果は、１個の試験デバイ
スで３種の微生物、Ａ・アクチノマイセテムコミタンス
、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・インターメディウスのす
べてについてのスクリーニング用バインディングアッセ
イホーマットに使用できることを示す。

【００４３】

【表１】

【００４４】 例２：サンドイッチスクリーニングアッセイこの例は、
生物学的被検体における微生物Ａ・アクチノマイセテム
コミタンス、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・インターメデ
ィウスのいずれかについてのサンドイッチアッセイの使
用を具体的に説明する。 材料および方法 Ｓｕｒｅｃｅｌｌ　（商標）　使い捨て試験デバイス（
Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｃｋ　Ｃｏ．）を試験に使用
した。これらは、底部にそれぞれＬｏｐｒｏｄｙｎｅ（
商標）　微孔質膜（５μｍ、Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐ．）　
を有する３個の試験ウェルを含ませた。各膜は、Ｆｌｕ
ｏｒａｄ（商標）　ＦＣ　１３５非イオン界面活性剤　
（０．０５ｇ／ｍ２、３Ｍ）で予備処理した。Ａ・アク
チノマイセテムコミタンス〔等しい濃度の血清型Ａおよ
びＢ、それぞれＡＴＣＣ　４３７１７およびＡＴＣＣ　
４３７１８、Ｚａｍｂｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．，４１（１）　、１９〜２７ページ、１９８３〕に
対する抗体類を、ヨーロッパ特許公開第　３２３，６９
２号　（上述）　公報に記載の方法を用いてポリ〔スチ
レン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）スチレン〕（モル比、９６：４）のポリマー粒子（
平均径１．５〜２．５μｍ）に共有結合してポリマー１
ｇ当たり結合した抗原約９ｍｇを有する試薬を提供した
。

【００４５】同様にＢ・インターメディウス（等しい濃
度の血清型Ａ、ＡＴＣＣ　２５６１１；血清型Ｂ、ＮＣ
ＴＣ　９３３６　および血清型Ｃ、ＡＴＣＣ　４９０４
６）　に対する抗体類を、同じタイプのポリマー粒子に
共有結合した。Ｂ・ギンギバリス（等しい濃度の血清型
Ａ、ＡＴＣＣ３３２７７；血清型Ｂ、ＡＴＣＣ　５３９
７８および血清型Ｃ、ＡＴＣＣ　５３９７７）　に対す
る抗体類を同様なポリマー粒子に共有結合した。こうし
て形成した各ポリマー−抗体試薬を、グリシン緩衝液（
０．１モル濃度、ｐＨ８．５）中前記試薬（１％）およ
びポリアクリルアミド（５％）を含有する組成物と調合
した。結合組成物は、上記例１に記載したように調製し
た。微生物の各株は、Ｈ．Ｓ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＳＵ
ＮＹ，ＢｕｆｆａｌｏＳｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｄｅｎｔｉ
ｓｔｒｙ）から生きた培養物として入手し、分離株は上
記のようにして得た。培養懸濁液を室温中約１分間ドデ
シル硫酸ナトリウム（１０％溶液）　で抽出した。洗液
は、デシル硫酸ナトリウム　（１８ｇ／ｌ）を含めた。 色素生成組成物は、例１で使用したものと同一であった
。

【００４６】アッセイ 同量の粒子−抗体試薬組成物類を一緒に混合し、試験デ
バイス中の膜の特定領域に適用した。第一のセットのウ
ェルにＡ・アクチノマイセテムコミタンスの抽出抗原の
各種濃厚物（５０μｌ）を加え、次いで前記結合組成物
（５０μｌ）を加えた。第二のセットのウェルに抽出し
たＢ・インターメディウス抗原の各種濃厚物（５０μｌ
）を加え、次いで前記結合組成物（５０μｌ）を加えた
。第三のセットのウェルに抽出したＢ・ギンギバリス抗
原の各種濃厚物（５０μｌ）を加え、次いで前記結合組
成物（５０μｌ）を加えた。負対照は粒子−抗体試薬を
適用した膜上の特定領域の周囲域として位置付けた。

【００４７】すべての試験ウェルを室温で５分間インキ
ュベーションし、次いで洗液（２４０μｌ）で２度洗浄
した。色素生成組成物（５０μｌ）を加えた後、２分間
室温でインキュベーションした。各試験で観察した色素
を反射濃度の検量カラーチャートと比較し、次いで例１
に記載したように透過率濃度（ＤＴ　）に変換した。下
記表２に示す結果は、単一の試験デバイスを用いて各微
生物種の検出を行うことができることを示す。

【００４８】

【表２】

【００４９】

【発明の効果】この発明の方法は、歯周疾患に随伴する
いずれかの微生物について患者から得られた生物学的被
検体をスクリーニングする効果的で、迅速かつ安価な手
段である。とりわけ、このスクリーニング試験は、Ａ・
アクチノマイセテムコミタンス、Ｂ・ギンギバリスおよ
びＢ・インターメディウスいずれかの検出に有用である
。従来は、時間のかかる個別の培養法によって各微生物
が検出されるか、あるいは当該技術分野で既知のより高
価で感度の低い免疫学的な方法で各微生物が検出されて
いた。

【００５０】この発明は、患者に対する歯の治療を続け
ながら医院で歯のプラークまたは歯肉間隙の液体試料を
スクリーニングすることを希望する開業医に便宜を与え
る。従って、患者が帰る前に、しばしばいずれかの注目
に値する疾患の徴候となるある種の微生物の存在につい
てその患者を処置しなければならないか否かを開業医は
知ることができる。このような予防的な管理は今日多く
の理由で強く望まれている。また、この方法を使用する
場合には、患者および開業医は結果を知るために長時間
待つ必要がない。

【００５１】このような注目すべき利点は、被検体を数
種の微生物に反応する１種以上の抗体と接触する免疫学
的方法によって達成される。従って、少なくとも１種の
微生物（またはその抗原成分）が存在する場合には、そ
れに由来する抗原部位が適当な抗体と複合体を形成し、
次いで得られた複合体が適当に検出される。この複合体
化は、未複合体化物質が迅速に除去される微孔質支持体
上で起こり、残存する、複合体が検出に供される。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　Ａ．歯周疾患に随伴する１種以上の微
   生物から抽出した１種以上の抗原を含有することが疑わ
   れる被検体を微孔質支持体と接触し、そして前記１種以
   上の抗原を歯周疾患に随伴する複数の微生物に向けた１
   種以上の抗体と同時に接触することによって１種以上の
   免疫複合体を前記支持体上で形成する工程、ならびにＢ
   ．被検体中の前記微生物の抗原少なくとも１種の存在の
   指標として支持体上の前記１種以上の複合体の存在を検
   出する工程、を含んでなる歯周疾患に随伴するいずれか
   の微生物を同時、かつ無差別に検出する方法。
2. 【請求項２】　　第一の外面および反対側の第二の外面
   を有し、そして歯周疾患に随伴する複数の微生物に向け
   た１種以上の抗体を前記面の少なくとも１つに無作為に
   付着した微孔質支持体であって、前記抗体類が前記第一
   または第二の外面上に実質的にすべて存在する微孔質支
   持体を含んでなる水不溶性製品。
3. 【請求項３】　　ａ．第一の外面および反対側の第二の
   外面を有し、そして歯周疾患に随伴する複数の微生物に
   向けた１種以上の未標識抗体を前記面の少なくとも１つ
   に無作為に付着した微孔質支持体であって、前記抗体類
   が前記第一または第二の外面上に実質的にすべて存在す
   る微孔質支持体を含んでなる水不溶性製品、ならびにｂ
   ．前記付着した抗体類と同一の反応性を有する検出可能
   に標識した抗体類であって、それらを分離した状態また
   は混合した状態で包装した前記標識した抗体類、を含ん
   でなる歯周疾患に随伴するいずれかの微生物を同時、か
   つ無差別に検出するための試験キット。