JPH04212062A - アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンスに対する抗体組成物およびその診断における使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はアクチノバシラス・ア
クチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎ
ｓ　）の３種の血清型（Ａ，ＢおよびＣ）すべての検出
に有用なポリクローナル抗体組成物に関する。本発明は
また、その組成物が付着している水不溶性製品および前
記微生物の検出方法にも関する。この発明は歯科上の検
診および健康管理に有用である。

【０００２】

【従来の技術】医療、歯科および獣医学上の試験、研究
および診断法において、生物学的流体または被検体中に
存在する生物学的または化学的物質の迅速、かつ正確な
測定または定量に対する欲求は依然として存在する。た
とえば、ヒトおよび動物の組織、流体および細胞におけ
る各種微生物の存在は、疾病の診断および有効な処置に
とって非常に有用である。

【０００３】特定の微生物は、ヒトや動物の各種歯周疾
患、例えば歯肉炎および歯周炎に対するマーカーとして
関連付けられてきた。これらの疾患の重大性は、特に長
生きしている人々のような世代のヒトにとってますます
重要性が増してきたので、その予防は医療上および商業
上著しく重要性が増大してきた。その上、動物の適切な
管理（歯科上の医療を含む）は、われわれの文化におけ
る大きな関心事でもある。

【０００４】歯周疾患に関連した微生物の検出は、培養
技法（一般に時間がかかる）、ＤＮＡプローブ法および
各種の免疫学的な手法、例えば凝集アッセイ、エンザイ
ム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）　、免疫蛍光法および免疫沈殿法を用いて行われて
きた。これらの免疫学的な手法は、微生物の抗原部位（
それらから抽出された成分上に存在してもよい）とそれ
に特異的な対応する抗体との免疫反応を伴う。次に、得
られた免疫反応複合体を各種方法で検出することができ
る。

【０００５】アクチノバシラス・アクチノマイセテムコ
ミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　）（以下、Ａ・
アクチノマイセテムコミタンスと称することもある）は
、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　）属微生物
に近似する口内グラム陰性の条件的生物である。この生
物は、細菌性心内膜炎、甲状腺膿瘍、尿路感染症、脳膿
瘍および脊椎骨髄炎を初めとする重篤なヒト感染症を引
き起こす可能性がある。それは、一定のタイプの歯周疾
患、特に局所幼年性（ｊｕｖｅｎｉｌｅ）　歯肉炎およ
びある種のヒト歯肉炎の病原と密接に関連付けられた。 Ａ・アクチノマイセテムコミタンスのヒト分離株は、Ｚ
ａｍｂｏｎら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，　４１　
，　１９〜２７ページ、１９８３）によって、７５（Ａ
ＴＣＣ　４３７１７）、Ｙ４（ＡＴＣＣ　４３７１８）
および６７（ＡＴＣＣ　４３７１９）とそれぞれ命名さ
れた菌株に対応する血清型Ａ，ＢおよびＣと称される３
つの主要な血清群に分類された。

【０００６】歯肉間隙の流体および歯肉下の歯プラーク
における前記のような細菌に特異的な臨床上のアッセイ
は、歯周疾患の診断、歯周処置の選択および進捗状況の
評価ならびに時後の歯科試験における患者の状態を決定
する上で有用である。このような生物を同定するのに使
用されている標準的な培養法は、時間および経費がかか
り、そして高い水準の経験を持つオペレーターが必要で
ある。また、このような試験は搬入および搬出を通じて
厳密な嫌気性条件が必要であるため低いレベルの生物体
の検出にとって十分な感度に欠ける可能性もある。

【０００７】上記各種のイムノアッセイが開発され、あ
る程度成功裏に使用されてきた。特に有用であるのは、
ラジオイムノ沈殿アッセイおよび　ＥＬＩＳＡ試験であ
る。これらの試験は標準的な培養法を陵駕する改良を示
すものの、目的とする生物体に対するアッセイ感度を向
上させると共にヘモフィルス群のような類似する他の生
物体との交差反応性を低減させるためのさらなる改良が
試みられてきた。たとえば、米国特許第　４，７４１，
９９９号明細書は、Ａ・アクチノマイセテムコミタンス
の抗原に対するモノクローナル抗体の産生を記載する

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記のモノクローナル
抗体は前記生物体の幾つかの抗原に対する改良された特
異性を提供するが、それらはポリクローナル抗体に関連
する低レベルの生物体を検出するに際し低い感度を示す
。Ａ・アクチノマイセテムコミタンスの３種の血清型す
べてを検出するに際し、高感度で類似の生物体の抗原部
位との交差反応性が極めて少ない改良された手段への欲
求は依然として存在する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記の課題は、微生物ア
クチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃ
ｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　）の各３種の血清型少なくとも
１種の抗原と免疫複合体を形成するのに有用なポリクロ
ーナル抗体組成物であって、唯一の免疫反応体として、
前記微生物の血清型Ａに向けられた第一ポリクローナル
抗体および前記微生物の血清型Ｂに向けられた第二ポリ
クローナル抗体を含んでなる組成物によって解決される
。

【００１０】また、この発明によれば、少なくとも第一
の外面および反対側の第二の外面を有する微孔質支持体
を含んでなり、そして上述のポリクローナル抗体組成物
をそれらの面の少なくとも一つ付着した水不溶性製品も
提供される。さらに、Ａ．微生物アクチノバシラス・ア
クチノマイセテムコミタンスから抽出された抗原を上述
のポリクローナル抗体組成物と接触させてその抗原とポ
リクローナル抗体間で免疫複合体を形成する工程、なら
びにＢ．その抗原の存在の指標として前記複合体の存在
を検出する工程を含んでなる微生物アクチノバシラス・
アクチノマイセテムコミタンスの３種の血清型すべての
検出方法が提供される。

【００１１】この発明を用いてＡ・アクチノマイセテム
コミタンスの３種の血清型すべての抗原（例えば、リポ
多糖類、莢膜抗原または膜タンパク質）を同時に迅速か
つ感度よく検出することができる。このような抗原は細
胞そのものの一部として検出できるかも知れないが、通
常、生物学的被検体中に存在する細胞そのものから適当
な方法で抽出される。限定されるものでないが、このよ
うな被検体としては、咽喉または口に由来する粘液、涙
液、ヒトまたは動物の組織抽出物、歯のプラークおよび
歯肉間隙の液体が挙げられる。一般的に、前記生物体は
歯のプラーク、唾液または歯肉間隙の液体中に検出され
ている。

【００１２】抗原抽出は、たとえば、米国特許第　４，
７４１，９９９号に記載される浸透ショック法〔例えば
、Ｄｉｒｉｅｎｚｏらの、Ｉｎｆｅｃｔ．　＆　Ｉｍｍ
ｕｎ．，　４７（１），　３１　〜３６ページ、１９８
５、参照〕または音波処理〔例えば、Ｚａｍｂｏｎらの
、Ｉｎｆｅｃｔ．　＆　Ｉｍｍｕｎ．，　４１（１），
　１９　〜２７ページ、１９８３、参照〕のような標準
的方法を用いるか洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、デオキシコール酸ナトリウムまたはデシル硫酸ナト
リウム）を用いる物理的または化学的手段によって都合
よく行われる。

【００１３】この発明の組成物は、いずれもＡ・アクチ
ノマイセテムコミタンスの２種のポリクローナル抗体を
必須のものとし、第一のものは血清型Ａの抗原少なくと
も１種に向けられ、第二のものは血清型Ｂの抗原少なく
とも１種に向けられる。これらの抗体類は、既知の方法
、例えば上述のＺａｍｂｏｎらの文献に記載される方法
によって産生することができる。一般的に、哺乳類（例
えば、ウサギ）を目的とする適当量の抗原成分または血
清型の細菌細胞そのもので１度以上感作する。力価が許
容できる適当時間後、抗血清をその哺乳類から採取する
。 抗体は、必要があれば既知の方法で抗血清から精製採取
することができ、使用するまで緩衝溶液中で凍結保存す
ることができる。このような操作のさらなる詳細は、当
該技術分野で周知である。

【００１４】一般的に、抗体を単離すると、必要があれ
ば防腐剤を含み、そして１種以上の適当な緩衝剤を含む
緩衝液を用いて保存することができる。好ましくは、そ
れらを凍結状態で保存する。緩衝液では、一般的にｐＨ
を６〜９、好ましくは６．５〜８．５に維持する。有用
な緩衝剤としては、リン酸緩衝溶液、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン、トリシン、ビシン、Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスル
ホン酸および当業者に自明の他の緩衝剤が挙げられる。

【００１５】好ましくは上述のポリクローナル抗体組成
物は、粒状有機体、ポリマー、ガラス、セラミック、天
然もしくは合成の樹脂、珪藻土または磁性粒子から形成
された水不溶性粒状キャリア材料上に適当な様式で固定
化される。これらの粒子は、好ましくは球状であって、
平均径０．０１〜１０μｍ、好ましくは０．５〜５μｍ
を有するが、構造および空間配置は限定されない。

【００１６】抗体類は、前記材料表面への吸着またはそ
の表面の反応性基との共有結合を初めとする物理的また
は化学的手段によって粒状キャリア材料に付着すること
ができる。共有結合が好ましい。好ましいポリマー粒子
は、それに抗体分子を共有結合するための適当な表面反
応性基を有する。キャリア材料上の抗体分子の密度は、
前記材料の組成、それらのサイズおよび抗体の性質に応
じて変動しうるが、アッセイに適する感度に要する十分
な密度は当業者によって容易に決定できる。場合によっ
て抗体を結合に適するように変性してもよい。

【００１７】抗体の共有結合は、通常抗体の遊離アミン
、糖質またはスルフヒドリル基と直接または間接的に（
すなわち、タンパク質またはアビジン−ビオチンのよう
な連結を介して）反応しうる表面反応性基を使用して達
成される。限定されるものでないが、このような表面反
応性基としては、カルボキシル基、エポキシ基、アルデ
ヒド基、活性ハロ原子、活性２−置換エチルスルホニル
基、ビニルスルホニル基および当該技術分野で既知の他
の基が挙げられる。粒子の好ましい態様に関する以下の
説明は、単に例示を目的とするものであって限定するこ
とを意味しない。

【００１８】特に有用なポリマー粒子としてはヨーロッ
パ特許公開第３２３６９２号公報に記載されるものが挙
げられる。これらの粒子は、一般に、平均粒子サイズが
０．０１μｍを越える水不溶性ラテックス粒子である。 それらは、少なくとも１つの活性ハロ原子、活性２−置
換エチルスルホニル基または活性ビニルスルホニル基を
有する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノマーから
製造されるポリマー類から構成される。これらのモノマ
ー類の１種以上を、個別にまたは組み合わせて重合して
ホモポリマーまたはコポリマーを形成することができる
。また、それらの１種以上が少なくとも１種の他のエチ
レン系不飽和重合性モノマーと共重合される。一般的に
これらのモノマー類は、疎水性、分散性または他の特質
のような様々な好ましい特性を提供する。特に有用なコ
モノマー類はヨーロッパ特許公開第３２３６９２号公報
に記載されている。

【００１９】代表的な有用ポリマー類としては次のもの
が挙げられる：ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）
、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン
−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレート）（モル比、
６７：３０：３）、ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２
−クロロエチルスルホニルメチル）−スチレン〕（モル
比、９６：４）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−
（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アク
リルアミド｝（モル比、９９．３：０．７）、ポリ（ｍ
＆ｐ−クロロメチルスチレン−コ−メタクリル酸）（モ
ル比、９５：５，９８：２および９９．８：０．２）、
ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスル
ホニルメチル）スチレン−コ−メタクリル酸〕（モル比
、９３．５：４．５：２）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−
〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェ
ニル〕アクリルアミド−コ−メタクリル酸｝（モル比、
９７．３：０．７：２）およびポリ（スチレン−コ−ｍ
＆ｐ−クロロメチルスチレン）（モル比、７０：３０）
。

【００２０】開示する発明の重要な点は、この発明の抗
体組成物が付着される水不溶性製品の使用にある。この
製品は、第一の外面と第二の外面を有する微孔質支持体
から構成される。この支持体はどのような化学反応また
は生物学的反応にも不活性であり、一般的に、アッセイ
中に抗体を付着するのに十分な統合性を有しそして適切
な濾過に必要な多孔度を有する１種以上の天然または合
成物質からなる（通常、平均細孔サイズ０．５〜１０μ
ｍ）。限定されるものでないが、有用な支持体材料とし
ては、天然もしくは合成ポリマーマットもしくは布、焼
結ガラス、ガラス製もしくはポリマーフィルムもしくは
繊維製の膜もしくはフィルター、多孔質セラミックもし
くはセルロース系材料、粘着性もしくはバインダー物質
を一緒に結合したビーズからなる多孔質粒状構造物が挙
げられる。この微孔質支持体は、表面のある程度の不規
則性は許容できるが、本発明の製品にとって好ましいな
らば一般的に平坦で一定の曲率を有する。当業者は、こ
の発明に有用な多くの市販材料またはそれ以外の設計を
容易に選ぶことができる。特に有用な材料は、Ｐａｌｌ
　Ｃｏｒｐ．から販売されているポリアミド（特に、ナ
イロン）微孔質膜である。

【００２１】この微孔質支持体は、アッセイ中に遭遇す
る流体および未複合化物質を排出するのに十分な多孔度
を有するように設計される。このような未複合化物質に
は、未複合体化抗原、抗体類、細胞残屑および生物学的
被検体由来の他の非粒子状の異物が包含される。したが
って、微孔質支持体の細孔サイズは、上記物質がその多
孔質支持体を通過するようなものでなければならない。 さらに、試薬類の一定のものはその製品の細孔内にとり
込んでもよいが、その細孔サイズは本発明のアッセイに
使用される試薬の主要部分を一般に収容しない。前記抗
体組成物の実質的にすべてが、微孔質支持体の一の外面
上に存在することが非常に好ましい。場合によって、非
特異的な相互作用を低下させることが当該技術分野で知
られているようなタンパク質（例えば、カゼインまたは
スクシニル化カゼイン）で被覆してもよく、あるいは迅
速な濾過に寄与する界面活性剤またはアッセイを促進す
る他の任意の物質で被覆してもよい。

【００２２】この発明の抗体組成物は、被検体の抗原と
の反応にその抗体が利用できる限りいずれか適当な方法
で微孔質支持体へ付着することができる。一般的に、製
造および処理中に温和な機械的障害が抗体類を損失させ
ないようにそれらが付着される。さらに、抗体類はアッ
セイ中に漏れ出さない。例えば、抗体を塗布、スポット
または噴霧によって機械的に付着し、そして分子間なら
びに分子と支持体との間の疎水結合によってその場合に
保持できる。また、適当な化学反応によって共有結合す
ることもできる。

【００２３】支持体上に塗布され、次いで親水性、中性
または正の荷電バインダー材料と混合した粒状材料への
アタッチメントによって抗体組成物を微孔質支持体上に
固定化することが特に有用である。バインダー材料の量
は、試薬の総重量基準でほぼ２０％未満である。限定さ
れるものでないが、特に有用なバインダーとしては、ビ
ニルピロリドンポリマー類、アクリルアミドポリマー類
、ならびに第四級塩類および当該技術分野で既知の電荷
が中性であるかもしくは正に荷電した他の基を含有する
ポリマー類が挙げられる。「電荷が中性」とは、ポリマ
ー類が電荷をもたないか、または分子中に比較的小さな
ネット負電荷もしくは正電荷を有することを意味する。 これらのポリマー類は、ホモポリマー類またはコポリマ
ー類であることができ、単一または組み合わせて使用す
ることができる。アクリルアミドポリマー類は、メタク
リルアミドポリマーを含めたものを意味する。

【００２４】有用な正荷電ポリマーバインダー類として
は米国特許第　４，０６９，０１７号明細書に記載され
る媒染剤が挙げられ、この媒染剤は十分な水溶性を示す
。十分な水溶性は、一般にポリマーの少なくとも５０重
量％が正荷電基を含有するモノマー類から構成される。 最も好ましくは、この発明の抗体組成物が微孔質支持体
の表面上に実質的に存在し、すなわち支持体内に埋没す
るものが５％（試薬の重量当たり）未満であることを意
味する。「埋没する」とは、全組成物が支持体の細孔内
にあることを意味する。これは、抗体分子が支持体の外
面またはその付近の細孔中に部分的に埋まることができ
ないことを意味しない。

【００２５】抗体組成物は表面の１以上の分離区画で支
持体表面に付着することができ、各区画はその表面の総
面積未満を表わす。また、その組成物は全表面に付着す
ることもできる。抗体組成物は、上述の外面にそれを付
着するいずれか適当な方法で多孔質支持体に適用するこ
とができる。適切な条件下で適当な溶媒（例えば、抗体
に害を及ぼさない水、緩衝液または有機溶媒）中で表面
上にそれを塗布、堆積または稀れに滴下することが可能
である。一般的に組成物はアッセイに使用する前に乾燥
するが、この操作は必ずしも必要でない。

【００２６】この発明の水不溶性製品は、必要でない場
合には他の備品または試験容器（例えば流体を容器に排
液する支持具のようなもの）を伴うことなくアッセイに
使用することができる。しかしながら、通常それは試験
デバイスの一部として固定する。各種の試験デバイスが
当該技術分野で知られている。特に有用なデバイスとし
ては、抗原物質の検出用スレセル（Ｓｕｒｅｃｅｌｌ、
商標）試験キット（イーストマンコダック社）の一部と
して市販されているものが挙げられる。

【００２７】この発明の方法は、免疫複合体を抗体と存
在するいずれかの抗原との間で形成するためＡ・アクチ
ノマイセテムコミタンスの一種以上の血清型を含むこと
が疑われる被検体にポリクローナル抗体組成物を接触さ
せるいずれかの様式で実施することができる。一般的に
、この接触は抗体が固定化されたこの発明の製品を被検
体と接触することによって行われる。接触はいずれか適
当な方法で達成できるが、好ましくは、例えば使い捨て
試験デバイス中の前記製品に被検体を滴下しまたは流し
込む。

【００２８】次に、こうして形成された複合体は、被検
体における抗原の存在の指標として適当な方法で検出さ
れる。検出法は、実施されるアッセイのタイプおよび使
用される標識のタイプ、ならびに存在する場合には適当
な試薬類および装置のタイプに依存する。例えば、この
方法は競争バインディングイムノアッセイとして知られ
ている抗体ならびに被検体中の抗原と反応する標識され
た抗原の量を測定するものであってよい。さらに、この
発明の製品に付着した標識抗体と未標識抗体の両方と被
検体を接触させることによって抗原を間接的に測定する
ことができる。このようなアッセイの具体的な詳細は、
当業者の技術水準の範囲内にある。

【００２９】別の態様では、「直接バインディング」ア
ッセイと称されるように被検体中の抗原（好ましくは生
物体から抽出された）を固体支持体上に直接結合（また
は捕捉）することができる。支持体に付着した後、被検
体中の抗原はこの発明の抗体組成物と接触し支持体に結
合した免疫複合体を形成することができる。この複合体
は、抗体が標識（例えば、酵素によって）されている場
合にはそれで検出することができ、あるいは未標識の場
合には第一の抗体に向けられた（対する）抗抗体を加え
て検出可能な抗原−抗体−抗体複合体を支持体上に形成
して検出することができる。いずれの場合でも検出は、
酵素とその基質の存在下で色素を発生する組成物を用い
ることができる。

【００３０】好ましい態様では、前記方法は一定の抗体
組成物が不溶化されておりそして検出可能なある組成物
が不溶化されていないポリクローナル抗体類と抗原の複
合体化を伴う。この組成物の標識抗体および未標識（不
溶性）抗体との複合体化は、その後または同時に別のデ
バイスまたは固体支持体に結合するかまたは集めること
によって起こすことができる。例えば、この発明の最初
の水溶性検出可能な（上述のような）抗体組成物ならび
にこの発明の不溶化抗体組成物と前記抗原が複合体化す
ることができる。これは一般に、当該技術分野でイムノ
メトリックまたは「サンドイッチ」アッセイとして知ら
れている。標識は、特異的バインディング試薬（例えば
、アビジンとビオチン）、放射性同位体または酵素およ
び当該技術分野で既知の他のものを包含するいずれかの
検出可能成分であることができる。より好ましい標識は
、酵素類（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼまたは
β−ガラクトシダーゼ）である。

【００３１】別法では、不溶性抗体がこの発明のポリク
ローナル抗体組成物の抗体類であり、標識抗体類が前記
抗原に向けられた水溶性モノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体であることもできる。好ましい態様では
、微生物アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタ
ンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　）の３種の血清型す
べてを検出する方法は、次の工程を含んでなる： Ａ．微生物アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミ
タンスから抽出された抗原を含有することが疑われる生
物学的被検体を、少なくとも第一の外面および反対側の
第二の外面を有し、前記微生物アクチノバシラス・アク
チノマイセテムコミタンスの各３種の血清型の抗原少な
くとも１種と免疫複合体を形成するのに有用なポリクロ
ーナル抗体組成物であって唯一の免疫反応体として前記
微生物の血清型Ａに向けられた第一ポリクローナル抗体
および前記微生物の血清型Ｂに向けられた第二ポリクロ
ーナル抗体を含んでなる組成物を前記表面の少なくとも
一方に付着した微孔質支持体と接触させて前記抗原とポ
リクローナル抗体類との間の免疫複合体を形成する工程
、ならびに Ｂ．被検体中の抗原の存在の指標として前記複合体の存
在を検出する工程。

【００３２】さらに、下記の工程を含んでなる微生物ア
クチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンスの３種
の血清型すべての検出方法： Ａ．微生物アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミ
タンスから抽出された抗原を含有することが疑われる生
物学的被検体を、使い捨て試験デバイス中の水不溶性製
品であって、少なくとも第一の外面および反対側の第二
の外面を有し、そして唯一の免疫反応体として前記微生
物の血清型Ａに向けられた第一ポリクローナル抗体およ
び前記微生物の血清型Ｂに向けられた第二ポリクローナ
ル抗体を含んでなり、平均径０．０１〜１０μｍのポリ
マー粒子上に前記抗体の両方が固定されており、この粒
子が親水性ポリマーバインダー材料と混合されている製
品と接触させて製品の膜上に抗原と前記ポリクローナル
抗体類との間の免疫複合体を形成する工程、 Ｂ．工程Ａの接触と同時にまたは前後に、被検体を血清
型ＡおよびＢに対する水不溶性酵素標識抗体類と接触さ
せて前記膜上に抗体類および抗原を固定化する標識抗体
類の標識複合体を形成する工程、 Ｃ．工程Ｂの接触と同時またはその後に、前記膜を介し
て未複合体化物質を洗浄することによって標識された前
記複合体からその未複合体化物質を分離する工程、なら
びに Ｄ．酵素の存在下で色素を提供する組成物を使用して、
前記被検体中の抗原の存在の指標として前記膜上の標識
複合体の存在を検出する工程。

【００３３】Ａ・アクチノマイセテムコミタンス抗原は
、上記のいずれか適当な抽出法、好ましくはドデシル硫
酸ナトリウム１０重量％によって生物学的被検体（例え
ば、プラーク試料）から抽出することができる。次に、
抽出した抗原を前述のような微孔質製品と接触させてそ
の製品に付着したこの発明のポリクローナル抗体組成物
との抗原−抗体複合体を形成する。複合体形成に短時間
のインキュベーションが必要な場合があるが、一般的に
室温でそれは５分未満、好ましくは２分未満である。

【００３４】標識された複合体は、抗体に対する検出可
能な標識抗体を用いて形成される。この標識抗体は、膜
上の抗体類と反応させると同時にまたはその前後に抗原
と反応することができる。得られた複合体の未複合体化
物質からの分離は、複合体の形成とほぼ同時に開始する
。しかしながら、好ましくは膜上の反応体と流体を完全
に反応するように短時間インキュベーションすることも
できる。抗原と２種以上の抗体類の不溶性標識複合体は
膜上に保持される。分離を促進するために１度以上の洗
浄を行ってもよい。

【００３５】次に、標識複合体が適当に検出される。好
ましくは、標識が酵素であり、適当な色素生成組成物が
加えられて酵素とその基質の存在下で色素（発色源また
は蛍光源）が提供される。ペルオキシダーゼが好ましい
酵素標識であり、基質または基質生成反応体ならびに色
素生成反応体を含む数多くの適当な色素生成組成物が知
られている。

【００３６】不溶性複合体の存在下で一度び色素が生成
すると、アッセイが被検体中に抗原の存在を示す場合に
はそれを視覚的に評価するか、または分光光度計を用い
て測定することができる。被検体の試験と共に正対照試
験および負対照試験の両方も行うことが好ましい。各対
照試験には適当な試薬類を使用して所期の結果を与える
ことができる。

【００３７】この発明の診断試験キットは、この発明の
製品と抗原の検出可能な標識された抗体分子を含む。こ
れらのキット成分は、適当な方法で包装することができ
、製品（単独または試験デバイス中に）を区分けして収
容することができるある種のキャリヤーおよび液体もし
くは固体試薬のバイアルもしくはボトルを含めることが
できる。その上、前記方法を実施するのに有用な下記の
ものを１種以上含めることができる。すなわちそれらは
、色素生成組成物、抽出試薬類（アッセイ前にリガンド
を抽出しなければならない場合）、洗液、希釈剤、さら
なる受容体分子およびアッセイを行う上で当業者に既知
の他の試薬類である。試薬類は乾燥状態または適当な溶
液状態で提供することができる。キットの無反応性成分
としては説明書、混合容器、攪拌手段およびピペットな
どを含めることができる。

【００３８】一の態様では、アクチノバシラス・アクチ
ノマイセテムコミタンスの測定に有用な診断試験キット
は、少なくとも第一の外面および反応側の第二の外面を
有し、微生物アクチノバシラス・アクチノマイセテムコ
ミタンスの各３種の血清型の抗原少なくとも１種と免疫
複合体を形成するのに有用なポリクローナル抗体組成物
であって、唯一の免疫反応体として前記微生物の血清型
Ａに向けられた第一ポリクローナル抗体および前記微生
物の血清型Ｂに向けられた第二ポリクローナル抗体を含
んでなる組成物を前記面の少なくとも１つに付着した微
孔質支持体から構成される水不溶性製品を含んでなる。

【００３９】別の態様では、アクチノバシラス・アクチ
ノマイセテムコミタンスの測定に有用な診断試験キット
は、アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス
の各３種の血清型のすべての抗原少なくとも１種との免
疫複合体形成に有用なポリクローナル抗体であって、唯
一の免疫反応体として前記微生物の血清型Ａに向けられ
た第一ポリクローナル抗体および前記微生物の血清型Ｂ
に向けられた第二ポリクローナル抗体を含んでなる組成
物から構成される。

【００４０】

【実施例】以下の例はこの発明を具体的に説明する目的
で提供するものであって、発明の範囲を限定するもので
ない。別に指摘しない限りすべてのパーセンテージは重
量による。 例１：アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタン
スに対するポリクローナル抗体組成物 この例では、Ａ・アクチノマイセテムコミタンスの２種
の血清型に向けられたポリクローナル抗体が調製された
。これらの２種の血清型は、７５株（ＡＴＣＣ　４３７
１７）およびＹ４株（ＡＴＣＣ　４３７１８）と命名さ
れ、それぞれ血清型ＡおよびＢと称されている。ＡＴＣ
Ｃは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ）を表わす。

【００４１】免疫原の調製および免疫法はＺａｍｂｏｎ
ら、（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，　４１（１）１９
〜２７ページ、１９８３）によって記載されている。血
清型ＡおよびＢに対する抗血清は、Ｊ．Ｊ．Ｚａｍｂｏ
ｎおよびＨ．Ｓ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ博士（ＳＵＮＹ，　
Ｂｕｆｆａｌｏ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｓｃｈｏｏｌ　
ｏｆ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ）から入手した。次に、両抗
体のＩｇＧ　画分を硫酸アンモニウム沈殿で調製し、リ
ン酸緩衝溶液（０．３〜０．４％溶液）中混合物として
（研究目的で使用する少量については４℃で、そして多
量のものは−７０℃）保存した。

【００４２】例２：結合した抗体組成物を有する微孔質
製品 この例は、アッセイで使用するための抗体組成物を結合
したこの発明の製品を記載する。上記例１で記載したポ
リクローナル抗体組成物をポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ
−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕（
モル比、９６：４）からなるポリマー粒子上に固体化し
た。この粒子は、ヨーロッパ特許公開第３２３６９２号
公報に記載された方法および出発原料を使用して調製し
た。

【００４３】Ａ・アクチノマイセテムコミタンスの血清
型Ａに対する抗体（リン酸緩衝溶液６７μｌ中５６．５
μｇ）とＡ・アクチノマイセテムコミタンスの血清型Ｂ
に対する抗体（リン酸緩衝溶液４５μｌ中５６．５μｇ
）を含んでなる抗体組成物を試験管中のホウ酸緩衝液（
０．０５モル濃度、ｐＨ８．５）６５９μｌに加え、そ
して十分に混合した。この抗体組成物にポリマー粒子（
固体　１３．１５％を含有する懸濁液　２２８μｌ）を
加え、得られた懸濁液を室温で１４〜２４時間回転させ
て粒子へ抗体を共有結合させた。次に、この懸濁液を１
０分間　２８００ｒｐｍで遠心した。上澄を廃棄し、ペ
レットをマーシオレート（０．０１％）含有グリシン緩
衝液（１ｍｌ、０．０１モル濃度、ｐＨ８．５）に懸濁
した。この操作を２度繰り返した。

【００４４】この最終的抗体／粒子試薬組成物は、グリ
シン緩衝液（０．１モル濃度、ｐＨ８．５）中抗体／粒
子試薬（１％）、ポリアクリルアミドバインダー（５％
）およびマーシオレート防腐剤（０．０１％）を含めた
。次に、この試薬組成物をＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（商標）
またはＢｉｏｄｙｎｅ（商標）Ａ微孔質膜（Ｐａｌｌ　
Ｃｏｒｐ．）の一領域に適用し、そして乾燥して抗体組
成物を有する製品を作製した。

【００４５】 例３：アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタン
スの３種の血清型用サンドイッチアッセイこの例は、サ
ンドイッチアッセイでＡ・アクチノマイセテムコミタン
スの３種の血清型すべてを検出するための血清型Ａおよ
びＢに対する抗血清を含有するこの発明のポリクローナ
ル組成物の使用を具体的に説明する。 材料 Ｓｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイスをこの
アッセイで使用した。これらのデバイスは、それぞれＦ
ｌｕｏｒａｄ（商標）ＦＣ−１３５非イオン界面活性剤
（０．０５ｇ／ｍ２　）を塗布したＬｏＰｒｏｄｙｎｅ
（商標）微孔質膜（５μｍ）を有する３種の試験ウェル
を有していた。

【００４６】血清型ＡおよびＢに対する抗体類を、上記
例２に記載したようなポリマー粒子に共有結合した。得
られた抗体／粒子試薬組成物（２μｌ）を前記試験デバ
イスの各試験ウェルに加えた。　Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　．，　１０１，　３９
５　ページ、１９７９）の方法によってワサビペルオキ
シダーゼを結合させた血清型ＡおよびＢの両抗体から酵
素−抗体結合体を調製した。この結合体組成物は、３−
（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（０．１
モル濃度、ｐＨ７．５）中カゼイン（０．５％）および
マーシオレート（０．０１％）を含んでなる溶液中に両
結合体（１ｍｌ当たり各抗体２．５μｇ）を含めた。

【００４７】色素生成組成物は、２−（４−ヒドロキシ
−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−
メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料（０．００
８％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン酸緩
衝液（１０ミリモル濃度、ｐＨ６．８）、ジエチレント
リアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）、４′−ヒド
ロキシアセタニリド（２ミリモル濃度）および過酸化水
素（１０ミリモル濃度）を含めた。洗浄は水中デシル硫
酸ナトリウム（１８ｇ／ｌ）を含めた。血清型Ａ，Ｂお
よびＣにそれぞれ対応する菌株７５、Ｙ４および６７を
Ｊ．Ｊ．ＺａｍｂｏｎおよびＨ．Ｓ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ
（上述）博士から得た。室温で約１分間ドデシル硫酸ナ
トリウム（０．０５％）を用いて抗原を抽出した。

【００４８】アッセイ 前記試験デバイスの分離した試験ウェルに各血清型Ａ，
ＢおよびＣから抽出した抗原（５０μｌ）を加え、それ
らの中の前記膜上に固定した抗体と複合体を形成した。 負対照として各試験デバイスの単一ウェルにドデシル硫
酸ナトリウム（０．５％の５０μｌ）を加えた。この結
合組成物（５０μｌ）を試験ウェルに加え、次いで約５
分間室温でインキュベーションした。

【００４９】この試験ウェルに洗液（２４０μｌ）を２
度加え、次いで色素生成組成物（１滴）を加えた後、こ
の試験デバイスを２分間室温でインキュベーションした
。膜上に形成した色素を視覚的に読みとり、反射濃度値
を有する検量カラーチャートと比較し、次いでＷｉｌｌ
ｉａｍｓ−Ｃｌａｐｐｅｒ変換（Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．
Ａｍ．，　４３　，　５９５　ページ、１９５３）を用
いて透過率濃度（ＤＴ　）に換算した。絶対細胞濃度の
対数対絶対ＤＴ　として図１に示した結果は、血清型Ａ
とＢの抗体組成物を使用してサンドイッチアッセイによ
り前記微生物のすべての菌株が検出できることを示す。 このアッセイを使用して　７５０細胞程の少ないもので
も検出することができる。

【００５０】例４：アクチノバシラス・アクチノマイセ
テムコミタンスの３種の血清型すべてに対する直接バイ
ンディングアッセイ この例は、直接バインディングアッセイによるＡ・アク
チノマイセテムコミタンスの３種の血清型すべてを検出
する目的でこの発明のポリクローナル抗体組成物の使用
を具体的に説明する。 材料： Ｚｏｎｙｌ（商標）ＦＳＮ非イオン界面活性剤（０．０
５ｇ／ｍ２，　Ｄｕｐｏｎｔ）で塗布した５μｍのＢｉ
ｏｄｙｎｅ（商標）Ａ微孔質膜（Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐ．
）　含むＳｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイ
スを使用した。ブロッキング溶液は、３−（Ｎ−モルホ
リノ）プロパンスルホン酸緩衝液（０．０１モル濃度、
ｐＨ７．５）中カゼイン（０．５％）、Ｔｗｅｅｎ（商
標）２０非イオン界面活性剤（０．３％）、４′−ヒド
ロキシアセタニリド（０．１モル濃度）およびマーシオ
レート（０．０１％）を含めた。

【００５１】血清型ＡおよびＢに対する酵素−抗体結合
体は、Ｙｏｓｉｔａｋｅら（例３に記載した）の方法に
よって特異的ウサギポリクローナル抗体類にワサビペル
オキシダーゼを共有結合することで調製した。この結合
体組成物は、両接合体（ブロッキング溶液１ｍｌ当たり
各９μｇ）を含めた。例３の色素溶液を使用した。洗液
は、３−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシ−１−
プロパンスルホン酸緩衝液（０．０５モル濃度）、Ｅｍ
ｃｏｌ（商標）ＣＣ−９カチオン界面活性剤（０．７５
％，　Ｗｉｔｃｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）　およびマーシ
オレート（０．０１％）を含めた。そのｐＨを水酸化ナ
トリウム（０．０５規定）を添加して１０に調節した。 ３種の血清型のすべてに対する菌株は、上記例３のよう
に入手しそして抽出した。

【００５２】アッセイ： 前記使い捨て試験デバイスの試験ウェルに抽出した抗原
（５０μｌ）を加え、微孔質膜に吸着させた。リン酸緩
衝溶液（５０μｌ）を負対照として第二のウェルに加え
た。 この酵素−抗体結合体溶液（５０μｌ）を両試験ウェル
に加え、次いで５分間室温でインキュベーションした。 試験ウェルを２度（約２４０μｌ）洗浄し、次いで色素
生成組成物（５０μｌ）を加えた。２分間室温でインキ
ュベーションした後、膜上の色素を視覚的に観察し、上
記例３と同様に透過率濃度（ＤＴ　）に換算した。細胞
濃度の対数対絶対ＤＴ　のプロットとして図２に表わす
結果は、この発明の組成物を直接バインディングアッセ
イに使用して前記微生物の３種の血清型のすべてを検出
することができることを示す。このアッセイは約３００
０細胞程の少ない細胞を検出できる。

【００５３】

【発明の効果】この発明のポリクローナル組成物は、Ａ
・アクチノマイセテムコミタンスの３種の血清型すべて
に非常に高い特異性を有する。従って、患者の被検体中
に存在する可能性のあるこの生物体のすべての菌株を検
出するのにほんの２種の抗体類が必要であるにすぎない
。通常、生物体の３種の血清型すべてを検出するのに３
種の血清型すべてに対する特異的な抗体類が必要であろ
う。さらに、この組成物はサンドイッチアッセイおよび
直接バインディングアッセイ（前述）を初めとする各種
の分析法で有利に使用することができる。この発明の組
成物は緩衝液状態で前記のようなアッセイに供給できる
が、好ましくは使い捨て試験デバイス（前述）のような
水不溶性製品に設置した微孔質支持体に付着することが
好ましい。

【図面の簡単な説明】

【図１】サンドイッチアッセイで示されるＡ・アクチノ
マイセテムコミタンスの絶対透過率濃度（ＤＴ　）対絶
対細胞濃度の対数のグラフである。

【図２】例４に詳細に記載した直接バインディングアッ
セイで示されるＡ・アクチノマイセテムコミタンスの絶
対透過率濃度対絶対細胞濃度の対数をプロットするグラ
フである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　微生物アクチノバシラス・アクチノマ
   イセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
   　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ　）の
   各３種の血清型少なくとも１種の抗原と免疫複合体を形
   成するのに有用なポリクローナル抗体組成物であって、
   唯一の免疫反応体として前記微生物の血清型Ａに向けら
   れた第一ポリクローナル抗体および前記微生物の血清型
   Ｂに向けられた第二ポリクローナル抗体を含んでなる組
   成物。
2. 【請求項２】　　少なくとも第一の外面および反対側の
   第二の外面を有する微孔質支持体を含んでなり、かつそ
   れらの面の少なくとも一つに、微生物アクチノバシラス
   ・アクチノマイセテムコミタンスの各３種の血清型少な
   くとも１種の抗原と免疫複合体を形成するのに有用なポ
   リクローナル抗体組成物であって、唯一の免疫反応体と
   して前記微生物の血清型Ａに向けられた第一ポリクロー
   ナル抗体および前記微生物の血清型Ｂに向けられた第二
   ポリクローナル抗体を含んでなる組成物を付着した水不
   溶性製品。
3. 【請求項３】　　Ａ．微生物アクチノバシラス・アクチ
   ノマイセテムコミタンスから抽出された抗原を唯一の免
   疫反応体として前記微生物の血清型Ａに向けられた第一
   ポリクローナル抗体および前記微生物の血清型Ｂに向け
   られた第二ポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗
   体組成物を接触させて前記抗原と前記ポリクローナル抗
   体との間で免疫複合体を形成する工程、ならびにＢ．前
   記抗原の存在の指標として前記複合体の存在を検出する
   工程、を含んでなる微生物アクチノバシラス・アクチノ
   マイセテムコミタンスの３種の血清型すべての検出方法
   。
4. 【請求項４】　　少なくとも第一の外面および反応側の
   第二の外面を有する微孔質支持体を含んでなり、かつそ
   れらの面の少なくとも一つに、微生物アクチノバシラス
   ・アクチノマイセテムコミタンスの各３種の血清型少な
   くとも１種の抗原と免疫複合体を形成するのに有用なポ
   リクローナル抗体組成物であって、唯一の免疫反応体と
   して前記微生物の血清型Ａに向けられた第一ポリクロー
   ナル抗体および前記微生物の血清型Ｂに向けられた第二
   ポリクローナル抗体を含んでなる組成物を付着した水不
   溶性製品からなるアクチノバシラス・アクチノマイセテ
   ムコミタンスの測定に有用な診断試験キット。
5. 【請求項５】　　アクチノバシラス・アクチノマイセテ
   ムコミタンスの各３種の血清型少なくとも１種の抗原と
   免疫複合体を形成するのに有用なポリクローナル抗体組
   成物であって、唯一の免疫反応体として前記微生物の血
   清型Ａに向けられた第一ポリクローナル抗体および前記
   微生物の血清型Ｂに向けられた第二ポリクローナル抗体
   をを含んでなる組成物、からなるアクチノバシラス・ア
   クチノマイセテムコミタンスの測定に有用な診断試験キ
   ット。