JPH04218363A - ハンセヌラ・ポリモルファおよびその培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規微生物およびその培
養方法に関する。一面では本発明は単細胞タン白の製造
に関し、別の面では新規酵母菌株に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決するための課題】世界的
なタン白不足を軽減するために、種々の生合成方法が開
発された。その方法では、各種の炭素含有基質上で１種
以上の各種微生物を生育させて単細胞タン白（ＳＣＰ）
を得ている。

【０００３】炭素エネルギー基質は容易に入手でき、比
較的安価で、均一および安全でなくてはならない。石油
系炭化水素は炭素エネルギー源として使用されたが、水
溶性が不足することおよび微生物変換を助けるためにか
なりの分子状酸素が消費されるので実用上問題があった
。他の方法では、酸素化飽和炭化水素誘導体が相対的に
水溶性のため、それを供給原料として集中的に使われて
きた。水性醗酵体の取扱いが容易なことおよび微生物変
換−生育方法に要する分子状酸素が実質的に減少するか
らである。

【０００４】しかし、ＳＣＰの工業的製造上の制限因子
は、消費基質に基づき乾燥細胞の適度の収量を有すると
共に、比較的適度の細胞密度に醗酵液を調整する必要が
あることおよびその消費されかつその結果適量のＳＣＰ
物質を回収するために大量の全醗酵流出液を処理する必
要性があることである。大量の水性醗酵流出液を処理す
ると、遠心分離、また洗滌および乾燥工程のようにＳＣ
Ｐ生成物の濃縮を困難にする。

【０００５】従来のいくつかの方法は一般に酵母から得
られる粗タン白含量に比し、バクテリア細胞のそれは僅
かに高いためにバクテリアの培養法に集中した。しかし
酵母は広く入手でき、比較的簡単に培養される。酵母細
胞は一般にバクテリア細胞に比し僅かに大きいから、酵
母細胞は醗酵流出液から一層容易に分離できる。

【０００６】細胞収量を増加させ、特に高細胞密度で操
作する手段および方法の発見は非常に望ましい。たとえ
ば実質的に少ない醗酵流出液容量を取扱うことは、配管
やポンプの大きさを小さくし、所要殺菌の減少による所
要水の減少、そして凝固および分離工程に対する装置の
大きさや取扱い上の要件が減少するという大きな節約を
意味する。

【０００７】特開昭５７−４３６８２号公報に記載の発
明には、醗酵器内の醗酵体に無機塩高濃度を含む培地を
添加することにより、通常得られない非常に高い細胞密
度で醗酵器内の醗酵液を操作し、高収量の酵母ＳＣＰ生
成物を生産するように酵母培養物を使用する連続的好気
性醗酵方法が開示される。細胞密度とは醗酵液１容につ
き乾物重量規準の細胞濃度を意味する。醗酵液は細胞を
含む水性醗酵ブロスもしくは液の全容量を意味する。細
胞密度は通常ｇ／ｌとして表わす。収量は醗酵液に供給
した炭素エネルギー源もしくは基質重量で所定消費に対
し産生された細胞重量を意味する。そして通例はｇ／ｇ
で表わされる。

【０００８】本発明方法により得ることのできる高細胞
密度は非常に能率化され、ＳＣＰ生産コストを減少させ
る。多くの場合、遠心分離等によりＳＣＰ生成物を濃縮
するのは非常に減少し、もしくは使用されないことさえ
ある。細胞生成物は必要なら、洗滌要素で洗滌して未消
費残存塩を除き、そして噴霧乾燥機のような乾燥要素に
直接移送することができる。洗滌液は細胞に組込まれな
い大部分の残存無機塩を含み、醗酵器に再循環すること
ができる。したがって、醗酵工程に要する水は非常に減
少し、そして重要なことは廃棄を要する廃水がほとんど
もしくは全くないことである。別法として、所望の場合
残存塩を含む全醗酵液を乾燥することができる。

【０００９】これまで酵母培養物からＳＣＰ材料を連続
的に製造する方法には、一般には醗酵液１リットルにつ
き約２０〜２５ｇの細胞のような比較的低酵母細胞含量
を有する醗酵流出液を供した。しかし、本発明は醗酵液
１リットルにつき１００ｇ以上のような比較的高レベル
で酵母細胞を産生する醗酵方法を供する。酵母細胞の高
収量と連結した醗酵液中のこのような高細胞密度は特に
連続生産条件では一層有効、効率的生産を意味する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明はＨａｎｓｅｎｕ
ｌａ　　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　　ＮＲＲＬ　　Ｙ−１
１４３２の酵母培養物およびその誘導物を供し、炭素源
が酸素化炭化水素の炭素である水性醗酵培地にて好気培
養した時、単細胞タン白の製造上特に有用である。

【００１１】本発明によれば、酵母は有効量の分子状酸
素含有ガス、同化性窒素源、栄養無機塩を使用し、必要
の場合、ビオチンやチアミンのようなビタミンなどの付
加的栄養有機物質を添加して、基質として適当な炭素エ
ネルギー源で実質的に連続的な好気水性醗酵条件下に生
育させる。この方法では、無機塩は後記するように、高
レベルで添加でき、その結果高細胞密度で操作し、高収
量を得る醗酵方法となる。高濃度（比較的）無機塩を醗
酵液に添加して細胞にほとんど強制的に供して高生育割
合を得る醗酵を行なうのに有用である。醗酵液自体の上
澄液（すなわち細胞を除く醗酵液）中の無機塩濃度は勿
論比較的低レベルで残留する。それは塩が細胞により生
育および再生産に消費されるからである。従って、細胞
プラス上澄液中の塩濃度は非常に高い。

【００１２】醗酵条件 水性無機塩培地、炭素エネルギー源材料、分子状酸素、
同化性窒素、および勿論、使用する酵母の１種以上の特
定種の出発接種材料より成る生育培地で培養を行なう。

【００１３】本発明方法では、高濃度の無機塩を醗酵液
に供給できるので、醗酵液に高濃度で保持される。適当
な微生物の生育を確保するため、微生物変換方法におい
て細胞による炭素およびエネルギー源の同化を最高にす
るため、そして醗酵培地において最高の細胞密度で最高
の細胞収量を達成するために、供給培地に一定割合の選
択無機栄養素を適当量供することが必要である。

【００１４】醗酵液の組成は一部酵母および使用基質に
より広範囲に変化しうるが、本発明による醗酵液（すな
わち、液プラス細胞）中の無機物含量は比較的高く、こ
れまで適当と考えられ、もしくは先行技術により実施さ
れたものより高レベルである。醗酵液中の各種要素の最
少の巾広いそして現在好ましい濃度範囲は以下の表に示
す。その濃度は要素のものとして表わすが、各々のすべ
てもしくは一部は可溶性イオンの形で、もしくはＰのよ
うな場合にはリン酸塩のような結合形で存在しうること
が認められる。各要素量は醗酵液（細胞を含む水性相）
１リットルにつきｇもしくはｍｇで表わされる。

【００１５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　醗酵液１リ
ットル当りの要素重量要素　　　　　　最　　小　　　
　　　　　　　　　広い範囲　　　　　　　　　　　　
　　好ましい範囲Ｐ　　　　　　　　１．９ｇ　　　　
　　　　１．９〜２０ｇ　　　　　　　　　　２．２〜
１０ｇＫ　　　　　　　　１　　ｇ　　　　　　　　　
　１〜２０ｇ　　　　　　　　　　　　　　１．５〜１
０ｇＭｇ　　　　　　０．１５ｇ　　　　　　０．１５
〜３ｇ　　　　　　　　　　０．３〜１．２ｇＣａ　　
　　　　０．０６ｇ　　　　　　０．０６〜１．６ｇ　
　　　　　０．０８〜０．８ｇＳ　　　　　　　　０．
１ｇ　　　　　　　　０．１〜８ｇ　　　　　　　　　
　　　０．２〜５ｇＦｅ　　　　　　６　　ｍｇ　　　
　　　　　６〜１４０ｍｇ　　　　　　　　　　９〜８
０ｍｇＺｎ　　　　　　２　　ｍｇ　　　　　　　　２
〜１００ｍｇ　　　　　　　　　　３〜４０ｍｇＣｕ　
　　　　　０．６ｍｇ　　　　　　０．６〜１６ｍｇ　
　　　　　　　１〜１０ｍｇＭｎ　　　　　　０．６ｍ
ｇ　　　　　　０．６〜２０ｍｇ　　　　　　　　０．
９〜８ｍｇ硫黄は硫酸塩の形で使用することが望ましい
。所要金属のいくつかは硫酸塩の形で添加することが有
利であるので、硫黄の最小濃度は通常超過する。表示し
た任意の金属又はすべては硫酸塩として使用しもしくは
含ませることができる。Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ
およびＭｎは硫酸塩もしくは塩化物の形で、もしくはそ
の場所で硫酸塩又は塩化物に変換する化合物の形で使用
するのがよい。Ｋは硫酸塩、塩化物、もしくはリン酸塩
として、もしくはその場所で硫酸塩、塩化物もしくはリ
ン酸塩に変換する化合物の形で使用することが好ましい
。Ｐはリン酸形又はリン酸塩、たとえばカリもしくはア
ンモニウム塩のような１水素リン酸塩もしくは２水素リ
ン酸塩の形で、もしくはその場所でこのような塩に変換
する化合物として使用することが好ましい。

【００１６】少なくとも痕跡量で含ませることができる
他の要素はたとえばハロゲン化物もしくは硫酸塩のＮａ
およびＣｏ，Ｍｏ（たとえばモリブデン酸塩），Ｂ（た
とえば硼酸塩），Ｓｅ（たとえば亜セレン酸塩もしくは
セレン酸塩）又はＩ（たとえば沃化物）を含む。代表的
高細胞密度醗酵では、醗酵液は容量で約１／２上澄培地
および１／２細胞から成る。しかし、これらの１／２容
量細胞は少なくとも約２／３の醗酵液の無機塩含量を含
む。

【００１７】酵　　母 本発明方法は水性醗酵条件下で炭素含有基質に生育する
のに適する酵母培養物を使用する。本発明で使用する酵
母は新規菌株Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３２である。しかし、Ｃａ
ｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉ
ｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｄｅ
ｂａｒｙｏｍｙｃｅｓおよびＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅ
ｓ属由来の種を含む他の酵母と併用することができる。 好ましい属はＣａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｔ
ｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓを含む。適当な種の例は： 　　Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　ｐｅｔｒｏｐｈｉｌ
ｉｕｍ　　　　　　　　Ｐｉｃｈｉａ　　ｆａｒｉｎｏ
ｓａ　　Ｃａｍｄｉｄａ　　ｂｏｉｄｉｎｉｉ　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｐｉｃｈｉａ　　ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａ　　Ｃａｍｄｉｄａ　　ｌｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａ　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｉｃｈｉａ　　
ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ　　Ｃａｍｄｉｄａ
　　ｍｙｃｏｄｅｒｍａ　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｐｉｃｈｉａ　　ｐｉｎｕｓ　　　Ｃａｍｄｉｄａ
　　ｕｔｉｌｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ　　Ｃａｍｄｉ
ｄａ　　ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ　　　　　　　　　
　　　　Ｐｉｃｈｉａ　　ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ　
　Ｃａｍｄｉｄａ　　ｒｏｂｕｓｔａ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　　Ｃａｍｄｉｄａ　　ｃｌａ
ｕｓｓｅｎｉｉ　　　　　　　　　　　　　　　Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｆｒａｇｉｌｉｓ　　　Ｃａ
ｍｄｉｄａ　　ｒｕｇｏｓａ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｒｏｓ
ｅｉ　　Ｃａｍｄｉｄａ　　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ　　
　　　　　　　　　　　　　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　　ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ　　　Ｄｅｂａｒｙｏ
ｍｙｃｅｓ　ｈａｎｓｅｎｉｉ　　　　　　　　　　　
　　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｅｌｅｇａｎｓ　
　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｍｉｎｕｔａ　　　　　　　
　　　　　　　　　　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　
ｒｏｕｘｉｉ　　　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｓａｔｕｒ
ｎｕｓ　　　　　　　　　　　　　　　Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　　ｌａｃｔｉｓ　　　Ｈａｎｓｅｎｕｌ
ａ　　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　　　　　　　　　　　
　Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ　　
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｍｒａｋｉｉ　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｃａｎｄ
ｉｄａ　　　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｓｉｌｖｉｃｏｌ
ａ　　　　　　　　　　　　　　Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
　　ｂｏｉｍｉｉ　　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａ　　　　　　　　　　　　　Ｔｏｒｕｌｏ
ｐｓｉｓ　　ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ　　Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａ　　ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ　　　　　　　　　　
　　Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｇｌａｂｒａｔａ　　Ｈ
ａｎｓｅｎｕｌａ　　ｃａｐｓｕｌａｔａ　　　　　　
　　　　　　　　Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｍｏｌｉｓ
ｈｉａｎａ　　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｇｌｕｃｏｚｙ
ｍａ　　　　　　　　　　　　　　Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉ
ｓ　　ｎｅｍｏｄｅｎｄｒａ　　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　
　ｈｅｎｒｉｃｉｉ　　　　　　　　　　　　　　　Ｔ
ｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｎｉｔｒａｔｏｐｈｉｌａ、お
よび　　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔ
ａｎｓ　　　　　　　　　　Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　
ｐｉｎｕｓ　　　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｈｉｌｏｄ
ｅｎｄｒａを含む。使用特定酵母は一部使用する炭素含
有基質による。その理由は酵母が異るとしばしば最善の
生育をするためにいくらか異る基質を要求することは周
知であるからである。たとえば、Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａ
ｓｔｏｒｉｓのような上記種の或る特定菌株はメタノー
ルに生育しないことが認められる。

【００１８】Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａ（カルチャー２１−３）ＮＲＲＬＹ−１１４３２と
して寄託された特定菌株又はその誘導菌株は高細胞密度
で高収量を有するＳＣＰ材料の製造に使用するのに特に
適している。この菌株の特徴はこれらの種に対し特に異
例と考えられる。何故ならばメタノール上に生育したか
らである。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａ（カルチャー２１−３）ＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３２
は新規且ユニークであると考えられる。

【００１９】炭素エネルギー基質は酵母基質として適す
る各種炭水化物を含む酸素化炭化水素等を含む。特定酵
母は各種基質に対する好みで変わることが認められる。

【００２０】水性醗酵条件に対し現在好ましい基質は炭
素−酸素−水素の高水溶性化合物である。「酸素化炭化
水素」なる用語は使用できる化合物を記載する本開示で
は総括的用語を意味するもので、必ずしも基質源を意味
する限定用語ではない。本開示に対し、酸素化炭化水素
は水溶性炭水化物、ならびにこれらのアルコール、ケト
ン、エステル、酸およびアルデヒド、および混合物を含
み、それらは１分子につき１〜２０炭素原子を有し一般
的に有意に水溶性のものである。一層適当な酸素化炭化
水素は通例１分子につき約１０個までの炭素原子を有す
る実質的により大きい水溶性のものであるかもしくは一
般的に水溶性炭水化物である。

【００２１】例示する炭水化物はグルコース、フラクト
ース、ガラクトース、ラクトース、シュクロース、澱粉
、デキストリンなどを単独もしくは混合物で含む。酸素
化炭化水素の他のタイプとしてはメタノール、エタノー
ル、エチレングリコール、プロピレングリコール、１−
プロパノール、２−プロパノール、グリセロール、１−
ブタノール、２−ブタノール、３−メチル−１−ブタノ
ール、１−ペンタノール、２−ヘキサノール、１，７−
ヘプタンジオール、１−オクタノール、２−デカノール
、１−ヘキサデカノール、１−エイコサノール、アセト
ン、２−ブタノン、４−メチル−２−ペンタノン、２−
デカノン、３−ペンタデカノン、２−エイコサノン、ホ
ルムアルデヒト、アセトアルデヒド、プロピオンアルデ
ヒド、ブチルアルデヒド、ヘキサナール、７−メチルオ
クタナール、テトラデカナール、エイコサナール、酢酸
、プロピオン酸、酪酸、グルタール酸、５−メチルヘキ
サン酸、アゼライン酸、ドデカン酸、エイコサノン酸、
蟻酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酪酸プロピル、
ヘキサノン酸イソプロピル、ヘキシル５−メチルオクタ
ノエート、ドデカノン酸オクチル等およびその混合物を
含む。

【００２２】ＳＣＰの細胞から残存基質を除去すること
が時々困難であるため余り好ましくはないが、本発明方
法により１分子につき１０〜２０個の炭素原子のような
ノルマルパラフィンを使用することもできる。酵母は一
般に１分子につき炭素原子１０個より少ないパラフィン
を同化しない。代表的にはこれらはデカン、ウンデカン
、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン
、ヘキサデカン、オクタデカン、エイコサン等およびそ
の混合物を含む。

【００２３】炭素原子１〜４個の水溶性アルコール、炭
素原子２〜４個の水溶性酸および水溶性炭水化物が好ま
しい。水溶性モノハイドリック脂肪族ハイドロカルビル
アルコールが好ましい。２−メチル−１−プロパノール
は或る酵母に対し阻害的であることは注目すべきである
。このような酵母による醗酵ではこのアルコールは避け
るべきである。炭素原子１〜４個のアルコール（２−メ
チル−プロパノール以外の）が最も好ましい。これらの
うちメタノールおよびエタノールがその他のもの以上に
好ましい。そしてメタノールはこのような供給材料のう
ち比較的低コストのため最も好ましい。

【００２４】石油ガスは酸化することができる。そして
各種のアルデヒド、ケトン、酸などと共に相当するアル
コールの優勢混合物を供するために使用される、メタン
、エタンなどの酸化のような水溶性材料、および同様に
総合的精製・化学処理コンプレックス、往々ペトロコン
プレックスと呼ばれる内で製造された各種石油精製所源
由来の適当な炭化水素画分は醗酵の目的に使用すること
ができる。

【００２５】上澄液中の塩は比較的低濃度である。それ
は生育再生産細胞による高摂取があるからである。細胞
中の無機塩は、いくらかが結合有機形であるために供給
、適用することができない。勿論醗酵液の無機物の分析
は全無機物含量を反映するであろう。

【００２６】無機塩の他にビタミン（有機生育因子）は
当業者に公知のように、選択した特定酵母の増殖にその
存在が望ましい場合には醗酵液に使用することができる
。たとえば、適当な増殖のために多くの酵母はビタミン
のビオチンおよびチアミンのうちの１種もしくは両者、
もしくはこれらのビタミンを含む他の培地成分、たとえ
ば酵母エキスの存在を必要とするらしい。従って、たと
えばＨａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのよ
うな酵母については水性ミネラル培地１リットルにつき
約０．０４〜０．８ｍｇ量のビオチンおよび水性ミネラ
ル培地１リットルにつき約４〜８０ｍｇ量のチアミン塩
酸塩を使用することが望ましい。別法では、ビオチンお
よびチアミンの全部もしくは一部は酵母エキスなどの使
用により供することができる。

【００２７】水性好気醗酵方法において生育因子が添加
される使用ミネラル培地の製造において、ある国で精製
処理工程による水に普通に遭遇するような残留塩素量を
含む水の使用は、生育因子特にビオチンもしくはチアミ
ンのようなビタミンを無効化する傾向があること、そし
てこのような醗酵システムで、残留塩素を含む水から製
造した水性ミネラル培地を使用する場合、生育因子の添
加前に塩素を除去すると生育因子のロスもしくは不活性
化を回避することが以前から分っていた。従って、残留
痕跡塩素を効果的に除去し、こうしてビタミンロスを避
けるように残留塩素含有水を処理する方法が開発された
。

【００２８】これまで残留塩素の好ましくない量を含む
水は、それにも拘らずビタミンが水性栄養培地とは別の
流れとして醗酵帯に添加される場合、塩素によるビタミ
ンの不活性化を生ぜずにビタミンを使用する醗酵方法で
使用できることが分った。従って、ミネラル栄養培地は
痕跡量の塩素を含む水を使用することができる。こうし
てこの手順は残留痕跡量の塩素を含む水の高価でおよび
／もしくは時間を消費する方法による前処理の必要を回
避する。

【００２９】上記の醗酵帯へビタミンを別に添加するこ
とは、醗酵帯にこれらの材料を添加する前にビタミンを
少なくとも一部の好ましくは全部の炭素エネルギー基質
の流れと混合することにより、好ましく、且有利に達成
される。ビタミンおよび炭素エネルギー基質の水性混合
物が使用される場合、最初のビタミンの稀釈に使用する
水は好ましくはイオン除去水のような残留塩素の痕跡を
含まぬものであるべきで、メタノール水溶液のような水
性炭素基質と混合前にはどんな事前のロスをも避けるべ
きである。

【００３０】所望の場合、そして好ましくは混合物は水
およびメタノールのような水溶性炭素基質たとえば約２
０容量％メタノール水溶液から製造され、次にビタミン
をメタノール水溶液に溶解し、次に醗酵器に供給するこ
とができる。この態様により、残留塩素は最初に除去す
る必要はないが、尚ビタミンは完全に保存される。

【００３１】一層好ましい態様では醗酵帯へのビタミン
の別の添加はビタミン、上記の少なくとも一部の炭素エ
ネルギー基質および更に水性微量無機塩溶液を添加した
混合物を使用して達成される。微量無機塩はＣｏ、Ｍｏ
、Ｂ、Ｓｅ、Ｉ、Ｍｎ、Ｃｕ、ＺｎおよびＦｅのような
微量元素として上記したものより成る。この一層好まし
い態様の使用は水性無機塩培地に使用する水中の痕跡塩
素により生ずるビタミンの不活性化問題を避けるのみで
なく、醗酵方法でしばしば遭遇する別の問題をも回避す
る。この問題はしばしば清浄化を要する水性無機塩培地
を処理するために使う加熱殺菌帯における沈澱物の形成
である。最初の無機栄養塩と通例混合する微量無機塩の
存在は加熱殺菌帯における厄介な沈澱の形成を明らかに
促進する。従って、水性無機塩培地流に微量無機塩を含
まず、しかしむしろその代りに微量無機塩をビタミンお
よび少なくとも一部の炭素エネルギー基質と混合して入
れることにより、２つの非常に厄介な問題を解決する。 上記のように微量無機塩、少なくとも一部の炭素エネル
ギー基質およびビタミンの混合物を製造するために使用
する水は好ましくは残留痕跡塩素を含むべきではない。

【００３２】ビタミン、一部の炭素エネルギー基質およ
び微量ミネラルより成る流れは必要な場合濾過により無
菌にすることができる。しかし、醗酵帯に入れる前にそ
の流れと主な炭素エネルギー基質とを組み合せ、醗酵帯
に入れる直前に全体の組み合せた流れを濾過することは
好ましく、有利である。

【００３３】醗酵自体は分子状酸素を必要とする好気性
方法であり、それは空気、酸素の多い空気のような分子
状酸素含有ガス又は実質的に純粋な分子状酸素により供
給され、増殖様式で微生物の生長を助けるのに有効な酸
素分圧により醗酵液を維持する。酸素化炭化水素基質を
使用することにより、微生物の生育上の全酸素要求量は
、パラフィンを使用する場合より少ない。そうであって
も、適当量の分子状酸素は生育のため供給しなければな
らない。何故ならば基質の同化および微生物の相当する
生育はいく分かは燃焼過程であるからである。

【００３４】分子状酸素を醗酵液に供給する場合は、酵
母の生育が酸素の不足により制限されないようにすべき
である。醗酵槽のデザインは培養物に酸素を移送する能
力を広く変化させる。全体の通気割合はかなりの範囲で
変えることができるが、酸素移送に非常に効果的な醗酵
槽では、通気は一般に１分間当り醗酵槽中の液体容量に
ついて分子状酸素含有ガス容量（使用圧および２５℃で
）で約０．５〜８、好ましくは約１〜６の割合で行なわ
れる。この量は反応器に供給される通常の酸素含量の空
気および純粋の分子状酸素に基づき、それぞれの範囲は
１分間当り醗酵槽内の液体容量について分子状酸素の容
量（使用圧および２５℃で）で約０．１〜１．７、もし
くは好ましくは約０．２〜１．３であろう。

【００３５】微生物醗酵工程に使用する圧は広く変える
ことができる。代表的圧は装置および運転コスト対達成
される酸素溶解度のバランスとして、約０〜１５０ｐｓ
ｉｇ、好ましくは約０〜６０ｐｓｉｇ、更に好ましくは
少なくとも大気圧より僅かに高いものである。大気圧よ
り高い圧は水性醗酵液において溶存酸素濃度を増加させ
る傾向があることで有利である。それは次に細胞の生育
割合の増大を助けることができる。同時に高圧は装置お
よび運転コストを増加させるという事実により相殺され
る。

【００３６】醗酵温度はいくらか変えることができるが
、一般に約２５〜６５℃、好ましくは約２８〜５０℃で
ある。ＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３２として寄託されたＨ
ａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　　カルチ
ャー２１−３は約３８〜４０℃の醗酵温度を好む。

【００３７】酵母は同化性窒素源を必要とする。同化可
能な窒素は酵母の代謝利用に適する形の任意の窒素含有
化合物もしくは窒素を遊離できる化合物により供給する
ことができる。タン白加水分解物のような各種の有機窒
素源化合物は技術的に使用することができるが、通例は
アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素のような安価な
窒素含有化合物およびリン酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、ピロリン酸アンモニウムおよび塩化アンモニウ
ムのような各種アンモニウム塩を使用することができる
。アンモニアガス自体は大規模操作には有利であり、適
当量で水性微生物醗酵液を泡立て使用することができる
。同時にこのようなアンモニアはｐＨ調整に役立つ。

【００３８】水性微生物醗酵液のｐＨ範囲は約３〜７、
好ましくはそして通例は約３．５〜５．５の範囲である
べきである。ｐＨ範囲に対する或る種の微生物の好みは
或る程度まで使用培地により、および特定微生物による
。従って培地を変えていくらか変えることができ、当業
者により容易に決定できる。醗酵槽内の醗酵液の平均保
持時間は一部は醗酵温度および使用酵母培養物によりか
なり変えることができる。一般に保持時間は平均保持を
規準として約２〜３０時間、好ましくは約４〜１４時間
である。

【００３９】高濃度の既述のいくつかの炭素およびエネ
ルギー基質、特にメタノール、もしくはホルムアルデヒ
ドなどは満足すべき微生物の生育に阻害的であり又は醗
酵微生物に有毒でさえある。従って、比較的高濃度の基
質は避けるべきであり、一般には最大の許容できるレベ
ルで醗酵液の基質濃度を維持することが望ましい。ある
低級アルコールについては、醗酵液中のこのレベルは一
般に約０．００１〜５容量％、好ましくは約０．０１〜
０．０５容量％であり、一方アルデヒドについては、餓
死、もしくは選択した微生物の生育割合を阻害しないよ
うに、アルデヒドの毒性の点からこれらの１／１０であ
るべきである。

【００４０】炭素およびエネルギー源材料が微生物に対
し有害可能量のアルデヒドを含む場合、有害アルデヒド
作用は基質を適当量の窒素含有化合物、好ましくはアン
モニア、水酸化アンモニウム、もしくは他の活性アンモ
ニウム化合物で、アルデヒド１モルにつきこのような窒
素含有化合物を約０．０１〜１０モル当量の比率で最初
に処理することにより軽減することができる。次にこの
ような処理基質は炭素エネルギー源のみだけでなく、少
なくとも一部の必要な同化可能な窒素を含む。

【００４１】炭素含有基質は限定因子として調整するこ
とができ、それによって炭素含有基質を酵母細胞に十分
に変換させ、実質量の未変換基質による酵母細胞の可能
な汚染を避けるような方法で醗酵を行なうのがよい。後
者は水溶性基質による問題ではない。何故ならいかなる
残留痕跡も容易に洗い出されるからである。しかし、適
当な溶媒洗滌工程による残存炭化水素除去などの添加生
成物処理工程を必要とする。高級ｎ−パラフィンの如き
非水溶性基質の場合には問題がある。

【００４２】連続運転は調整の容易さ、均一量の均一生
成物の製造およびすべての装置の最も経済的使用のため
非常に好ましい。連続方法では、基質として炭素および
エネルギー源材料、水性ミネラル培地、同化可能な窒素
源および分子状酵素含有ガスは醗酵液の連続的回収と組
み合せて醗酵槽の醗酵液に連続的に添加される。添加炭
素エネルギー基質：添加水性ミネラル培地の容量比は、
一部は炭素含有基質の性質により広範囲に変化しうるが
、一般には約１：９〜６：４の範囲、好ましくは約２：
８〜５：５の範囲である。必要の場合、すべての炭素エ
ネルギー源材料の一部分および／もしくはアンモニアの
ような同化可能な窒素源の一部分は、醗酵槽に水性ミネ
ラル培地を通す前に水性ミネラル培地に添加することが
できる。高細胞密度醗酵の本方法において約４０容量％
アルコール対６０容量％無機塩培地の供給比率の使用が
もっとも有利であった。

【００４３】反応器に導入される各流れは所定の割合で
、もしくは炭素およびエネルギー基質濃度、ｐＨ、溶存
酸素、醗酵槽から排出されるガス中の酸素もしくは炭酸
ガス、光透過により測定できる細胞密度などを監視して
測定できる要求に応じて調整される。各種材料の供給割
合は炭素およびエネルギー源の効率的利用と一致させ、
できるだけ早い細胞生育速度を得るように、添加基質に
対する酵母細胞の収量をできるだけ高く得るように変え
ることができる。本発明方法により、酵母細胞は、一部
は使用する特定基質により、添加基質１００ｇにつき約
３０〜１１０ｇの収量で得ることができる。

【００４４】すべての装置、反応器、もしくは醗酵要素
、容器、配管、付属の循環もしくは冷却装置などは、通
例は約２５０°Ｆ（１２０℃）で少なくとも約１５分間
のような蒸気を使用して殺菌することが最も好ましい。 殺菌した反応器は分子状酸素および炭素含有基質を含む
すべての所要栄養素の存在下に特定微生物の培養物を接
種させる。使用醗酵槽のタイプは、泡を満たした醗酵槽
における操作が好ましいが、本発明の醗酵方法の実施に
おいては重要ではない。生成泡の促進および保持するた
めに考案された醗酵槽は必要な高細胞密度および急速生
育速度を維持するために必要な酸素移送を増大させる方
法には有利である。

【００４５】醗酵の出発において、水性ミネラル培地、
適当な濃度の炭素源、同化可能な窒素、必要の場合微量
成分および酵母の出発接種材料を殺菌した醗酵槽に入れ
、酸素および各種供給物の適当な流れを徐々に開始させ
る。必要の場合、初めの醗酵基質はグルコースなどで、
細胞密度が高まると共に徐々にメタノールなどに変える
ことができる。水性醗酵液においては低無機塩レベルで
開始し、無機塩の高濃度を有する水性ミネラル培地を醗
酵液に供給することにより高無機塩レベルに増強するこ
とができる。しかし、通常は単に初めに醗酵槽に高塩培
地を添加し直ちに操作を開始する。当業者は接種材料が
塩および使用基質の完全な投入に対し、十分な細胞を形
成する前に出発後通例短かい遅延時間が生ずることは理
解するであろう。

【００４６】生成物の回収 本発明の高細胞密度方法により生産した酵母細胞は遠心
分離又は濾過のような常法により醗酵混合物流出液から
回収することができる。所望の場合、細胞外生成物は常
法により実質的に細胞を含まぬ残留上澄液から回収する
ことができる。実質的に細胞を含まぬ流出部は、たとえ
ばアセトン又は低級アルコール（メタノールもしくはエ
タノール）で処理し、細胞外に生産された任意の高分子
物質に沈澱させることができる。細胞を含まぬ流出物は
溶媒抽出および／もしくは塩基抽出により処理し、所望
の場合培養工程中に産生した色素、ビタミン、又は有機
酸のような他の細胞外生成物を回収することができる。 このような付随的処理をするか又はせずに、細胞を含ま
ぬ流出液は、水性成分の一部として、もしくは水性成分
の実質的もしくはほとんど全部として醗酵槽に戻し、で
きる限り廃棄物問題を回避することができる。微生物細
胞は通例加熱もしくは化学的手段により殺し、これは醗
酵流出物から細胞を分離する前後に行なうことができる
。酵母細胞は人間や動物にとって貴重なタン白源である
。人の消費に対し、必要に応じて細胞を処理して核酸を
減少させることができるが、動物飼料目的に対してはこ
のような処理は現在必要とは思われない。

【００４７】本発明によれば、高細胞密度たとえば醗酵
混合物１リットルにつき乾燥規準で酵母細胞を約６０〜
１６０ｇ、望ましくは約７０〜１５０ｇの範囲内の細胞
密度の操作を使用して高収量を得ることができる。所望
の場合、細胞は遠心分離又は他の分離方法により醗酵混
合物から回収することができる。また、所望の場合、次
に濃縮細胞を例えば水と混合して洗滌しそして再遠心分
離などにより分離し、もしくは遠心分離前もしくは中に
水を添加して、実質的にミネラル培地の細胞を遊離する
ことができ、次に分離ミネラル培地を含む洗滌液は水お
よびミネラル培地として醗酵槽に戻し、こうして廃棄物
問題を実質的に減少もしくは回避することができる。次
に回収細胞は単に乾燥し将来使用のための乾燥生成物を
製造することができる。所望の場合、高細胞密度醗酵流
出物は全体を乾燥して、乾燥細胞および塩を含む残留水
溶性物質の全乾燥生成物を製造し、そしてこの全乾燥生
成物は高タン白高塩性のきわめて有用な動物飼料として
使用することができる。以下に本発明による方法を使用
する試験を記載する。特定量の材料、特定タイプの使用
供給原料、酵母の特定種もしくは菌株は例として考える
べきで、本発明の限定例として考えるべきではない。

【００４８】例１（参考） 連続的好気醗酵方法条件下で行った試験では、それぞれ
３０．１５対６９．８５の容量比のメタノールおよび水
性無機塩培地をＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３１として寄託
した酵母Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ　　カルチ
ャー２１−２を接種した醗酵槽に個々に供給した。前調
整培地もしくは基質は全く使用しなかった。醗酵槽は２
リットル液容の４リットル醗酵槽で、ｐＨ、温度および
レベルの自動調整付きであった。攪拌は１０００〜１２
００ｒｐｍで回転する２翼で行なった。通気速度は十分
な酸素を有し供給空気を１分につき醗酵容積当り１〜１
．５容（およそ大気圧および２５℃で）であり、大気圧
および約３０℃で空気を飽和した醗酵混合物に溶解する
であろうその約２０％量に等しい溶存酸素量を醗酵混合
物に維持させた。水性水酸化アンモニウム（濃水酸化ア
ンモニウム２部およびイオン除去水１部）を醗酵混合物
のｐＨを約３．５に維持するような割合で添加した。使
用した水性無機塩培地は１リットル溶液に対し、１２．
５ｍｌの８５％Ｈ３　ＰＯ４　、２．５ｇの８５％　　
ＫＯＨ、８．５ｇ　　ＫＣｌ、７．０ｇＭｇＳＯ４　・
７Ｈ２　Ｏ、１．５ｇ　　ＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ、
２５ｍｌの微量ミネラル溶液Ａ、２５ｍｌの微量ミネラ
ル溶液Ｂ、１０ｍｌのビオチン−チアミン塩酸塩溶液、
約０．０８ｍｌの消泡剤（Ｍａｚｕ　　ＤＦ−３７℃）
、および十分なイオン除去水を混合して１リットルの溶
液を製造した。微量ミネラル溶液Ａは１リットル溶液に
対し、４．８ｇのＦｅＣｌ３　・６Ｈ２　Ｏ、２．０ｇ
のＺｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、０．０２ｇのＨ３　ＢＯ
３　、０．２０ｇのＮａ２　ＭｏＯ４　・２Ｈ２　Ｏ、
０．３０ｇのＭｎＳＯ４　・Ｈ２　Ｏ、０．０８ｇのＫ
ｌ、０．０６ｇのＣｕＳＯ４　・５Ｈ２　Ｏ、３ｍｌの
濃Ｈ２ＳＯ４　および十分なイオン除去水を混合して１
リットルの溶液を製造した。微量ミネラル溶液Ｂは１リ
ットル溶液に対し、２．０ｇ　　ＦｅＣｌ３　・６Ｈ２
　Ｏ、２．０ｇのＺｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、０．３ｇ
のＭｎＳＯ４　・Ｈ２　Ｏ、０．６ｇのＣｕＳＯ４　・
５Ｈ２　Ｏ、２ｍｌの濃Ｈ２　ＳＯ４　、および十分な
イオン除去水を混合して１リットルの溶液を製造した。 ビオチン−チアミン塩酸塩溶液は２ｍｇのビオチン、２
００ｍｇのチアミン塩酸塩および５０ｍｌのイオン除去
水を混合して製造した。 醗酵は約３０℃およびおよそ大気圧で、７．０時間の保
持時間で行なった。酵母細胞は遠心分離により醗酵流出
液から分離し、水サスペンジョンで洗滌し、再遠心分離
し、１００℃で一夜乾燥し、そして秤量した。乾燥規準
で酵母細胞は供給メタノール１００ｇにつき４２．３ｇ
の収量で産生した。細胞密度は流出液１リットルにつき
細胞１００．７ｇの高レベルであった。

【００４９】例２（参考） 別の醗酵試験を、水性無機塩培地の組成をいくらか変え
、メタノール対水性無機塩培地の容量比を４０．８対５
９．２とし、ｐＨ調整用水性水酸化アンモニウムを濃水
酸化アンモニウム３部およびイオン除去水１部により調
製し、そして醗酵保持時間を８．３５時間としたことを
除いて、実質的に例１記載の方法を使用し行なった。 この試験で使用する水性無機塩培地は、１リットル溶液
に対し、２０．０ｍｌの８５％Ｈ３　ＰＯ４　、４．０
ｇの８５％ＫＯＨ、１２．０ｇのＫＣｌ、１０．４ｇの
ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、２．４ｇのＣａＣｌ２　・
２Ｈ２　Ｏ、例１記載の微量ミネラル溶液Ａ４０ｍｌ、
例１記載の微量ミネラル溶液Ｂ４０ｍｌ、例１記載のビ
オチン−チアミン塩酸塩溶液１６ｍｌ、約０．０８ｍｌ
の消泡剤、および１リットルの溶液にするのに十分なイ
オン除去水を混合して製造した。酵母細胞を醗酵流出液
から分離し、洗滌し、そして例１のように乾燥した。乾
燥規準で、酵母細胞は供給メタノール１００ｇにつき４
１．４ｇの収量で産生した。細胞密度は流出液１リット
ルにつき１３３．３ｇのきわめて望ましい高レベルであ
った。

【００５０】例３ 連続的好気醗酵を、今回はＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３２
として寄託した酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈａカルチャー２１−３を接種し、例１記載のよ
うに醗酵槽中で行なった。醗酵槽に全溶液１リットルに
つき３００ｍｌメタノールを含むメタノールおよび水性
無機塩培地混合物を供給した。攪拌醗酵混合物は、十分
な酸素を有し供給空気を１分につき醗酵容量当り２容（
およそ大気圧および約２５℃で）を醗酵槽に通すことに
よって通気し、醗酵混合物内に、大気圧および約３８℃
で空気を飽和した醗酵混合物に溶解するであろうその約
２０％に等しい溶存酸素量を維持させた。水性水酸化ア
ンモニウム（２部の濃水酸化アンモニウムおよび１部の
イオン除去水）を醗酵混合物のｐＨを３．７〜４．１に
維持する割合で添加した。メタノールおよび水性無機塩
培地の混合物は、溶液１リットルに対し３００ｍｌのメ
タノール、６ｍｌの８５％　　Ｈ３　ＰＯ４　、３ｇの
ＫＣｌ、４．５ｇのＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、０．６
ｇのＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ、０．３ｇのＮａＣｌ、
１０ｍｌの例１記載の微量ミネラル溶液Ａ、１０ｍｌの
例１記載の微量ミネラル溶液Ｂ、４ｍｌの例１記載のビ
オチン−チアミン塩酸塩溶液、４滴の消泡剤および１リ
ットル溶液にするのに十分なイオン除去水を混合して製
造した。醗酵は約３８℃および約大気圧で、５．６６時
間の保持時間により行なった。酵母細胞は醗酵流出液か
ら分離し、洗滌しそして例１のように乾燥した。乾燥規
準で、酵母細胞は供給メタノール１００ｇにつき３１．
０ｇの収量で産生した。細胞密度は流出液１リットルに
つき７３．３ｇの細胞であった。

【００５１】例４（参考） 連続的好気醗酵方法において、それぞれ３６．９対６３
．１の容量比でメタノールおよび水性ミネラル培地を、
ＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３０として寄託した酵母Ｐｉｃ
ｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ　　カルチャー２１−１を
接種した醗酵槽に個々に供給した。醗酵槽は約６００リ
ットルの液体容量、ｐＨ、温度、レベルの自動調整およ
び通風管を備えた１５００リットルの泡を満たした醗酵
槽であった。攪拌は通風管の下部の、７５０ｒｐｍで駆
動するタービンにより行なった。通気速度は１分につき
醗酵槽内の醗酵液容量当り約１．６容の空気（約３８ｐ
ｓｉｇおよび約２５℃で）であった。無水アンモニアを
醗酵混合物のｐＨを約３．５に維持する割合で添加した
。 最初の水性無機塩培地は、溶液１リットルに対し１２．
２ｍｌの７５％　　Ｈ３　ＰＯ４　、６．０ｇのＫＣｌ
、６．０ｇのＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、０．８ｇのＣ
ａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ、２．０ｇの８５％ＫＯＨ、２
．０ｍｌの微量ミネラル溶液Ｃ、０．８ｍｌのビオチン
−チアミン塩酸塩溶液および溶液１リットルにするのに
十分な飲料水（飲料水は最初に十分なチオ硫酸ソーダで
処理し、そこに含まれる遊離塩素と反応させる）を混合
して製造した。微量ミネラル溶液Ｃは、溶液１リットル
に対し６５ｇのＦｅＣｌ３　・６Ｈ２　Ｏ、１８ｇのＺ
ｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、５．０ｇのＭｎＳＯ４　・Ｈ
２　Ｏ、６．０ｇのＣｕＳＯ４　・５Ｈ２　Ｏ、２．０
ｍｌの濃Ｈ２　ＳＯ４　および溶液１リットルにするの
に十分なイオン除去水を混合して製造した。ビオチン−
チアミン塩酸塩溶液は０．４ｇビオチン対４０ｇチアミ
ン塩酸塩の割合で１リットルのイオン除去水に成分を混
合して製造した。醗酵は３０℃および３８ｐｓｉｇ圧で
、１２．７時間の保持時間により行なった。酵母細胞は
醗酵流出物から遠心分離により分離し、水サスペンジョ
ンで洗滌し、再遠心分離し、１００℃で一夜乾燥し、そ
して秤量した。乾燥規準で酵母細胞は供給メタノール１
００ｇにつき３７ｇの収量で産生した。細胞密度は流出
物１リットルにつききわめて望ましい１１０．３ｇの細
胞であった。例５（参考）連続的好気醗酵方法において
、それぞれ４０対６０の容量比でメタノールおよび水性
無機塩培地を、ＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３０として寄託
した酵母Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ　　カルチ
ャー２１−１を接種した醗酵槽に個々に供給した。醗酵
槽は約６１０リットルの液体容量、ｐＨ、温度およびレ
ベルの自動調整を有する１５００リットルの泡を満たし
た醗酵槽であった。攪拌は１０００ｒｐｍで駆動する２
個の通例のパドル−タイプタービンにより行なった。通
気速度は１分につき醗酵槽内の醗酵液１部当り約４部の
空気（約３８ｐｓｉｇおよび約２５℃で）であった。無
水アンモニアを醗酵混合物のｐＨを約３．５に維持する
割合で添加した。水性無機塩培地は、飲料水１リットル
に対し、１５．８６ｍｌの７５％　　Ｈ３　ＰＯ４　、
９．５３ｇのＫ２　ＳＯ４　、７．８ｇのＭｇＳＯ４　
・７Ｈ２　Ｏ、０．６ｇのＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ、
および２．６ｇの８５％ＫＯＨを混合して製造した。微
量ミネラル溶液のプラスビオチンはメタノール１リット
ルにつき１０ｍｌの割合でメタノール流を経て別々に供
給した。微量ミネラル溶液プラスビオチンは７８０ｍｌ
の微量ミネラル溶液Ｄ、２０ｍｌの水、２００ｍｌのメ
タノールおよび０．０３２ｇのビオチンを混合して製造
した。微量ミネラル溶液Ｄは、溶液１リットルに対し、
６５ｇのＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、２０ｇのＺｎＳＯ
４　・７Ｈ２　Ｏ、３．０ｇのＭｎＳＯ４　・Ｈ２　Ｏ
、６．０ｇのＣｕＳＯ４　・５Ｈ２　Ｏ、５．０ｍｌの
濃硫酸および溶液１リットルを作るのに十分なイオン除
去水を混合して製造した。水性無機塩培地は１時間につ
き３１．５リットルの割合で、メタノールは１時間につ
き２１リットルの割合で供給した。醗酵は３０℃および
約３８ｐｓｉｇ圧で、１１．６時間の保持時間により行
なった。分析目的のために、酵母細胞を醗酵流出物から
遠心分離により分離し、水性サスペンジョンで洗滌し、
再遠心分離し、１００℃で一夜乾燥しそして秤量した。 乾燥規準で酵母細胞は供給メタノール１００ｇにつき４
０．６ｇの収量で産生した。細胞密度は流出物１リット
ルにつききわめて望ましい１２８．４ｇの細胞であった
。醗酵液（醗酵槽からの流出物）の総固形含量は１リッ
トルにつき１３４．７ｇ（細胞プラス溶解固形物）であ
った。醗酵槽からの流出液は酵母を殺すために殺菌機を
通し、それ以上の濃縮もしくは処理することなく直接噴
霧乾燥機に供給した。

【００５２】例６ 連続的好気醗酵方法において、それぞれ２９対７１の容
量比でメタノールおよび水性無機塩培地を、酵母Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　　ＮＲＲＬ　
　Ｙ−１１１７０を接種した醗酵槽に個々に供給した。 醗酵槽は約５６０リットルの液体容量、ｐＨ、温度およ
びレベルの自動調整、および通気管を備えた１５００リ
ットルの泡を満たした醗酵槽であった。攪拌は通気管下
部の、８１０ｒｐｍで駆動するタービンにより行なった
。通気速度は１分につき醗酵槽内の醗酵液１部当り約５
部の空気（約３８ｐｓｉｇおよび約２５℃で）であった
。無水アンモニアを醗酵混合物のｐＨを約３．５に維持
する割合で添加した。水性無機塩溶液は１０．３８ｍｌ
の７５％　　Ｈ３　ＰＯ４　、４．２９ｇのＫＣｌ、６
．４４ｇのＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ、０．８６ｇのＣ
ａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ、０．４３ｇのＮａＣｌ、３．
０ｍｌの微量ミネラル溶液Ｃ、および飲料水（飲料水は
最初に十分なチオ硫酸ソーダで処理し、そこに含まれる
遊離塩素と反応させる）１０００ｍｌ中のビオチン−チ
アミン塩酸塩溶液０．６４ｍｌを混合して製造した。醗
酵は３９〜４０℃および３８ｐｓｉｇ圧で、７．６時間
の保持時間により行なった。分析のために酵母細胞は醗
酵流出液から遠心分離により分離し、水サスペンジョン
で洗滌し、再遠心分離し１００℃で一夜乾燥し、そして
秤量した。乾燥規準で、酵母細胞は供給メタノール１０
０ｇにつき３３．３ｇの収量で産生した。細胞密度は流
出液１リットルにつき望ましい７６．２ｇの細胞であっ
た。急速生育および高生産性の能力を有する酵母の発見
は明らかに有利である。本発明は非常に望ましくかつ有
用な、きわめて独特の酵母培養物、ＮＲＲＬＹ−１１４
３２として寄託したＨａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈａ（カルチャー２１−３）を供する。これらの
独特な培養物は高無機塩レベルおよび細胞密度で特に良
く生育する。これらの３種の独特の酵母培養物は酸素を
飽和させた炭化水素、特に低級アルコール、もっとも好
ましくはメタノールもしくはエタノール上に高生産性で
効果的に生育する。これらの独特の種は次のように命名
される：　　　　　　カルチャー名　　　　　　　　　
　　　　　　　　　本発明菌株　　　　　　　　　　寄
託番号　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　名　　称　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｉｃｈｉａ
　ｐａｓｔｏｒｉｓ　（参考）　　　　　　　　　　２
１−２　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３１
　　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　（参考）　　　
　　　　　　　２１−１　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ
　Ｙ−１１４３０　　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　Ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈａ　　　　　　　　　　　　　　２１−３　　
　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３２ＮＲＲＬ　
　Ｙ−１１４３１、ＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３０および
ＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３２は新規酵母カルチャーを公
式保管者、Ｕｎｉｔｅｄ　　ＳｔａｔｅｓＤｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｓｅｒｖｉｃ
ｅ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｅｏｒｉａ，
Ｉｌｌｉｎｏｉｓ６１６０４に各２個の傾斜寒天カルチ
ャーを寄託することにより出願人らが寄託し、そして保
管者から示すような個々にＮＲＲＬ菌株番号を受けた。 従って、これらの寄託からもしくは寄託をなした出願人
のカルチャーからのカルチャー試料は出願人の発見した
種に由来する菌株を供する。本発明は水性好気培養条件
下で微生物の３種の新規カルチャーもしくは菌株に属す
る酸素飽和炭化水素−同化性微生物細胞の一面における
培養方法を供する。これらの菌株を分類した：

【００５３】

【表１】

【００５４】

【表２】

【００５５】

【表３】

【００５６】

【表４】

【００５７】勿論すべての微生物のように、特徴のうち
あるものは培地および特別の条件によりいくらか変化を
受けることができる。例に示した培地処方は本発明の新
規酵母種を培養するために使用することができる。しか
し、それらはメタノール含有基質以外にも生育するであ
ろう。これらの新規酵母培養物は本明細書に記載の高塩
培地について使用できるのみでなく次のような培地を使
用する通例の醗酵条件で使用することもできる：　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
培地　　　　１Ｍ−１　　　　　　　　　　　　　　　
　　　成　　分　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　量　　　　　　　　　　　　　　
ＫＨ２　ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　５．０ｇ　　　　　　　　　　　　
　　　　ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．５ｇ　　　　　　　　　　　　
　　　　ＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．１ｇ　　　　　　　　　　　　
　　　　ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ　　　　　　　
　　　　　　　　　（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　３．０ｇ　　　　　
　　　　　　　　　　　ビオチン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０４ｍ
ｇ　　　　　　　　　　　　チアミン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０
ｍｇ　　　　　　　　　　　　　　微量ミネラル溶液（
ａ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５ｍ
ｌ　　　　　　　　　　　　　　水　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１，
０００ｍｌ　　　　　　　　　　　　　　殺菌メタノー
ル（ｂ）　　　　　　　　　　　　　０．５〜１．０容
量％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　（ａ）　下記の処方参照　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　（ｂ）　使用直前に添
加　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　微量金属溶液　　　　　　　　　　　　　
　　　　　成　　分　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　量　　　　　　　　　　　　
ＣｕＳＯ４　・５Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．０６ｇ　　　　　　　　　　　　　　Ｋ
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．０８ｇ　　　　　　　　　　
　　　　ＭｎＳＯ４　・Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．３ｇ　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｎａ２　ＭｏＯ４　・２Ｈ２　Ｏ　　　　　
　　　　　　　　　０．２ｇ　　　　　　　　　　　　
　　　　Ｈ３　ＢＯ３　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０．０２ｇ　　　　　　
　　　　　　　　ＺｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２．０ｇ　　　　　　　　
　　　　　　　　ＦｅＣｌ３　・６Ｈ２　Ｏ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　４．８ｇ　　　　　　　　
　　　　　　　　蒸溜水　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１，０００ｍｌ　　　　
　　　　　　　　　　Ｈ２　ＳＯ４　（濃）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｍｌ　　　　　
　資料を含む本開示は本発明の価値および効果を例示す
る。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　メタノール下で生育能を有するハンセ
   ヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｐｏｌｙ
   ｍｏｒｐｈａ）ＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３２（ＦＲＩ　
   　５６８４）。
2. 【請求項２】　　長期間対数増殖期がなく、メタノール
   の代謝能を有しかつ収量のロスなしで高細胞密度にメタ
   ノール下生育能を有する、請求項１記載のハンセヌラ・
   ポリモルファ。
3. 【請求項３】　　メタノールに高細胞密度で生育させる
   ために、ビオチン要求性を有する、請求項１記載のハン
   セヌラ・ポリモルファ。
4. 【請求項４】　　生物学的に純粋な培養物の形である、
   請求項１記載のハンセヌラ・ポリモルファ。
5. 【請求項５】　　ハンセヌラ・ポリモルファＮＲＲＬ　
   　Ｙ−１１４３２（ＦＲＩ　　５６８４）と命名され、
   もしくは由来する酵母菌株を炭素およびエネルギー基質
   として酸素化炭化水素を使用する水性培地で好気醗酵条
   件下に培養することを特徴とする、ハンセヌラ・ポリモ
   ルファＮＲＲＬ　　Ｙ−１１４３２（ＦＲＩ５６８４）
   の培養方法。
6. 【請求項６】　　生成した微生物細胞を単細胞タン白材
   料として分離し、回収する、請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】　　酸素化炭化水素およびエネルギー基質
   は１種以上の実質的に水溶性アルコール、ケトン、エス
   テル、エーテル、酸又は１分子につき約１０炭素原子ま
   でのアルデヒドよりなる、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】　　炭素およびエネルギー基質は水溶性脂
   肪族の１価炭化水素アルコールよりなる、請求項５記載
   の方法。
9. 【請求項９】　　アルコールはメタノールである、請求
   項８記載の方法。