JPH04218374A

JPH04218374A - ヒト毛様体神経栄養因子

Info

Publication number: JPH04218374A
Application number: JP3074704A
Authority: JP
Inventors: Valle Francesco Della; フランチェスコ・デッラ・バッレ; Lanfranco Callegaro; ランフランコ・カッレガーロ; Alessandro Negro; アレッサンドロ・ネグーロ
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia SpA
Priority date: 1990-03-14
Filing date: 1991-03-14
Publication date: 1992-08-07
Also published as: AU7291891A; HUT62033A; CA2038208A1; NO911025D0; AR243237A1; IL97557A0; EP0446931A1; KR910016921A; HU910840D0; PL289413A1; CN1057295A; NO911025L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】本発明はヒト毛様体神経栄養因子に関す
る。より詳細には、ヒト毛様体神経栄養因子をコードし
ているＤＮＡの遺伝子配列セグメントの発見、該因子の
アミノ酸配列および組換えＤＮＡ技術によってその因子
を生産する方法に関する。本発明によれば、重要な生物
学的活性を有し、かつヒト由来の夾雑タンパク質を含ま
ない均一なタンパク質を意義ある量で入手することがで
きる。

【０００２】

【従来技術】Ａ．毛様体神経栄養因子　　毛様体神経節（ＣＧ）は、共にコリン作動性である
毛様体および脈絡膜様ニューロンの２つの叢を含有して
いる。ＣＧニューロンは、脈絡膜、毛様体および虹彩に
おける眼の固有筋構造を神経支配している。ひな（ｃｈ
ｉｃｋ）の胚では、発育期に、およそ半分のＣＧニュー
ロンの軸索が眼内神経支配領域と接合すると、そのニュ
ーロンはＥ８およびＥ１５の日の間に死滅する。

【０００３】その神経の死滅は、眼の除去によって強く
導かれる一方で、補充的な眼の芽を移植することで防止
される。このような知見に基づいて、この神経支配領域
はそれ自身特異的なニューロンのための栄養因子を含有
していると推定された。種々のひなの胚組織（Ｅ８日）
から得た抽出物は、同じ発育期のひなの胚の毛様体神経
節から分離されたニューロンに対し、栄養活性を有して
いることが判明した［Ａｄｌｅｒ　１９７９］。

【０００４】この栄養活性はその後、毛様体神経栄養因
子（ＣＮＴＦ）と名付けられた［Ｂａｒｂｉｎ　１９８
２］。Ｅ８日におけるひな胚の毛様体神経節由来のニュ
ーロンを適当な培養培地と共に適当な基質に接種すると
、その培地に特殊な添加物を加えない限りそのニューロ
ンは生存しない。これは毛様体神経栄養因子の生物学的
試験の一般的モデルであり、より詳細にはそのニューロ
ンのタンパク質としての生物学的試験のためのモデルで
ある。この点について、Ｅ８日におけるひな胚の組織の
種々の抽出物を比較すると、胚の全ＣＮＴＦ活性の１／
３が眼において見いだされ、その眼自身の活性の３／４
は、脈絡膜、虹彩および毛様体（眼の固有筋構造）なら
びにその色素上皮（ＣＩＥＰ）に局在している。生存性
の評価によって、ＣＧニューロンにとって栄養的に活性
である可溶性タンパク質は、（ｉ）そのニューロンが神
経支配している眼領域内に高濃度で見いだされ、かつ（
ｉｉ）インビボにおいてニューロンの運命が決定付けら
れる非常に発育的な時期のＥ８−Ｅ１５間で、最も高い
特異的活性に至る、ことが示された。Ｅ１５ひなの胚Ｃ
ＮＴＦの精製法には、ＣＩＥＰ組織の選択的な細切開（
ｓｕｂｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）、さらにはイオン交換ク
ロマトグラフィー、ショ糖グラジエントの超遠心および
ドデシル硫酸ナトリウム　ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による相当する抽出物の連続
処置が包含される。

【０００５】このタンパク質をイオン交換クロマトグラ
フィー、ショ糖グラジエントの超遠心および還元条件下
のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製することにより、それは
約２１ｋＤａの分子量であり、正味負に帯電しているこ
とが判明した。Ｅ８段階のひなＣＧニューロン、Ｅ１０
段階のひなＤＲＧニューロンおよびＥ１１段階の交感神
経ニューロンに対するその精製タンパク質の栄養活性は
、１０−１１　　１０−１２Ｍ　オーダーであるので、
ＤＲＧおよび交感神経ニューロンという標的に対しては
、もう１つの神経栄養因子、すなわち雄性マウスの顎下
腺から精製される神経成長因子（ＮＧＦ）と同じオーダ
ーである。

【０００６】ＣＩＥＰ抽出物のようなひな胚の眼抽出物
は、（ｉ）Ｅ１０（Ｅ８ではない）のひな胚様ＤＲＧニ
ューロンおよび新生児マウスニューロン、ならびに（ｉ
ｉ）Ｅ１１ひなおよび新生児ラット神経節に対する栄養
活性を有しているが、このことは、感覚神経および交感
神経ニューロンの神経支配領域はＣＧニューロンのそれ
と部分的に同じであると考えられるので、驚くに値しな
い。他方、ＤＲＧおよび交感神経ニューロンは、ＣＧニ
ューロンに対する栄養活性についてＣＮＴＦを選択した
にもかかわらず、精製されたひな眼ＣＮＴＦの栄養活性
に対して感受性である。

【０００７】ＣＮＴＦはＮＧＦのように培養物中の副腎
クロム親和性細胞の増殖を支持するが、これら２つの因
子はヒドロキシラーゼ　　チロシンおよびフェニルエタ
ノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ酵素に対す
る作用程度が異なっている。ＣＮＴＦはニワトリの網膜
細胞培養物中のＣｈＡＴ活性を増強するが、このことは
コリン作動性ニューロンの応答を示している。ＣＮＴＦ
はラット胚様の基底前脳またはその脳の橋領域のコリン
作動性ニューロンに対して栄養効果を有しておらず、こ
れをコリン作動性の神経栄養因子とみなすことはできな
い。ごく最近のデータには、ＣＮＴＦの作用は神経細胞
によって制限を受けないことが示されている。ＣＮＴＦ
はラット視神経のグリア始原細胞を２型の神経膠星状細
胞にまで分化させるよう誘導することが見いだされた。

【０００８】ＣＮＴＦの他の活性には、軸索切断による
単神経の変性予防に関連しているものもある［Ｓｅｎｄ
ｔｎｅｒ　１９９０］。要約すれば、この新規な因子は
、少なくとも３つの型のニューロンであって、そのうち
の２つはＮＧＦに対しても感受性であるニューロンに対
し、活性であるタンパク質として表される。その分子量
を考えると、ひな眼ＣＮＴＦはＥ８ひなのＣＧニューロ
ン、Ｅ１０ひなのＤＲＧニューロンおよびＥ１１ひなの
交感神経ニューロンの最大生存性の半分を濃度１０−１
１−１０−１２Ｍ　で促進させ、その比活性のオーダー
は、マウス顎下腺由来の精製ＮＧＦがその神経標的、Ｄ
ＲＧおよび交感神経に対して示す比活性のオーダーと同
じである。ひな眼ＣＮＴＦの栄養活性は、マウス顎下腺
由来のＮＧＦのβ−サブユニットに対して特異性である
抗体によって阻害、すなわち妨害されない。

【０００９】ＣＮＴＦの他の供給源　　ＣＧニューロンにとっての栄養因子はＤＲＧおよび
交感神経ニューロンの栄養因子と同様に、組織抽出物お
よび切除体液から種々の細胞培養物によってならされた
培地に至る、種々の他の供給源から入手されている。「
ならし培養培地」は、「細胞供給源」の同定が容易であ
ることから、組織抽出物よりも有利である。しかし、そ
れから得られる栄養活性は低濃度であることから、なら
し培地は栄養活性を有する精製タンパク質の調製にはあ
まり適していない。実際、心筋培養物から得られたなら
し培地はＣＮＴＦの存在が証明された最初の材料であっ
た（その直後に骨格筋培養物の材料があった）。ウシ心
臓抽出物も可能な出発物質と考えられたが、ＣＮＴＦの
完全な特性化を行うことはできなかったようである。心
臓および骨格筋にＣＮＴＦが存在することにより、それ
は眼の固有筋を神経支配するもの（ＣＧ）以外の内蔵−
および体性−運動コリン作動性ニューロンに対して活性
なのではないかと仮定されている。しかし、眼、心臓お
よび骨格筋のＣＮＴＦは、分子特性または神経標的の範
囲のいずれに対しても、未だ体系的に相互に比較されて
いない。

【００１０】上皮（シュワン）および中心（大グリア細
胞）の両方の神経膠細胞培養物もまた、毛様体ニューロ
ンならびに背側および交感根神経節のニューロンに対す
る、ＮＧＦとは異なった栄養活性を示し、このことは神
経膠細胞がインビボにおいて神経栄養因子の供給源とし
ての役割を果し得るという仮説を支持するものであるこ
とには議論の余地がない。

【００１１】成熟ラットの座骨神経から得られた抽出物
はＣＮＳ組織のそれとは違って、非常に高いＣＮＴＦ含
量を有しており、その比活性はＥ１５ひな眼由来のＣＩ
ＥＰのそれと同じであること（約２０，０００栄養単位
／タンパク質ｍｇ）も証明されている。ＣＮＴＦの活性
は、神経または純粋運動根または純粋感覚根由来の抽出
物においても高く、このことは、上記の類別判定基準で
は、その神経活性を、特異的な神経支配領域と正しく相
関させることができず、むしろその構造内に含有される
シュワン細胞またはそれらの両者と相関させることを示
している。

【００１２】Ｍａｎｔｈｏｒｐｅおよび共同研究者［Ｍ
ａｎｔｈｏｒｐｅらの神経成長因子における毛様体神経
栄養因子，Ｒ．Ａ．Ｒｕｓｈ編，Ｉｂｒｏ　ハンドブッ
クシリーズ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，１２巻，３１−５６頁］は、ラッ
トの神経ＣＮＴＦを分析レベルにまで精製し、それが、
ひなの眼から精製されたＣＮＴＦのそれよりも若干下方
の負の電荷を有し、若干高い分子量（２４ｋＤ）である
ことを示した。

【００１３】現在では、ＣＮＴＦはラットの座骨神経、
ウシの心臓および神経芽細胞腫細胞からも単離されてい
る。Ｗｉｌｌｉａｍｓらは、成熟ラットの座骨神経内で
はＣＮＴＦ含量は高く、その比活性はひなのそれと同等
であること（２０，０００ＴＵ／タンパク質ｍｇ）を証
明した。

【００１４】２つの型のＣＮＴＦ、すなわち１つが分子
量約２５ｋＤ、他方が分子量約２８ｋＤのＣＮＴＦが同
定された。ウサギおよびラットの座骨神経からＣＮＴＦ
のある量を均一に精製することにより、そのアミノ酸配
列が部分的に確定することができた［Ｌｉｎ　Ｌ−Ｆ，
Ｈ．のＪ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５巻，１５号，８
９４２−８９４７頁，１９９０］。この知見から、およ
びＰＣＲ（複製連鎖反応）法によって、これら２つの動
物のＣＮＴＦをコードしている完全な遺伝子セグメント
が単離された［ＳｔｏｅｃｋｌｉらのＮａｔｕｒｅ，３
４２巻，９２０−９２３頁，１９８９、Ｌｉｎ　Ｌ−Ｆ
，Ｈ．らのＳｃｉｅｎｃｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｒｔ
ｉｃｌｅｓ，２４６巻，１０２３−１０２５頁，１９８
９］。そのタンパク質の分子量はそれぞれ２２．７およ
び２２．８ｋＤであり、精製タンパク質について前者の
等電点は５．７８であった。

【００１５】ラットおよびウサギのＣＮＴＦ配列の比較
分析により、それらがアミノ酸およびヌクレオチド配列
において高い相同性を示すことが判明した。この分子の
良好な保存ドメインの中にはコンピューター分析による
測定が成功を収めているものがあり、それによりＰＣＲ
法およびそれらドメイン内の数種の合成オリゴヌクレオ
チドを使用して、完全配列の８０％に相当する、そのヒ
ト遺伝子セグメントの有意な部分を同定および単離でき
るようになっている。この部分の遺伝子配列および対応
するアミノ酸配列を以下に示す。

【００１６】Ｂ．組換えＤＮＡ技術　　組換えＤＮＡ技術は、所望のタンパク質を大量に発
現できる一連のベクターの構築を可能にした。この新し
い技術により、分子生物学者はＤＮＡ配列を組み立てて
、所望のタンパク質を産生できるハイブリッド分子を作
製することができる。この方法は、制限酵素による切断
、このようにして得られたフラグメントのリガーゼによ
る結合、組み立てに使うオリゴヌクレオチドの化学的合
成、および当業界の種々の研究所で開発されている他の
方法［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）らのＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ラボラト
リーＮＹ，１９８２］、などの種々の反応を基礎とする
ものである。

【００１７】高いレベルの発現を行うには、組み立てに
使うＤＮＡ要素は特定の必須情報、例えば複製起点、抗
生物質のための選択、発現プロモーター、目的遺伝子の
転写アクチベーター、および当業者に既知の他の特性を
付与しなければならない。これらの要素を適当に組み合
わせることにより、問題の遺伝子が転写および翻訳の調
節配列に関して天然の状態で挿入されれば、得られたプ
ラスミドは発現プラスミドと呼ばれる。したがって、こ
の発現プラスミドまたはベクターは真核または原核生物
起源であることのできる宿主細胞において、タンパク質
を発現することができる。次いで、このタンパク質は精
製によって得ることができる。

【００１８】成長因子などの多くの遺伝子の発現を天然
で制御している要素（プロモーター）はその発現がそれ
ほど強くなく、知られていないことの多い適切な天然条
件下でのみ活性化される。そのため、一連のバキュロウ
イルスのプロモーター、または他の既知のプロモーター
遺伝子配列などの、活性が知られているプロモーターを
使用する。したがって、高いレベルの発現のために使用
される要素は、末端が互いに連結した異なる遺伝子部分
から構成されている種々の起源（真核生物、細菌、ウイ
ルスなど）のＤＮＡの組合わせ物であり、これによりハ
イブリッドが形成される。遺伝子の転写活性は、調節配
列およびコード化配列間の距離に左右される。

【００１９】これらが事実とすれば、調節配列を適切に
機能させるための最良の態様の１つは、導入する遺伝子
を天然遺伝子の位置と同じところに配置させることであ
る。使用される１つの系は、調節配列がコード化配列の
数個のアミノ酸を含有していることが必要である。導入
する遺伝子と結合して融合タンパク質が得られ、次いで
それを取り出せば、より高い生物学的価値を得ることが
できる。この融合タンパク質法で行わない場合は、調節
配列に近接して位置する遺伝子を得るための常法は、ク
ローニングを行うことのできる適切な制限部位に左右さ
れる。近くに適合部位が無く、別の部位しか存在しない
場合は、所望の制限部位を含有するオリゴヌクレオチド
またはリンカーを合成することによってセグメントの結
合物を得ればよい。

【００２０】リンカーを使用することのできる制限部位
が近くに存在しない場合は、Ｂａｌ１３１またはＳＩに
よってＤＮＡを欠失させる手段をとればよい。しかし、
この場合、正確に欠失させることができず、最も適切な
ものを確認するためにスクリーニング毎に種々のクロー
ンを検査しなければならない。

【００２１】新規な生物学的活性を有するタンパク質を
単離するために使用される通常の方法が、生物学的体液
からの精製によりそのタンパク質自身を単離することを
包含している場合でさえ、得ることのできるそのタンパ
ク質の量は必ずしも、以後のその構造、機能の試験およ
び結果として適用試験を行うに十分であるとはいえない
。組換えＤＮＡ法を使用すれば、発現ベクター内にその
タンパク質をクローンして適量のタンパク質を入手する
ことができる。しかし、本発明の場合のように、タンパ
ク質の一次構造が知られておらず、通常のクローニング
が行えない場合がある。ＣＮＴＦの場合、本発明以前に
知られていた価値ある情報は、ウサギおよびラットの遺
伝子が単離され、その相当するヌクレオチド配列が配列
決定されていた、ということのみである［Ｋ．Ａ．Ｓｔ
ｏｅｃｋｌｉらのＮａｔｕｒｅ，３４２巻，１９８９，
９２０−９２３頁、Ｌｅｕ−Ｆｅｎ　Ｈ．ＬｉｎらのＳ
ｃｉｅｎｃｅ，２４６巻，１９８９，１０２３−１０２
５頁］。

【００２２】このことに基づけば、これら２つの遺伝子
をプローブとして用い、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡか
ら得られたヒト遺伝子のバンクをスクリーニングすると
いう、常法を使用し、ヒトＣＮＴＦを単離することは可
能かもしれない。

【００２３】しかし、これらの方法は分子生物学者にと
って極めて制限的であり、現在使用できる新しい技術の
中から、代替の手法を画策しなければない。例えば、複
製連鎖反応（ＰＣＲ法）である［サイキ（Ｓａｉｋｉ）
らのＳｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７，１９８８、スカ
ーフ（Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ．）のＳｃｉｅｎｃｅ　２
３３：１０７６，１９８６］。この手法によれば、遺伝
子セグメントを１０６倍にまで増幅することが可能であ
る。この原理の基本は、増幅しようとするＤＮＡ鎖の１
つと各々対合できる２つのオリゴヌクレオチドを使用す
ることにある。その遺伝子配列に関するこの２つのオリゴヌクレオチド
間の距離に応じて、産生される分子のディメンジョン（
ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）が決められる。これら２つのオ
リゴヌクレオチドは、各オリゴヌクレオチドの配列内に
以後のクローニングを行うことのできる制限部位が存在
するように構築する。この制限部位は天然に存在するも
のか、または最小限の数のヌクレオチドの縮重（ｄｅｇ
ｅｎｅｒａｔｉｎｇ）に基づいて特別に構築されたもの
かのいずれかである。

【００２４】部位特異的突然変異法と呼ぶことのできる
この手法によれば、分子生物学者の意のままの位置に制
限部位を構築することができる。他の遺伝子セグメント
と適合する部位を構築すれば、クローニングが容易にな
るばかりでなく、所望の遺伝子セグメントの特別な連結
が可能になる。ウサギおよびラット遺伝子の上記知見に
基づいた配列を使用し、一連のオリゴヌクレオチドが構
築された。

【００２５】この方法は、直接突然変異によるクローニ
ングとして説明することができる。実際、組換えＤＮＡ
技術のおかげで、完全にヘテロローガスなポリペプチド
を直接発現によって発現させることができ、さらに同族
ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と融合したヘテロロ
ーガスなポリペプチドを発現させることができる。一般
には、このようにして得られた産物は生物学的に活性で
ない［英国特許出願公開第２００７６７６Ａ号、ウェン
ゼル（Ｗｅｎｚｅｌ）のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｓｔ　６８，６６４，１９８０］。

【００２６】ＣＮＴＦは、現在試験されてその生物学的
活性の特異性が同定され、また組換えＤＮＡ技術によっ
て入手できる方法もしくは他の精製および抽出方法が工
夫されている多くの成長因子のなかの１つである。この
ようなＣＮＴＦなどの成長因子は、末梢、中枢および栄
養性神経系に影響を与える神経変性または免疫神経変性
などの急性または慢性の病因論的症状における神経機能
の維持または予防を目的として、それを回復させるため
に治療学的に使用することができる。

【００２７】

【発明の要旨】既述のように、本発明はヒトＣＮＴＦを
コードしているヒト遺伝子の単離および配列決定、ヒト
ＣＮＴＦの対応するアミノ酸配列の同定、および組換え
技術によってヒト由来の夾雑タンパク質を含ませずに該
タンパク質を商業的に有用かつ生物学的に活性な量で生
産することに関する。

【００２８】本発明はさらに、ヒトＣＮＴＦを単独で、
またはガングリオシド（天然に存在するガングリオシド
、ガングリオシド誘導体、およびガングリオシドの半合
成同族体）、ポリサッカライド（天然および化学的に修
飾されたポリサッカライド）、および／または他の成長
因子と共に含有する医薬組成物に関する。また、本発明
はヒトＣＮＴＦ、および上記医薬組成物における治療学
的用途に関する。

【００２９】

【発明の詳しい説明】ヒトＣＮＴＦ遺伝子の配列を研究
するに当たり、本発明者らは第１にその遺伝子の一部の
配列決定に成功し、次いでその情報を基に全遺伝子の配
列決定に成功し、ヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列の同定を
行った。本発明で利用できる操作法として、以下に特定
の工程に適用できる種々の一般的操作法を例示するが、
これは本発明の説明のためのものである。

【００３０】Ａ．一般的操作法　　反応および操作法の幾つかは当業界周知であり、例
えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ　Ｊ．ら（１９８９）、およびマニアチス（Ｍａ
ｎｔｉａｔｉｓ，Ｔ．）らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ
，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，コ
ールド・スプリング・ラボラトリー，ニューヨーク（１
９８２）に記載されている。

【００３１】制限酵素によるＤＮＡ鎖の切断は製造元の
教示にしたがって行う。一般には、プラスミド１μｇを
溶液２０μｌ　内で１単位の酵素を使用して切断した。そのインキュベート温度および時間は、使用する酵素に
応じて変動するが、一般には３７℃で１時間である。イ
ンキュベートした後は、すべての場合においてプラスミ
ドおよび遺伝子セグメントを４０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ
、２０ｍＭ　酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中にお
いてアガロースゲルのＬＭＰアガロース［ＢＲＬ、アメ
リカ合衆国］で精製し、次いでＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ
キット［ＢＩＯ　１０１　Ｉｎｃ，米国カルフォルニア
、ラ・ジョラ］を用いてそのアガロースから溶出させる
。

【００３２】連結反応は、反応物２０μｌ　中、ＤＮＡ
０．５μｇ当たり濃度１単位のＴ４　リガーゼ用い、１
２時間、１３℃で行う。正しいプラスミド配列の確認分
析は、ＨＢ１０１細胞に形質転換し、アンピシリン抗生
物質を５０μｇ／ｍｌ　で含有するＬＢ培地［ルリア・
バータニ（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ）］のアガロー
ス平板上において得られた形質転換細胞を選択すること
により行う。ＨＢ１０１細胞に含有されたプラスミドを
１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンのＬＢ中で培養し、次
いでＱｕｉａｇｅｎのキット［ＤＩＡＧＥＮ　Ｇｍｂｈ
、ドイツ，デュッセルドルフ］を用い、小さいおよび大
きな両調製物を精製した。クローニングベクターの細菌
細胞からの調製はＱｕｉａｇｅｎの教示に従った。

【００３３】ＰＣＲ反応のためのＤＮＡは周期のあるヒ
ト胎盤から以下のようにして調製する。絨毛膜絨毛の０
．４ｃｍ３片をハサミで丁寧に切り出し、５０ｍＭ　ト
リス−ＨＣｌｐＨ７．８、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０
０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの７００μｌ　中に懸濁
する。次いで、この中にプロテイナーゼ（Ｋ　１００μ
ｇ／ｍｌ）３５μｌ　を加え、そのすべてを５５℃で一
晩インキュベートする。次に、ＲＮＡアーゼＡの１３μｇ／ｍｌ　溶液２０μｌ
　を加え、さらに２時間インキュベートする。次いで、
得られた混合物をフェノールで２回、クロロホルムで２
回抽出する。次に、１容量のイソプロパノールを加えて
ＤＮＡを精緻な試験管において沈澱させる。この時点で
、７０％および１００％エタノールを数回通し、乾燥さ
せる。次いで、得られたＤＮＡを試験管中の緩衝液（１０ｍＭ
　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中
に穏やかに撹拌しながら溶解する。数時間後、溶解した
ＤＮＡを遺伝子増幅のために準備する。ＰＣＲに使用す
るには通常、ＤＮＡは０．１μｇで十分であることが認
められている。

【００３４】サザーンブロットのためのＤＮＡは周期の
あるヒト胎盤から以下のようにして調製する。絨毛膜絨
毛の０．４ｃｍ３片をハサミで丁寧に切り出し、５０ｍ
Ｍ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．８、１００ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの７００μｌ　
中に懸濁する。次いで、この中にプロテイナーゼ（Ｋ　
１００μｇ／ｍｌ）３５μｌ　を加え、そのすべてを５
５℃で一晩インキュベートする。次に、ＲＮＡアーゼＡ
の１３μｇ／ｍｌ　溶液２０μｌ　を加え、さらに２時
間インキュベートする。次いで、得られた混合物をフェ
ノールで２回、クロロホルムで２回抽出する。次に、１
容量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを精緻な試験管
において沈澱させる。この時点で、７０％および１００
％エタノールを数回通し、乾燥させる。

【００３５】得られたＤＮＡを試験管中の緩衝液（１０
ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ
）中に穏やかに撹拌しながら溶解する。次いで、制限酵
素を用いて３７℃で一晩消化する。次に、得られたフラ
グメントをＴＡＥ（トリス酢酸ＥＤＴＡ）中、０．８％
アガロースゲルで分離する。そのゲルを０．１Ｍ　塩酸
および１．５ＭＮａＣｌで２回、１Ｍ　ＮａＯＨ、１．
５Ｍ　ＮａＣｌ　で２回、２Ｍ　トリスｐＨ７．４、０
．６Ｍ　ＮａＣｌ　２回洗浄し、次いでニトロセルロー
ス（Ｈｙｂｏｕｎｄ　Ｎ　Ａｍｅｒｓｈａｍ）に一晩移
動させる。そのニトロセルロース膜を紫外線に３分間暴
露し、次いで５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓ、５×ＳＳＣ、サケ精子由来の１ｍｇ／ｍｌ　Ｄ
ＮＡ中でプレハイブリダイズし、４２℃で２時間インキ
ュベートする。５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ、５×ＳＳＣ、サケ精子由来の０．２５０μｇ
／ｍｌ　ＤＮＡ中、１０％デキストラン硫酸ナトリウム
を加えたものにおいてハイブリダイゼーションを行う。得られた膜を０．１％ＳＤＳ　２×ＳＳＣ中、６５℃で
２時間洗浄し、次いでオートラジオグラフィーにかける
。

【００３６】すべてのオリゴヌクレオチドの合成は３８
０Ｂ　ＤＮＡ合成機［Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ−ＵＳＡ］を使用し、その製造元の教示にしたが
って固相において行う。窒素雰囲気下、５５℃で１２時間処理し、真空−加速下
に処理する。得られたオリゴヌクレオチドを２．５Ｍ酢
酸アンモニウム中に再懸濁し、３容量の冷エタノール（
−２０℃）で沈殿させる。それらを冷８０％エタノール
で再度洗浄し、水中に再懸濁する。オリゴヌクレオチド
の濃度は分光器で測定する。

【００３７】増幅反応は、パーキン・エルマー・セツス
のＤＮＡサーマル・サイクラー・アンプリフィケーター
［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　Ｔ
ｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｏｒ
］によって行い、その増幅に使用する試薬は相当するＤ
ＮＡＴＭアンプリファイアー［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅ
ｒ　Ｃｅｔｕｓ］のものであった。

【００３８】Ｂ．ヒトＣＮＴＦ遺伝子の部分的配列決定
　　ヒトＣＮＴＦセグメントをプラスミドにクローンす
るため、ジーンバンク（ＧＥＮＥＢＡＮＫ）から受託番
号Ｍ２９８２８の下で入手可能なウサギＣＮＴＦヌクレ
オチド配列を利用した。この配列から出発して２つのオ
リゴヌクレオチドを合成した。第１は、塩基１２３から
１４７間に、配列：　　　　　　　　５’　ＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡ
ＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣ　３’を含有するものである。こ
の８番目の塩基を突然変異させ、ＡｐａＩ部位を作成し
、以後のクローニングを容易にする：

【化６】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡｐａＩ　　
　　　　　　５’　ＣＡＧＧＧＣＣＣＧＡＡＣＡＡＧＡ
ＡＣＡＴＣＡＡＣ　３’このオリゴヌクレオチドをＡｐ
ａＩと命名する。

【００３９】第２のオリゴヌクレオチドは塩基５８１か
ら６００を包含するが、これはＰＣＲ法が行えるように
上記配列と相補的であり、以下の配列を有している：５
’　ＣＴＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＡＧ　３’
５’側にはＳａｌＩ制限部位を付加し、以後のクローニ
ングを容易にする。したがって、以下の配列を合成する
：

【化７】　　　　　　　　　　　　　　　ＳａｌＩ　　　　　５
’　ＴＡＧＴＧＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧ
ＴＴＡＧ　３’これら２つのオリゴヌクレオチドを３３
０Ｂ　ＤＮＡ合成機［Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ−ＵＳＡ］を使用し、その製造元の教示にしたが
って固相において合成する。窒素雰囲気下に、５５℃で
１２時間処理し、次いで真空−加速下に処理する。得ら
れたオリゴヌクレオチドを２．５Ｍ　酢酸アンモニウム
中に再懸濁し、３容量の冷エタノール（−２０℃）で沈
殿させる。それらを冷８０％エタノールで再度洗浄し、
水中に再懸濁する。これら２つのオリゴヌクレオチドの
濃度は分光器で測定する。

【００４０】増幅反応は、パーキン・エルマー・セツス
のＤＮＡサーマル・サイクラー・アンプリフィケーター
［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　Ｔ
ｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｏｒ
］によって行い、その増幅に使用する試薬は相当するＤ
ＮＡＴＭアンプリファイアー［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅ
ｒ　Ｃｅｔｕｓ］のものである。手短に説明すれば、２
００μＭの各オリゴヌクレオチド、およびそれぞれ０．
５μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰヌク
レオチドおよびヒトＤＮＡ０．１μｇを含有する混合物
、ならびに０．５単位のＴＡＱポリメラーゼを含有する
全混合物１００μｌの反応緩衝液を使用し、そのすべて
を液状パラフィンで被覆して蒸発を防ぐ。ヒトＤＮＡの
場合はその装置を３５サイクルで操作して増幅反応を行
い、精製ＤＮＡファージの場合は２５サイクルで行う。両方の場合ともそのサイクルは以下のようである：９４
℃で１分、４５℃で２分、７２℃で３分。増幅しようと
する配列が長い場合には適当に若干の修飾を施す。

【００４１】ＧＥＮＥ−ＣＬＥＡＮＴＭ（ジェネクリー
ンＴＭ）キット［ＢＩＯ　１０１　Ｉｎｃ．、ラ・ジョ
ラ、カリフォルニア、米国］を使用し、低融解アガロー
スゲル［ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）］中で、４８２ｂ
ｐ　の増幅したフラグメントをそのアガロースを溶解し
て精製する。得られたＤＮＡをＡｐａＩおよびＳａｌＩ
制限酵素で切断し、既述のように再精製する。このよう
にして得られた精製フラグメントをｐＧＥＭ−７Ｚｆ（
＋）ベクター［プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）］のＡｐａ
ＩおよびＸｈｏＩ部位にクローンする。

【００４２】このプラスミドの２９４１−２９５７およ
び１５８−１７４の位置を占める（ｍａｐ）ｐＵＣ／Ｍ
１３プライマーを用い、上記増幅したセグメントの配列
決定を行う。両方向の配列決定を行い、得られた配列を
添付の図１に示す。図１中、Ａはデオキシアデニル酸残
基、Ｇはデオキシグアニル酸残基、Ｃはデオキシシチジ
ル酸残基、Ｔはチミジル酸残基をそれぞれ示し、この図
の左および右末端はそれぞれ５’−末端および３’末端
を示す。

【００４３】図１のヌクレオチド配列は３つの種々の可
能なコドンに応じて対応するアミノ酸に翻訳される。そ
の翻訳されたものを添付の図２に示す。図２から明らか
なように、２列目の翻訳は終止コドンを有さない間断の
ない遺伝子を与えている。この間断ないタンパク質配列
を添付の図３に示す。

【００４４】図３に示したアミノ酸配列をＮｅｅｄｌｅ
ｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈの方法に従って、ラットおよびウ
サギのＣＮＴＦ配列を使用して配列操作（ａｒｒａｇｅ
）した（図４参照）。得られたペプチド配列が高い相同
性を有していることから、単離したＤＮＡセグメントは
ヒトＣＮＴＦに対応していることが相応に確信された。

【００４５】さらに、本発明者らがクローンした上記セ
グメントのヒドロパシープロフィル（ｈｙｄｒｏｐａｔ
ｈｉｃｉｔｙ　ｐｒｏｆｉｌｅ）をウサギおよびラット
のそれと比較することにより（図５に記載している）、
ここにクローンしたセグメントの鎖内で変化しているア
ミノ酸残基はポリペプチドの一般的プロフィルに影響を
与えていないことを本質的に証明することができる。こ
れら２つの証拠は、本発明のクローン化セグメントがヒ
ト毛様体神経栄養因子に対応していることを実質的に示
している。

【００４６】Ｃ．ヒトＣＮＴＦ遺伝子の完全な配列決定
　　ヒトＣＮＴＦ遺伝子の上記部分的配列に基づいて、
その完全な遺伝子配列を取り出すことができる。それを
行うため、既に単離されているＣＮＴＦタンパク質につ
いての市販されている２つのヒト遺伝子ライブラリーを
使用して分析を行った。使用したライブラリーは市販さ
れている。第１のものは、ＥＭＢＬ−３内の真核生物の
ヒトゲノムライブラリーであり、他方はλファージｇｔ
１１内のヒト網膜のメッセンジャー（ｃＤＮＡ）である
。

【００４７】Ｃ．１．ヒトＣＮＴＦについてのＥＭＢＬ
−３ライブラリーの分析　　ヒト毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の組換え体を
含有するファージを単離するための方法は、このＣＮＴ
Ｆ遺伝子から調製した放射活性プローブとのヌクレオチ
ド相同性を決定することから構成される。ライブラリー
を分析するために使用する方法は例えばＳａｍｂｒｏｏ
ｋ　Ｊ．らの文献（１９８９）に十分に記載されている
。

【００４８】より詳細には、８００，０００個の組換え
体を４つの２０×２０ｃｍ平板にプレートし、ニトロセ
ルロースに複製（レプリケート）する。５×ＳＳＣ、５
×Ｄａｎｈａｒｄｔ’ｓおよび５０％ホルムアミド中、
４２℃で２時間、そのニトロセルロースをプレハイブリ
ダイズする。続いて、そのプレハイブリダイゼーションに使用したも
のと同様の溶液に１０％硫酸デキストランナトリウムを
加え、その中で、一晩ハイブリダイズする。３２Ｐで標
識したプローブを、ベーリンガー「ランダムプライマー
」キットを使用し、上記ｐＧＥＭ７プラスミドのＡｐａ
−ＳａｌＩフラグメントから調製した。ニトロセルロー
スを０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０℃で
３０分間４回洗浄し、次いで室温で２×ＳＳＣ中で洗浄
する。次いで、４つの複製物を、強化スクローンを用い
たコダック（Ｋｏｄａｋ）ＸＲ−５線フィルムのオート
ラジオグラフィーにかける。ＣＮＴＦクローンのハイブ
リダイズにより、オートラジオグラフィーの２０個のス
ポットが得られる。ＰＣＲ法およびオリゴヌクレオチド
ＡｐａＩおよびＳａｌＩを使用し、これらクローン各々
をＣＮＴＦクローンについて調べる。この分析により、
７つの陽性クローンの存在が判明した。

【００４９】次いで、ＰＣＲ法によって完全なＣＮＴＦ
の存在について、得られたクローンを調べる。２つのオ
リゴヌクレオチドを合成した。第１のオリゴヌクレオチ
ドはウサギのＣＮＴＦ由来の最初のヌクレオチドに基づ
いており、以下の配列を有している。

【化８】　　　　　　　５’　ＡＡＣ　ＣＡＴＧ　ＧＣＴＴＴＣ
ＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡ　３’　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ＮｃｏＩこのオリゴヌクレオチドでは、
５’側の幾つかのヌクレオチドを突然変異させ、クロー
ニングを簡単にする。すなわち、ＮｃｏＩ部位を付加し
た。

【００５０】第２のオリゴヌクレオチドを上記ヒトＣＮ
ＴＦ配列中の天然ＨｉｎｄＩＩＩ部位に配置することに
より、以下の配列を調製し、以後のクローニングを容易
にする：

【化９】　　　　　　　　　５’　ＧＡＴＡ　ＡＧＣＴ　ＴＧＡ
ＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧ　３’　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＨｉｎｄＩＩＩ増幅により、１
％アガロースゲル内に１５００ｂｐ　のバンドが存在す
ることが判明した。この精製バンドをＴ４　ＤＮＡキナ
ーゼで処理し、次いでアガロース／ジーンクリーンＴＭ
（Ａｇａｒｏｓｅ／ＧｅｎｅｃｌｅａｎＴＭ）で精製す
る。

【００５１】次いで、ＨｉｎｄＩＩＩをスプライシング
し、プラスミドｐＧＥＭ７のＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位間にクローンし、プラスミドｐＧＥＭ７　ＣＮ
ＴＦｈを得る。このクローンをサンガー（Ｓａｎｇｅｒ
，１９８３）の方法によって配列決定することにより、
ヒト、ラットおよびウサギＣＮＴＦのものと類似した配
列の存在が判明した。次いで、この配列を担うファージ
クローンを均一に精製し、１４ｋｂ　の挿入体が明らか
になった。ＣＮＴＦをコードしている配列について、こ
のファージを配列決定し、それを添付を図６に示す。図
６に示す遺伝子配列は、既述した図１の遺伝子部分を含
有している。

【００５２】Ｃ．２．ＣＮＴＦについてのヒト網膜ファ
ージのライブラリーの分析　　ｇｔ１０のライブラリー由来の特定のタンパク質に
ついてのクローンを単離するための常法［Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ　Ｊ．ら，１９８９］には、単離しようとする配列
とホモローガスな放射活性遺伝子プロープを使用するこ
とを要する。ホモローガスな遺伝子プロープが無い場合
は、この問題のタンパク質に対する抗体を使用すればよ
い。クローンを単離するために、構築しようとするライ
ブラリーは発現ライブラリー、例えばｇｔ１１である。新しい手法の出現、すなわちＰＣＲ法により、放射活性
遺伝子プロープによってライブラリーをスクリーニング
するための方法が実施できる。

【００５３】本発明の場合、本発明者らによって明らか
になった配列を有するＣＮＴＦのゲノム配列を単離し、
２つのオリゴヌクレオチドを構築して、その遺伝子自身
の５’および３’セグメントにヌクレオチドを付加する
ことなく、その遺伝子を取り出した。以後のクローニン
グが容易になるように天然のＮｃｏＩ制限部位を含有す
る以下の配列：

【化１０】　　　　　　　　　　　　　ＡＧＣ　ＣＡＴＧ　ＧＣＴ
ＴＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ＮｃｏＩを有する、ＮｃｏＩと呼ばれる
最初のオリゴヌクレオチドをその遺伝子の５’部位に配
置させる。ＥｃｏＲＩと呼ばれる第２のオリゴヌクレオ
チドは、配列：

【化１１】　　　　　　５’　ＡＧＧ　ＡＡＴＴ　ＣＴＡＣＡＴＴ
ＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴ　３’　　　　　　　　　　　
　　　　　　ＥｃｏＲＩを有している。このオリゴヌク
レオチドは非天然の制限部位ＥｃｏＲＩを含有している
。

【００５４】これら２つのオリゴヌクレオチドを使用し
、３×１０６個の異なるクローンと同等のヒト網膜ライ
ブラリー１μｌ　から始めてＰＣＲ増幅を行う（ライブ
ラリーの連続希釈から測定し、サイクルの設定は３０と
し、既述の手法を使用する）。得られた増幅産物を始め
にＴ４　ＤＮＡキナーゼで処理し、次いでアガロース／
ＢＩＯ１０１で精製する。

【００５５】次に、ＥｃｏＲＩを切断し、アガロース／
ＢＩＯ１０１で再度精製し、プラスミドｐＧＥＭ７のＳ
ｍａＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローンし、それにより
プラスミドｐＧＥＭ７ＣＮＴＦｈを得る。このクローン
の配列を添付の図７に示す。このゲノムクローンについ
ては開始コドンの後ろのスプライシング１１４ｂｐ　を
示している。

【００５６】図６および図７に示す配列を比較すること
により、図７の配列と図６の９６−２１０および３１１
−７９４の配列とに同一性が確認される。この図６およ
び図７におけるヌクレオチド配列の情報に基づき、間断
のないヒトＣＮＴＦタンパク質のアミノ酸配列を図８に
示す。図８中、Ｍｅｔはメチオニン残基、Ｇｌｎはグル
タミン残基、Ａｓｐはアスパラギン酸残基、Ｐｒｏはプ
ロリン残基、Ｔｙｒはチロシン残基、Ｖａｌはバリン残
基、Ｌｙｓはリシン残基、Ｇｌｕはグルタミン酸残基、
Ａｌａはアラニン残基、Ａｓｎはアスパラギン残基、Ｌ
ｅｕはロイシン残基、Ｐｈｅはフェニルアラニン残基、
Ｇｌｙはグリシン残基、Ｈｉｓはヒスチジン残基、Ｓｅ
ｒはセリン残基、Ｔｈｒはスレオニン残基、Ｉｌｅはイ
ソロイシン残基、Ｔｒｐはトリプトファン残基、Ａｒｇ
はアルギニン残基、およびＣｙｓはシステイン残基を示
している。このタンパク質は分子量２２．８ダルトンで
あり、その等電点は６．０２と計算される。

【００５７】Ｄ．ヒトＣＮＴＦの原核生物発現ベクター
　　プラスミドｐＧＥＭ７　ＣＮＴＦｈのＳｍａＩおよ
びＥｃｏＲＩ間にクローンしたヒトＣＮＴＦのｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって修飾し、このタンパク質を良好に転
写できるようにする。新しいオリゴヌクレオチドＮｃｏ
Ｉ（２）であって、アミノ酸をコードしているコドンが
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に好都合なように改変され、他
のヌクレオチドが発現ベクターのシャイン−ダルガーノ
（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）領域と関連し、メッ
センジャーの安定性を考慮して改変されているものを合
成する。このオリゴヌクレオチドの配列は、

【化１２】　　　　　　　　　　ＡＧＣ　ＣＡＴＧ　ＧＣＴＴＴＴ
ＡＣＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ＮｃｏＩである。

【００５８】上記のオリゴヌクレオチドＮｃｏＩ（２）
およびＥｃｏＲＩを使用するＰＣＲによって得られた増
幅産物を、既述のようにしてプラスミドｐＪＬＡ６０２
のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位間にクローンする（図
９）。このようにしてヒトＣＮＴＦをλファージＰＬお
よびｐＲのプロモーターおよびＣＩ８５７レプレッサー
によって制御する。この発現プラスミドを７１／１８お
よびＣＡＧ６２８などの種々の大腸菌セルラインにトラ
ンスフェクトし、本発明タンパク質を発現させる。

【００５９】Ｅ．細菌の発育および増殖　　プラスミド
ｐＪＬＡ６０２ＣＮＴＦを含有する７１／１８の大腸菌
コロニーを３０μｇ／ｍｌ　アンピシリンを含有するＬ
Ｂ培地５ｍｌ　に接種する。その細胞を３０℃で一晩増
殖させる。次いで、その一部を２０μｇ／ｍｌ　アンピ
シリンを含有するＭ９中に１／１００の比率で希釈する
。その細胞を５５０ｎｍの吸光度ＯＤ０．４にまで発酵
槽中で増殖させる。次いで、その発酵槽を素早く４２℃
に加熱する。細胞をさらに３時間増殖させ、次いで遠心
し、トリス−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、１０ｍＭＥＤＴＡ中
に再懸濁した後、以後の抽出に備える。

【００６０】Ｆ．ヒトＣＮＴＦのための真核生物発現ベ
クター　　ヒトＣＮＴＦをコードしている配列をＰＳＶＴ７真
核生物発現プラスミド［Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ら，１
９８９］に挿入する。このため、ゲノムクローンＥＭＢＬ−３由来のＤＮＡを
使用する。２つの新しいオリゴヌクレオチドを合成する
。第１のオリゴヌクレオチドはこの遺伝子の５’および
第２のオリゴヌクレオチドは３’である。これらオリゴ
ヌクレオチドは以下の配列を有している：

【化１３】　　　　　５’　ＴＴＧ　ＡＡＴＴ　ＣＡＴＧＧＣＴＴ
ＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴ　３’　　　　　　　　　　　
　　　　　ＥｃｏＲＩ　　　　　５’　ＴＧＧ　ＴＣＧ
Ａ　ＣＴＡＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴ　３’　　
　　　　　　　　　　　　　　　ＳａｌＩ

【００６１】
これら２つのオリゴヌクレオチドも非天然のＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩ制限部位を含有し、以後のクローニング
が容易である。したがって、ＰＣＲによって得られた増
幅した産物は第１のエクソン、第１のイントロンをコー
ドしている配列、および第２のエクソンをコードしてい
る配列を含有している。約１９００ｂｐ　のフラグメン
トをアガロース、次いでジーンクリーンで精製した後、
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ切断し、連結反応によりｐＳＶＴ
７ベクターのＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位間にクロー
ンする。得られた発現ベクターを添付の図１０に示す。

【００６２】Ｇ．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞におけるリポソームによる一時的トランスフェク
ション　　ＣＨＯ細胞を５％ウシ胎仔血清と共に増殖させる。トランスフェクションの前日にそれをトリプシンで処理
し、翌日に８０％全面成長しているように再度プレート
する。プラスミドＤＮＡ　ｐＳＶｈＣＮＴＦをＤＮＡ濃
度１０μｇになるように水５０μｌ　中に希釈し、それ
にリポフェクチンＴＭ（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ）［
ギブコ］５０μｌを加え、全体をポリスチレン管に入れ
る。１５分放置した後、得られた混合物を、オプチ−メ
ン（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ）培地［ギブコ］で前もって洗浄
した細胞に加える。このようにして得られた細胞を８時
間インキュベートし、次いでウシ胎仔血清を含有する通
常の培地を加え、継続して増殖させる。Ｓｔｏｅｃｋｌ
ｉら（１９８９）に記載のようにして生物学的活性を測
定する。

【００６３】毛様体ひな神経節を培養培地または、ヒト
ＣＮＴＦを有し得るまたは有し得ない発現ベクターでト
ランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞溶解物と共にイン
キュベートする。プラスミドｐＳＶｈＣＮＴＦでトラン
スフェクトした、ヒトＣＮＴＦの遺伝子配列を有するＣ
ＨＯ細胞の細胞溶解物のみが、毛様体神経節の生存性を
持続させることができる（図１１）。

【００６４】Ｈ．ヒトゲノム内のヒトＣＮＴＦ遺伝子の
単独性の評価　　本明細書に記載の単離したＣＮＴＦ遺伝子がヒトゲ
ノム内においてただ１つのものであるか否かを調べるた
め、種々の制限酵素を使用して消化したヒト胎盤から得
たＤＮＡ１０μｇを出発物質としてサザーンブロットを
行った。標識に使用するプローブはヒトＣＮＴＦの最初
のクローンに使用した、ベーリンガーのランダムプライ
マーキットを使用して３２Ｐで標識した上記のものと同
一である。２０×１０６ｃｐｍでハイブリダイズし、１
回洗浄し、オートラジオグラフィーにかける。ＤＮＡを
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、Ｐ
ｓｔＩで切断しておいた場合、２日暴露させた後では、
単一のバンドが視覚化される。このことは、単一の遺伝
子しか存在していないことを示している。

【００６５】医薬組成物　　既述のように、本発明はさらにＣＮＴＦの治療学的
用途、およびその因子を単独で、または他の活性物質と
共に含有する医薬組成物によってそれを投与することに
関する。本発明のＣＮＴＦは、神経機能の維持または神
経機能の喪失の予防、ならびに脳血管性、感染症、炎症
、圧迫性および代謝性障害などの急性の症状および慢性
または神経変性症状などの処置を包含する、急性または
慢性の病因論的症状に由来する神経機能の喪失の処置に
使用することができる。本発明のＣＮＴＦはさらに、神
経系の加齢または免疫系に影響する疾患によって招来さ
れる神経病因論的症状の処置にも有用である。

【００６６】本発明の医薬調製物は活性物質として、成
長因子ＣＮＴＦと、天然ガングリオシド（またはガング
リオシド誘導もしくはガングリオシドの半合成同族体）
または塩またはそれらの会合物、および他の成長因子ま
たはポリサッカライド（天然のもの、化学的に修飾され
ものまたは生体物質などの最終産物に変換するポリサッ
カライド）との１つまたはそれ以上の組合わせ物を含有
することもできる。このような医薬調製物は経口、経直
腸、腸管外、局所、吸入用、脳内に適用することができ
る。したがって、その剤形は固形または半固形型であり
、例えば糖衣錠、錠剤、クリーム剤、ゼラチンカプセル
剤、カプセル剤、坐剤、ゼラチン軟カプセル剤、ゲル剤
、メンブラン剤、チューブ剤などである。腸管外または
脳内適用の場合は、筋注もしくは皮下投与用の剤形を使
用することができ、または注入すなわち静脈内もしくは
脳内注入用に使用するができる。したがって、本発明製
剤は、本発明活性物質の溶液剤または活性物質の凍結乾
燥粉末剤であって、それらの用途に適切かつ生理学的体
液に適合する浸透性を有する１つまたはそれ以上の医薬
的に許容され得る賦形剤または希釈剤を混合したものと
して調製する。局所投与用には、通常使用するものとし
てクリームまたは軟膏の剤形の調製物が考えられるが、
吸入用には例えば鼻腔スプレーなどのスプレー剤の調製
物を考えるべきである。

【００６７】本発明の調製物は、ヒトまたは動物に投与
することができる。それらは、溶液剤、スプレー剤、軟
膏およびクリーム剤の場合には活性成分を０．０１％か
ら１０％含有するものが好ましく、また固形剤の調製物
では活性成分を１％から１００％含有し、そして５％か
ら５０％含有するものが好ましい。投与すべき投与量は
、個々の要求度、所望の効果および選択する投与経路に
よって変動する。しかし、ヒトに対する皮下、筋注また
は脳内注射での１日投与量は一般に、体重１ｋｇ当たり
活性物質０．０５ｍｇから５ｍｇと種々変動する。

【００６８】本発明はさらに、ガングリオシドまたはヒ
アルロン酸誘導体またはそれらの誘導体と本発明成長因
子ＣＮＴＦとのすべての新規複合体を上記適応症に治療
学的に使用することをも包含している。組換えＤＮＡ技
術によって得られるヒトＣＮＴＦ分子を含有する、ガン
グリオシド、リン脂質、ヒアルロン酸をも含有すること
ある医薬組成物は、医薬的に許容され得るビヒクルと共
に混合物中にＣＮＴＦ分子の有効量を混合するようにし
て、医薬的に許容され得る組成物を調製するためのそれ
自体既知の方法によって調製することができ、それは患
者に投与できる。適当なビヒクル、および他のタンパク
質を含有するその製剤は、例えば「レミングトンの医薬
科学」［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，マック・パブリッシン
グ・カンパニー，イーストン，Ｐａ．，米国，１９８５
］に記載されている。これらのビヒクルには、注射用の
「沈渣製剤（ｄｅｐｏｓｉｔ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ
）」が包含される。

【００６９】これらのことに基づけば、本発明の医薬製
剤としては、１つまたはそれ以上の医薬的に許容され得
るビヒクルまたは希釈剤を共に含有するＣＮＴＦ成長因
子の溶液剤またはその凍結乾燥粉末剤が挙げられるが、
これらは総括的なものでなく、またそれらは適切なｐＨ
に、および生理学的体液と等張性にするための緩衝化溶
液中に含有されていることもできる。凍結乾燥した調製
物の場合は、例えばマンニトールまたはグリシンなどを
支持賦形剤とすればよく、また所望のｐＨを有する適切
な等張性緩衝化溶液剤を得るためには、所望の容量の適
当な緩衝化溶液を加えればよい。所望の容量の等張性溶
液中に組換えＤＮＡによって得られたＣＮＴＦ分子を含
有する医薬組成物の調製には、上記と同様の溶液を使用
すればよく、それには所望のｐＨ、例えば中性ｐＨの等
張性医薬調製物を得るために適当な濃度のリン酸塩また
はクエン酸塩を含有する生理学的緩衝化溶液を使用する
ことが包含されるが、それに限定されない。

【００７０】本発明の医薬製剤としてはさらに、新油性
賦形剤、例えばグリコゼラチンなどの水溶性の自動乳化
性賦形剤を含有する直腸投与用の坐剤が挙げられるが、
それに限定されない。この調製物では、組換えＤＮＡに
よって得られたＣＮＴＦ成長因子を全賦形剤の重量に対
して０．０１％から１％の含量で存在させればよい。こ
の坐剤には、適量のアセチルサリチル酸塩を含有させる
ことができるが、その使用に限定されない。

【００７１】以下に本発明に従って調製される医薬組成
物の幾つかを例示するが、これらは本発明の単なる説明
のためのものであり、限定を意図するものではない。Ａ）注射用溶液剤調製例１−２ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：
活性物質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１μｇ（３，２００ＢＵ）塩化ナトリウム　　　　　
　　　　　　　　　１６ｍｇクエン酸緩衝液（ｐＨ７）
　　　　　　　　　２ｍｌ　注射用水に入れる。調製例２−２ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：
活性物質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０μｇ（３２，０００ＢＵ）塩化ナトリウム　　　　　
　　　　　　　　　１６ｍｇクエン酸緩衝液（ｐＨ７）
　　　　　　　　　２ｍｌ　注射用水に入れる。

【００７２】調製例３−２ｍｌ　バイアルは以下の成分
を含有する：活性物質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１μｇ（３，２００ＢＵ）塩化ナトリウム　　　
　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇガングリオシド（
Ｎａ塩として）　　１００ｍｇクエン酸緩衝液（ｐＨ７
）　　　　　　　　　　　２ｍｌ　注射用水に入れる。調製例４−２ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：
活性物質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０μｇ（３２，０００ＢＵ）塩化ナトリウム　　　
　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇガングリオシド（
Ｎａ塩として）　　　　５０ｍｇクエン酸緩衝液（ｐＨ
７）　　　　　　　　　　　２ｍｌ　注射用水に入れる
。調製例５−２ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：
　　活性物質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｇ（３，２
００ＢＵ）　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇ　　モ
ノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）（
Ｎａ塩として）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１００ｍｇ　　クエン酸緩衝液（ｐＨ７）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
ｍｌ　注射用水に入れる。

【００７３】調製例６−２ｍｌ　バイアルは以下の成分
を含有する：　　活性物質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１０μｇ（３２，０
００ＢＵ）　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇ　　モ
ノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）（
Ｎａ塩として）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１００ｍｇ　　クエン酸緩衝液（ｐＨ７）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
ｍｌ　注射用水に入れる。調製例７（ａ）２ｍｌ　アンプルは以下の成分を含有す
る：凍結乾燥した活性物質　　　　　　　　　　４μｇ
（１２，８００ＢＵ）グリシン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　３０ｍｇ（ｂ）２ｍｌ　アンプルの
溶媒は以下の成分を含有する：塩化ナトリウム　　　　
　　　　　　　　　　１６ｍｇクエン酸緩衝液の水溶液
　　　　　　　　２ｍｌ　注射用水調製例８（ａ）２ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：凍結
乾燥した活性物質　　　　　　　　　　４μｇ（１２，
８００ＢＵ）マンニトール　　　　　　　　　　　　　
　　　４０ｍｇ（ｂ）２ｍｌ　アンプルの溶媒は以下の
成分を含有する：塩化ナトリウム　　　　　　　　　　
　　　　１６ｍｇクエン酸緩衝液の水溶液　　　　　　
　　２ｍｌ　注射用水

【００７４】調製例９（ａ）３ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：凍結
乾燥した活性物質　　　　　　　　１０μｇ（３２，０
００ＢＵ）グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　４５ｍｇ（ｂ）３ｍｌ　アンプルの溶媒は以下
の成分を含有する：塩化ナトリウム　　　　　　　　　
　　　　　２４ｍｇクエン酸緩衝液の水溶液　　　　　
　　　３ｍｌ　注射用水調製例１０（ａ）３ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：凍結
乾燥した活性物質　　　　　　　　　　　　１０μｇ（
３２，０００ＢＵ）ガングリオシド（Ｎａ塩として）　
　　　１００ｍｇグリシン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　４５ｍｇ（ｂ）３ｍｌ　アンプ
ルの溶媒は以下の成分を含有する：塩化ナトリウム　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２４ｍｇクエン酸緩
衝液の水溶液　　　　　　　　　　　　３ｍｌ　注射用
水調製例１１（ａ）３ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：凍結
乾燥した活性物質　　　　　　　　　　　　１０μｇ（
３２，０００ＢＵ）ガングリオシド（Ｎａ塩として）　
　　　　　５０ｍｇグリシン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　４５ｍｇ（ｂ）３ｍｌ　アン
プルの溶媒は以下の成分を含有する：塩化ナトリウム　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２４ｍｇクエン酸
緩衝液の水溶液　　　　　　　　　　　　３ｍｌ　注射
用水

【００７５】調製例１２（ａ）３ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：　　
凍結乾燥した活性物質　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１μｇ（３，２００ＢＵ）　　モノ
シアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）（Ｎ
ａ塩として）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１００ｍｇ　　グリシン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
５ｍｇ（ｂ）３ｍｌ　アンプルの溶媒は以下の成分を含
有する：　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２４ｍｇ　　クエン
酸緩衝液の水溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　３ｍｌ　　　注射用水調製例１３（ａ）３ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：　　
凍結乾燥した活性物質　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０μｇ（３２，０００ＢＵ）　　モノ
シアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）（Ｎ
ａ塩として）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１００ｍｇ　　グリシン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
５ｍｇ（ｂ）３ｍｌ　アンプルの溶媒は以下の成分を含
有する：　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２４ｍｇ　　クエン
酸緩衝液の水溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　３ｍｌ　　　注射用水

【００７６】調製例１４（ａ）３ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：　　
凍結乾燥した活性物質　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０μｇ（３２，０００ＢＵ）　　３−
ｓｎ−ホスファチジルＬ−セリン　　　　　　　　　　
　　　５０ｍｇ　　レシチン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５ｍ
ｇ　　マンニトール　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ（ｂ）４ｍｌ　ア
ンプルの溶媒は以下の成分を含有する：　　マンニトー
ル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　６０ｍｇ注射用水で容量４ｍｌ　にする。調製例１５（ａ）３ｍｌ　アンプルは以下の成分を含有
する：　　凍結乾燥した活性物質　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１０μｇ（３２，０００ＢＵ
）　　マンニトール　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　６０ｍｇ（ｂ）３ｍｌ　
アンプルの溶媒は以下の成分を含有する：　　塩化ナト
リウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２４ｍｇ　　クエン酸緩衝液の水溶液　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｍｌ　　
　注射用水

【００７７】Ｂ）皮下注射剤調製例１６（ａ）２ｍｌ　バイアルは以下の成分を含有する：　　
凍結乾燥した活性物質　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　５μｇ（１６，０００ＢＵ）　　マ
ンニトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　３０ｍｇ（ｂ）２ｍｌ　アンプル
の溶媒は以下の成分を含有する：　　塩化ナトリウム　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１６ｍｇ　　クエン酸緩衝液の水溶液　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２ｍｌ　　　注射用
水

【００７８】

【００７９】既述のように本発明を説明してきたが、本
明細書に記載した方法が種々の態様で改変できることは
明らかである。このような改変は、本発明の思想および
範囲から逸脱するものと解してはならず、当業者にとっ
て自明と考えられるすべての改変は、本発明の特許請求
の範囲内に包含されるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　ヒトＣＮＴＦをコードしている遺伝子の部
分的配列を示す配列図である。

【図２】　　図１の配列を翻訳した場合にあり得る３つ
のコドンに対応するアミノ酸の配列を示す配列図である
。

【図３】　　図１で示されるヌクレオチド配列によって
コードされているアミノ酸の配列図である。

【図４】　　図３に示すアミノ酸配列をラットおよびウ
サギＣＮＴＦ配列と比較している配列図である。

【図５】　　図３に示すアミノ酸配列のヒドロパシープ
ロフィルをラットおよびウサギＣＮＴＦのそれと比較し
ているグラフである。

【図６】　　ＥＭＢＬ−３のヒトゲノムライブラリーか
ら得られたヒトＣＮＴＦ遺伝子のヌクレオチド配列を示
す配列図である。

【図７】　　ｇｔ１１のヒト網膜ライブラリーから得ら
れたヒトＣＮＴＦ遺伝子のヌクレオチド配列を示す配列
図である。

【図８】　　図７に示すヌクレオチド配列によってコー
ドされているヒトＣＮＴＦのアミノ酸配列を示す配列図
である。

【図９】　　ヒトＣＮＴＦの原核生物発現のためのプラ
スミドｐＳＶＣＮＴＦｈの構築物の模式図である。

【図１０】　　ヒトＣＮＴＦの真核生物発現のためのプ
ラスミドｐＪＬＡＣＮＴＦの構築物の模式図である。

【図１１】　　ヒトＣＮＴＦの遺伝子によってトランス
フェクトしたＣＨＯ細胞についての生物学的活性を示す
グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　ヒト毛様体神経栄養因子をコードして
いるＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ単離体。
【請求項２】　　［化１］：【化１】で示されるヌクレオチド配列またはその遺伝子コードの
縮重に基づく変異体を含有する請求項１に記載のＤＮＡ
単離体。
【請求項３】　　［化２］【化２】で示されるヌクレオチド配列またはその遺伝子コードの
縮重に基づく変異体を含有する請求項１に記載のＤＮＡ
単離体。
【請求項４】　　［化３］：【化３】で示されるアミノ酸配列を示す請求項１に記載のＤＮＡ
単離体。
【請求項５】　　形質転換された微生物または細胞培養
物内でヒト毛様体神経栄養因子を発現することのできる
、ヒト毛様体神経栄養因子をコードしているＤＮＡ配列
を含有する組換え発現ベクター。
【請求項６】　　該ＤＮＡ配列が請求項２に記載のヌク
レオチド配列である請求項５に記載の組換え発現ベクタ
ー。
【請求項７】　　該ＤＮＡ配列が請求項３に記載のヌク
レオチド配列である請求項５に記載の組換え発現ベクタ
ー。
【請求項８】　　該毛様体神経栄養因子が［化４］：【
化４】で示されるアミノ酸配列を有している、請求項５に記載
の組換え発現ベクター。
【請求項９】　　ヒト毛様体神経栄養因子を発現するこ
とのできる、請求項５に記載の発現ベクターによって形
質転換された微生物。
【請求項１０】　　ヒト毛様体神経栄養因子を発現する
ことのできる、請求項６に記載の発現ベクターによって
形質転換された微生物。
【請求項１１】　　ヒト毛様体神経栄養因子を発現する
ことのできる、請求項７に記載の発現ベクターによって
形質転換された微生物。
【請求項１２】　　ヒト毛様体神経栄養因子を発現する
ことのできる、請求項８に記載の発現ベクターによって
形質転換された微生物。
【請求項１３】　　請求項９から請求項１２までのいず
れかに記載の大腸菌微生物。
【請求項１４】　　ヒト毛様体神経栄養因子を発現する
ことのできる、請求項５に記載の発現ベクターによって
形質転換された細胞培養物。
【請求項１５】　　ヒト毛様体神経栄養因子を発現する
ことのできる、請求項６に記載の発現ベクターによって
形質転換された細胞培養物。
【請求項１６】　　ヒト毛様体神経栄養因子を発現する
ことのできる、請求項７に記載の発現ベクターによって
形質転換された細胞培養物。
【請求項１７】　　ヒト毛様体神経栄養因子を発現する
ことのできる、請求項８に記載の発現ベクターによって
形質転換された細胞培養物。
【請求項１８】　　非−ヒト哺乳動物セルラインである
請求項１４から請求項１７までのいずれかに記載の細胞
培養物。
【請求項１９】　　チャイニーズハムスター卵巣セルラ
インである請求項１８に記載の細胞培養物。
【請求項２０】　　ヒト由来の夾雑タンパク質を含まな
い実質的に純粋なヒト毛様体神経栄養因子。
【請求項２１】　　［化５］：【化５】で示されるアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の
実質的に純粋なヒト毛様体神経栄養因子。
【請求項２２】　　請求項２０に記載のヒト毛様体神経
栄養因子の神経処置に有効な量、および製薬的に許容さ
れ得る担体または希釈剤を含有する医薬組成物。
【請求項２３】　　請求項２１に記載のヒト毛様体神経
栄養因子の神経処置に有効な量、および製薬的に許容さ
れ得る担体または希釈剤を含有する医薬組成物。
【請求項２４】　　天然のガングリオシドまたはその誘
導体、またはそのようなガングリオシドの半合成同族体
もしくはその塩をさらに含有する請求項２２または請求
項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】　　天然のポリサッカライドまたはその
誘導体、またはそのようなポリサッカライドの半合成同
族体をさらに含有する請求項２２または請求項２３に記
載の医薬組成物。
【請求項２６】　　該ポリサッカライドがヒアルロン酸
である請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】　　請求項２０に記載のヒト毛様体神経
栄養因子の有効量を患者に投与することを特徴とする、
神経機能の維持、その喪失の予防、またはその回復を図
ることによって神経障害を処置するための方法。
【請求項２８】　　請求項２１に記載のヒト毛様体神経
栄養因子の有効量を患者に投与することを特徴とする、
神経機能の維持、その喪失の予防、またはその回復を図
ることによって神経障害を処置するための方法。
【請求項２９】　　請求項２４に記載の医薬組成物の有
効量を患者に投与することを特徴とする、神経機能の維
持、その喪失の予防、またはその回復を図ることによっ
て神経障害を処置するための方法。
【請求項３０】　　請求項２５に記載の医薬組成物の有
効量を患者に投与することを特徴とする、神経機能の維
持、その喪失の予防、またはその回復を図ることによっ
て神経障害を処置するための方法。
【請求項３１】　　請求項２０に記載のヒト毛様体神経
栄養因子の有効量を患者に投与することを特徴とする、
神経系の加齢または免疫系に影響する疾患に由来してい
る神経病因論的症状を処置するための方法。
【請求項３２】　　請求項２１に記載のヒト毛様体神経
栄養因子の有効量を患者に投与することを特徴とする、
神経系の加齢または免疫系に影響する疾患に由来してい
る神経病因論的症状を処置するための方法。
【請求項３３】　　請求項２４に記載の医薬組成物の有
効量を患者に投与することを特徴とする、神経系の加齢
または免疫系に影響する疾患に由来している神経病因論
的症状を処置するための方法。
【請求項３４】　　請求項２５に記載の医薬組成物の有
効量を患者に投与することを特徴とする、神経系の加齢
または免疫系に影響する疾患に由来している神経病因論
的症状を処置するための方法。