JPH0422559B2 - - Google Patents
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- JPH0422559B2 JPH0422559B2 JP57194394A JP19439482A JPH0422559B2 JP H0422559 B2 JPH0422559 B2 JP H0422559B2 JP 57194394 A JP57194394 A JP 57194394A JP 19439482 A JP19439482 A JP 19439482A JP H0422559 B2 JPH0422559 B2 JP H0422559B2
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- deoxyguanosine
- reaction
- deoxyribose
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- treatment
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/38—Nucleosides
- C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
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Description
本発明は3′−デオキシグアノシンの酵素的な製
造法に関するものである。 3′−デオキシグアノシンは、癌治療において放
射線増感作用を示すだけはでなく、各種の抗癌剤
と併用すると、その抗腫瘍効果を増強する作用を
有し、現在注目を浴びている化合物である（特開
昭57−35516号公報参照）。 従来、3′−デオキシグアノシンの調整法として
は、２−アセトアミドヒポキサンチンの塩化水銀
塩と２，５−ジ−Ｏ−ベンゾイル−３−デオキシ
−Ｄ−リボフラノシルブロミドとを縮合させる方
法が知られている（ザ・ジヤーナル・オブ・オー
ガニツク・ケミストリー（J.Org.Chem.）、30、
2851（1965））。しかしながら、この方法は原料で
ある３−デオキシリボースの入手が困難であるこ
と、縮合反応時に異性体を生ずること、および有
害な水銀塩を使用しなければならないことなど、
工業的生産においては種々の難点を有している。 本発明者らは、先に3′−デオキシアデノシン
（コルジセピン）から化学的に合成された２−ア
ミノ−3′−デオキシアデノシンまたはそのN6位
置換誘導体のN6位のみをアデノシンデアミナー
ゼによつて選択的に脱アミノし、3′−デオキシグ
アノシンを製造する方法を開発した（特願昭56−
10473号参照）。この方法は、原料化合物のN6位
に酵素的に脱アミノするので従来の化学的合成法
に比較して選択性および収率の点で優れてはいる
が、原料化合物をコルジセピンから化学的に合成
しなければならず、収率および操作性に問題があ
る。 本発明者らは、これらの従来技術の欠点を克服
するために種々検討した結果、グアニン誘導体と
3′−デオキシリボース供与体とを、ヌクレオシド
ホスホリラーゼ活性を有する微生物の作用によつ
て反応させることによつて3′−デオキシグアノシ
ンが生成することを知見し、この知見に基づいて
本発明を完成した。 本発明は、一般式〔〕 〔式中、Ｒは水素原子またはリボース−１−イル
基、２−デオキシリボース−１−イル基もしくは
これらのモノりん酸エステル、ジりん酸エステ
ル、トリりん酸エステルを示す。〕で表わされる
グアニン誘導体の一種または二種以上と、３−デ
オキシリボース供与体の一種または二種以上と
を、キサントモナス属、ミクロコツカス属、スタ
フイロコツカス属またはサルシナ属に属し、ヌク
レオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の作
用によつて反応させて3′−デオキシグアノシンを
得ることを特徴とする3′−デオキシグアノシンの
製造法である。 以下、本発明を具体的に説明する。 原料のグアニン誘導体としては前記の定義に含
まれる化合物の一種または二種以上が使用される
が、具体的にはグアニン（Gua）またはグアノシ
ン（Guo）、2′−デオキシグアノシン（dGuo）も
しくはこれらのモノりん酸エステル、ジりん酸エ
ステル、トリりん酸エステルなどを挙げることで
きる。上記のヌクレオシドの各種りん酸エステル
は、糖残基における水酸基のいずれの位置がりん
酸エステル化されたものであつてもよい。これら
りん酸エステルの具体例としてはグアノシン−
5′−モノりん酸（GMP）、グアノシン−3′−モノ
りん酸、ギアノシン−2′−モノりん酸、グアノシ
ン−5′−ジりん酸（GDP）、グアノシン−5′−ト
リりん酸（GTP）、2′−デオキシグアノシン−
5′−モノりん酸（2′−dGMP）、2′−デオキシグア
ノシン−3′−モノりん酸、2′−デオキシグアノシ
ン−5′−ジりん酸（2′−dGDP）、2′−デオキシグ
アノシン−5′−トリりん酸（2′−dGTP）などの
遊離型もしくは適当な塩型、たとえばナトリウム
塩を挙げることができる。本発明の目的に特に好
適なグアニン誘導体はグアノシンまたはグアノシ
ン−5′−モノりん酸である。 他の原料である３−デオキシリボース供与体と
しては、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用によ
つて前記グアニン誘導体に対して3′−デオキシリ
ボースを供与しうるものが用いられる。このよう
な３−デオキシリボース供与体としてはグアニン
塩基を除くプリン塩基を有する3′−デオキシヌク
レオシド類もしくは３−デオキシリボース類が例
示され、さらに具体的には3′−デオキシアデノシ
ン（3′−dAdo；コルジセピン）、3′−デオキシイ
ノシン（3′−dIno）、3′−デオキシキサントシン、
３−デオキシリボースまたはこれらのモノりん酸
エステル、ジりん酸エステル、トリりん酸エステ
ルなどの一種または二種以上が使用される。上記
のりん酸エステルは３−デオキシリボースにおけ
る水酸基のいずれの位置がりん酸エステル化され
たものであつてもよく、遊離型、塩型のいずれで
あつてもよい。具体的には3′−デオキシアデノシ
ン−5′−モノりん酸（3′−dAMP）、3′−デオキシ
アデノシン−5′−ジりん酸、3′−デオキシアデノ
シン−5′−トリりん酸、3′−デオキシイノシン−
5′−モノりん酸（3′−dIMP、または３−デオキ
シリボース−１−りん酸などを例示することがで
きる。 本発明における反応の酵素源は、キサントモナ
ス（Xanthomonas；以下「X.」と略す。）属、
ミクロコツカス（Micrococcus；以下「M.」と
略す。）属、スタフイロコツカス
（Staphylococcus；以下「St.」と略す。）属また
はサルシナ（Sarcina；以下「Sa.」と略す。）属
に属し、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有す
る微生物である。なお、本発明において「ヌクレ
オシドホスホリラーゼ活性」とは前記グアニン誘
導体と前記３−デオキシリボース供与体とを反応
させて3′−デオキシグアノシンを与える単独の、
もしくは複数の酵素活性を総称するものである。
したがつて本発明においては前記の属に属し、グ
アニン誘導体と３−デオキシリボース供与体とか
ら3′−デオキシグアノシンを生成する作用を有す
る微生物である限り使用することができる。以
下、このような微生物の代表的菌株を例示する。 キサントナス・キヤンペストリス（X.
campestris） IAM1671、ATCC7381（微工研菌寄第
6782号） ミクロコツカス・ルテウス（M.luteus） ATCC4698、IAM1056 スタフイロコツカス・アウレウス（St.aureus） IAM1011、ATCC6538P スタフイロコツカス・アウレウス（St.aureus） IFO3060 スタフイロコツカス・エピデルミデイス（St.
epidermidis） IFO3762、ATCC155 サルシナ・マルギナータ FERM Ｐ−6539（微工研菌寄第6239号） また、前記の菌株から、紫外線、Ｘ線、γ線の
照射などの物理的処理もしくはニトロソグアニジ
ンなどによる薬剤処理など、一般的変異誘導法に
よる誘発突然変異または自然の原因に起因する自
然突然変異によつて誘導された変異株も、本発明
の目的に適したヌクレオシドホスホリラーゼ活性
を失わない限り、本発明に使用することができ
る。 さらに、以上のような本発明に好適に使用され
る菌株の本発明の目的に適したヌクレオシドホス
ホリラーゼの遺伝子が、キサントモナス属、ミク
ロコツカス属、スタフイロコツカス属、またはサ
ルシナ属以外の微生物に取り込まれ、そのような
形質が発現するに至つた場合、このような微生物
の培養物、培養菌体またはその処理物を本発明の
目的に使用する方法は、本発明に包含される。 これらの微生物の培養に際し、使用される培地
および培養法は、これらの微生物が生育する限
り、特に限定されない。 培地としてはこれらの微生物が資化可能な炭素
源および窒素源を適当量含有し、必要に応じて無
機塩、微量発育促進物質、消泡剤などを添加した
ものが使用さいる。具体的には、炭素源として
は、グルコース、フラクトース、マルトース、ガ
ラクトース、リボース、サツカロース、澱粉、澱
粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類もしくは
その脂肪酸エステルなどの誘導体、麦、〓、米な
どの天然炭水化物、グリセロール、マンニトー
ル、メタノール、エタノールなどのアルコール
類、グルコン酸、ピルビン酸、酢酸、クエン酸な
どの脂肪酸類、ノルマルパラフイン、ケロシンな
どの炭化水素類、グリシン、グルタミン酸、グル
タミン、アラニン、アスパラギンなどのアミノ酸
類など、一般的な炭素源より使用する微生物の資
化性を考慮して一種または二種以上を適宜に選択
して使用すればよい。窒素源としては、肉エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、大豆加水
分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カザミノ酸、
各種アミノ酸、コーンステイープリカー、コツト
ンシードミールないしその加水分解物、フイツシ
ユミールないしその加水分解物、その他の動物、
植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合
物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの
アンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、
尿素など無機窒素化合物より使用微生物の資化性
を考慮し、一種または二種以上を適宜に選択して
使用する。さらに、無機塩として微量のマグネシ
ウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カ
ルシウム、カリウムなどのりん酸塩、塩酸塩、硫
酸塩、炭酸塩、硝酸塩、酢酸塩などの一種または
二種以上を適宜添加し、必要に応じて植物油、界
面活性剤などの消泡剤、ビタンミンB1、B2、ニ
コチン酸、パントテン酸、ビオチン、ｐ−アミノ
安息香酸などの微量発育促進物質を添加してもよ
い。また、栄養要求を同時に示す微生物を使用す
る場合、当然その生育を満足させる物質を培地に
添加しなければならない。 培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で
振盪培養、通気撹拌培養、静置培養、連続培養な
どの通常の培養法より使用微生物に適した培養法
を選択して行う。 培養条件は、使用微生物および培地の種類によ
り適宜選択すればよいが、通常は培養開始のPHを
約６〜８に調整し、約25〜35℃の温度条件下で培
養を行う。培養期間は使用微生物の生育に十分な
時間であればよく、通常１〜３日間である。 本発明においてグアニン誘導体および３−デオ
キシリボース供与体に前記微生物を作用させる方
法としては、以下の方法を採用することができ
る。 第一の方法は、前記微生物の培養に際し、グア
ニン誘導体および３−デオキシリボース供与体を
培地に存在させ、培地中に3′−デオキシグアノシ
ンを蓄積させる方法である。 上記の方法はグアニン誘導体および３−デオキ
シリボース供与体の必要量を培養前に培地に添加
して微生物を培養するか、あるいはこれらの物質
を培養中の適宜の時期に一度に添加し、または断
続的もしくは連続的に添加しながら培養すること
によつて行われる。 第二の方法は、前記微生物をその生育条件下で
培養して得られた培養物、培養物から遠心分離、
沈降分離、凝集分離などの通常の方法によつて集
菌した生菌体、または生菌体に適宜な処理を施し
て得られる菌体処理物（以下、これらを「菌体
等」と総称することもある。）を、少なくともグ
アニン誘導体および３−デオキシリボース供与体
を含有する水性媒体と3′−デオキシグアノシンが
生成する条件下で接触させることによつて行なわ
れる。 ここで、培養物と培養後の培地と培養菌体が未
分離の状態のものをいう。また、菌体処理物と
は、乾燥菌体、細胞膜・壁変性菌体、破砕菌体、
固定化菌体、菌体抽出物、ヌクレオシドホスホリ
ラーゼ活性を有する菌体抽出物の蛋白質画分もし
くはその精製物、蛋白質画分もしくはその精製物
の固定化物などを指称する菌体処理物を得るため
の方法を以下に例示する。すなわち、生菌体に
対し、たとえば凍結融解処理、凍結乾燥処理、通
風乾燥処理、アセトン乾燥処理、酸性ないしアル
カリ性下における加温処理、磨砕処理、超音波処
理、浸透圧処理などの物理的処理手段、もしくは
たとえば、リゾチーム、細胞壁溶解酵素などの酵
素処理、トルエン、キシレン、ブチルアルコール
などの溶媒もしくは界面活性剤との接触処理など
の化学的ないし生物化学的処理を単独もしくは組
合せて施す方法、菌体抽出物に対し、たとえば
塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、
各種クロマトグラフ処理、透析処理などの酵素分
離精製手段を単独もしくは組合せて施す方法、
生菌体、菌体抽出物もしくはその精製物に包括処
理、架橋処理、担体への結合処理（共有結合、イ
オン結合、物理的吸着などによる。）などの酵素
固定化手段を施す方法などによる菌体処理物を得
ることができる。 グアニン誘導体および３−デオキシリボース供
与体を溶解もしくは懸濁させるための水性媒体
は、水または酵素反応に好適な各種緩衝液（りん
酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ベロナー
ル−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液など）であ
り、りん酸イオン供与源を含有し、必要に応じて
諸物質を含有していてもよい。 りん酸イオン供与源としては、水性媒体中でり
ん酸イオンに解離しうるもののいずれを用いても
よく、たとえば遊離型りん酸そのもの、無機りん
酸塩、たとえばナトリウム、カリウムなどのアル
カリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアル
カリ土類金属、アンモニウムとの塩が好適に使用
される。これらのりん酸供与源はりん酸イオンと
してグアニン誘導体の約1.0〜2.5倍モルになるよ
うに使用すればよい。 なお、反応基質のグアニン誘導体および／また
は３−デオキシリボース供与体としてりん酸エス
テル体のものを用い、かつ反応系にホスフアター
ゼ活性を有する場合には、特に他のりん酸供与源
を添加する必要はない。りん酸イオン供与源のほ
か、グルコース、サツカロースなどの糖類、メタ
ノール、エタノール、プロパノール、ブタノー
ル、ベンタノール、トルエン、キシレン、酢酸エ
チル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチ
ルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの有
機溶媒、各種界面活性剤、金属塩類などを反応に
際して水性媒体中に存在させてもよい。 菌体等とグアニン誘導体および３−デオキシリ
ボース供与体とを、水性媒体中で接触させる方法
としては、これらの反応基質を含有する水性媒体
に菌体等を懸濁ないし溶解させ、必要に応じて撹
拌もしくは振盪する方法、菌体等の懸濁液もしく
は溶解液に各反応基質のいずれか、もしくは両方
を連続的もしくは断続的に添加する方法、または
菌体等を必要に応じて適当な助剤を混和してカラ
ムに充填し、反応基質を含有する水性媒体を通液
する方法などが適用される。 反応に際し、基質濃度は特に制限されないが、
いずれの反応基質も５〜50ｍＭの範囲で通常使用
され、グアニン誘導体については15〜35ｍＭ程度
が、３−デオキシリボース供与体についても15〜
30ｍＭ程度が好適である。また、菌体等の使用量
は反応基質の濃度、反応効率、経済性などを考慮
し、当業者が容易に決定できる。 反応条件は、特に限定されるものではなく、菌
体等に含まれるヌクレオシドホスホリラーゼの至
適温度および至適PH、基質の安定性、反応効率な
どを考慮して決定すべきものであるが、通常、温
度35〜80℃、好ましくは40〜70℃、PH5.0〜9.0、
好ましくはPH6.0〜8.0の範囲である。なお、反応
中にPHが変動するときは、酸またはアルカリなど
を用いて好ましいPHに補正すればよい。また、例
示菌株に由来するヌクレオシドホスホリラーゼ含
有物を使用する際には、その至適温度はいずれも
40〜70℃付近であり、比較的高温で反応を行える
ので微生物汚染への対策を考慮する必要がないと
いう利点を有する。 反応時間は、反応基質の目的物への変換率を確
認しながら決定すればよいが、通常バツチ方式で
は15〜45時間程度、好ましくは24〜36時間程度反
応させればよく、カラム方式ではバツチ方式に準
じて適当な条件を設定して反応させればよい。 第一の方法による培養後、または第二の方法に
よる接触反応後、常法により菌体等を分離除去
し、3′−デオキシグアノシンの単離精製工程に供
する。 3′−デオキシグアノシンの単離精製は公知の方
法によればよく、たとえばイオン交換クロマトグ
ラフイー、吸着クロマトグラフイー、分配クロマ
トグラフイー、ゲル濾過など各種のクマトグラフ
イー、向流分配法、再結晶法などの一般的な分配
精製法を単独であるいは適宜に組合せて行えばよ
い。 以下、実施例をもつて本発明をより具体的に説
明するが、これらはいずれも実施の一態様を示す
ものであつて、本発明の範囲を制限するものでは
ない。 なお、各実施例において3′−デオキシグアノシ
ンの分析は高速液体クロマトグラフイーによつて
行つた。以下に示す装置および条件で分析する
と、3′−デオキシグアノシンは保持時間12.90分
付近に溶出され、検量線よりその量を算出でき
る。 また、3′−デオキシグアノシン生成率とは基質
である3′−デオキシリボース供与体に対する生成
した3′−デオキシグアノシンのモル比（％）であ
る。 装置：島津高速液体クロマトグラフLC−3A型
（(株)島津製作所製） カラム：ゾルバツクス（Sorbax）ODS、4.6mm×
230mm（島津デユポン社製） 溶出剤：５％アセトニトリルを含む20ｍＭトリス
塩酸緩衝液（PH7.5） 流速：１ml／分 カラム操作温度：室温 実施例 １ ２％粉末ブイヨンを含有する培地１を120℃、
15分間殺菌して冷却後、予め前培養したスタフイ
ロコツカス・アウレウスIAM1011の培養液50ml
を加え、28℃で20時間培養した。培養終了後、遠
心分離によつて集菌し、殺菌水を加えて100mlの
菌体懸濁液を調製した。 3′−デオキシアデノシン502.5mg、グアノシン
849.7mgおよびりん酸−カリウム272.0mgを加温溶
解後100ml（PH7.0）とした後、上記菌体懸濁液
100mlを加え、55℃で72時間反応した。反応後、
遠心分離によつて菌体を除去し、高速液体クロマ
トグラフイーで分析したところ3′−デオキシグア
ノシンの生成率は52.44％であつた。 菌体を除去した反応液を1000mlに稀釈（PH9.0）
後、陰イオン交換樹脂ダイヤイオンSA−11A（商
品名、三菱化成工業(株)製）（硼酸型）で処理し、
この通過水洗液を陽イオン交換樹脂ダイヤイオン
PK−216（商品名、三菱化成工業(株)製）（水素型）
に吸着後、溶出し、3′−デオキシグアノシンのフ
ラクシヨンを得た。このフラクシヨンを中和濃縮
後、冷却した。析出した粗結晶を熱水より再結し
て3′−デオキシグアノシンの結晶198.15mgを得
た。 実施例 ２ 各種のグアニン誘導体と3′−デオキシアデノシ
ンまたは3′−デオキシイノシンを基質とし、実施
例１と同一の菌体懸濁液を酵素源として使用し、
反応を行つた。 基質溶液として20ｍM3−デオキシリボース供
与体、30ｍＭグアニン誘導体および20ｍＭりん酸
一カリウムを含有する水溶液各１mlを使用し、こ
れに菌体懸濁液各１mlを加えて55℃、PH7.0で70
時間反応した。反応後、反応液を遠心分離して菌
体を除去し、3′−デオキシグアノシンの生成量を
測定し、生成率を算出して第１表に示した。 なお、第１表において各グアニン誘導体は次の
とおり略称する。 グアニン：Gua グアノシン：Guo グアノシン−5′−モノりん酸：GMP グアノシン−5′−ジりん酸：GDP グアノシン−5′−トリりん酸：GTP 2′−デオキシグアノシン：dGuo 2′−デオキシグアノシン−5′−モノりん酸：
dGMP
造法に関するものである。 3′−デオキシグアノシンは、癌治療において放
射線増感作用を示すだけはでなく、各種の抗癌剤
と併用すると、その抗腫瘍効果を増強する作用を
有し、現在注目を浴びている化合物である（特開
昭57−35516号公報参照）。 従来、3′−デオキシグアノシンの調整法として
は、２−アセトアミドヒポキサンチンの塩化水銀
塩と２，５−ジ−Ｏ−ベンゾイル−３−デオキシ
−Ｄ−リボフラノシルブロミドとを縮合させる方
法が知られている（ザ・ジヤーナル・オブ・オー
ガニツク・ケミストリー（J.Org.Chem.）、30、
2851（1965））。しかしながら、この方法は原料で
ある３−デオキシリボースの入手が困難であるこ
と、縮合反応時に異性体を生ずること、および有
害な水銀塩を使用しなければならないことなど、
工業的生産においては種々の難点を有している。 本発明者らは、先に3′−デオキシアデノシン
（コルジセピン）から化学的に合成された２−ア
ミノ−3′−デオキシアデノシンまたはそのN6位
置換誘導体のN6位のみをアデノシンデアミナー
ゼによつて選択的に脱アミノし、3′−デオキシグ
アノシンを製造する方法を開発した（特願昭56−
10473号参照）。この方法は、原料化合物のN6位
に酵素的に脱アミノするので従来の化学的合成法
に比較して選択性および収率の点で優れてはいる
が、原料化合物をコルジセピンから化学的に合成
しなければならず、収率および操作性に問題があ
る。 本発明者らは、これらの従来技術の欠点を克服
するために種々検討した結果、グアニン誘導体と
3′−デオキシリボース供与体とを、ヌクレオシド
ホスホリラーゼ活性を有する微生物の作用によつ
て反応させることによつて3′−デオキシグアノシ
ンが生成することを知見し、この知見に基づいて
本発明を完成した。 本発明は、一般式〔〕 〔式中、Ｒは水素原子またはリボース−１−イル
基、２−デオキシリボース−１−イル基もしくは
これらのモノりん酸エステル、ジりん酸エステ
ル、トリりん酸エステルを示す。〕で表わされる
グアニン誘導体の一種または二種以上と、３−デ
オキシリボース供与体の一種または二種以上と
を、キサントモナス属、ミクロコツカス属、スタ
フイロコツカス属またはサルシナ属に属し、ヌク
レオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の作
用によつて反応させて3′−デオキシグアノシンを
得ることを特徴とする3′−デオキシグアノシンの
製造法である。 以下、本発明を具体的に説明する。 原料のグアニン誘導体としては前記の定義に含
まれる化合物の一種または二種以上が使用される
が、具体的にはグアニン（Gua）またはグアノシ
ン（Guo）、2′−デオキシグアノシン（dGuo）も
しくはこれらのモノりん酸エステル、ジりん酸エ
ステル、トリりん酸エステルなどを挙げることで
きる。上記のヌクレオシドの各種りん酸エステル
は、糖残基における水酸基のいずれの位置がりん
酸エステル化されたものであつてもよい。これら
りん酸エステルの具体例としてはグアノシン−
5′−モノりん酸（GMP）、グアノシン−3′−モノ
りん酸、ギアノシン−2′−モノりん酸、グアノシ
ン−5′−ジりん酸（GDP）、グアノシン−5′−ト
リりん酸（GTP）、2′−デオキシグアノシン−
5′−モノりん酸（2′−dGMP）、2′−デオキシグア
ノシン−3′−モノりん酸、2′−デオキシグアノシ
ン−5′−ジりん酸（2′−dGDP）、2′−デオキシグ
アノシン−5′−トリりん酸（2′−dGTP）などの
遊離型もしくは適当な塩型、たとえばナトリウム
塩を挙げることができる。本発明の目的に特に好
適なグアニン誘導体はグアノシンまたはグアノシ
ン−5′−モノりん酸である。 他の原料である３−デオキシリボース供与体と
しては、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用によ
つて前記グアニン誘導体に対して3′−デオキシリ
ボースを供与しうるものが用いられる。このよう
な３−デオキシリボース供与体としてはグアニン
塩基を除くプリン塩基を有する3′−デオキシヌク
レオシド類もしくは３−デオキシリボース類が例
示され、さらに具体的には3′−デオキシアデノシ
ン（3′−dAdo；コルジセピン）、3′−デオキシイ
ノシン（3′−dIno）、3′−デオキシキサントシン、
３−デオキシリボースまたはこれらのモノりん酸
エステル、ジりん酸エステル、トリりん酸エステ
ルなどの一種または二種以上が使用される。上記
のりん酸エステルは３−デオキシリボースにおけ
る水酸基のいずれの位置がりん酸エステル化され
たものであつてもよく、遊離型、塩型のいずれで
あつてもよい。具体的には3′−デオキシアデノシ
ン−5′−モノりん酸（3′−dAMP）、3′−デオキシ
アデノシン−5′−ジりん酸、3′−デオキシアデノ
シン−5′−トリりん酸、3′−デオキシイノシン−
5′−モノりん酸（3′−dIMP、または３−デオキ
シリボース−１−りん酸などを例示することがで
きる。 本発明における反応の酵素源は、キサントモナ
ス（Xanthomonas；以下「X.」と略す。）属、
ミクロコツカス（Micrococcus；以下「M.」と
略す。）属、スタフイロコツカス
（Staphylococcus；以下「St.」と略す。）属また
はサルシナ（Sarcina；以下「Sa.」と略す。）属
に属し、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有す
る微生物である。なお、本発明において「ヌクレ
オシドホスホリラーゼ活性」とは前記グアニン誘
導体と前記３−デオキシリボース供与体とを反応
させて3′−デオキシグアノシンを与える単独の、
もしくは複数の酵素活性を総称するものである。
したがつて本発明においては前記の属に属し、グ
アニン誘導体と３−デオキシリボース供与体とか
ら3′−デオキシグアノシンを生成する作用を有す
る微生物である限り使用することができる。以
下、このような微生物の代表的菌株を例示する。 キサントナス・キヤンペストリス（X.
campestris） IAM1671、ATCC7381（微工研菌寄第
6782号） ミクロコツカス・ルテウス（M.luteus） ATCC4698、IAM1056 スタフイロコツカス・アウレウス（St.aureus） IAM1011、ATCC6538P スタフイロコツカス・アウレウス（St.aureus） IFO3060 スタフイロコツカス・エピデルミデイス（St.
epidermidis） IFO3762、ATCC155 サルシナ・マルギナータ FERM Ｐ−6539（微工研菌寄第6239号） また、前記の菌株から、紫外線、Ｘ線、γ線の
照射などの物理的処理もしくはニトロソグアニジ
ンなどによる薬剤処理など、一般的変異誘導法に
よる誘発突然変異または自然の原因に起因する自
然突然変異によつて誘導された変異株も、本発明
の目的に適したヌクレオシドホスホリラーゼ活性
を失わない限り、本発明に使用することができ
る。 さらに、以上のような本発明に好適に使用され
る菌株の本発明の目的に適したヌクレオシドホス
ホリラーゼの遺伝子が、キサントモナス属、ミク
ロコツカス属、スタフイロコツカス属、またはサ
ルシナ属以外の微生物に取り込まれ、そのような
形質が発現するに至つた場合、このような微生物
の培養物、培養菌体またはその処理物を本発明の
目的に使用する方法は、本発明に包含される。 これらの微生物の培養に際し、使用される培地
および培養法は、これらの微生物が生育する限
り、特に限定されない。 培地としてはこれらの微生物が資化可能な炭素
源および窒素源を適当量含有し、必要に応じて無
機塩、微量発育促進物質、消泡剤などを添加した
ものが使用さいる。具体的には、炭素源として
は、グルコース、フラクトース、マルトース、ガ
ラクトース、リボース、サツカロース、澱粉、澱
粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類もしくは
その脂肪酸エステルなどの誘導体、麦、〓、米な
どの天然炭水化物、グリセロール、マンニトー
ル、メタノール、エタノールなどのアルコール
類、グルコン酸、ピルビン酸、酢酸、クエン酸な
どの脂肪酸類、ノルマルパラフイン、ケロシンな
どの炭化水素類、グリシン、グルタミン酸、グル
タミン、アラニン、アスパラギンなどのアミノ酸
類など、一般的な炭素源より使用する微生物の資
化性を考慮して一種または二種以上を適宜に選択
して使用すればよい。窒素源としては、肉エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、大豆加水
分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カザミノ酸、
各種アミノ酸、コーンステイープリカー、コツト
ンシードミールないしその加水分解物、フイツシ
ユミールないしその加水分解物、その他の動物、
植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合
物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの
アンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、
尿素など無機窒素化合物より使用微生物の資化性
を考慮し、一種または二種以上を適宜に選択して
使用する。さらに、無機塩として微量のマグネシ
ウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カ
ルシウム、カリウムなどのりん酸塩、塩酸塩、硫
酸塩、炭酸塩、硝酸塩、酢酸塩などの一種または
二種以上を適宜添加し、必要に応じて植物油、界
面活性剤などの消泡剤、ビタンミンB1、B2、ニ
コチン酸、パントテン酸、ビオチン、ｐ−アミノ
安息香酸などの微量発育促進物質を添加してもよ
い。また、栄養要求を同時に示す微生物を使用す
る場合、当然その生育を満足させる物質を培地に
添加しなければならない。 培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で
振盪培養、通気撹拌培養、静置培養、連続培養な
どの通常の培養法より使用微生物に適した培養法
を選択して行う。 培養条件は、使用微生物および培地の種類によ
り適宜選択すればよいが、通常は培養開始のPHを
約６〜８に調整し、約25〜35℃の温度条件下で培
養を行う。培養期間は使用微生物の生育に十分な
時間であればよく、通常１〜３日間である。 本発明においてグアニン誘導体および３−デオ
キシリボース供与体に前記微生物を作用させる方
法としては、以下の方法を採用することができ
る。 第一の方法は、前記微生物の培養に際し、グア
ニン誘導体および３−デオキシリボース供与体を
培地に存在させ、培地中に3′−デオキシグアノシ
ンを蓄積させる方法である。 上記の方法はグアニン誘導体および３−デオキ
シリボース供与体の必要量を培養前に培地に添加
して微生物を培養するか、あるいはこれらの物質
を培養中の適宜の時期に一度に添加し、または断
続的もしくは連続的に添加しながら培養すること
によつて行われる。 第二の方法は、前記微生物をその生育条件下で
培養して得られた培養物、培養物から遠心分離、
沈降分離、凝集分離などの通常の方法によつて集
菌した生菌体、または生菌体に適宜な処理を施し
て得られる菌体処理物（以下、これらを「菌体
等」と総称することもある。）を、少なくともグ
アニン誘導体および３−デオキシリボース供与体
を含有する水性媒体と3′−デオキシグアノシンが
生成する条件下で接触させることによつて行なわ
れる。 ここで、培養物と培養後の培地と培養菌体が未
分離の状態のものをいう。また、菌体処理物と
は、乾燥菌体、細胞膜・壁変性菌体、破砕菌体、
固定化菌体、菌体抽出物、ヌクレオシドホスホリ
ラーゼ活性を有する菌体抽出物の蛋白質画分もし
くはその精製物、蛋白質画分もしくはその精製物
の固定化物などを指称する菌体処理物を得るため
の方法を以下に例示する。すなわち、生菌体に
対し、たとえば凍結融解処理、凍結乾燥処理、通
風乾燥処理、アセトン乾燥処理、酸性ないしアル
カリ性下における加温処理、磨砕処理、超音波処
理、浸透圧処理などの物理的処理手段、もしくは
たとえば、リゾチーム、細胞壁溶解酵素などの酵
素処理、トルエン、キシレン、ブチルアルコール
などの溶媒もしくは界面活性剤との接触処理など
の化学的ないし生物化学的処理を単独もしくは組
合せて施す方法、菌体抽出物に対し、たとえば
塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、
各種クロマトグラフ処理、透析処理などの酵素分
離精製手段を単独もしくは組合せて施す方法、
生菌体、菌体抽出物もしくはその精製物に包括処
理、架橋処理、担体への結合処理（共有結合、イ
オン結合、物理的吸着などによる。）などの酵素
固定化手段を施す方法などによる菌体処理物を得
ることができる。 グアニン誘導体および３−デオキシリボース供
与体を溶解もしくは懸濁させるための水性媒体
は、水または酵素反応に好適な各種緩衝液（りん
酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ベロナー
ル−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液など）であ
り、りん酸イオン供与源を含有し、必要に応じて
諸物質を含有していてもよい。 りん酸イオン供与源としては、水性媒体中でり
ん酸イオンに解離しうるもののいずれを用いても
よく、たとえば遊離型りん酸そのもの、無機りん
酸塩、たとえばナトリウム、カリウムなどのアル
カリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアル
カリ土類金属、アンモニウムとの塩が好適に使用
される。これらのりん酸供与源はりん酸イオンと
してグアニン誘導体の約1.0〜2.5倍モルになるよ
うに使用すればよい。 なお、反応基質のグアニン誘導体および／また
は３−デオキシリボース供与体としてりん酸エス
テル体のものを用い、かつ反応系にホスフアター
ゼ活性を有する場合には、特に他のりん酸供与源
を添加する必要はない。りん酸イオン供与源のほ
か、グルコース、サツカロースなどの糖類、メタ
ノール、エタノール、プロパノール、ブタノー
ル、ベンタノール、トルエン、キシレン、酢酸エ
チル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチ
ルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの有
機溶媒、各種界面活性剤、金属塩類などを反応に
際して水性媒体中に存在させてもよい。 菌体等とグアニン誘導体および３−デオキシリ
ボース供与体とを、水性媒体中で接触させる方法
としては、これらの反応基質を含有する水性媒体
に菌体等を懸濁ないし溶解させ、必要に応じて撹
拌もしくは振盪する方法、菌体等の懸濁液もしく
は溶解液に各反応基質のいずれか、もしくは両方
を連続的もしくは断続的に添加する方法、または
菌体等を必要に応じて適当な助剤を混和してカラ
ムに充填し、反応基質を含有する水性媒体を通液
する方法などが適用される。 反応に際し、基質濃度は特に制限されないが、
いずれの反応基質も５〜50ｍＭの範囲で通常使用
され、グアニン誘導体については15〜35ｍＭ程度
が、３−デオキシリボース供与体についても15〜
30ｍＭ程度が好適である。また、菌体等の使用量
は反応基質の濃度、反応効率、経済性などを考慮
し、当業者が容易に決定できる。 反応条件は、特に限定されるものではなく、菌
体等に含まれるヌクレオシドホスホリラーゼの至
適温度および至適PH、基質の安定性、反応効率な
どを考慮して決定すべきものであるが、通常、温
度35〜80℃、好ましくは40〜70℃、PH5.0〜9.0、
好ましくはPH6.0〜8.0の範囲である。なお、反応
中にPHが変動するときは、酸またはアルカリなど
を用いて好ましいPHに補正すればよい。また、例
示菌株に由来するヌクレオシドホスホリラーゼ含
有物を使用する際には、その至適温度はいずれも
40〜70℃付近であり、比較的高温で反応を行える
ので微生物汚染への対策を考慮する必要がないと
いう利点を有する。 反応時間は、反応基質の目的物への変換率を確
認しながら決定すればよいが、通常バツチ方式で
は15〜45時間程度、好ましくは24〜36時間程度反
応させればよく、カラム方式ではバツチ方式に準
じて適当な条件を設定して反応させればよい。 第一の方法による培養後、または第二の方法に
よる接触反応後、常法により菌体等を分離除去
し、3′−デオキシグアノシンの単離精製工程に供
する。 3′−デオキシグアノシンの単離精製は公知の方
法によればよく、たとえばイオン交換クロマトグ
ラフイー、吸着クロマトグラフイー、分配クロマ
トグラフイー、ゲル濾過など各種のクマトグラフ
イー、向流分配法、再結晶法などの一般的な分配
精製法を単独であるいは適宜に組合せて行えばよ
い。 以下、実施例をもつて本発明をより具体的に説
明するが、これらはいずれも実施の一態様を示す
ものであつて、本発明の範囲を制限するものでは
ない。 なお、各実施例において3′−デオキシグアノシ
ンの分析は高速液体クロマトグラフイーによつて
行つた。以下に示す装置および条件で分析する
と、3′−デオキシグアノシンは保持時間12.90分
付近に溶出され、検量線よりその量を算出でき
る。 また、3′−デオキシグアノシン生成率とは基質
である3′−デオキシリボース供与体に対する生成
した3′−デオキシグアノシンのモル比（％）であ
る。 装置：島津高速液体クロマトグラフLC−3A型
（(株)島津製作所製） カラム：ゾルバツクス（Sorbax）ODS、4.6mm×
230mm（島津デユポン社製） 溶出剤：５％アセトニトリルを含む20ｍＭトリス
塩酸緩衝液（PH7.5） 流速：１ml／分 カラム操作温度：室温 実施例 １ ２％粉末ブイヨンを含有する培地１を120℃、
15分間殺菌して冷却後、予め前培養したスタフイ
ロコツカス・アウレウスIAM1011の培養液50ml
を加え、28℃で20時間培養した。培養終了後、遠
心分離によつて集菌し、殺菌水を加えて100mlの
菌体懸濁液を調製した。 3′−デオキシアデノシン502.5mg、グアノシン
849.7mgおよびりん酸−カリウム272.0mgを加温溶
解後100ml（PH7.0）とした後、上記菌体懸濁液
100mlを加え、55℃で72時間反応した。反応後、
遠心分離によつて菌体を除去し、高速液体クロマ
トグラフイーで分析したところ3′−デオキシグア
ノシンの生成率は52.44％であつた。 菌体を除去した反応液を1000mlに稀釈（PH9.0）
後、陰イオン交換樹脂ダイヤイオンSA−11A（商
品名、三菱化成工業(株)製）（硼酸型）で処理し、
この通過水洗液を陽イオン交換樹脂ダイヤイオン
PK−216（商品名、三菱化成工業(株)製）（水素型）
に吸着後、溶出し、3′−デオキシグアノシンのフ
ラクシヨンを得た。このフラクシヨンを中和濃縮
後、冷却した。析出した粗結晶を熱水より再結し
て3′−デオキシグアノシンの結晶198.15mgを得
た。 実施例 ２ 各種のグアニン誘導体と3′−デオキシアデノシ
ンまたは3′−デオキシイノシンを基質とし、実施
例１と同一の菌体懸濁液を酵素源として使用し、
反応を行つた。 基質溶液として20ｍM3−デオキシリボース供
与体、30ｍＭグアニン誘導体および20ｍＭりん酸
一カリウムを含有する水溶液各１mlを使用し、こ
れに菌体懸濁液各１mlを加えて55℃、PH7.0で70
時間反応した。反応後、反応液を遠心分離して菌
体を除去し、3′−デオキシグアノシンの生成量を
測定し、生成率を算出して第１表に示した。 なお、第１表において各グアニン誘導体は次の
とおり略称する。 グアニン：Gua グアノシン：Guo グアノシン−5′−モノりん酸：GMP グアノシン−5′−ジりん酸：GDP グアノシン−5′−トリりん酸：GTP 2′−デオキシグアノシン：dGuo 2′−デオキシグアノシン−5′−モノりん酸：
dGMP
【表】
実施例 ３
第２表に示す各種の微生物を実施例１と同様に
培養し、培養菌体を集菌し、実施例１と同様の菌
体懸濁液を得た。 基質溶液として20ｍM3′−デオキシアデノシ
ン、30ｍＭグアノシン−5′−モノりん酸および４
ｍＭりん酸一カリウムを含有する水溶液各１mlを
使用し、これに前記の菌体懸濁液各１mlを加え、
60℃、PH7.0で20時間反応した。3′−デオキシグ
アノシン生成率を前記と同様に算出し、第２表に
示す。
培養し、培養菌体を集菌し、実施例１と同様の菌
体懸濁液を得た。 基質溶液として20ｍM3′−デオキシアデノシ
ン、30ｍＭグアノシン−5′−モノりん酸および４
ｍＭりん酸一カリウムを含有する水溶液各１mlを
使用し、これに前記の菌体懸濁液各１mlを加え、
60℃、PH7.0で20時間反応した。3′−デオキシグ
アノシン生成率を前記と同様に算出し、第２表に
示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式〔〕 〔式中、Ｒは水素原子またはリボース−１−イル
基、２−デオキシリボース−１−イル基もしくは
これらのモノりん酸エステル、ジりん酸エステ
ル、トリりん酸エステルを示す。〕で表わされる
グアニン誘導体の一種または二種以上と、３−デ
オキシリボース供与体の一種または二種以上と
を、キサントモナス属、ミクロコツカス属、スタ
フイロコツカス属またはサルシナ属に属し、ヌク
レオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の作
用によつて反応させて3′−デオキシグアノシンを
得ることを特徴とする3′−デオキシグアノシンの
製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57194394A JPS5985298A (ja) | 1982-11-04 | 1982-11-04 | ３′−デオキシグアノシンの製造法 |
| DE8888100254T DE3382322D1 (de) | 1982-04-01 | 1983-03-29 | Phosphorylase produzierender mikroorganismus. |
| US06/479,980 US4594320A (en) | 1982-11-04 | 1983-03-29 | Process for producing 3-deoxyguanosine |
| EP88100254A EP0275065B1 (en) | 1982-04-01 | 1983-03-29 | New phosphorylase producing microorganism |
| EP83103128A EP0090417B1 (en) | 1982-04-01 | 1983-03-29 | Process for producing 3'-deoxyguanosine |
| DE8383103128T DE3379274D1 (en) | 1982-04-01 | 1983-03-29 | Process for producing 3'-deoxyguanosine |
| CA000425108A CA1189468A (en) | 1982-04-01 | 1983-03-31 | Process for producing 3'-deoxyguanosine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57194394A JPS5985298A (ja) | 1982-11-04 | 1982-11-04 | ３′−デオキシグアノシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5985298A JPS5985298A (ja) | 1984-05-17 |
| JPH0422559B2 true JPH0422559B2 (ja) | 1992-04-17 |
Family
ID=16323860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57194394A Granted JPS5985298A (ja) | 1982-04-01 | 1982-11-04 | ３′−デオキシグアノシンの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4594320A (ja) |
| JP (1) | JPS5985298A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| DE4020529A1 (de) * | 1989-09-12 | 1991-03-21 | Roxana Vasiloiu | Multifunktionelle(s) enzym(e) mit nucleosid-didesoxyribosyltransferase(n) und/oder nucleoside-desoxyribosyltransferasen(n) und/oder kinease- und/oder reduktase- und/oder desaminase- und/oder polymerase-aktivitaet |
| US5679648A (en) * | 1994-11-30 | 1997-10-21 | The University Hospital | Methods for the treatment and prevention of fungal infections by administration of 3'-deoxypurine nucleosides |
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| US7745125B2 (en) * | 2004-06-28 | 2010-06-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | 2′-terminator related pyrophosphorolysis activated polymerization |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3269917A (en) * | 1963-03-18 | 1966-08-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Process for producing purine-nucleosides |
| CA989341A (en) * | 1971-02-26 | 1976-05-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co. | Process for producing ribosides of heterocyclic organic bases by fermentation |
| US4381344A (en) * | 1980-04-25 | 1983-04-26 | Burroughs Wellcome Co. | Process for producing deoxyribosides using bacterial phosphorylase |
-
1982
- 1982-11-04 JP JP57194394A patent/JPS5985298A/ja active Granted
-
1983
- 1983-03-29 US US06/479,980 patent/US4594320A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4594320A (en) | 1986-06-10 |
| JPS5985298A (ja) | 1984-05-17 |
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