JPH04228082A - ストレプトミセスでの調節された遺伝子発現 - Google Patents
ストレプトミセスでの調節された遺伝子発現Info
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- JPH04228082A JPH04228082A JP3108461A JP10846191A JPH04228082A JP H04228082 A JPH04228082 A JP H04228082A JP 3108461 A JP3108461 A JP 3108461A JP 10846191 A JP10846191 A JP 10846191A JP H04228082 A JPH04228082 A JP H04228082A
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- kora
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本発明は、ストレプトミセスにおける調節
された遺伝子発現に関する。
された遺伝子発現に関する。
【０００２】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）は最も重要な抗生物質産生菌の仲間であるが
、遺伝学に関しては余りよく知られていない。したがっ
て、ストレプトミセスにおける遺伝子発現を制御する機
構については余りよく知られていない。
ｅｔｅｓ）は最も重要な抗生物質産生菌の仲間であるが
、遺伝学に関しては余りよく知られていない。したがっ
て、ストレプトミセスにおける遺伝子発現を制御する機
構については余りよく知られていない。
【０００３】チオストレプトンによる誘導発現は知られ
ているが、これは高価であり且つ水への溶解度が低いた
め工業的規模で実際に使用するには不適当である。
ているが、これは高価であり且つ水への溶解度が低いた
め工業的規模で実際に使用するには不適当である。
【０００４】プラスミドｐＩＪ１０１からそれ自体知ら
れているｋｉｌ−ｋｏｒ 系がストレプトミセスでの調
節された遺伝子発現に利用することができることを見出
した。この系はＫｅｎｄａｌｌ とＣｏｈｅｎ のＪ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６９ （１９８７），
４１７７−４１８３；１７０ （１９８８）， ４６３
４−４６５１ に記載されており、プラスミドｐＩＪ１
０１の完全なヌクレオチド配列は前記の第二の文献に記
載されている。以後、この配列について説明する。特に
、ｋｉｌＡ遺伝子の調節領域は本発明による方法に特に
好適であることが見出された。
れているｋｉｌ−ｋｏｒ 系がストレプトミセスでの調
節された遺伝子発現に利用することができることを見出
した。この系はＫｅｎｄａｌｌ とＣｏｈｅｎ のＪ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １６９ （１９８７），
４１７７−４１８３；１７０ （１９８８）， ４６３
４−４６５１ に記載されており、プラスミドｐＩＪ１
０１の完全なヌクレオチド配列は前記の第二の文献に記
載されている。以後、この配列について説明する。特に
、ｋｉｌＡ遺伝子の調節領域は本発明による方法に特に
好適であることが見出された。
【０００５】したがって、本発明はｋｉｌＡ−ｋｏｒＡ
系をスイッチとして用いるストレプトミセス宿主菌株
における遺伝子の調節された発現の方法であって、発現
される遺伝子がｋｉｌＡ調節領域に結合し、ＫｏｒＡタ
ン白質が不活性化されまたは除去されてスイッチが入る
ことを特徴とする方法に関する。この発明の更なる発展
および好ましい態様は以下に詳細に説明され、特許請求
の範囲に定義されている。
系をスイッチとして用いるストレプトミセス宿主菌株
における遺伝子の調節された発現の方法であって、発現
される遺伝子がｋｉｌＡ調節領域に結合し、ＫｏｒＡタ
ン白質が不活性化されまたは除去されてスイッチが入る
ことを特徴とする方法に関する。この発明の更なる発展
および好ましい態様は以下に詳細に説明され、特許請求
の範囲に定義されている。
【０００６】本発明による「スイッチ」の一部はｋｉｌ
Ａ遺伝子の調節領域に存在し、ＫｏｒＡタン白質の付着
または結合によって発現され且つ好都合ではあるが必ず
しもｋｉｌＡ遺伝子のプロモーターを包含しないＤＮＡ
領域を意味する。この領域は、（ヌクレオチド番号６１
６０から出発する）酵素ＢｇｌＩＩ または（ヌクレオ
チド番号６０２７から出発する）ＨｉｎｆＩ および（
ヌクレオチド番号５７６４から出発する）ＮｃｏＩの開
裂部位によって天然のＤＮＡ配列に結合され、最後に記
載の開裂部位はＫｉｌＡタン白質（そこではｔｒａ と
呼ばれる）のＡＴＧ開始コドンも包含する。ｋｉｌＡプ
ロモーターの−３５ 領域のＤＮＡ配列ＴＴＧＡＣＡは
ヌクレオチド番号５９７５から始まり、転写はヌクレオ
チド番号５９３９から始まる。これらのデーターを知る
ことによって、調節領域についてのより短いまたは修飾
されたＤＮＡセグメントを用いることおよび適当な場合
には他のプロモーターを用いることが可能である。
Ａ遺伝子の調節領域に存在し、ＫｏｒＡタン白質の付着
または結合によって発現され且つ好都合ではあるが必ず
しもｋｉｌＡ遺伝子のプロモーターを包含しないＤＮＡ
領域を意味する。この領域は、（ヌクレオチド番号６１
６０から出発する）酵素ＢｇｌＩＩ または（ヌクレオ
チド番号６０２７から出発する）ＨｉｎｆＩ および（
ヌクレオチド番号５７６４から出発する）ＮｃｏＩの開
裂部位によって天然のＤＮＡ配列に結合され、最後に記
載の開裂部位はＫｉｌＡタン白質（そこではｔｒａ と
呼ばれる）のＡＴＧ開始コドンも包含する。ｋｉｌＡプ
ロモーターの−３５ 領域のＤＮＡ配列ＴＴＧＡＣＡは
ヌクレオチド番号５９７５から始まり、転写はヌクレオ
チド番号５９３９から始まる。これらのデーターを知る
ことによって、調節領域についてのより短いまたは修飾
されたＤＮＡセグメントを用いることおよび適当な場合
には他のプロモーターを用いることが可能である。
【０００７】調節された方法で発現される遺伝子は、Ｎ
ｃｏＩ開裂部位に対応する突出配列に直接連結すること
ができる。ＮｃｏＩ開裂部位は、開始後の最初のコドン
がＧ で始まるときに保持することができる。
ｃｏＩ開裂部位に対応する突出配列に直接連結すること
ができる。ＮｃｏＩ開裂部位は、開始後の最初のコドン
がＧ で始まるときに保持することができる。
【０００８】本発明による「スイッチ」の第二の本質的
な成分はＫｏｒＡタン白質であって、これはｋｉｌＡ遺
伝子のリプレッサーとして働く。適当量の活性ＫｏｒＡ
タン白質が存在するかぎり、必要とされる遺伝子の調節
された発現はスイッチが切れている。したがって、スイ
ッチを入れるには、原則として２つの可能性がある。ａ
）ＫｏｒＡタン白質を不活性化する、またはｂ）これを
除去する。
な成分はＫｏｒＡタン白質であって、これはｋｉｌＡ遺
伝子のリプレッサーとして働く。適当量の活性ＫｏｒＡ
タン白質が存在するかぎり、必要とされる遺伝子の調節
された発現はスイッチが切れている。したがって、スイ
ッチを入れるには、原則として２つの可能性がある。ａ
）ＫｏｒＡタン白質を不活性化する、またはｂ）これを
除去する。
【０００９】ＫｏｒＡタン白質はこのタン白質の温度感
受性変異体を発現させることによって不活性化すること
ができ、必要な遺伝子にスイッチを入れるために、温度
を閾値を上回る値に上昇させこの閾値を上回る温度では
温度感受性変異体が不活性化され、すなわちｋｉｌＡ遺
伝子の調節領域の抑制には最早不適当となる用にするこ
とによって不活性化することができる。このような温度
感受性変異体の調製は知られており、例えばＢｉｒｃｈ
らのＪ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３
１ （１９８５）， １２９９−１３０３ に記載され
ている。この種類の突然変異は高収率で起こり、生成す
る温度感受性タン白質は本発明の範囲内の適当な分析法
を用いて容易に見出される。
受性変異体を発現させることによって不活性化すること
ができ、必要な遺伝子にスイッチを入れるために、温度
を閾値を上回る値に上昇させこの閾値を上回る温度では
温度感受性変異体が不活性化され、すなわちｋｉｌＡ遺
伝子の調節領域の抑制には最早不適当となる用にするこ
とによって不活性化することができる。このような温度
感受性変異体の調製は知られており、例えばＢｉｒｃｈ
らのＪ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３
１ （１９８５）， １２９９−１３０３ に記載され
ている。この種類の突然変異は高収率で起こり、生成す
る温度感受性タン白質は本発明の範囲内の適当な分析法
を用いて容易に見出される。
【００１０】ＫｏｒＡタン白質はいくつかの方法によっ
て除去することができる。
て除去することができる。
【００１１】ｋｏｒＡ遺伝子をスイッチ可能なプロモー
ターの制御下に置くことが可能である。リジンデカルボ
キシラーゼに対するｍＲＮＡの転写は鉄（ＩＩＩ） 塩
化物を培養物に加えることによって発現することが知ら
れている（Ｓｃｈｕｐｐら、Ｇｅｎｅ， ６４ （１９
８８），１７９−１８８）。しかしながら、工業的醗酵
バッチに重金属イオンを添加することは、例えばそれに
関連して腐蝕の危険性があるため不利であることがある
。
ターの制御下に置くことが可能である。リジンデカルボ
キシラーゼに対するｍＲＮＡの転写は鉄（ＩＩＩ） 塩
化物を培養物に加えることによって発現することが知ら
れている（Ｓｃｈｕｐｐら、Ｇｅｎｅ， ６４ （１９
８８），１７９−１８８）。しかしながら、工業的醗酵
バッチに重金属イオンを添加することは、例えばそれに
関連して腐蝕の危険性があるため不利であることがある
。
【００１２】ｋｏｒＡ遺伝子を温度感受性プラスミドに
組込むのが一層有利であり、この場合にはそれ自身のプ
ロモーターまたはストレプトミセス中で活性な他のプロ
モーターを用いることができる。ストレプトミセス中で
複製する温度感受性プラスミドは既知であり、例えばＢ
ｉｒｃｈ らによって報告されている。しかしながら、
プラスミドｐＳＧ５の温度感受性レプリコンを用いるプ
ラスミドが特に有利である。このプラスミドは、欧州特
許第０ １５８ ８７２ 号公報および米国特許第４
８８０ ７４６ 号公報に記載されており、ｐＳＧ５の
温度感受性プラスミドとしての使用は欧州特許第０ ３
３４ ２８２ 号公開公報に記載されている。プラスミ
ドｐＳＧ５は広い宿主範囲を有し、多くの他のストレプ
トミセスプラスミドと適合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）
である。欧州特許第０ １５８ ２０１ 号公報には、
これらの特性を用いるシャトルベクターが記載されてい
る。
組込むのが一層有利であり、この場合にはそれ自身のプ
ロモーターまたはストレプトミセス中で活性な他のプロ
モーターを用いることができる。ストレプトミセス中で
複製する温度感受性プラスミドは既知であり、例えばＢ
ｉｒｃｈ らによって報告されている。しかしながら、
プラスミドｐＳＧ５の温度感受性レプリコンを用いるプ
ラスミドが特に有利である。このプラスミドは、欧州特
許第０ １５８ ８７２ 号公報および米国特許第４
８８０ ７４６ 号公報に記載されており、ｐＳＧ５の
温度感受性プラスミドとしての使用は欧州特許第０ ３
３４ ２８２ 号公開公報に記載されている。プラスミ
ドｐＳＧ５は広い宿主範囲を有し、多くの他のストレプ
トミセスプラスミドと適合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）
である。欧州特許第０ １５８ ２０１ 号公報には、
これらの特性を用いるシャトルベクターが記載されてい
る。
【００１３】それ故、本発明によれば、ｋｏｒＡ遺伝子
をｐＳＧ５の温度感受性レプリコンを含むプラスミドに
組み入れることが可能であり且つ特に有利であり、その
場合には発現される遺伝子はｋｉｌＡ調節領域の制御下
で、ｐＳＧ５誘導体と適合性であり且つｐＳＧ５レプリ
コンの閾値温度を上回る温度でも安定な複製を行うもう
一つのプラスミドに組み入れられる。
をｐＳＧ５の温度感受性レプリコンを含むプラスミドに
組み入れることが可能であり且つ特に有利であり、その
場合には発現される遺伝子はｋｉｌＡ調節領域の制御下
で、ｐＳＧ５誘導体と適合性であり且つｐＳＧ５レプリ
コンの閾値温度を上回る温度でも安定な複製を行うもう
一つのプラスミドに組み入れられる。
【００１４】ｋｏｒＡ遺伝子はプラスミドｐＩＪ１０１
からのＡｈａＩＩ−ＢｃｌＩフラグメントとして用いる
のが好都合である（ＡｈａＩＩ についての認識配列は
ヌクレオチド５９３０から開始し、ＢｃｌＩの認識配列
は６７５３から開始し、ｋｏｒＡプロモーターの−３５
領域のＣＧＣＡＣＡ配列はヌクレオチド５９５７から
開始し、転写はヌクレオチド番号５９９２から開始する
）。
からのＡｈａＩＩ−ＢｃｌＩフラグメントとして用いる
のが好都合である（ＡｈａＩＩ についての認識配列は
ヌクレオチド５９３０から開始し、ＢｃｌＩの認識配列
は６７５３から開始し、ｋｏｒＡプロモーターの−３５
領域のＣＧＣＡＣＡ配列はヌクレオチド５９５７から
開始し、転写はヌクレオチド番号５９９２から開始する
）。
【００１５】２種類の異なるプラスミドでの手順を用い
るときには、両方のプラスミドがシャトルベクターであ
ることが可能であるが、必ずしも必要ではない。しかし
ながら、これら２種類のプラスミドがいかなる相同の領
域を含まず、組換工程を妨げないように留意しなければ
ならない。
るときには、両方のプラスミドがシャトルベクターであ
ることが可能であるが、必ずしも必要ではない。しかし
ながら、これら２種類のプラスミドがいかなる相同の領
域を含まず、組換工程を妨げないように留意しなければ
ならない。
【００１６】発現される遺伝子はＫｉｌＡ調節領域の制
御下で通常のストレプトミセス発現プラスミド上に収容
することができる。本発明の有利な展開は、必要とされ
るタン白質をコードし、例えばプロインシュリンをコー
ドする遺伝子をα−アミラーゼインヒビターテンダミス
タット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）の遺伝子またはこの
遺伝子の一部に結合することを含んでいる。これによっ
てコードされる融合タン白質は細胞から放出され、醗酵
上澄液から直接的に得ることができる。この種類の遺伝
子融合は、例えば欧州特許第０ ２８１ ０９０号公開
公報および第０ ２８９ ９３６ 号公開公報に記載さ
れており、この欧州特許第０ ２８９ ９３６ 号公開
公報にはプロインシュリンを含む融合タン白質をコード
する発現プラスミドのいくつかの例が含まれている。
御下で通常のストレプトミセス発現プラスミド上に収容
することができる。本発明の有利な展開は、必要とされ
るタン白質をコードし、例えばプロインシュリンをコー
ドする遺伝子をα−アミラーゼインヒビターテンダミス
タット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）の遺伝子またはこの
遺伝子の一部に結合することを含んでいる。これによっ
てコードされる融合タン白質は細胞から放出され、醗酵
上澄液から直接的に得ることができる。この種類の遺伝
子融合は、例えば欧州特許第０ ２８１ ０９０号公開
公報および第０ ２８９ ９３６ 号公開公報に記載さ
れており、この欧州特許第０ ２８９ ９３６ 号公開
公報にはプロインシュリンを含む融合タン白質をコード
する発現プラスミドのいくつかの例が含まれている。
【００１７】本発明を下記の例で詳細に説明する。
【００１８】
【実施例】例１
ベクターｐＫＯＲＥ２の構築
（ザ・ジョン・インズ・ファンデーション（ｔｈｅ Ｊ
ｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ） 、ノリ
ッジ、英国から入手可能な）プラスミドｐＩＪ１０１を
ＡｈａＩＩ およびＢｃｌＩで消化し、大きさが８３０
ｂｐのフラグメントを単離する。プラスミドｐＳＧ５
（欧州特許第０ １５８ ８７２ 号公報および米国特
許第４ ８８０ ７４６ 号公報）から大きさが３．８
ｋｂｐ のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ フラグメントを
単離し、ＢａｍＨＩ−ＡｈａＩＩ リンカーを提供する
。市販のプラスミドｐＵＣ１９ を酵素ＥｃｏＲＩ お
よびＨｉｎｄＩＩＩ で消化し、ｂｌａ 遺伝子を含む
大きなフラグメントを単離する。 ストレプトミセス中で選択可能なマーカーを導入するた
め、大きさが１．８５ ｋｂｐでありトランスポゾンＴ
ｎ５からのａｐｈＩＩ 遺伝子を有するＨｉｎｄＩＩＩ
−ＢａｍＨＩ フラグメントを用いる。これらのＤＮＡ
フラグメントを連結すると、大きさが９．２ ｋｂｐ
のプラスミドｐＫＯＲＥ２を生じる（図１）。 これはプラスミドｐＳＧ５からの温度感受性レプリコン
を含み、したがって、３４℃を下回る温度でのみ安定な
複製を行う。対照的に、３６℃を上回る温度では、プラ
スミドの複製は阻害され、プラスミドは細胞から除去さ
れる。ｐＳＧ５レプリコンの広い宿主範囲および例えば
プラスミドｐＳＶＨ１ （欧州特許第００７０ ５２２
号公報、米国特許第４ ６７３ ６４２ 号公報）、
ｐＳＧ２（欧州特許第０ ０６６ ７０１ 号公報、米
国特許第４ ６２１ ０６１ 号公報）、ｐＩＪ１０１
（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．
， １８５ （１９８２）， ２２３−２３８ ）およ
びＳＬＰ１．２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｇｅｎｅ， ２
０ （１９８２）， ５１−６２）に基づく多くの他の
ベクター系との適合性のため、プラスミドｐＫＯＲＥ２
を必要なタン白質をコードする多くのプラスミドと結合
することができる。
ｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ） 、ノリ
ッジ、英国から入手可能な）プラスミドｐＩＪ１０１を
ＡｈａＩＩ およびＢｃｌＩで消化し、大きさが８３０
ｂｐのフラグメントを単離する。プラスミドｐＳＧ５
（欧州特許第０ １５８ ８７２ 号公報および米国特
許第４ ８８０ ７４６ 号公報）から大きさが３．８
ｋｂｐ のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ フラグメントを
単離し、ＢａｍＨＩ−ＡｈａＩＩ リンカーを提供する
。市販のプラスミドｐＵＣ１９ を酵素ＥｃｏＲＩ お
よびＨｉｎｄＩＩＩ で消化し、ｂｌａ 遺伝子を含む
大きなフラグメントを単離する。 ストレプトミセス中で選択可能なマーカーを導入するた
め、大きさが１．８５ ｋｂｐでありトランスポゾンＴ
ｎ５からのａｐｈＩＩ 遺伝子を有するＨｉｎｄＩＩＩ
−ＢａｍＨＩ フラグメントを用いる。これらのＤＮＡ
フラグメントを連結すると、大きさが９．２ ｋｂｐ
のプラスミドｐＫＯＲＥ２を生じる（図１）。 これはプラスミドｐＳＧ５からの温度感受性レプリコン
を含み、したがって、３４℃を下回る温度でのみ安定な
複製を行う。対照的に、３６℃を上回る温度では、プラ
スミドの複製は阻害され、プラスミドは細胞から除去さ
れる。ｐＳＧ５レプリコンの広い宿主範囲および例えば
プラスミドｐＳＶＨ１ （欧州特許第００７０ ５２２
号公報、米国特許第４ ６７３ ６４２ 号公報）、
ｐＳＧ２（欧州特許第０ ０６６ ７０１ 号公報、米
国特許第４ ６２１ ０６１ 号公報）、ｐＩＪ１０１
（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．
， １８５ （１９８２）， ２２３−２３８ ）およ
びＳＬＰ１．２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｇｅｎｅ， ２
０ （１９８２）， ５１−６２）に基づく多くの他の
ベクター系との適合性のため、プラスミドｐＫＯＲＥ２
を必要なタン白質をコードする多くのプラスミドと結合
することができる。
【００１９】例２
融合タン白質の熱誘導による産生
プラスミドｐＩＪ１０１のｋｉｌＡ遺伝子のプロモータ
ー領域を制限酵素Ｓａｕ３Ａ で切断し、（ザ・ジョン
・インズ・ファンデーション（ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎ
ｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ） 、から入手可能な）
「プロモーター選択ベクター」ｐＩＪ４８７の特異Ｂａ
ｍＨＩ 開裂部位にクローニングする。Ｓ． ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ ＴＫ２４の形質転換の後に、ネオマイシン耐
性の発現によってクローニングが成功したことが認めら
れる。単離したプロモーター領域（フラグメント１）を
制限酵素ＫｐｎＩおよびＳｐｈＩで切断して、既知の方
法での電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によ
って単離することができる。α−ＡＩプロモーターはＳ
ｐｈＩ−ＸｍａＩＩＩ ＤＮＡフラグメントを、先端を
切り詰めた合成ＳｐｈＩ−ＸｍａＩＩＩ ＤＮＡフラグ
メント（配列番号：１）（表１）で置換することによっ
てプラスミドｐＧＦ１（欧州特許第０ ２８９ ９３６
号公開公報、南アフリカ特許第８８／３１６８ 号公
報、オーストラリア特許第１５ ５５９／８８ 号公開
公報、ニュージーランド特許第２２２ ４６４ 号公報
）から欠失する。
１０
（ＭＥＴ）ＡＲＧ ＶＡＬ ＡＲＧ ＡＬＡ ＬＥＵ
ＡＲＧ ＬＥＵ ＡＬＡ ＡＬＡ ＬＥＵ ＶＡＬ
ＧＬＹ ＡＬＡ ＣＧＣ ＧＴＡ
ＣＧＧ ＧＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＣＧ
ＧＣＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＣＧＧ
ＴＡＣ ＧＣＧ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ＧＡＡ
ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＣＡＣ Ｃ
ＣＡ ＣＧＣ（ＳｐｈＩ）
２０ ＧＬＹ ＡＬＡ ＡＬＡ ＬＥＵ
ＡＬＡ ＬＥＵ ＳＥＲ ＰＲＯ ＬＥＵ （ＡＬＡ）
（ＡＬＡ） ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＣＡ
ＣＴＣ ＧＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＣ Ｇ
Ｃ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＧＴ ＧＡＧ ＣＧ
Ｇ ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＧＣ Ｃ
ＧＧ
（ＸｍａＩＩＩ
）
ー領域を制限酵素Ｓａｕ３Ａ で切断し、（ザ・ジョン
・インズ・ファンデーション（ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎ
ｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ） 、から入手可能な）
「プロモーター選択ベクター」ｐＩＪ４８７の特異Ｂａ
ｍＨＩ 開裂部位にクローニングする。Ｓ． ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ ＴＫ２４の形質転換の後に、ネオマイシン耐
性の発現によってクローニングが成功したことが認めら
れる。単離したプロモーター領域（フラグメント１）を
制限酵素ＫｐｎＩおよびＳｐｈＩで切断して、既知の方
法での電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によ
って単離することができる。α−ＡＩプロモーターはＳ
ｐｈＩ−ＸｍａＩＩＩ ＤＮＡフラグメントを、先端を
切り詰めた合成ＳｐｈＩ−ＸｍａＩＩＩ ＤＮＡフラグ
メント（配列番号：１）（表１）で置換することによっ
てプラスミドｐＧＦ１（欧州特許第０ ２８９ ９３６
号公開公報、南アフリカ特許第８８／３１６８ 号公
報、オーストラリア特許第１５ ５５９／８８ 号公開
公報、ニュージーランド特許第２２２ ４６４ 号公報
）から欠失する。
１０
（ＭＥＴ）ＡＲＧ ＶＡＬ ＡＲＧ ＡＬＡ ＬＥＵ
ＡＲＧ ＬＥＵ ＡＬＡ ＡＬＡ ＬＥＵ ＶＡＬ
ＧＬＹ ＡＬＡ ＣＧＣ ＧＴＡ
ＣＧＧ ＧＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＣＧ
ＧＣＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＣＧＧ
ＴＡＣ ＧＣＧ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ＧＡＡ
ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＣＡＣ Ｃ
ＣＡ ＣＧＣ（ＳｐｈＩ）
２０ ＧＬＹ ＡＬＡ ＡＬＡ ＬＥＵ
ＡＬＡ ＬＥＵ ＳＥＲ ＰＲＯ ＬＥＵ （ＡＬＡ）
（ＡＬＡ） ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＣＡ
ＣＴＣ ＧＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＣ Ｇ
Ｃ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＧＴ ＧＡＧ ＣＧ
Ｇ ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＧＣ Ｃ
ＧＧ
（ＸｍａＩＩＩ
）
【表１】
シグナル配列、α−ＡＩ遺伝子、プロインシュリン遺伝
子および終止配列から成る完全な融合構造を含むプラス
ミドｐＧＦ１ｐ１が生じる。このＤＮＡ配列（フラグメ
ント２）を制限酵素ＳｐｈＩおよびＳｓｔＩで消化する
ことによって切断し、既知の方法で単離することができ
る。市販の発現ベクターｐＩＪ７０２（ジョン・インズ
・ファンデーション（Ｊｏｈｎ ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎ） ）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＳｓｔＩで
消化して、大きなフラグメント（フラグメント３）を同
様にして電気溶出する。フラグメント１、２および３の
連結によって組換プラスミドｐＫＩＬＰ１が生成する（
図２）。適合性プラスミドｐＫＯＲＥ２を既に含んでい
るＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４の形質転換の後に、
チオストレプトンおよびネオマイシン耐性マーカーの存
在に就いての選択を行う。温度が３６℃に上昇した後、
両方のプラスミドを含むクローンは、α−アミラーゼイ
ンヒビターとプロインシュリンとから成る必要な融合タ
ン白質を分泌するが、これはそれ自体既知の方法で検出
し、単離することができる。
子および終止配列から成る完全な融合構造を含むプラス
ミドｐＧＦ１ｐ１が生じる。このＤＮＡ配列（フラグメ
ント２）を制限酵素ＳｐｈＩおよびＳｓｔＩで消化する
ことによって切断し、既知の方法で単離することができ
る。市販の発現ベクターｐＩＪ７０２（ジョン・インズ
・ファンデーション（Ｊｏｈｎ ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎ） ）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＳｓｔＩで
消化して、大きなフラグメント（フラグメント３）を同
様にして電気溶出する。フラグメント１、２および３の
連結によって組換プラスミドｐＫＩＬＰ１が生成する（
図２）。適合性プラスミドｐＫＯＲＥ２を既に含んでい
るＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４の形質転換の後に、
チオストレプトンおよびネオマイシン耐性マーカーの存
在に就いての選択を行う。温度が３６℃に上昇した後、
両方のプラスミドを含むクローンは、α−アミラーゼイ
ンヒビターとプロインシュリンとから成る必要な融合タ
ン白質を分泌するが、これはそれ自体既知の方法で検出
し、単離することができる。
【００２０】
【配列表】配列番号：１
配列の型：対応するタン白質を有するヌクレオチド配列
の長さ：７６塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：Ｎ末端（シグナル配列）起源：合成Ｄ
ＮＡ 配列 ＣＧＣ ＧＴＡ ＣＧＧ ＧＣＡ
ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＧ ＣＴＧ
ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＣＧ Ｇ ＴＡＣ ＧＣＧ
ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＡＡ
ＣＧＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＧＣ
Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ １
１０ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＣ
Ａ ＣＴＣ ＧＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＣ
ＧＣ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＧＴ ＧＡＧ
ＣＧＧ ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＧＣ Ｃ
ＧＧ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａ
ｌａ
２０
の長さ：７６塩基 鎖の数：突出認識配列を有する二本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：Ｎ末端（シグナル配列）起源：合成Ｄ
ＮＡ 配列 ＣＧＣ ＧＴＡ ＣＧＧ ＧＣＡ
ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＧ ＣＴＧ
ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＣＧ Ｇ ＴＡＣ ＧＣＧ
ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＡＡ
ＣＧＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＧＣ
Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ １
１０ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＣ
Ａ ＣＴＣ ＧＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＣ
ＧＣ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＧＴ ＧＡＧ
ＣＧＧ ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＧＣ Ｃ
ＧＧ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａ
ｌａ
２０
【図１】９．２ ｋｂｐ のプラスミドｐＫＯＲＥ２の
構成を示す説明図。
構成を示す説明図。
【図２】組換プラスミドｐＫＩＬＰ１の構成を示す説明
図。
図。
Claims (4)
- 【請求項１】ｋｉｌＡ−ＫｏｒＡ 系をスイッチとして
用いることを特徴とするストレプトミセス宿主菌株にお
ける遺伝子の調節された発現の方法であって、発現され
る遺伝子がｋｉｌＡ調節領域に結合し、ＫｏｒＡタン白
質が不活性化されまたは除去されてスイッチが入ること
を特徴とする方法。 - 【請求項２】温度感受性ＫｏｒＡタン白質を発現させ、
温度をその閾値を上回って上昇させる、請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】ｋｏｒＡ 遺伝子がスイッチ可能プロモー
ターの制御下に置かれる、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】ｋｏｒＡ遺伝子が温度感受性プラスミドに
よって発現され、温度をその閾値を上回って上昇させる
、請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4011863A DE4011863A1 (de) | 1990-04-12 | 1990-04-12 | Regulierte genexpression in streptomyceten |
| DE4011863.0 | 1990-04-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04228082A true JPH04228082A (ja) | 1992-08-18 |
| JP3043832B2 JP3043832B2 (ja) | 2000-05-22 |
Family
ID=6404289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3108461A Expired - Lifetime JP3043832B2 (ja) | 1990-04-12 | 1991-04-12 | ストレプトミセスでの調節された遺伝子発現 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5336607A (ja) |
| EP (1) | EP0451792B1 (ja) |
| JP (1) | JP3043832B2 (ja) |
| KR (1) | KR0168670B1 (ja) |
| AT (1) | ATE150485T1 (ja) |
| AU (1) | AU630551B2 (ja) |
| DE (2) | DE4011863A1 (ja) |
| DK (1) | DK0451792T3 (ja) |
| ES (1) | ES2099101T3 (ja) |
| GR (1) | GR3023115T3 (ja) |
| IE (1) | IE911228A1 (ja) |
| PT (2) | PT97331A (ja) |
| TW (1) | TW226409B (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1352964A4 (en) * | 2000-12-22 | 2005-02-16 | Nippon Soda Co | PROCESS FOR PRODUCING A SUBSTANCE USING A MICROBIAL CATALYST |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3809692A1 (de) * | 1988-03-23 | 1989-10-12 | Hoechst Ag | Verwendung von psg5 als temperatursensitives plasmid |
-
1990
- 1990-04-12 DE DE4011863A patent/DE4011863A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-04-09 AT AT91105616T patent/ATE150485T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-09 ES ES91105616T patent/ES2099101T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-09 EP EP91105616A patent/EP0451792B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-09 DK DK91105616.6T patent/DK0451792T3/da active
- 1991-04-09 DE DE59108620T patent/DE59108620D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-11 PT PT97331A patent/PT97331A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-04-11 AU AU74287/91A patent/AU630551B2/en not_active Expired
- 1991-04-11 IE IE122891A patent/IE911228A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-04-11 PT PT97327A patent/PT97327B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-04-12 KR KR1019910005820A patent/KR0168670B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-12 JP JP3108461A patent/JP3043832B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-29 TW TW080104197A patent/TW226409B/zh not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-07-23 US US08/095,481 patent/US5336607A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-04-11 GR GR970400777T patent/GR3023115T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE911228A1 (en) | 1991-10-23 |
| PT97327A (pt) | 1992-01-31 |
| DE59108620D1 (de) | 1997-04-24 |
| ES2099101T3 (es) | 1997-05-16 |
| JP3043832B2 (ja) | 2000-05-22 |
| DE4011863A1 (de) | 1991-10-17 |
| EP0451792A1 (de) | 1991-10-16 |
| TW226409B (ja) | 1994-07-11 |
| US5336607A (en) | 1994-08-09 |
| PT97327B (pt) | 1998-08-31 |
| AU630551B2 (en) | 1992-10-29 |
| PT97331A (pt) | 1992-01-31 |
| KR0168670B1 (ko) | 1999-01-15 |
| DK0451792T3 (da) | 1997-09-15 |
| KR910018552A (ko) | 1991-11-30 |
| AU7428791A (en) | 1991-10-17 |
| EP0451792B1 (de) | 1997-03-19 |
| GR3023115T3 (en) | 1997-07-30 |
| ATE150485T1 (de) | 1997-04-15 |
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