JPH04228091A - 抗体を使用するソマトトロピンの体発達作用の免疫学的増強 - Google Patents
抗体を使用するソマトトロピンの体発達作用の免疫学的増強Info
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- JPH04228091A JPH04228091A JP3135262A JP13526291A JPH04228091A JP H04228091 A JPH04228091 A JP H04228091A JP 3135262 A JP3135262 A JP 3135262A JP 13526291 A JP13526291 A JP 13526291A JP H04228091 A JPH04228091 A JP H04228091A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本発明は、ブタのソマトトロピン（ｐＳＴ
）の抗体、とくにモノクローナル抗体に関する。これら
の抗体はｐＳＴと一緒に投与するとき、脊椎動物の成長
はｐＳＴ単独の投与で達成されるより大きい。本発明は
、また、脊椎動物のソマトトロピンに対する抗体をこの
ようなソマトトロピンと一緒に投与するとき、このよう
なソマトトロピン単独の投与と比較したとき、脊椎動物
の成長の増加が長期間にわたって持続するという一般的
発見に関する。
）の抗体、とくにモノクローナル抗体に関する。これら
の抗体はｐＳＴと一緒に投与するとき、脊椎動物の成長
はｐＳＴ単独の投与で達成されるより大きい。本発明は
、また、脊椎動物のソマトトロピンに対する抗体をこの
ようなソマトトロピンと一緒に投与するとき、このよう
なソマトトロピン単独の投与と比較したとき、脊椎動物
の成長の増加が長期間にわたって持続するという一般的
発見に関する。
【０００２】ソマトトロピンは、温血動物において下垂
体前葉により分泌されるポリペプチドであり、そして肝
臓の中に主として位置する特異的細胞表面のレセプタを
通して作用する［フウグス（Ｈｙｇｈｅｓ）、Ｊ．Ｒ．
およびフリーセン（Ｆｒｉｅｓｅｎ）、Ｈ．Ｇ．、Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、４７、４６９−４８２
（１９８５）］。ソマトトロピンは動物、例えば、ウシ
（畜牛）、ブタ（豚）、やぎ（ヤギ）、鳥類（ニワトリ
、シチメンチョウ、ガンなど）およびウサギなどの成長
を増強するために有用である。ソマトトロピンは、また
、他の脊椎動物、例えば、魚類の成長の増強に有用であ
る。
体前葉により分泌されるポリペプチドであり、そして肝
臓の中に主として位置する特異的細胞表面のレセプタを
通して作用する［フウグス（Ｈｙｇｈｅｓ）、Ｊ．Ｒ．
およびフリーセン（Ｆｒｉｅｓｅｎ）、Ｈ．Ｇ．、Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、４７、４６９−４８２
（１９８５）］。ソマトトロピンは動物、例えば、ウシ
（畜牛）、ブタ（豚）、やぎ（ヤギ）、鳥類（ニワトリ
、シチメンチョウ、ガンなど）およびウサギなどの成長
を増強するために有用である。ソマトトロピンは、また
、他の脊椎動物、例えば、魚類の成長の増強に有用であ
る。
【０００３】詳しくは、成長ホルモンｐＳＴは豚本来の
ものであり、そして動物の成熟、例えば、成長速度およ
び赤身対脂肪の比の増加の原因となる。ｐＳＴは、それ
ぞれ、５３−１６４および１８１−１８９のシスチン華
僑結合残基をもつ１９１アミノ酸の一本鎖のポリペプチ
ドである［アブデル−メグイド（Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕ
ｉｄ）、Ｓ．Ｓ．ら、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、８４、６４３４−６
４３７（１９８７）］。
ものであり、そして動物の成熟、例えば、成長速度およ
び赤身対脂肪の比の増加の原因となる。ｐＳＴは、それ
ぞれ、５３−１６４および１８１−１８９のシスチン華
僑結合残基をもつ１９１アミノ酸の一本鎖のポリペプチ
ドである［アブデル−メグイド（Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕ
ｉｄ）、Ｓ．Ｓ．ら、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、８４、６４３４−６
４３７（１９８７）］。
【０００４】ｐＳＴの内因性量は少ないので、大規模の
農業における使用するための外因性ｐＳＴの調製に努力
が集中された。また、ｐＳＴ分子の小さい部分の同定、
それらの部分に対する抗体の発生、および成長を増強す
るためにｐＳＴとともにそれらの抗体を投与することに
努力が向けられて来た。参照、例えば、公開欧州特許出
願第２８４，４０５号。
農業における使用するための外因性ｐＳＴの調製に努力
が集中された。また、ｐＳＴ分子の小さい部分の同定、
それらの部分に対する抗体の発生、および成長を増強す
るためにｐＳＴとともにそれらの抗体を投与することに
努力が向けられて来た。参照、例えば、公開欧州特許出
願第２８４，４０５号。
【０００５】前述のアプローチは動物の成長の増強を約
束するが、この領域において追加の方法および技術の開
発がなお要求されている。
束するが、この領域において追加の方法および技術の開
発がなお要求されている。
【０００６】したがって、本発明の目的は、ｐＳＴ分子
の一部分と反対に、その全体に対する抗体、とくにモノ
クローナル抗体を開発することである。
の一部分と反対に、その全体に対する抗体、とくにモノ
クローナル抗体を開発することである。
【０００７】本発明の他の目的は、脊椎動物をｐＳＴと
組み合わせてこのような抗体で処置することによって、
成長を改良することである。
組み合わせてこのような抗体で処置することによって、
成長を改良することである。
【０００８】本発明のなお他の目的は、ｐＳＴの同等の
強化を達成すると同時に１または２以上のこのような抗
体で減少した量のｐＳＴで脊椎動物を処置することによ
って、ｐＳＴの投与量を減少することである。
強化を達成すると同時に１または２以上のこのような抗
体で減少した量のｐＳＴで脊椎動物を処置することによ
って、ｐＳＴの投与量を減少することである。
【０００９】本発明のなおそれ以上の目的は、１または
２以上のこのような抗体をｐＳＴと組み合わせて投与す
ることによってｐＳＴの強化を加速し、こうして同等の
強化を前記組み合わせでｐＳＴ単独の投与で達成される
時間より短い時間で達成することである。
２以上のこのような抗体をｐＳＴと組み合わせて投与す
ることによってｐＳＴの強化を加速し、こうして同等の
強化を前記組み合わせでｐＳＴ単独の投与で達成される
時間より短い時間で達成することである。
【００１０】本発明のより一般の目的は、ソマトトロピ
ンを前記ソマトトロピンに対する１または２以上の抗体
と組み合わせて投与することによって、ソマトトロピン
の活性を延長した期間にわたって強化し、こうして脊椎
動物の体重が所定の期間にわたってソマトトロピン単独
の同一量で処置した脊椎動物の体重を越え続けるように
することである。
ンを前記ソマトトロピンに対する１または２以上の抗体
と組み合わせて投与することによって、ソマトトロピン
の活性を延長した期間にわたって強化し、こうして脊椎
動物の体重が所定の期間にわたってソマトトロピン単独
の同一量で処置した脊椎動物の体重を越え続けるように
することである。
【００１１】本発明は、また、このような抗体の前述の
成長増強機能が維持されるかぎり、修飾されたアミノ酸
配列を有するソマトトロピンの抗体に関する。
成長増強機能が維持されるかぎり、修飾されたアミノ酸
配列を有するソマトトロピンの抗体に関する。
【００１２】本発明のこれらの目的は、後述する本発明
により達成される。
により達成される。
【００１３】本発明は、ｐＳＴに対する抗体、とくにモ
ノクローナル抗体の発生に関する。次いで、このような
抗体をｐＳＴと一緒に脊椎動物、例えば、温血動物およ
び魚類に投与して、ｐＳＴの活性を強化することによっ
て、それらの成長を増強する。あるいは、これらの抗体
は脊椎動物に投与し、その後脊椎動物をｐＳＴで処置す
る。
ノクローナル抗体の発生に関する。次いで、このような
抗体をｐＳＴと一緒に脊椎動物、例えば、温血動物およ
び魚類に投与して、ｐＳＴの活性を強化することによっ
て、それらの成長を増強する。あるいは、これらの抗体
は脊椎動物に投与し、その後脊椎動物をｐＳＴで処置す
る。
【００１４】本発明のｐＳＴに対するモノクローナル抗
体は、次の方法でｐＳＴの活性に影響を与える：１）脊
椎動物に有効成長増強量のｐＳＴおよび有効ｐＳＴ強化
量のｐＳＴに対する１または２以上の抗体を投与したと
き、抗体はｐＳＴの活性を強化する。こうして、所定の
期間にわたって、所定量のｐＳＴとともに、このような
抗体を与えられている脊椎動物は成長の増加を示す。
体は、次の方法でｐＳＴの活性に影響を与える：１）脊
椎動物に有効成長増強量のｐＳＴおよび有効ｐＳＴ強化
量のｐＳＴに対する１または２以上の抗体を投与したと
き、抗体はｐＳＴの活性を強化する。こうして、所定の
期間にわたって、所定量のｐＳＴとともに、このような
抗体を与えられている脊椎動物は成長の増加を示す。
【００１５】２）脊椎動物に有効成長増強量のｐＳＴお
よび有効ｐＳＴ強化量のｐＳＴに対する１または２以上
の抗体を投与したとき、抗体はｐＳＴの同等の強化を達
成すると同時にｐＳＴの投与量を減少し、こうしてより
多い量の投与量のｐＳＴ単独を使用するときと同等の強
化は前記ｐＳＴとｐＳＴに対する１または２以上の抗体
との組み合わせで達成される。こうして、所定の期間に
わたって、このような抗体をまた投与する場合、同一の
成長はより少ないｐＳＴで達成される。
よび有効ｐＳＴ強化量のｐＳＴに対する１または２以上
の抗体を投与したとき、抗体はｐＳＴの同等の強化を達
成すると同時にｐＳＴの投与量を減少し、こうしてより
多い量の投与量のｐＳＴ単独を使用するときと同等の強
化は前記ｐＳＴとｐＳＴに対する１または２以上の抗体
との組み合わせで達成される。こうして、所定の期間に
わたって、このような抗体をまた投与する場合、同一の
成長はより少ないｐＳＴで達成される。
【００１６】３）脊椎動物に有効成長増強量のｐＳＴお
よび有効ｐＳＴ強化量のｐＳＴに対する１または２以上
の抗体を投与したとき、抗体はｐＳＴの強化を加速し、
こうしてｐＳＴ単独を投与するときより短い時間で、同
等の強化は前記ｐＳＴとｐＳＴに対する１または２以上
の抗体との組み合わせで達成される。こうして、所定量
のｐＳＴで、このような抗体をまた投与する場合、同一
の成長はより短い時間で達成される。
よび有効ｐＳＴ強化量のｐＳＴに対する１または２以上
の抗体を投与したとき、抗体はｐＳＴの強化を加速し、
こうしてｐＳＴ単独を投与するときより短い時間で、同
等の強化は前記ｐＳＴとｐＳＴに対する１または２以上
の抗体との組み合わせで達成される。こうして、所定量
のｐＳＴで、このような抗体をまた投与する場合、同一
の成長はより短い時間で達成される。
【００１７】本発明は、また、ソマトトロピン（ｐＳＴ
を包含するが、これに限定されない）に対する抗体を前
記ソマトトロピンと組み合わせて投与することから生ず
る改良された成長は一次的な現象ではないという一般的
観測に関する。むしろ、脊椎動物の体重はソマトトロピ
ン単独で処置した脊椎動物の体重を所定の期間にわたっ
て越え続ける。脊椎動物に有効成長増強量のソマトトロ
ピンおよび有効ソマトトロピン強化量の前記ソマトトロ
ピンに対する１または２以上の抗体を投与するとき、抗
体はソマトトロピンの活性を延長した期間にわたって強
化し、こうして脊椎動物の体重は、同一量の前記ソマト
トロピンで処置した脊椎動物の体重を所定の期間にわた
って越え続ける。
を包含するが、これに限定されない）に対する抗体を前
記ソマトトロピンと組み合わせて投与することから生ず
る改良された成長は一次的な現象ではないという一般的
観測に関する。むしろ、脊椎動物の体重はソマトトロピ
ン単独で処置した脊椎動物の体重を所定の期間にわたっ
て越え続ける。脊椎動物に有効成長増強量のソマトトロ
ピンおよび有効ソマトトロピン強化量の前記ソマトトロ
ピンに対する１または２以上の抗体を投与するとき、抗
体はソマトトロピンの活性を延長した期間にわたって強
化し、こうして脊椎動物の体重は、同一量の前記ソマト
トロピンで処置した脊椎動物の体重を所定の期間にわた
って越え続ける。
【００１８】本発明は、さらに、ソマトトロピンのアミ
ノ酸配列に抗原的に同等のアミノ酸配列を有するペプチ
ドに対する抗体に関する。これらのペプチドのアミノ酸
配列が、ソマトトロピンの配列への付加または置換から
の欠失により異なり、こうしてペプチドの二次および／
または三次の立体配置がソマトトロピンのそれらから実
質的に変化せず、そして抗体をそれらのペプチドに対し
て発生させることができる場合、これらのペプチドはソ
マトトロピンと抗原的に同等であるということができる
。
ノ酸配列に抗原的に同等のアミノ酸配列を有するペプチ
ドに対する抗体に関する。これらのペプチドのアミノ酸
配列が、ソマトトロピンの配列への付加または置換から
の欠失により異なり、こうしてペプチドの二次および／
または三次の立体配置がソマトトロピンのそれらから実
質的に変化せず、そして抗体をそれらのペプチドに対し
て発生させることができる場合、これらのペプチドはソ
マトトロピンと抗原的に同等であるということができる
。
【００１９】本発明の１つの面において、マウスをソマ
トトロピンで免疫化し、マウスから脾臓を取り出し、リ
ンパ球の懸濁液を調製し、これらのリンパ球をマウスの
骨髄腫細胞に融合し、細胞を培養し、そして生存するハ
イブリドーマの上澄み液を集め、そして固相酵素結合免
疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により抗体をスクリーニ
ングすることによって、モノクローナル抗体は調製され
る。所望の抗体を産生するハイブリドーマをさらにサブ
クローニングし、そしてマウスに注射する。次いで、腹
水をマウスの腹腔から集め、そして硫酸アンモニウムの
沈澱または急速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆ
ＰＬＣ）によりプロテインＡ親和性カラムにより、免疫
グロブリン（Ｉｇ）を精製する。そのように精製したＩ
ｇの試料をＥＬＩＳＡを使用して抗原に対してアッセイ
して、形成された抗体を同定する。
トトロピンで免疫化し、マウスから脾臓を取り出し、リ
ンパ球の懸濁液を調製し、これらのリンパ球をマウスの
骨髄腫細胞に融合し、細胞を培養し、そして生存するハ
イブリドーマの上澄み液を集め、そして固相酵素結合免
疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により抗体をスクリーニ
ングすることによって、モノクローナル抗体は調製され
る。所望の抗体を産生するハイブリドーマをさらにサブ
クローニングし、そしてマウスに注射する。次いで、腹
水をマウスの腹腔から集め、そして硫酸アンモニウムの
沈澱または急速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆ
ＰＬＣ）によりプロテインＡ親和性カラムにより、免疫
グロブリン（Ｉｇ）を精製する。そのように精製したＩ
ｇの試料をＥＬＩＳＡを使用して抗原に対してアッセイ
して、形成された抗体を同定する。
【００２０】本発明の他の面において、ソマトトロピン
に対するポリクローナル抗体を発生させ、そして免疫化
した温血動物、例えば、ブタおよびウサギから精製する
。ポリクローナル抗体は、脊椎動物をこのようなソマト
トロピンで免疫化することによって発生させる。
に対するポリクローナル抗体を発生させ、そして免疫化
した温血動物、例えば、ブタおよびウサギから精製する
。ポリクローナル抗体は、脊椎動物をこのようなソマト
トロピンで免疫化することによって発生させる。
【００２１】ソマトトロピンの投与から抗体が形成する
ために十分な時間後、まず血液試料を免疫化した動物か
らえることによって、ポリクローナル抗体を回収する。 血清（これは抗体を含有する）を普通の手段、例えば、
遠心により分離する。血清をＩｇを含有する分画および
免疫グロブリンを欠く分画（非Ｉｇ）に手段、例えば、
ＦＰＬＣにより分割する。Ｉｇ分画のみはペプチドに対
する抗体を含有する。次いで、抗体をＩｇ分画からドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離する。そのようにし
て分離された抗体の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決
定して９８％より大きい。抗体の力価のレベルは普通の
手順に従いＥＬＩＳＡを使用してアッセイする。
ために十分な時間後、まず血液試料を免疫化した動物か
らえることによって、ポリクローナル抗体を回収する。 血清（これは抗体を含有する）を普通の手段、例えば、
遠心により分離する。血清をＩｇを含有する分画および
免疫グロブリンを欠く分画（非Ｉｇ）に手段、例えば、
ＦＰＬＣにより分割する。Ｉｇ分画のみはペプチドに対
する抗体を含有する。次いで、抗体をＩｇ分画からドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離する。そのようにし
て分離された抗体の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決
定して９８％より大きい。抗体の力価のレベルは普通の
手順に従いＥＬＩＳＡを使用してアッセイする。
【００２２】この出願において例示するソマトトロピン
はｐＳＴであるが、当業者はここに記載する技術を利用
して、他のソマトトロピンに対するモノクローナル抗体
およびポリクローナル抗体を発生させることができる。
はｐＳＴであるが、当業者はここに記載する技術を利用
して、他のソマトトロピンに対するモノクローナル抗体
およびポリクローナル抗体を発生させることができる。
【００２３】本発明のモノクローナル抗体およびポリク
ローナル抗体は２つの方法で使用して、ソマトトロピン
の成長促進活性を強化および増強することができる。第
１に、抗体を脊椎動物にソマトトロピン、ｐＳＴと一緒
に投与する。あるいは、脊椎動物を１または２以上の投
与量の抗ソマトトロピン抗体で処置し、引き続いてソマ
トトロピンで処置する。いずれの手順においても、特定
のソマトトロピンに対する１より多い抗体を使用するこ
とができる。こうして、本発明は、また、抗ソマトトロ
ピン抗体またはそれらの抗原性同等因子の組み合わせの
投与を包含する。
ローナル抗体は２つの方法で使用して、ソマトトロピン
の成長促進活性を強化および増強することができる。第
１に、抗体を脊椎動物にソマトトロピン、ｐＳＴと一緒
に投与する。あるいは、脊椎動物を１または２以上の投
与量の抗ソマトトロピン抗体で処置し、引き続いてソマ
トトロピンで処置する。いずれの手順においても、特定
のソマトトロピンに対する１より多い抗体を使用するこ
とができる。こうして、本発明は、また、抗ソマトトロ
ピン抗体またはそれらの抗原性同等因子の組み合わせの
投与を包含する。
【００２４】抗体は、普通のルート、例えば、皮下注射
、筋肉内注射および静脈内の流れ、ならびに経皮的およ
び経口的投与により投与することができる。抗体は適当
な担体と組み合わせて投与することが好ましい。抗体を
最初に投与し、次いで規則的な時間間隔で同一抗体を１
または２以上の促進投与する、投与の養生法を使用する
ことはとくに好ましい。
、筋肉内注射および静脈内の流れ、ならびに経皮的およ
び経口的投与により投与することができる。抗体は適当
な担体と組み合わせて投与することが好ましい。抗体を
最初に投与し、次いで規則的な時間間隔で同一抗体を１
または２以上の促進投与する、投与の養生法を使用する
ことはとくに好ましい。
【００２５】これらの抗体の生物学的活性は下垂体切除
した（ｈｙｐｏｘ）ラットにおいて試験する。下垂体切
除したラットは、それらの下垂体の外科的切除の結果、
成長を欠く。下垂体切除したラットはソマトトロピンの
成長への効果を研究するための有用なモデルとして働く
［グレスベック（Ｇｒｅｓｂｅｃｋ）、Ｍ．Ｄ．および
パーロウ（Ｐａｒｌｏｗ）、Ａ．Ｆ．、エンドクリノロ
ジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１２０、２５８
２−２５９０（１９８７）］。
した（ｈｙｐｏｘ）ラットにおいて試験する。下垂体切
除したラットは、それらの下垂体の外科的切除の結果、
成長を欠く。下垂体切除したラットはソマトトロピンの
成長への効果を研究するための有用なモデルとして働く
［グレスベック（Ｇｒｅｓｂｅｃｋ）、Ｍ．Ｄ．および
パーロウ（Ｐａｒｌｏｗ）、Ａ．Ｆ．、エンドクリノロ
ジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１２０、２５８
２−２５９０（１９８７）］。
【００２６】これらの下垂体切除したラットをｐＳＴと
ｐＳＴに対する抗体との組み合わせで処置すると、前述
の種々の方法でｐＳＴの成長促進作用は増強される。使
用するｐＳＴは天然源から分離するか、あるいは組み換
え技術、例えば、欧州特許出願公開第１０４，９２０ま
たは１１１，３８９号に記載されている技術を使用して
調製することができる。ｐＳＴそれ自体の分離／調製の
源および方法は、本発明の一部分を形成しない。抗体は
、また、自然ｐＳＴのアミノ酸配列はある技術、例えば
、部位特異的突然変異誘発を使用して修飾されている、
組み換えｐＳＴと一緒に使用することができるが、ただ
しｐＳＴの成長増強機能が維持されることを条件とする
。参照、例えば、欧州特許出願公開第３０３，９７２号
。
ｐＳＴに対する抗体との組み合わせで処置すると、前述
の種々の方法でｐＳＴの成長促進作用は増強される。使
用するｐＳＴは天然源から分離するか、あるいは組み換
え技術、例えば、欧州特許出願公開第１０４，９２０ま
たは１１１，３８９号に記載されている技術を使用して
調製することができる。ｐＳＴそれ自体の分離／調製の
源および方法は、本発明の一部分を形成しない。抗体は
、また、自然ｐＳＴのアミノ酸配列はある技術、例えば
、部位特異的突然変異誘発を使用して修飾されている、
組み換えｐＳＴと一緒に使用することができるが、ただ
しｐＳＴの成長増強機能が維持されることを条件とする
。参照、例えば、欧州特許出願公開第３０３，９７２号
。
【００２７】検査するモノクローナル抗体のうちで、抗
体ＰＳ−７．６はｐＳＴ活性のとくに強い強化を有する
ことが発見され、そしてそれ以上の分析のために選択す
る。モノクローナル抗体ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８
．３は、また、ｐＳＴ活性の強い強化を与えることが発
見された。
体ＰＳ−７．６はｐＳＴ活性のとくに強い強化を有する
ことが発見され、そしてそれ以上の分析のために選択す
る。モノクローナル抗体ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８
．３は、また、ｐＳＴ活性の強い強化を与えることが発
見された。
【００２８】モノクローナル抗体ＰＳ−７．６は、ｋ軽
鎖特性をもつＩｇＧ１サブタイプの免疫グロブリンであ
る。免疫特異性の研究（図１）は、それがｐＳＴと高度
に反応性であり、ｂＳＴと弱く反応性であるが、ｃＳＴ
、ＰＲＬ、ＳＲＩＦまたはＧＲＦと反応しないことを示
す。
鎖特性をもつＩｇＧ１サブタイプの免疫グロブリンであ
る。免疫特異性の研究（図１）は、それがｐＳＴと高度
に反応性であり、ｂＳＴと弱く反応性であるが、ｃＳＴ
、ＰＲＬ、ＳＲＩＦまたはＧＲＦと反応しないことを示
す。
【００２９】下垂体切除したラットのバイオアッセイに
おいて、連続５日間の５ｍｇのｐＳＴ単独の注射はこれ
らの動物の成長を刺激することが実証された（図２）。 この作用は、ｐＳＴを投与の前にモノクローナル抗体Ｐ
Ｓ−７．６とともに室温において１時間インキュベーシ
ョンするとき、有意に強化される。モノクローナル抗体
ＰＳ−７．６単独を与えられるラットの成長プロフィル
は未処置の対照のそれに類似し、抗体それ自体は成長の
刺激因子でないことが示される（図２）。
おいて、連続５日間の５ｍｇのｐＳＴ単独の注射はこれ
らの動物の成長を刺激することが実証された（図２）。 この作用は、ｐＳＴを投与の前にモノクローナル抗体Ｐ
Ｓ−７．６とともに室温において１時間インキュベーシ
ョンするとき、有意に強化される。モノクローナル抗体
ＰＳ−７．６単独を与えられるラットの成長プロフィル
は未処置の対照のそれに類似し、抗体それ自体は成長の
刺激因子でないことが示される（図２）。
【００３０】ソマトトロピンに対する抗体により延長し
た期間にわたる前記ソマトトロピンの活性の強化は、同
様な下垂体切除したラットのアッセイを使用して実証さ
れる。動物の成長をより長い時間の間監視する。この方
法はｐＳＴおよびｐＳＴに対する抗体を使用して例示す
る。ｐＳＴ単独の５日間の注射は下垂体切除したラット
において認め得る体重の増加を産生せず、この作用は８
日までのみ有意でありそして２８日までに未処置動物の
成長ラットと完全に一致する（図３）。しかしながら、
モノクローナル抗体ＰＳ−７．６による処置は有意なレ
ベルで増加した成長のパターンを２８日まで延長する。 すべての抗体処置した動物は、最初の処置後少なくとも
５６日間、ｐＳＴ処置した対照および未処置対照より認
められ得るほどに重く止まり、その長い持続性を明瞭に
示す。抗体による成長の増強は、極めて長く続く。なぜ
なら、抗体処置した動物および対照（ｐＳＴ単独）動物
の間の体重増加における有意差は、最初の処置後少なく
とも５６日間持続する（図３）からである。モノクロー
ナル抗体ＰＳ−７．６のｐＳＴへの成長強化作用は、対
照のポリクローナル抗体より有意にすぐれる。モノクロ
ーナル抗体ＰＳ−７．６はｐＳＴの活性を有意に高める
が、対照の抗体（Ｉｇ）は５日後ｐＳＴの活性にに影響
を与えることができない（図４）。モノクローナル抗体
ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８．３は、それらのｐＳＴ
成長強化作用においてモノクローナル抗体ＰＳ−７．６
に匹敵する（図７）。
た期間にわたる前記ソマトトロピンの活性の強化は、同
様な下垂体切除したラットのアッセイを使用して実証さ
れる。動物の成長をより長い時間の間監視する。この方
法はｐＳＴおよびｐＳＴに対する抗体を使用して例示す
る。ｐＳＴ単独の５日間の注射は下垂体切除したラット
において認め得る体重の増加を産生せず、この作用は８
日までのみ有意でありそして２８日までに未処置動物の
成長ラットと完全に一致する（図３）。しかしながら、
モノクローナル抗体ＰＳ−７．６による処置は有意なレ
ベルで増加した成長のパターンを２８日まで延長する。 すべての抗体処置した動物は、最初の処置後少なくとも
５６日間、ｐＳＴ処置した対照および未処置対照より認
められ得るほどに重く止まり、その長い持続性を明瞭に
示す。抗体による成長の増強は、極めて長く続く。なぜ
なら、抗体処置した動物および対照（ｐＳＴ単独）動物
の間の体重増加における有意差は、最初の処置後少なく
とも５６日間持続する（図３）からである。モノクロー
ナル抗体ＰＳ−７．６のｐＳＴへの成長強化作用は、対
照のポリクローナル抗体より有意にすぐれる。モノクロ
ーナル抗体ＰＳ−７．６はｐＳＴの活性を有意に高める
が、対照の抗体（Ｉｇ）は５日後ｐＳＴの活性にに影響
を与えることができない（図４）。モノクローナル抗体
ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８．３は、それらのｐＳＴ
成長強化作用においてモノクローナル抗体ＰＳ−７．６
に匹敵する（図７）。
【００３１】モノクローナル抗体の有効な投与量は０．
１〜２．０ｍｇ／注射の範囲であり、最適な投与量は０
．５〜１．０ｍｇ／注射である（図５）。図５に示す投
与量の応答の結果は、モノクローナル抗体ＰＳ−７．６
およびｐＳＴの作用が急速であることを示す。モノクロ
ーナル抗体ＰＳ−７．６＋ｐＳＴを使用する反復する注
射（５回の処置）は最大の効果生成するが、有意な増強
は２回程度に少ない処置で検出可能である（図６）。 対照的に、ｐＳＴ単独を使用するより少ない増強は最小
３日の処置を必要とし、そしてより少ない増強は、モノ
クローナル抗体ＰＳ−７．６＋ｐＳＴを使用する注射の
２日より５日間の注射後、ｐＳＴ単独で達成される（図
６）。図５および図６におけるデータが実証するように
、本発明のｐＳＴに対するモノクローナル抗体は（ａ）
ｐＳＴの同等の強化を活性化すると同時にｐＳＴの投与
量を減少し、そして（ｂ）ｐＳＴの強化の加速を達成す
る。
１〜２．０ｍｇ／注射の範囲であり、最適な投与量は０
．５〜１．０ｍｇ／注射である（図５）。図５に示す投
与量の応答の結果は、モノクローナル抗体ＰＳ−７．６
およびｐＳＴの作用が急速であることを示す。モノクロ
ーナル抗体ＰＳ−７．６＋ｐＳＴを使用する反復する注
射（５回の処置）は最大の効果生成するが、有意な増強
は２回程度に少ない処置で検出可能である（図６）。 対照的に、ｐＳＴ単独を使用するより少ない増強は最小
３日の処置を必要とし、そしてより少ない増強は、モノ
クローナル抗体ＰＳ−７．６＋ｐＳＴを使用する注射の
２日より５日間の注射後、ｐＳＴ単独で達成される（図
６）。図５および図６におけるデータが実証するように
、本発明のｐＳＴに対するモノクローナル抗体は（ａ）
ｐＳＴの同等の強化を活性化すると同時にｐＳＴの投与
量を減少し、そして（ｂ）ｐＳＴの強化の加速を達成す
る。
【００３２】一緒にすると、これらのデータが示すよう
に、モノクローナル抗体ＰＳ−３．１２、ＰＳ−７．６
およびＰＳ−８．３はｐＳＴの体発達を増進するうえで
高度に活性であり、したがって、動物の成長性能の改良
において有用である。
に、モノクローナル抗体ＰＳ−３．１２、ＰＳ−７．６
およびＰＳ−８．３はｐＳＴの体発達を増進するうえで
高度に活性であり、したがって、動物の成長性能の改良
において有用である。
【００３３】本発明をよりよく理解できるようにするた
めに、次の実施例を記載する。これらの実施例は例示の
みを目的とし、そして本発明の範囲を限定すると解釈す
べきではない。
めに、次の実施例を記載する。これらの実施例は例示の
みを目的とし、そして本発明の範囲を限定すると解釈す
べきではない。
【００３４】
【実施例】実施例１
１、モノクローナル抗体ＰＳ−７．６を包含する、モノ
クローナル抗体の発生Ｂａｌｂ／Ｃマウス、６〜１０週
齢、を、チャールス・リバー・ブリーディング・ラボラ
トリーズ（マサチュセッツ州ウィルミントン）から購入
した。これらのマウスを完全フロインドアジュバントの
中に乳濁した１００ｍｇのｐＳＴで免疫化し、その後３
週毎に５０ｍｇのｐＳＴで促進する。それらの脾臓を最
後の促進後３日に取り出し、そしてリンパ球の単細胞の
懸濁液を調製する。これらのリンパ球をハイポキサンチ
ンフィオスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ
）を欠くＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞と、２０％の胎児
仔ウシ血清［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）］、０．１７５μｇ
／ｍｌのアミノプテリン、１３．６μｇ／ｍｌのハイポ
キサンチン、３．８８μｇ／ｍｌチミジンおよび５０μ
ｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＨＡＴ培地）を含有するダル
ベッコ変性イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）の中に懸濁した
５０％のポリエチレングリコールで融合し、そして最後
に９６ウェル（ｗｅｌｌ）の培養プレートの中に分配し
た。１０〜１４日間培養した後、リンパ球のＨＰＲＴ陽
性表現型のために生存するハイブリドーマの上澄み液（
ほぼ３０％）を固相ＥＬＩＳＡにおける抗体のスクリー
ニングのために集める。適当な抗体を産生することが決
定されるもの（上澄み液中で高い力価絶えず達成するこ
とによって−−前述のほぼ３０％のうちほぼ２５％、正
味についてほぼ７％）を、さらに、問題の抗体を産生す
るための制限希釈手順によりサブクローニングする。
クローナル抗体の発生Ｂａｌｂ／Ｃマウス、６〜１０週
齢、を、チャールス・リバー・ブリーディング・ラボラ
トリーズ（マサチュセッツ州ウィルミントン）から購入
した。これらのマウスを完全フロインドアジュバントの
中に乳濁した１００ｍｇのｐＳＴで免疫化し、その後３
週毎に５０ｍｇのｐＳＴで促進する。それらの脾臓を最
後の促進後３日に取り出し、そしてリンパ球の単細胞の
懸濁液を調製する。これらのリンパ球をハイポキサンチ
ンフィオスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ
）を欠くＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞と、２０％の胎児
仔ウシ血清［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）］、０．１７５μｇ
／ｍｌのアミノプテリン、１３．６μｇ／ｍｌのハイポ
キサンチン、３．８８μｇ／ｍｌチミジンおよび５０μ
ｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＨＡＴ培地）を含有するダル
ベッコ変性イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）の中に懸濁した
５０％のポリエチレングリコールで融合し、そして最後
に９６ウェル（ｗｅｌｌ）の培養プレートの中に分配し
た。１０〜１４日間培養した後、リンパ球のＨＰＲＴ陽
性表現型のために生存するハイブリドーマの上澄み液（
ほぼ３０％）を固相ＥＬＩＳＡにおける抗体のスクリー
ニングのために集める。適当な抗体を産生することが決
定されるもの（上澄み液中で高い力価絶えず達成するこ
とによって−−前述のほぼ３０％のうちほぼ２５％、正
味についてほぼ７％）を、さらに、問題の抗体を産生す
るための制限希釈手順によりサブクローニングする。
【００３５】３つのハイブリドーマは、とくに興味ある
クローンを産生する。これらのハイブリドーマの試料は
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈ
ｅＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受託され、そしてそれらの
ハイブリドーマにより産生された問題のモノクローナル
抗体の表示と一緒に表１に示すように、受け入れ番号を
割り当てられた：
クローンを産生する。これらのハイブリドーマの試料は
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈ
ｅＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受託され、そしてそれらの
ハイブリドーマにより産生された問題のモノクローナル
抗体の表示と一緒に表１に示すように、受け入れ番号を
割り当てられた：
【００３６】
【表１】
表１ハイブリドーマ
受け入れ番号 モノクロ
ーナル抗体ＰＳ−３．１２ ＡＴＣＣ ＨＢ
１０４１５ ＭｏＡｂ ＰＳ−３．１２ＰＳ
−７．６ ＡＴＣＣ ＨＢ １０４１６
ＭｏＡｂ ＰＳ−７．６ＰＳ−８．３
ＡＴＣＣ ＨＢ １０４１７ ＭｏＡ
ｂ ＰＳ−８．３＊ ＭｏＡｂはモノクローナル抗
体を表わす。
表１ハイブリドーマ
受け入れ番号 モノクロ
ーナル抗体ＰＳ−３．１２ ＡＴＣＣ ＨＢ
１０４１５ ＭｏＡｂ ＰＳ−３．１２ＰＳ
−７．６ ＡＴＣＣ ＨＢ １０４１６
ＭｏＡｂ ＰＳ−７．６ＰＳ−８．３
ＡＴＣＣ ＨＢ １０４１７ ＭｏＡ
ｂ ＰＳ−８．３＊ ＭｏＡｂはモノクローナル抗
体を表わす。
【００３７】選択したクローンを、抗体を含有する腹水
の産生のためにプリスタンでプライミングしたＢａｌｂ
／Ｃマウスマウスに腹腔内注射する。モノクローナル抗
体のアイソタイプの同定は、抗体アイソタイピングキッ
ト［ザイムド・ラボラトリーズ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州サンフランシ
スコ］で実施する。ＰＳ−７．６と表示するモノクロー
ナル抗体を、この実施例１におけるそれ以上の研究のた
めに例として選択する。
の産生のためにプリスタンでプライミングしたＢａｌｂ
／Ｃマウスマウスに腹腔内注射する。モノクローナル抗
体のアイソタイプの同定は、抗体アイソタイピングキッ
ト［ザイムド・ラボラトリーズ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州サンフランシ
スコ］で実施する。ＰＳ−７．６と表示するモノクロー
ナル抗体を、この実施例１におけるそれ以上の研究のた
めに例として選択する。
【００３８】２、抗体の調製
腹水をマウスの腹腔から集め、そしてＩｇを５０％の硫
酸アンモニウム沈澱技術により精製する。あるいは、試
料を５０％に結合緩衝液（３モルのＨＣｌ、１．５モル
のグリシン、ｐＨ８．９）で希釈し、そして急速タンパ
ク質液体クロマトグラフィー系の調製用プロテインＡス
パロースＨＲ１６／５カラム［ファーマシア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）、ニュージャージイ州ピスカタウェイ］上
に供給する。非Ｉｇ分画を結合緩衝液でカラムから溶離
し、そして結合したＩｇを引き続いてカラムを０．１モ
ルのクエン酸、ｐＨ３、ですすぐことによって集める。 それを直ちにｐＨ７〜８に２モルのトリス緩衝液、ｐＨ
８．２、で中和する。両者の手順により調製された抗体
をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に対してよく透析し、限外
濾過［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、マサチュセッツ州デ
ンバース］により濃縮し、アリコートと取り、そして最
後に−２０℃において使用するまで貯蔵する。
酸アンモニウム沈澱技術により精製する。あるいは、試
料を５０％に結合緩衝液（３モルのＨＣｌ、１．５モル
のグリシン、ｐＨ８．９）で希釈し、そして急速タンパ
ク質液体クロマトグラフィー系の調製用プロテインＡス
パロースＨＲ１６／５カラム［ファーマシア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）、ニュージャージイ州ピスカタウェイ］上
に供給する。非Ｉｇ分画を結合緩衝液でカラムから溶離
し、そして結合したＩｇを引き続いてカラムを０．１モ
ルのクエン酸、ｐＨ３、ですすぐことによって集める。 それを直ちにｐＨ７〜８に２モルのトリス緩衝液、ｐＨ
８．２、で中和する。両者の手順により調製された抗体
をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に対してよく透析し、限外
濾過［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、マサチュセッツ州デ
ンバース］により濃縮し、アリコートと取り、そして最
後に−２０℃において使用するまで貯蔵する。
【００３９】３、固相ＥＬＩＳＡ
抗原をＰＢＳの中に溶解し、そして１００μｌの１μｇ
を９６ウェルの平らな底のポリスチレンプレートの各ウ
ェルに添加する。１時間インキュベーションした後、プ
レートを０．０５％のツイーン−２０を含有するＰＢＳ
で３回オートマチックプレート洗浄装置［ダイナテク・
ウォッシ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｗａｓｈ）ＩＩ、バー
ジニア州チャチリー］により洗浄する。各ウェルを２０
０ｍｌの２％のウシ血清アルブミン［シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）］で分散し、そしてプレートをさらに１時間インキ
ュベーションする。試験試料をウェルに添加し、３０分
間インキュベーションし、ＰＢＳで６回洗浄し、そして
１００μｌのアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウ
スＩｇＧのＦ（ａｂ’）２［［ザイムド・ラボラトリー
ズ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリ
フォルニア州サンフランシスコ］を添加する。プレート
を再び３０分間インキュベーション後各し、そして０．
１モルのジエタノールアミン、ｐＨ１０．３、中の１０
０μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート［１ｍｇ／ｍ
ｌ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）］を色の発現のための基質と
して添加する。最後に、比色の応答を光学密度（ＯＤ）
としてＥＬＩＳＡプレートのリーダーにより４０５ｎｍ
の波長において記録する。インキュベーションの手順は
常に３７℃において実施する。
を９６ウェルの平らな底のポリスチレンプレートの各ウ
ェルに添加する。１時間インキュベーションした後、プ
レートを０．０５％のツイーン−２０を含有するＰＢＳ
で３回オートマチックプレート洗浄装置［ダイナテク・
ウォッシ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｗａｓｈ）ＩＩ、バー
ジニア州チャチリー］により洗浄する。各ウェルを２０
０ｍｌの２％のウシ血清アルブミン［シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）］で分散し、そしてプレートをさらに１時間インキ
ュベーションする。試験試料をウェルに添加し、３０分
間インキュベーションし、ＰＢＳで６回洗浄し、そして
１００μｌのアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウ
スＩｇＧのＦ（ａｂ’）２［［ザイムド・ラボラトリー
ズ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリ
フォルニア州サンフランシスコ］を添加する。プレート
を再び３０分間インキュベーション後各し、そして０．
１モルのジエタノールアミン、ｐＨ１０．３、中の１０
０μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート［１ｍｇ／ｍ
ｌ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）］を色の発現のための基質と
して添加する。最後に、比色の応答を光学密度（ＯＤ）
としてＥＬＩＳＡプレートのリーダーにより４０５ｎｍ
の波長において記録する。インキュベーションの手順は
常に３７℃において実施する。
【００４０】４、モノクローナル抗体ＰＳ−７．６の特
性決定 ＰＳ−７．６モノクローナル抗体の免疫特異性を固相Ｅ
ＬＩＳＡにより試験する。種々の抗原を９６ウェルのプ
レートの中にコーティングし、そしてモノクローナル抗
体ＰＳ−７．６腹水の１系列の希釈物を相互作用のため
に添加する。図１はモノクローナル抗体ＰＳ−７．６が
ｐＳＴ抗原に対して顕著によく応答することを示す。そ
れは、また、ｂＳＴとのわずかの交差反応性を示すが、
ｃＳＴ、ＰＲＬ、ＳＲＩＦおよびＧＲＦと交差反応しな
い。
性決定 ＰＳ−７．６モノクローナル抗体の免疫特異性を固相Ｅ
ＬＩＳＡにより試験する。種々の抗原を９６ウェルのプ
レートの中にコーティングし、そしてモノクローナル抗
体ＰＳ−７．６腹水の１系列の希釈物を相互作用のため
に添加する。図１はモノクローナル抗体ＰＳ−７．６が
ｐＳＴ抗原に対して顕著によく応答することを示す。そ
れは、また、ｂＳＴとのわずかの交差反応性を示すが、
ｃＳＴ、ＰＲＬ、ＳＲＩＦおよびＧＲＦと交差反応しな
い。
【００４１】抗原依存性、ビオチン−アビジン増幅ＥＬ
ＩＳＡにより決定したモノクローナル抗体ＰＳ−７．６
のアイソタイプは、ｋ軽鎖特性をもつＩｇＧ１である。
ＩＳＡにより決定したモノクローナル抗体ＰＳ−７．６
のアイソタイプは、ｋ軽鎖特性をもつＩｇＧ１である。
【００４２】５、ｐＳＴおよび抗体についての生物学的
アッセイ 前述したように発生したモノクローナル抗体の免疫反応
性をｐＳＴと組み合わせて検査する。雌のスプレイグ−
ダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット、２
１日齢および体重５０〜６５ｇ、をタコニック・ファー
ム（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍ）（ニューヨーク州ジ
ャーマンタウン）から入手した。下垂体を外科的に除去
した結果、成長を欠く、これらの下垂体切除したラット
を使用してバイオアッセイを実施する。受け渡し後、こ
れらのラットをさらに７〜１０日間観察して完全な下垂
体切除を保証する。動物を不規則的に８匹のラット／群
に割り当てる。２群の対照動物をすべての実験に常に含
める。第１群は、陰性の対照として働く、未処置の下垂
体切除したラットから成る。他方の対照群は、毎日の注
射により最小の有効投与量のｐＳＴ（５μｇ）を与えら
れ、こうして陽性の対照として働く、下垂体切除したラ
ットから成る。室温において１時間５μｇのｐＳＴと混
合した抗体（０．５〜１ｍｇ）を、各実験ラットの首の
領域に皮下投与する。これらの動物の成長を個々に監視
し、そして実験の過程の間に体重増加として記録する。
アッセイ 前述したように発生したモノクローナル抗体の免疫反応
性をｐＳＴと組み合わせて検査する。雌のスプレイグ−
ダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット、２
１日齢および体重５０〜６５ｇ、をタコニック・ファー
ム（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍ）（ニューヨーク州ジ
ャーマンタウン）から入手した。下垂体を外科的に除去
した結果、成長を欠く、これらの下垂体切除したラット
を使用してバイオアッセイを実施する。受け渡し後、こ
れらのラットをさらに７〜１０日間観察して完全な下垂
体切除を保証する。動物を不規則的に８匹のラット／群
に割り当てる。２群の対照動物をすべての実験に常に含
める。第１群は、陰性の対照として働く、未処置の下垂
体切除したラットから成る。他方の対照群は、毎日の注
射により最小の有効投与量のｐＳＴ（５μｇ）を与えら
れ、こうして陽性の対照として働く、下垂体切除したラ
ットから成る。室温において１時間５μｇのｐＳＴと混
合した抗体（０．５〜１ｍｇ）を、各実験ラットの首の
領域に皮下投与する。これらの動物の成長を個々に監視
し、そして実験の過程の間に体重増加として記録する。
【００４３】結果を、８匹のラットの各群について、平
均の体重増加として平均の標準偏差と一緒に表す。統計
学的分析システムの一般線形モデルを使用して、不規則
化したデザインについての変動の最小自乗分析により、
統計学的評価を実施する。特記しない限り、分析は処置
を受けなかった陰性の対照との比較により行う。
均の体重増加として平均の標準偏差と一緒に表す。統計
学的分析システムの一般線形モデルを使用して、不規則
化したデザインについての変動の最小自乗分析により、
統計学的評価を実施する。特記しない限り、分析は処置
を受けなかった陰性の対照との比較により行う。
【００４４】６、モノクローナル抗体ＰＳ−７．６を使
用する成長の増強 ｐＳＴとともに投与したモノクローナル抗体ｐ７の成長
増強作用を下垂体切除したラットにおいて評価する。下
垂体切除したラットを前述したように４つの群に分ける
。未処置対照動物に５μｇのｐＳＴを５日間毎日注射す
ると、それらの成長パターンの勾配の増加により証明さ
れるように、有意の体重増加が生成する。しかしながら
、この作用は短い。なぜなら、これらの対照動物の加速
された成長曲線は、ｐＳＴの処置を５日に停止するとす
ぐに遅くなるからである。未処置対照は１６日間の期間
にわたって遅延する成長速度を示す（図２）。対照的に
、ｐＳＴの成長促進作用は、ｐＳＴおよびモノクローナ
ル抗体ＰＳ−７．６の両者を投与の前に室温において１
時間インキュベーションすると、モノクローナル抗体Ｐ
Ｓ−７．６により増強されかつ１６日の期間にわたって
延長する。モノクローナル抗体ＰＳ−７．６単独の注射
は無効である。
用する成長の増強 ｐＳＴとともに投与したモノクローナル抗体ｐ７の成長
増強作用を下垂体切除したラットにおいて評価する。下
垂体切除したラットを前述したように４つの群に分ける
。未処置対照動物に５μｇのｐＳＴを５日間毎日注射す
ると、それらの成長パターンの勾配の増加により証明さ
れるように、有意の体重増加が生成する。しかしながら
、この作用は短い。なぜなら、これらの対照動物の加速
された成長曲線は、ｐＳＴの処置を５日に停止するとす
ぐに遅くなるからである。未処置対照は１６日間の期間
にわたって遅延する成長速度を示す（図２）。対照的に
、ｐＳＴの成長促進作用は、ｐＳＴおよびモノクローナ
ル抗体ＰＳ−７．６の両者を投与の前に室温において１
時間インキュベーションすると、モノクローナル抗体Ｐ
Ｓ−７．６により増強されかつ１６日の期間にわたって
延長する。モノクローナル抗体ＰＳ−７．６単独の注射
は無効である。
【００４５】別の実験において、抗体の作用の極めて長
い持続性（５６日）が実証される（図３）。ｐＳＴ単独
を５回毎日注射された動物は、再び、最初の８日間未処
置対照を越えた有意の体重増加を示すが、５６日後の全
体の成長は未処置対照と同一である。ｐＳＴとモノクロ
ーナル抗体ＰＳ−７．６との組み合わせの投与は、成長
をさらに高くするばかりでなく、かつまた最初の処置後
２８日程度に長い間、処置または未処置の対照より有意
に重い体重にこれらの動物を維持する（ｐ＜０．０１）
。両者の対照群からのこのラットの体重増加における認
め得る差は、少なくとも５６日間持続する（対照より２
５％の増加）。
い持続性（５６日）が実証される（図３）。ｐＳＴ単独
を５回毎日注射された動物は、再び、最初の８日間未処
置対照を越えた有意の体重増加を示すが、５６日後の全
体の成長は未処置対照と同一である。ｐＳＴとモノクロ
ーナル抗体ＰＳ−７．６との組み合わせの投与は、成長
をさらに高くするばかりでなく、かつまた最初の処置後
２８日程度に長い間、処置または未処置の対照より有意
に重い体重にこれらの動物を維持する（ｐ＜０．０１）
。両者の対照群からのこのラットの体重増加における認
め得る差は、少なくとも５６日間持続する（対照より２
５％の増加）。
【００４６】図３の投与のパターンは、非特異的Ｉｇの
追加の対照を含めて反復する。５日後の結果を図４に表
す。ｐＳＴ単独による処置は、再び、処置対照（体重増
加＝２．９ｇ；ｐ＜０．０１）と比較したとき、下垂体
切除したラットの成長を顕著に強化する（体重増加＝６
．６ｇ）。ｐＳＴをＳＰ２／０骨髄腫腹水（アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション、マリイランド州
ロックビレ）からの対照Ｉｇとの混合はｐＳＴ活性を増
強しない（体重増加＝７．６ｇ；ｐ＜０．５）が、ｐＳ
Ｔとモノクローナル抗体ＰＳ−７．６との混合はこの作
用を有意に高める（体重増加＝１０ｇ；ｐ＜０．０５）
。
追加の対照を含めて反復する。５日後の結果を図４に表
す。ｐＳＴ単独による処置は、再び、処置対照（体重増
加＝２．９ｇ；ｐ＜０．０１）と比較したとき、下垂体
切除したラットの成長を顕著に強化する（体重増加＝６
．６ｇ）。ｐＳＴをＳＰ２／０骨髄腫腹水（アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション、マリイランド州
ロックビレ）からの対照Ｉｇとの混合はｐＳＴ活性を増
強しない（体重増加＝７．６ｇ；ｐ＜０．５）が、ｐＳ
Ｔとモノクローナル抗体ＰＳ−７．６との混合はこの作
用を有意に高める（体重増加＝１０ｇ；ｐ＜０．０５）
。
【００４７】７、ｐＳＴ活性の増強へのモノクローナル
抗体ＰＳ−７．６の投与量の応答効果 下垂体切除したラットを５μｇ／日のｐＳＴを種々の投
与量のモノクローナル抗体ＰＳ−７．６と一緒に５日間
連続的に処置することによって、投与量の応答の研究を
実施する。成長は１０日にスコアをつける。未処置ラッ
トは実験の全過程にわたって１ｇのみ体重を増加する。 図５におけるデータが示すように、ｐＳＴ単独を与えら
れた動物は６．４ｇの体重増加を生成する。しかしなが
ら、モノクローナル抗体ＰＳ−７．６を使用する組み合
わせの処置は０．１〜２ｍｇ／処置の投与量の範囲にわ
たってｐＳＴの作用を有意に増強し、ピークの活性は０
．５および１ｍｇ／処置においてである（体重増加＝そ
れぞれ、９．４および９．５ｇ）。
抗体ＰＳ−７．６の投与量の応答効果 下垂体切除したラットを５μｇ／日のｐＳＴを種々の投
与量のモノクローナル抗体ＰＳ−７．６と一緒に５日間
連続的に処置することによって、投与量の応答の研究を
実施する。成長は１０日にスコアをつける。未処置ラッ
トは実験の全過程にわたって１ｇのみ体重を増加する。 図５におけるデータが示すように、ｐＳＴ単独を与えら
れた動物は６．４ｇの体重増加を生成する。しかしなが
ら、モノクローナル抗体ＰＳ−７．６を使用する組み合
わせの処置は０．１〜２ｍｇ／処置の投与量の範囲にわ
たってｐＳＴの作用を有意に増強し、ピークの活性は０
．５および１ｍｇ／処置においてである（体重増加＝そ
れぞれ、９．４および９．５ｇ）。
【００４８】８、ｐＳＴ活性の増強へのモノクローナル
抗体ＰＳ−７．６の処置の頻度の効果 ５μｇ／日のｐＳＴまたはｐＳＴ＋１ｍｇのモノクロー
ナル抗体ＰＳ−７．６を１〜５日の連続期間の間下垂体
切除したラットに毎日注射し、そして第８日に成長のス
コアをつける。ｐＳＴ単独の効果は、これらのラットが
３回またはそれ以上の注射を受けるまで、明らかではな
い。対照的に、ｐＳＴとモノクローナル抗体ＰＳ−７．
６との組み合わせの処置による体重増加の顕著な増加は
、第３回の注射後にまさに明らかである。体重増加の有
意差は５回の注射後において２つの処置群の間に維持さ
れる；事実、ｐＳＴとモノクローナル抗体ＰＳ−７．６
との組み合わせを与えられた群は、わずかに２回の注射
後、ｐＳＴ単独を与えられた５回の注射後のそれより、
体重増加が大きく増加する。
抗体ＰＳ−７．６の処置の頻度の効果 ５μｇ／日のｐＳＴまたはｐＳＴ＋１ｍｇのモノクロー
ナル抗体ＰＳ−７．６を１〜５日の連続期間の間下垂体
切除したラットに毎日注射し、そして第８日に成長のス
コアをつける。ｐＳＴ単独の効果は、これらのラットが
３回またはそれ以上の注射を受けるまで、明らかではな
い。対照的に、ｐＳＴとモノクローナル抗体ＰＳ−７．
６との組み合わせの処置による体重増加の顕著な増加は
、第３回の注射後にまさに明らかである。体重増加の有
意差は５回の注射後において２つの処置群の間に維持さ
れる；事実、ｐＳＴとモノクローナル抗体ＰＳ−７．６
との組み合わせを与えられた群は、わずかに２回の注射
後、ｐＳＴ単独を与えられた５回の注射後のそれより、
体重増加が大きく増加する。
【００４９】実施例２
実施例１の工程１〜４を反復して、モノクローナル抗体
ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８．３を発生させ、精製し
、そして特性決定する。これらの抗体を使用する成長の
増強は、下垂体切除したラットにおいて、モノクローナ
ル抗体ＰＳ−７．６と比較して評価する。下垂体切除し
たラットを、実施例１の工程５における手順の適用にお
いて、５つの群に分割する。第１群は未処置対照である
；第２群は５μｇのｐＳＴを５日間の注射により与えら
れる；他の群は５日間５μｇのｐＳＴ＋、それぞれ、１
．０ｍｇのモノクローナル抗体ＰＳ−３．１２、ＰＳ−
７．６およびＰＳ−８．３を与えられる。５日後の結果
を図７に表す。ｐＳＴ単独による処置は、未処置対照（
体重増加＝１．９ｇ）と比較したとき、下垂体切除した
ラットの成長を顕著に強化する；ｐ＜０．０１。ｐＳＴ
および３つのモノクローナル抗体の各々との組み合わせ
による処置は、その作用を有意に高める（ＰＳ−３．１
２の体重増加＝９．４ｇ；ｐ＜０．００１；ＰＳ−７．
６の体重増加＝１０．０ｇ；ｐ＜０．００１；ＰＳ−８
．３の体重増加＝９．４；ｐ＜０．００１）。
ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８．３を発生させ、精製し
、そして特性決定する。これらの抗体を使用する成長の
増強は、下垂体切除したラットにおいて、モノクローナ
ル抗体ＰＳ−７．６と比較して評価する。下垂体切除し
たラットを、実施例１の工程５における手順の適用にお
いて、５つの群に分割する。第１群は未処置対照である
；第２群は５μｇのｐＳＴを５日間の注射により与えら
れる；他の群は５日間５μｇのｐＳＴ＋、それぞれ、１
．０ｍｇのモノクローナル抗体ＰＳ−３．１２、ＰＳ−
７．６およびＰＳ−８．３を与えられる。５日後の結果
を図７に表す。ｐＳＴ単独による処置は、未処置対照（
体重増加＝１．９ｇ）と比較したとき、下垂体切除した
ラットの成長を顕著に強化する；ｐ＜０．０１。ｐＳＴ
および３つのモノクローナル抗体の各々との組み合わせ
による処置は、その作用を有意に高める（ＰＳ−３．１
２の体重増加＝９．４ｇ；ｐ＜０．００１；ＰＳ−７．
６の体重増加＝１０．０ｇ；ｐ＜０．００１；ＰＳ−８
．３の体重増加＝９．４；ｐ＜０．００１）。
【００５０】本発明の主な特徴および態様は次の通りで
ある。
ある。
【００５１】１、モノクローナル抗体がＰＳ−７．６、
ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８．３と表示するモノクロ
ーナル抗体から成る群より選択される、ブタのソマトト
ロピン（ｐＳＴ）またはｐＳＴの抗原性同等因子に対す
るモノクローナル抗体。
ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８．３と表示するモノクロ
ーナル抗体から成る群より選択される、ブタのソマトト
ロピン（ｐＳＴ）またはｐＳＴの抗原性同等因子に対す
るモノクローナル抗体。
【００５２】２、モノクローナル抗体はＰＳ−７．６と
表示されるものである上記第１項記載のモノクローナル
抗体。
表示されるものである上記第１項記載のモノクローナル
抗体。
【００５３】３、モノクローナル抗体はＰＳ−３．１２
と表示されるものである上記第１項記載のモノクローナ
ル抗体。
と表示されるものである上記第１項記載のモノクローナ
ル抗体。
【００５４】４、モノクローナル抗体はＰＳ−８．３と
表示されるものである上記第１項記載のモノクローナル
抗体。
表示されるものである上記第１項記載のモノクローナル
抗体。
【００５５】５、組成物で処置された脊椎動物の体重が
、所定の期間にわたってソマトトロピン単独の同一量で
処置した脊椎動物の体重を、延長した期間にわたって、
越え続けるように、成分： （ａ）有効成長増強量のソマトトロピン、（ｂ）有効ソ
マトトロピン強化量の前記ソマトトロピンまたは前記ソ
マトトロピンの抗原性同等因子に対する抗体、および （ｃ）製剤学的に許容されうる担体、からなる組成物。
、所定の期間にわたってソマトトロピン単独の同一量で
処置した脊椎動物の体重を、延長した期間にわたって、
越え続けるように、成分： （ａ）有効成長増強量のソマトトロピン、（ｂ）有効ソ
マトトロピン強化量の前記ソマトトロピンまたは前記ソ
マトトロピンの抗原性同等因子に対する抗体、および （ｃ）製剤学的に許容されうる担体、からなる組成物。
【００５６】６、ソマトトロピンはｐＳＴである上記第
５項記載の組成物。
５項記載の組成物。
【００５７】７、抗体はモノクローナル抗体である上記
第６項記載の組成物。
第６項記載の組成物。
【００５８】８、成分：
（ａ）有効成長増強量のブタのソマトトロピン（ｐＳＴ
）、（ｂ）有効ｐＳＴ強化量のｐＳＴまたはｐＳＴの抗
原性同等因子に対するモノ クローナル抗体、ここで前記モノクローナル抗体はＰＳ
−７．６、ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８．３と表示す
るモノクローナル抗体から成る群より選択される、およ
び （ｃ）製剤学的に許容されうる担体、からなる製剤学的
組成物。
）、（ｂ）有効ｐＳＴ強化量のｐＳＴまたはｐＳＴの抗
原性同等因子に対するモノ クローナル抗体、ここで前記モノクローナル抗体はＰＳ
−７．６、ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８．３と表示す
るモノクローナル抗体から成る群より選択される、およ
び （ｃ）製剤学的に許容されうる担体、からなる製剤学的
組成物。
【００５９】９、ＰＳ−７．６、ＰＳ−３．１２および
ＰＳ−８．３と表示するモノクローナル抗体から成る群
より選択されるモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ。
ＰＳ−８．３と表示するモノクローナル抗体から成る群
より選択されるモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ。
【図１】種々の抗原に対するモノクローナル抗体ＰＳ−
７．６の免疫特異性の研究の結果を示すグラフであり、
ここでｐＳＴ、ｂＳＴおよびｃＳＴは、それぞれ、ブタ
、ウシおよびニワトリのソマトトロピンであり、ＰＲＬ
はプロラクチンであり、ＳＲＩＦはソマトスタチンであ
り、そしてＧＲＦは成長ホルモン解放因子である。図１
およびいくつかの引き続く図において、モノクローナル
抗体は「ＭｏＡｂ」と略す。
７．６の免疫特異性の研究の結果を示すグラフであり、
ここでｐＳＴ、ｂＳＴおよびｃＳＴは、それぞれ、ブタ
、ウシおよびニワトリのソマトトロピンであり、ＰＲＬ
はプロラクチンであり、ＳＲＩＦはソマトスタチンであ
り、そしてＧＲＦは成長ホルモン解放因子である。図１
およびいくつかの引き続く図において、モノクローナル
抗体は「ＭｏＡｂ」と略す。
【図２】ｐＳＴ単独、モノクローナル抗体ＰＳ−７．６
単独、ｐＳＴとモノクローナル抗体ＰＳ−７．６との組
み合わせで処置した、または処置なしの、下垂体切除し
たラットの成長への効果を比較する時間経過の研究の結
果を示すグラフである。この図、ならびに図３、４およ
び６における星印は、次のような統計学的に有意の結果
を表す：★＝＜０．０５；★★＝＜０．０１；★★★＝
＜０．００１。
単独、ｐＳＴとモノクローナル抗体ＰＳ−７．６との組
み合わせで処置した、または処置なしの、下垂体切除し
たラットの成長への効果を比較する時間経過の研究の結
果を示すグラフである。この図、ならびに図３、４およ
び６における星印は、次のような統計学的に有意の結果
を表す：★＝＜０．０５；★★＝＜０．０１；★★★＝
＜０．００１。
【図３】ｐＳＴ単独、ｐＳＴとモノクローナル抗体ＰＳ
−７．６との組み合わせで処置した、または処置なしの
、下垂体切除したラットの成長への効果を比較する長時
間（５６日）の時間経過の研究の結果を示すグラフであ
る。
−７．６との組み合わせで処置した、または処置なしの
、下垂体切除したラットの成長への効果を比較する長時
間（５６日）の時間経過の研究の結果を示すグラフであ
る。
【図４】ｐＳＴ単独、ｐＳＴとＳＰ２／０骨髄腫腹水か
らの対照との組み合わせ、ｐＳＴとモノクローナル抗体
ＰＳ−７．６との組み合わせで処置した、または処置な
しの、下垂体切除したラットの成長への効果の結果を示
すグラフである。
らの対照との組み合わせ、ｐＳＴとモノクローナル抗体
ＰＳ−７．６との組み合わせで処置した、または処置な
しの、下垂体切除したラットの成長への効果の結果を示
すグラフである。
【図５】下垂体切除したラットの成長への、モノクロー
ナル抗体ＰＳ−７．６＋ｐＳＴの投与、ｐＳＴ単独の投
与および処置なし（ｐＳＴを使用せず）の応答の比較の
グラフである。
ナル抗体ＰＳ−７．６＋ｐＳＴの投与、ｐＳＴ単独の投
与および処置なし（ｐＳＴを使用せず）の応答の比較の
グラフである。
【図６】ｐＳＴ単独またはｐＳＴとモノクローナル抗体
ＰＳ−７．６による処置の頻度（１回の注射／日）の下
垂体切除したラットの成長への効果のグラフである。
ＰＳ−７．６による処置の頻度（１回の注射／日）の下
垂体切除したラットの成長への効果のグラフである。
【図７】ｐＳＴ単独、ｐＳＴとモノクローナル抗体、そ
れぞれ、ＰＳ−３．１２、ＰＳ−７．６およびＰＳ−８
．３との組み合わせで処置した、または処置なしの、下
垂体切除したラットの成長への効果のグラフである。
れぞれ、ＰＳ−３．１２、ＰＳ−７．６およびＰＳ−８
．３との組み合わせで処置した、または処置なしの、下
垂体切除したラットの成長への効果のグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】 モノクローナル抗体がＰＳ−７．６、
ＰＳ−３．１２およびＰＳ−８．３と表示するモノクロ
ーナル抗体から成る群より選択される、ブタのソマトト
ロピン（ｐＳＴ）またはｐＳＴの抗原性同等因子に対す
るモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 組成物で処置された脊椎動物の体重が
、所定の期間にわたってソマトトロピン単独の同一量で
処置した脊椎動物の体重を、延長した期間にわたって、
越え続けるように、成分： （ａ）有効成長増強量のソマトトロピン、（ｂ）有効ソ
マトトロピン強化量の前記ソマトトロピンまたは前記ソ
マトトロピンの抗原性同等因子に対する抗体、および （ｃ）製剤学的に許容されうる担体、からなる組成物。 - 【請求項３】 成分：（ａ）有効成長増強量のブタの
ソマトトロピン（ｐＳＴ）、 （ｂ）有効ｐＳＴ強化量のｐＳＴまたはｐＳＴの抗原性
同等因子に対するモノクローナル抗体、ここで前記モノ
クローナル抗体はＰＳ−７．６、ＰＳ−３．１２および
ＰＳ−８．３と表示するモノクローナル抗体から成る群
より選択される、および （ｃ）製剤学的に許容されうる担体、からなる製剤学的
組成物。 - 【請求項４】 ＰＳ−７．６、ＰＳ−３．１２および
ＰＳ−８．３と表示するモノクローナル抗体から成る群
より選択されるモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US521695 | 1990-05-15 | ||
| US07/521,695 US6165465A (en) | 1990-05-15 | 1990-05-15 | Immunologic enhancement of the somatogenic effect of somatotropin with an antibody |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04228091A true JPH04228091A (ja) | 1992-08-18 |
Family
ID=24077752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3135262A Pending JPH04228091A (ja) | 1990-05-15 | 1991-05-13 | 抗体を使用するソマトトロピンの体発達作用の免疫学的増強 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6165465A (ja) |
| EP (1) | EP0458072B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04228091A (ja) |
| KR (1) | KR910019639A (ja) |
| AT (1) | ATE127849T1 (ja) |
| AU (1) | AU648303B2 (ja) |
| CA (1) | CA2042437A1 (ja) |
| DE (1) | DE69112904T2 (ja) |
| DK (1) | DK0458072T3 (ja) |
| ES (1) | ES2076399T3 (ja) |
| FI (1) | FI98828C (ja) |
| GR (1) | GR3017412T3 (ja) |
| IE (1) | IE69575B1 (ja) |
| IL (1) | IL97933A (ja) |
| NO (1) | NO911877L (ja) |
| NZ (1) | NZ238070A (ja) |
| PT (1) | PT97650B (ja) |
| ZA (1) | ZA913646B (ja) |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341012C (en) * | 1982-09-27 | 2000-06-06 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swine growth hormone-like polypeptides |
| AU2092983A (en) * | 1982-11-08 | 1984-05-17 | Genentech Inc. | Porcine growth hormone produced by recombinant dna technology |
| US4925922A (en) * | 1983-02-22 | 1990-05-15 | Xoma Corporation | Potentiation of cytotoxic conjugates |
| PH26708A (en) * | 1983-08-17 | 1992-09-15 | Wellcome Found | Physiologically active compositions containing anti-hormone anti-bodies and their use |
| US4599229A (en) * | 1985-09-09 | 1986-07-08 | International Minerals & Chemical Corp. | Method of promoting animal growth using antibodies against somatostatin |
| US4764475A (en) * | 1986-12-01 | 1988-08-16 | The University Of British Columbia | Pancreas dependant immunoassay for determining subpopulations of monoclonal antibodies to somatostatin. |
| GB8707398D0 (en) * | 1987-03-27 | 1987-04-29 | Coopers Animal Health | Biologically active molecules |
| AU630591B2 (en) * | 1987-07-06 | 1992-11-05 | Peptide Technology Limited | Growth hormone related peptide |
| GB8718937D0 (en) * | 1987-08-11 | 1987-09-16 | Coopers Animal Health | Biologically active molecules |
| NZ225760A (en) * | 1987-08-14 | 1991-02-26 | Bio Technology General Corp | Expression plasmids containing the deo promoter and bacterial hosts containing these plasmids |
| US4837202A (en) * | 1987-09-14 | 1989-06-06 | Pitman-Moore, Inc. | Method for stimulating the immune system |
| DK8189A (da) * | 1988-01-12 | 1989-07-13 | Bunge Australia | Antigen-antistof-konjugater, deres fremstilling og anvendelse |
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- 1990-05-15 US US07/521,695 patent/US6165465A/en not_active Expired - Fee Related
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- 1991-04-22 DE DE69112904T patent/DE69112904T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1991-04-22 ES ES91106423T patent/ES2076399T3/es not_active Expired - Lifetime
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- 1991-05-13 CA CA002042437A patent/CA2042437A1/en not_active Abandoned
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- 1991-05-14 ZA ZA913646A patent/ZA913646B/xx unknown
- 1991-05-14 KR KR1019910007773A patent/KR910019639A/ko not_active Ceased
- 1991-05-14 NO NO91911877A patent/NO911877L/no unknown
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