JPH04228100A - 生化学的反応を実施するための方法および手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、生化学的反応を実施するための
方法に関し、またその方法に使用するための毛細管と反
応容器の組合せに関する。

【０００２】本発明は、試薬を前もって混合することが
できない小容量のすべての生化学的反応に適用すること
ができる。とくに、本発明は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連
鎖反応）方を意図するものである。

【０００３】最近開発されたＰＣＲ法は、多数の重要な
診断領域、たとえば多くの様々な疾患の診断、父子鑑別
、法医学等に著しい進歩をもたらした。ＲＮＡの検出を
所望の場合、必要な予備段階は、逆転写酵素によるＲＮ
ＡのＤＮＡへの変換である。エイズの診断は定常的には
、血中のＨＩＶ−ウイルスに対する抗体のＥＬＩＳＡ（
固相酵素免疫吸着検定）試験による検出によって行われ
ている。しかしながら、患者がたとえば疾患の初期段階
にあると、抗体が存在しなくても、ＨＩＶ腸性の可能性
がある。この場合、ＥＬＩＳＡ試験は陰性の結果を与え
、この患者は不本意にも他人への感染症の伝播の危険を
冒すことになる。したがって、よりよい、すなわちさら
に感受性の高いＨＩＶ試験の必要性はきわめて大きい。 以前は培養に長時間を要した他のウイルスの診断もＰＣ
Ｒ法によって改良された。

【０００４】実際の操作に関しては、ＰＣＲ診断は以下
の３段階からなる。 １）　　反応混合物の調製、すなわち試験すべきサンプ
ルの調製 ２）　　実際の増幅、すなわちＤＮＡ分子が指数的に複
製される連鎖反応、 ３）　　電気泳動またはハイブリダイゼーションによる
陽性サンプルの検出

【０００５】本発明者らが除去を目的とするＰＣＲ法の
欠点は、主として試薬を前もって混合できないことによ
り、段階１）に時間と手間のかかることであり、その結
果、多くの誤差の原因を生じることである。段階２）の
増幅および段階３）の検出結果は、段階１）の信頼性に
絶対的に依存するので、段階１）を十分な注意をもって
正確に実施することは、きわめて重要である。

【０００６】生化学的反応、たとえば上述のＰＣＲのた
めの試薬を準備する様々な段階には、別個の反応容器ま
たは試験管の間での交差汚染の危険がある。

【０００７】ＰＣＲ反応の準備に際しては、さらに、サ
ンプルを取扱う人からの、いわゆる「キャリーオーバー
汚染」の危険がある。これはとくに、特異的ＤＮＡを検
出するための定常的分析において、同じ人がＰＣＲ反応
前のすべての段階を実施し、またＰＣＲ生成物を取扱う
場合にいえる。皮膚、毛髪または実験衣に、以前に実施
した増幅からのＣＰＲ生成物の一部が付着し、それが「
偽」陽性を生じる可能性がある。偽陽性の危険は試験の
感度が高いほど大きくなる。ＨＩＶの試験はきわめて高
感度であり、偽陽性の結果がそれを指摘された人に不必
要な悲嘆を生じることはいうまでもない。

【０００８】本発明の目的は、汚染の危険を低下させる
と同時に、試薬を前もって混合しておくことができず、
その準備に時間を要する特定の生化学的反応のための小
容量の試薬の準備に必要な時間を短縮させることを目的
とするものである。

【０００９】この目的は、それぞれ「請求項１」および
「請求項６」による毛細管および反応容器を組合わせて
使用することによって達成される。

【００１０】ＤＤ−Ａ１−２２５　　７８８号には、数
個の試薬が中間に置かれた疎水性液体、たとえばパラフ
ィン、油脂、アルカンによって分離されて含まれている
毛細管が記載されている。この毛細管中で、試薬の保存
ならびにサンプルとの反応が行われる。サンプルを毛細
管に添加し、ついで毛細管を一端で熔融する。サンプル
と試薬の混合は、毛細管内に鋼製のピンが挿入され、磁
石を毛細管の外側に沿って上下方向に移動させることに
よって行われる。適当なインキュベーション期間後に毛
細管を遠心分離して、反応溶液と疎水性液体を分離した
２相として得る。反応溶液を分析できるためには、毛細
管はシールされた末端とさらに疎水性液体−反応溶液の
境界で切断しなければならず、ついで反応溶液等を、た
とえばＵＶ吸収の測定のためにキュベットに移す。

【００１１】この既知の毛細管は、前もって調製できな
い試薬の準備の問題は解決している。しかしながら、上
述の処理段階のために、慣用のピペットによる採取法と
比べて、時間の節減も汚染の危険の低下も達成されては
いない。

【００１２】本発明を以下に、添付の図面を参照しなが
ら、さらに詳細に説明する。

【００１３】図１は、試薬を含んだ試薬毛細管を包含す
る反応容器の概略図である。図２は、別の実施態様の試
薬毛細管を包含する別の実施態様の反応容器の概略図で
ある。図３は、図２に示した実施態様の平面図である。 図４は、図１に示した試薬毛細管の拡大図である。図５
は、図２に示した試薬毛細管の拡大図である。

【００１４】図１には、本発明による予め調製した反応
容器１を示す。反応容器１、たとえばエッペンドルフ管
の内部には、試薬毛細管３が配置されている。試薬毛細
管３には、所望の反応に適当な任意の種類の数種の試薬
が配置されている。反応容器１の底部には、以後の試薬
の希釈のための水または緩衝液２を配置することができ
る。

【００１５】図２には、反応容器１および試薬毛細管３
の別の好ましい実施態様に示す。反応容器１には孔部４
ａを有する蓋４が設けられている。孔部４は通過可能な
膜４ｂで覆われている。膜が適合された孔部４ａは示さ
れた実施態様では蓋４の中央に位置しているが、これは
必須の特徴ではない。実際、所望により２種以上の試薬
毛細管を入れることができるように、蓋に数個の孔部を
設けることも可能である。孔部４ａは、図５による試薬
毛細管３に対しては止め輪にもなるが、これについては
以下に詳述する。

【００１６】図４に示した試薬毛細管３は、図１に示し
た試薬容器１内に挿入するように設計されている。試薬
毛細管３には、特定の生化学的反応用の異種の試薬６〜
１３が配置されている。各試薬の量はこの特定の反応の
ためのみに計算され、意図されたものである。ＰＣＲ反
応を実施しようとする場合には、試薬溶液６〜１３は、
すべて特定のＰＣＲ反応のために計算された試薬、ＰＣ
Ｒ緩衝液、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰお
よび２種以上のオリゴヌクレオチド、ならびに熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼからなる。試薬間には空気または不
活性流体を置く。通常、相互の順序は任意である。

【００１７】図５には改良された試薬毛細管３を示す。 この試薬毛細管は、図２の反応容器に挿入するように設
計されたものである。この試薬毛細管は、図４に示した
試薬毛細管とは、毛細管の下方部に環状の固定溝５が孔
部４ａにぴったりはまるように設けられている点で異な
っている。さらに、毛細管の上方端には保護カバー１５
がはめ込まれている。図２による反応容器と図６による
試薬毛細管は使用時まで別個に保存される。使用に際し
ては、毛細管３の下方端を、反応容器１の蓋４における
通過可能な膜４ｂを貫いて押し込み、固定溝５を孔部４
ａによって形成された止め輪にはめ込む。保護カバー１
５は、反応容器１へ試薬毛細管３を挿入し、押し込む過
程での汚染から、試薬毛細管３の内容物を保護する。試
薬毛細管３内の試薬溶液が解凍されている場合には、つ
いでこれらを遠心分離に付して、互いにまた必要な場合
には容器１の底部の希釈と混合する。遠心分離後、蓋４
から毛細管３をはずさないまま、蓋４を開くことができ
る。この利点は、所望により物質を反応容器に容易に加
えること、また反応容器から容易に物質を抽出すること
を可能にする。

【００１８】試薬毛細管を製造したのち、すなわち、手
動または自動で各種試薬をその間に空気または不活性流
体を置いて吸引したのち、それらを別個にまたは反応容
器内に入れて包装し、特定の生化学的反応を実施するた
めのキッドとすることができる。もちろん、これらの包
装は滅菌条件下に行われる。

【００１９】毛細管を製造する別の方法としては、試薬
を間に空気または不活性流体をはさんで毛細管内に吸引
し、毛細管を凍結させ、毛細管を空気の区画で切断し、
所望の毛細管片を、その毛細管片の外径に相当する内径
を有する１つの共通の毛細管に入れる。これは試薬を任
意の所望の方法で組合せることを可能にする。

【００２０】試薬毛細管は反応容器とともにまたはそれ
とは別個に、使用時まで凍結して保存する。使用に際し
ては、試薬毛細管を解凍し、その内容物を下方に反応容
器中で遠心分離して互いに、また希釈液があればそれと
混合させる。ＰＣＲ反応を実施する場合には、熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼを含めた全試薬が反応容器中に存在
し、増幅を行う前にさらに必要なことは、サンプルたと
えば血液の添加のみである。

【００２１】サンプルは、本出願人の係属中のスエーデ
ン特許出願ＳＥ９１　　０７２６−０号に記載されてい
る添加システムを用いて加えるのが好ましい。略述すれ
ば、サンプルを、反応毛細管３と同じ種類の毛細管内へ
毛細管作用によって吸い込ませる。ついでサンプル毛細
管を反応容器の蓋４に設けた未使用の孔部４ａ内に挿入
し、その後に容器をもう一度遠心分離する。

【００２２】増幅反応の最初の検出については、ＵＶ光
を吸収しないあるいはほとんど吸収しない反応容器の材
料を用いることが提案される。もし反応後にエチジウム
ブロマイドを加えた場合には、ＵＶ照射した容器を肉眼
で見ることによってＤＮＡが増幅されたか否かを検出す
ることができる。好ましくは、上記したサンプルの添加
と同様にしてエチジウムブロマイドを添加することがで
きる。図に示された試薬毛細管３は、特定のサンプル容
量と特定の生化学的反応に応じて製造されたものである
ことを理解すべきである。別の反応では異なる容量およ
び異なる数の試薬が必要になる。

【００２３】本発明によれば、多くの因子たとえばピペ
ットによる採取、ピペット先端の交換、手袋の交換、容
器の開閉の反復等が不要になり、誤差の多くの原因が実
質的に減少し、試験は信頼性が高まり、迅速かつ安価に
なる。ＰＣＲにおける偽陽性の結果の問題はこのように
して著しく軽減される。

【００２４】本発明は、生物工学産業に、新しい種類の
「キット」、すなわち特定の反応用の試薬を含有する完
全なセットの供給の機会を提供するものである。現在、
このようなキットは多数市場に出回っているが、それら
は通常、約１００種の標準反応に適した多種の試薬を含
有するエッペンドルフ管からなるものである。各反応毎
にある容量を各管から混合しなければならない。試薬毛
細管を使用すれば、１つのキットにたとえば５００本の
毛細管を包含させることができ、そのために設計された
反応用にそれぞれをそのまま使用することができる。本
願に記載された試薬毛細管に基づくキットの利点は、使
用者が試薬をピペットで採取する必要がなく、ピンセッ
トの先で関連した反応に適当な試薬毛細管を選択するだ
けでよいことである。作業の単純化は明白であり、とく
に放射性試薬の取扱いに関しては、ピペットの汚染の危
険は消失し、放射性廃棄物による危険は低下し、スタッ
フが放射線に曝露される時間は短縮される。さらに、Ｐ
ＣＲ方における反応毛細管の経済的および操作的な利点
は、時間の節減と、多くの遺伝子工学領域における作業
者の保護という利益にある。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、試薬を含んだ試薬毛細管を包含する反
応器の概略図である。

【図２】図２は、別の実施態様の試薬毛細管を包含する
別の実施態様の反応容器の概略図である。

【図３】図３は、図２に示した実施態様の平面図である
。

【図４】図４は、図１に示した試薬毛細管の拡大図であ
る。

【図５】図５は、図２に示した試薬毛細管の拡大図であ
る。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　試薬を前もって混合できない生化学的
   反応を実施するにあたり、互いに分離された試薬が充填
   されている試薬毛細管（３）を使用する方法において、
   反応容器（１）の蓋（４）に設けた第一の孔部（４ａ）
   に試薬毛細管（３）を挿入し、毛細管（３）が挿入され
   た反応容器（１）を遠心分離に付して試薬毛細管（３）
   の内容物を反応容器（１）の底部に取り出し、ついで反
   応させるサンプルを反応容器（１）に加えることを特徴
   とする方法。
2. 【請求項２】　　サンプルを含有する毛細管を反応容器
   （１）の蓋（４）に設けた第二の孔部（４ａ）に挿入し
   て、第二の遠心分離と行う「請求項１」記載の方法。
3. 【請求項３】　　試薬溶液（６〜１３）は凍結しておき
   、遠心分離前に解凍させる「請求項１または２」記載の
   方法。
4. 【請求項４】　　試薬毛細管（３）の上端上には、その
   下端が孔部（４ａ）内に挿入されるまでは保護カバー（
   １５）が適合され、その下端は反応容器（１）内に毛細
   管上の固定溝（５）が孔部（４ａ）の縁部にかみ合うま
   で下方に挿入される「請求項１〜３」に記載の方法。
5. 【請求項５】　　試薬毛細管（３）は孔部（４ａ）を覆
   う通過可能の膜を通して挿入される「請求項４」記載の
   方法。
6. 【請求項６】　　予め定められた容量の異なる試薬溶液
   が互いに空気または不活性液体で分離されている試薬毛
   細管（３）、および１個または２個以上の孔部（４ａ）
   が設けられた蓋（４）を有する反応容器（１）からなり
   、使用時には反応容器（１）の蓋（４）に設けられた孔
   部（４ａ）に試薬毛細管（３）が挿入されることを意図
   した試薬毛細管と反応容器の組合せ。
7. 【請求項７】　　試薬溶液（６〜１３）は凍結されてい
   て、試薬毛細管（３）が孔部（４ａ）に挿入される前に
   、解凍される「請求項６」記載の組合せ。
8. 【請求項８】　　試薬毛細管（３）には、その下方端に
   固定溝（５）が、その上方端に保護カバー（１５）が設
   けられている「請求項６または７」記載の組合せ。
9. 【請求項９】　　孔部（４ａ）は通過可能な膜（４ｂ）
   で覆われている「請求項６〜８」記載の組合せ。
10. 【請求項１０】　　試薬溶液（６〜１３）は特異的反応
    のための１種または２種以上の核酸および／または酵素
    からなる「請求項６〜９」記載の組合せ。
11. 【請求項１１】　　試薬溶液（６〜１３）は、ＰＣＲ緩
    衝液、すべて特定のＰＣＲ反応用に計算された試薬、ｄ
    ＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，２種以上のオ
    リゴヌクレオチド、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
    からなる「請求項１０」記載の組合せ。
12. 【請求項１２】　　反応容器（１）はＵＶ光線を全くま
    たはわずかしか吸収しない材料で作られる「請求項５〜
    １１」記載の組合せ。