JPH11509100A - 核酸抽出、増幅および検出を統合する自己充足装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 単一の装置中に核酸抽出、特異性標的増幅および検出を統合する自己充足装置が記載される。この統合は迅速な且つ正確な核酸配列検出を可能にする。本発明は例えば遺伝的欠陥または接触伝染病を示す可能性がある核酸配列についてのスクリーニングにおいてならびに接触伝染病の治療における効力を監視するために使用されることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸抽出、増幅および検出を統合する自己充足装置関連出願 この出願は、１９９５年７月１３日に出願された規定特許出願シリアル第０６ ／０００８８５号に対する優先権を主張する。発明の分野 この発明は分子生物学および医療科学の一般的分野に関しそして特に自己充足 装置（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）において核酸を抽出し、 特異性標的配列を増幅しそして増幅された核酸配列を検出する方法に関する。し たがって、この出願は標的核酸配列の迅速な且つ正確な検出が出来る自己充足装 置を記載する。背景および先行技術 慣用の臨床実験室法における混成化（ハイブリディゼーション）に基づく核酸 プローブ試験の使用は感度の欠如により妨げられる。臨床サンプルからの核酸を 増幅する能力は非常に進歩した核酸プローブ技術を有し、非アイソトープアッセ イノ早期版において欠如している感度を提供する。核酸増幅を利用するオリゴヌ クレオチドプローブ試験により提供される感度は現在では任意の他の方法の感度 より優っている。核酸増幅の方法は、特異核酸配列の単一コピーを検出出来る。 特異性遺伝子配列の慣用の検出および確認は多くの生活環境および産業において 非常に広い適用範囲を有する。 技術を日常の分野の試験に移すのに対する主な障害は経済的で且つ使用し易い システムまたは装置が存在しないことである。今日の費用を意識する環境におい て競争するために、遺伝学をベースとする試験は、サンプルの交差汚染に起因す る偽りの正の結果を防止するために適当な制御および予防策を取り入れる一方で 、高い処理能力を提供しなければならない。 最近の開発は増幅された標的配列の検出のための自動化用システムに向けられ ているけれども、現在の技術は数工程を包含する。第１工程の核酸の抽出は、種 々の方法、例えばフェノール抽出、カオトロピズムの（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ） 試薬抽出、クロマトグラフィ精製（ＱｉａｇｅｎのＷＯ９５／０１３５９号（シ リカ膜上の精製）（この国際公開の内容を特に本明細書に組み入れる））および 超遠心分離（ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのＣｏｌｄ Ｓｐｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＭａｎｉａｔｉｓ等によるＭｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１ ９８２）（この内容を特に本明細書に組み入れる））により行われる。フェノー ルは定着した健康上の有害物質でありそして廃液除去のために特別の取り扱いを 必要とする。その抽出方法は、長たらしい時間がかかりそして手間がとてもかか る。超遠心分離は多くの場合、高価なそして有害な化学薬品の使用ならびに複雑 な且つ費用がかかる装置を必要とする。その方法は、ときには１日またはそれ以 上の遠心分離を包含する、長い操作時間を多くの場合必要とする。最も容易な且 つ最も速い方法はクロマトグラフィ精製を用いる分離である。 第２工程の標的核酸の増幅は、ポリメラーゼおよびリガーゼとして知られてい る種々の酵素を使用する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は最も普通に使用さ れている増幅技術である。ＰＣＲを使用する核酸の増幅のための一般的原理およ び条件は、当業界において全く周知である：その詳細は、すべてＭｕｌｌｉｓ等 に与えられた米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２ 号および米国特許第４，９６５，１８８号（これらのすべての特許の内容を特に 本明細書に組み入れる）を包含する多くの参考文献に提供されている。したがっ て、ＰＣＲ技術の詳細は本明細書中に含まれていない。他の方法は、リガーゼ連 鎖反応、Ｑβレプリカーゼ、ストランド転位アッセィ、転写媒介イソＣＲサイク リングプローブ技術および核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ）を包含す る。 抗原−抗体アッセィのための現在のたんぱく質検出技術は微小粒子の使用を包 含する。さらに、浸漬−付着（ｄｉｐ−ｓｔｉｃｋ）検出抗原−抗体アッセィの ための種々の微小粒子戦略は、現在利用出来、例えば現在市販されている在宅妊 娠試験（Ｃｏｌｅ等に与えられた米国特許第５，１４１，８５０号（この内容を 特に本明細書に組み入れる））がある。そのような試験は、特定の抗原−抗体反 応の後に、可視線を形成する染色された粒子を使用する。本発明は微小粒子に結 合されたオリゴヌクレオチドを捕獲するアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の混 成化（ハィブリデイゼーション）により遂行される。即ち、本明細書に開示され る本発明は核酸アンプリコンを検出する。 臨床上の使用のための増幅された核酸の検出は増幅された生成物の混成化そし て種々の酵素および発光試薬で標識化されたプローブを用いての検出に非常に頼 っている。Ｍｉｌｌｅｒに与えられた米国特許第５，３７４，５２４号（この内 容を特に本明細書に組み入れる）は、捕獲および注薬（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）プロ ーブを用いる、核酸増幅と溶液混成化とを組み合わせる核酸プローブアッセィを 記載している。これらの技術は複数の試薬、幾つかの洗浄工程および標的核酸の 検出のための特別の機器を必要とする。さらに、これらの技術は手間がとてもか かりそして分子生物学における専門技術を有する技術者を必要とする。 微小粒子に結合されたオリゴヌクレオチド配列からなるプローブの使用は周知 であり、そして先行技術において例示されている。混成化（ハィブリディゼーシ ョン）アッセィにおける微小粒子へのオリゴヌクレオチドの付着についてのメカ ニズムおよび核酸の精製についてのメカニズムはまた、周知である。ヨーロッパ 特許第２００１３３号（この内容を特に本明細書に組み入れる）は標的ヌクレオ チドの捕獲のための混成化（ハィブリディゼーション）アッセイにおいて使用さ れる直径５０ミクロメーター未満の水溶性粒子へのオリゴヌクレオチドの結合を 記載している。Ｗｕに与えられた米国特許第５，３８７，５１２号（この内容を 特に本明細書に組み入れる）は、ＰＣＲ増幅化核酸を捕獲するためのプローブと して微小粒子に共有的に結合されたオリゴヌクレオチド配列の使用を記載してい る。Ｆｉｎｄｌａｙに与えられた米国特許第５，３２８，８２５号（この内容を 特に本明細書に組み入れる）はまた、たんぱく質または炭水化物を経由して水溶 性粒子に結合されたオリゴヌクレオチドを記載している。オリゴヌクレオチドプ ローブは微小粒子または他の固体支持体に共有的にカップリングされる。上に挙 げられた特許のすべての感度および特異性は標的核酸へのオリゴヌクレオチドプ ローブの混成化に基づいている。 核酸の検出のための増幅反応に導入される非放射能標識の使用はまた、当業界 に周知である。ビオチン（Ｗａｒｄ等に与えられた米国特許第４，６８７，７３ ２号およびしヨーロッパ特許第０６３８７９号（この両特許の内容を特に本明細 書に組み入れる））、ジゴキシン（ヨーロッパ特許第１７３２５１号（この内容 を特に本明細書に組み入れる））および他のハプテン類を用いて修飾された核酸 がまた使用された。例えばＧｒａｆに与えられた米国特許第５，３４４，７５７ 号（この内容を特に本明細書に組み入れる）は固体膜に結合された相補的標的核 酸を用いての混成化（ハィブリディゼーション）のための標識として少なくとも １種のハプテンを含有する核酸プローブを使用する。これらのアッセィの感度お よび特異性は標識に対して特異性の抗体を用いて検出されることが出来る増幅反 応においての単一標識の導入に基づいている。通常の場合は酵素に共役結合され た抗体を包含する。さらに、基質の添加は機器を用いて検出されることが出来る 比色または蛍光変化を生ずる。 なお、上記方法は多くの工程および洗浄と共に手間がとてもかかり；標的核酸 の検出のための特別のそして費用がかかに機器を必要とし；熟練したスタッフを 必要とし；そして完了まで数時間かかる。増幅および次のアンプリコンの検出の 工程の自動化を扱っている幾つかの特許が出た。これらの特許は、特殊化された 機器を使用しそして依然として混成化（ハィブリディゼーション）および免疫検 定技術の原理に基づいている。例えばヨーロッパ特許第３２０３０８号（この内 容を特に本明細書に組み入れる）はリガーゼ連鎖反応により増幅された標的核酸 を検出するシステムを記載している。 自動化された方法は、特別に熟練した人員の必要性を排除するけれども、しか しながら機器の費用が非常に高くそして多くのサンプルが同じ機器により処理さ れるので汚染の可能性が依然として存在する。汚染の問題を排除するために、上 に概略した３つの工程を統合することが必要である。本明細書において開示され る自己充足装置は、新しい画期的な検出方法と共に、現存する核酸抽出および等 温増幅技術を統合することによりこの目的を遂行する。 本明細書に記載される本発明は自己充足装置を用いて増幅された核酸配列の迅 速な且つ正確な検出を提供する。汚染の可能性は、本明細書において記載される “使い捨て”方法の故に排除される。交差汚染の排除は、自動化を包含する多量 スクリーニングに門戸を開く。分析の高い感度は病気の早い検出および早い治療 の機会を可能にする。本発明は遺伝的、細菌またはウィルス源の感染疾患の存在 を診断する。この発明による分析は、例えば治療を受けている患者のプラスマ中 のＨＩＶウィルスを監視する、治療の効力を監視することが出来る。本明細書に おいて開示される本発明に従う分析は容易であり、分子生物学の業界における専 門的技術を殆ど必要としない。費用は、増幅された核酸を検出するために現在使 用されている他の方法よりも非常に低い。増幅された配列を検出するための時間 の枠は劇的に減少される。潜在的に有害な化学薬品の危険性はない。分析は特別 の廃液処理の処置を必要としない。免疫測定法または混成化（ハィブリデイゼー ション）法においての多くの洗浄の要件は排除される。本自己充足装置は、標準 の定温加熱ブロック以外は、特別の機器を必要としない。本装置の低い複雑性は クリニックおよび医院における“留意点（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）”試験 に適合させる。本装置の可搬性（携帯性）は、法廷において、農業、環境および 食品産業の領域において核酸配列を検出するための“現場での”分析のために供 する。 核酸プローブ技術は、科学界が種々の疾患、生体および遺伝的異常性の検出の ためにその価値を見い出したので、最近数年間に迅速に発達した。増幅技術は核 酸の微小量の存在でさえ定性的に測定するための感度を提供した。この技術の広 く普及した使用に対する欠点は、試験がそのように感受性であるので、サンプル の交差汚染の可能性である。核酸をベースとする試験の費用は、核酸をベースと する試験が高度に熟練した技術者および複雑な機器を必要とするので、高い。一 方のサンプルから他方のサンプルに運びこまれる可能性を排除する１つの方法は 完全に封入された（ｅｎｃｌｏｓｅｄ）使い捨て可能な装置を使用することであ る。発明の概要 この発明は、特異ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出する方法のための新規な概念 に基づいている。本発明は、核酸抽出、増幅のよび検出方法論を統合する自己充 足装置（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）により規定される。 本発明は、迅速な且つ正確な核酸配列検出を可能にする、単一の装置中に核酸 抽出、特異標的増幅および検出を統合する自己充足装置である。本発明は、あら ゆる核酸類およびそれらの誘導体に適用出来る。本発明は或る疾患または症状に 対応し並びに接触伝染病の治療における効力を監視する、特異核酸配列を同定（ 確認）するのに有用であるが、しかしながらこれらの用途に限定されることは意 図されない。 本発明の態様において、自己充足装置は単一の閉じた末端および中に複数の室 を有する第１の中空の細長いシリンダー、相対的な回転が出来る第１のシリンダ ーの内側に近接して配置されている第２の中空の細長いシリンダーを含む。サン プルは抽出のために第２のシリンダー中に導入される。抽出された核酸は固体相 膜またはシリカに結合されそしてそれ故に、洗浄緩衝液の添加により固体相から 溶離されない。増幅および標識化は同じシリンダー中で行われる。最後に、標識 化され、増幅された生成物は標的配列の検出のために受容体特異性リガンドと共 役結合された微小粒子と反応される。 本発明の他の態様において、サンプルは３つの別々のそして連続した室におい て、抽出され、増幅されそして検出される。 本発明の他の特徴および利点は、添付図面と組み合わせて、例によって本発明 の原理を例示する、以下の詳細な記載から明らかとなるだろう。 本発明は一般に、核酸抽出、特異性標的増幅および検出を統合する自己充足装 置に関する。この発明は、サンプルからのクロマトグラフィ核酸抽出、二重標識 化−増幅生成物を生ずる特異性標的核酸配列の増幅、リガンド−受容体結合およ び増幅された核酸の検出のための微小粒子技術の原理に頼っている。さらに、本 発明は核酸混成化（ハィブリディゼーション）に頼ることが出来る。 本発明に従う方法は、あらゆる核酸標的配列の測定に適している。この方法の 感度および精度は当業者により現在使用されている方法に比較して改良されてい る。本発明は、特異性増幅化標的核酸の存在の、汚染が存在しない、迅速な且つ 信頼出来る測定の可能性を提供する。図面の簡単な記載 図１は核酸抽出、増幅および検出を統合する自己充足装置の透視図である。 図２は３つの装置回転位置：Ａ）閉じている：Ｂ）開いている：およびＣ）溶 離：の各々を例示する好ましいシーリングメカニズムの概要図である。 図３は開いている位置でのちょうつがい付きカバーを示す、装置の上部本体お よび低部本体の横断面図である。 図４はちょうつがい付きカバー、および一体式ナイフの刃を有する反応ビーズ 室内に含有された反応ビーズの透視図である。 図５は第２の中空の細長いシリンダーの開口部の横断面図である。 図６は吸収パッドそして微小粒子および捕獲帯域を有するストリップの相対的 位置を描いている。 図７は自己充足装置の操作順序を例示する連続透視図である。 図８はＳＤＡ戦略における装置の増幅室における試薬およびそれらの見解的な 相互作用を例示する。 図９は別のＳＤＡ戦略における試薬およびそれらのそれぞれの相互作用を描い ている。 図１０はサイクリングプローブアッセィにおける試薬およびそれらのそれぞれ の相互作用を描いている。 図１１はストランド転位アッセィを用いる二機能的に標識化され、増幅された 標的配列を用いての等温増幅および検出の検出結果を例示する。 図１２は側方流動アッセィの検出結果を示す。 図１３は別の側方流動の検出結果を示す。 図１４はＮＡＳＢＡ戦略を描いている。 図１５は、単一の標識化プラィマーを用いての増幅、次に単一の標識を含有す るプローブを用いての混成化（ハィブリディゼーション）による検出の結果を示 す。図面中の参照数字 １． 第１の中空の細長いシリンダー、 ２． 第２の中空の細長いシリンダー、 ３． ちょうつがい付きカバー、 ６． 位置合わせピン、 ７． 位置合わせノッチ、 ９． 吸収剤パッド、 １０． ストリップ、 １１． 反応ビーズ、 １２． 反応ビーズ室、 １３． 開口部、 １４． リビングちょうつがい、 １５． シーリングリップ、 １６． 液貯め（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）、 １７． 固体表面、 １８． ナイフの刃、 １９． ホィルまたはホィル／ポリマー膜、 ２０． 検出室、 ２１． 透明視界窓、 ２２． 多孔質膜、 ２３． シリカスラリ、 ２４． 着色微小粒子、 ２５． 標的配列のための捕獲帯域、 ２６． 対照配列のための捕獲帯域、好ましい態様の詳細な記載 前記の一般記載および以下の詳細な記載の両方は例示および説明だけのもので ありそして請求の範囲に記載された本発明を限定するものではないことが理解さ れるべきである。 本発明は、サンプル中に存在する増幅された標的核酸配列を検出する方法を提 供する。サンプル中に存在する広い範囲の標的核酸配列のためのアッセィが本発 明に従って行われることが出来ることが当業者により認識されよう。サンプルは 、農業源、細菌およびウィルス源からそしてヒトまたは他の動物源から由来する 生物学的サンプル並びに廃水または飲料水、農業製品、加工食品、空気、等のよ うな他のサンプルを包含することが出来る。例は、血液、大便、痰、粘液、血清 、尿、唾液、涙滴、生検サンプル、組織学的組織サンプル、組織培養生成物、農 業製品、廃水、飲料水、食品、空気、等を包含する。本発明は遺伝的欠陥または 接触伝染病を示す核酸配列の検出のために有用である。 以下の定義は本明細書および請求の範囲を理解するにあたって助けとなるだろ う。本明細書において提供される定義は、これらの用語が以下の例においてそし て本願を通じて使用される場合に心に止めているべきである。 本明細書において用いられるものとして、用語“標的”核酸分子は、本方法に より増幅される核酸分子を言う。その“標的”分子は、サンプルにおいて、精製 されているか、部分的に精製されているかあるいは精製されていない状態で存在 することが出来る。 この発明において使用されるものとして、用語“増幅”はその初期濃度に関連 して核酸配列の濃度における増大を生ずる“鋳型−依存性方法（ｔｅｍｐｌａｔ ｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ）”を言う。“鋳型−依存性方法”は “プラィマー”分子の“鋳型依存性拡張（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎ ｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）”を包含する方法として定義される。“プラィマー” 分子は標的配列または対照配列の部分に相補的でありそしてハプテンで標識化さ れていてよいまたは標識化されていない核酸の配列を言う。“鋳型依存性拡張” は、核酸の新しく合成されたストランドの配列が標的核酸とプラィマーとの相補 的塩基対合の法則により指示される、ＲＮＡまたはＤＮＡの核酸合成を言う。 本発明は、自己充足装置の１室においての核酸の抽出および増幅、次に他の１ 室においての検出そしてもう１つの他の室においての廃液の収集に関連する。反 応室は機能的に異なり、連続的でありそしてコンパクトである。前記室は、正確 な容量を送り込み、試薬を分配しそして廃液を集める。このすべては、下に記載 されるような使用のための簡単な、けっして失敗することのない手引きを用いて 、完全に自己充足の装置内で起こる。 図１において例示されるように、抽出、増幅および検出装置は１つの閉じてい る末端を有する第１の中空の細長いシリンダー１、対向する開いている末端にち ょうつがいで取り付けられている一体的に成形されたカバー３および第１のシリ ンダー１の内側に近接して配置されそして相対的回転が出来る第２の中空の細長 いシリンダー２からなる。第２シリンダー２の好ましい態様は、シーリングリッ プ１５を有する開口部１３で終わっている円すいシリンダーである。第１シリン ダー１は、さらに２つの室、即ち液貯め１６および検出室２０からなり、前記検 出室はさらにパッド９およびストリップ１０からなる。装置の主な部分は、核酸 およびたんぱく質の結合を容易にしない材料から構成される。好ましい材料は、 軽い重量で、剛性且つ強い、耐熱性且つ耐冷性の材料である。好ましい大きさは 慣用の大きさの加熱ブロック（ｈｅａｔ ｂｌｏｃｋ）中に適合させるのに十分 な小型（コンパクト）であるがしかし、その大きさは対応して、スケールアップ してもよくまたはスケールダゥンしてもよい。好ましい態様は、加熱ブロックの ような定温環境中に装置を挿入して、定温の好ましい条件で反応を進行させるの を可能にする。 サンプルが装置に導入されたとき、核酸抽出および増幅が第２のシリンダー中 で起こり、前記第１の中空の細長いシリンダーは検出のための手段を有する検出 室２０を含有する。液貯め（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）１６は抽出処理および次の洗 浄において使用される溶解（ｌｙｓｉｓ）緩衝液を収集する。 第２のシリンダー２は第１のシリンダー１に相対して回転しそして位置Ａ、位 置Ｂまたは位置Ｃに固定する。第２のシリンダーの先細りの末端で、シーリング リップ１５を有する開口部１３は第２のシリンダー２を検出室２０または液貯め １６のいずれかと係合することを可能にする。第１のシリンダー１は、２つの室 、液貯め１６および検出室２０を含有する。ちょうつがい付きカバー３は位置Ａ 、位置Ｂおよび位置Ｃにおいて第２のシリンダーを固定化するために使用される １つの位置合わせピン６を有する。第２のシリンダー２は、Ａ、即ち閉じられて いる位置において、液溜め１６に対して閉じられている。Ｂ、即ち開いている位 置において、第２のシリンダー２は液溜め１６への流動を可能にする。Ｃ、即ち 溶離位置において、増幅された核酸標的および対照が検出室２０中へ浸出（ｗｉ ｃｋ）することが出来る。ちょうつがい付きカバー３はまた、反応ビーズ室１２ 内の反応ビーズ１１を含有する。このビーズ１１は増幅工程のために必要とされ る反応酵素および他の試薬を含有する。第２のシリンダー２は位置合わせピン６ で位置合わせをしそしてシリンダー１および２の相対的回転を固定するための３ つのノッチ７を含有する。 位置Ａにおいて、第２のシリンダー２はシールされて、抽出工程および増幅工 程が行われるのを可能にする。位置Ｂにおいて、第２のシリンダー２は、第２の シリンダー２における開口がシールされなくそして液溜め上方にあるような状態 にある。位置Ｃにおいて、第２のシリンダー２は、第２のシリンダー２がシール されないでそして開口が検出室２０に配置された吸収剤パッド９の上方にあるよ うに回転される。吸収剤パッド９は増幅された生成物を収集しそしてナイロン、 ニトロセルロースまたは他の適当な材料のストリップ１０上に生成物を浸出（ｗ ｉｃｋ）させる。ストリップ１０は着色微小粒子２４および、標的２５および対 照２６の配列のための捕獲帯域を含有する。検出室２０は反応の結果を観察する ための透明な視界窓２１を含有する。 図２は本明細書において開示された装置のシーリングメカニズムの好ましい態 様を例示する。開いて位置Ａにおいて、第２のシリンダー２はシーリングリップ １５によってシールされている。シーリングリップ１５は第１のシリンダー１の 頂部で固体表面１７と接触しているときに圧縮されることが出来る可撓生材料か らなる。閉じている位置Ｂにおいて、第１のシリンダー１に相対しての第２のシ リンダー２の回転は、第２のシリンダー２の内容物が第２のシリンダー２の底部 での多孔膜２２を通過させて液溜め１６中へ流入することを可能にする。この位 置において、シーリングリップ１５は圧縮の平面を超えて延びそして流体が液溜 め１６中に流れるのを可能にする。第２のシリンダー２は第１のシリンダー１に 相対して、溶離位置Ｃに回転されることが出来る。この位置において、シーリン グリップ１５は、検出工程のために使用される吸収剤パッド９および膜のストリ ップ１０を含有する開口上の圧縮の平面を超えて再び延びている。 開いている位置において装置の上部１体および低部２体およびちょうつがい付 きカバー３の横断面は図３において例示される。位置合わせピン６はちょうつが い付きカバー３上に配置されている。３つの位置合わせノッチ７は第２のシリン ダー２上に配置されている。反応ビーズ１１は、増幅反応のための、凍結乾燥酵 素および試薬を含有する。ちょうつがい付きカバー３はナィフの刃１８を含有し 、これは十分な圧力が適用されたとき、図４において示されるように、ホィル膜 １９に穴をあけて第２のシリンダー２中に反応ビーズ１１を放出する。 第２のシリンダー２の底部の横断面が図５に例示される。シーリングリップ１ ５は、第２のシリンダー２において抽出された核酸を結合する多孔質膜２２また はシリカスラリ２３を保持する多孔質膜２２を含有する。固定化された着色微小 粒子２４を有する領域および２つの捕獲帯域２５、２６を含有するストリップ１ ０は図６において描かれている。微小粒子２４は標的配列および対照配列に対し て特異的である受容体で被覆される。標的配列捕獲帯域２５は、標的配列上のハ プテンに対して特異性の受容体を含有しそして対照配列捕獲帯域２６は対照配列 上ハプテンに対して特異性の受容体を含有する。 以下の例は、本発明を説明しそして例示するのに役にたつ。それらの例はどん な方法によっても本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。種々の変 更は本発明の範囲内で可能である。例１： 自己充足装置の好ましい態様によるサンプル流れ 本明細書において開示された装置の好ましい態様は核酸配列の抽出、増幅およ び検出のために、図１において例示されているように、２つの中空の細長いシリ ンダーにより規定され、第１のシリンダーは閉じられた末端を有する。閉じてい る位置Ａにおいて、サンプルは第２のシリンダー２中に導入される。第２のシリ ンダー２は、核酸の抽出のための乾燥溶解用（ｌｙｓｉｎｇ）試薬を含有する。 サンプルは溶解用試薬を再懸濁する液体を提供する。カバー３を閉じて短時間の インキュベーション期間の後に、第２のシリンダー２は開いている位置Ｂに回転 される。抽出された核酸は上部室において多孔質膜２２またはシリカスラリ２３ に結合された状態のままであり、一方では液体は液溜め１６中に流れる。この位 置において、緩衝液または水の数回の洗浄が続く。次に、第２のシリンダー２は 、第２のシリンダー２がシールされるように閉じている位置Ａに回転され、水が 加えられそしてカバーが閉じられる。十分な圧力がちょうつがい付きカバー３に 適用されたとき、ナィフの刃１８でホィル膜１９を破ることにより反応ビーズ１ １が反応ビーズ質１２から放出されそして第２のシリンダー２に加えられる。反 応ビーズ１１は増幅のために必要な酵素を担持し、これは水中に再懸濁されそし て抽出された核酸を含有する膜２２またはシリカスラリ上で増幅が起こる。適当 なインキュベーション期間の後に、第２のシリンダー２は第１のシリンダー１に 相対して、溶離位置Ｃに回転される。増幅反応混合物は、それがパッド９上に吸 収されるので、検出室２０に入ることが出来る。パッド９が十分な量の液体を吸 収したときに、反応混合物はストリップ１０に浸出される。そのストリップ上で 、着色した微小粒子２４は増幅反応から生ずるハプテンに結合しそして膜上の捕 獲帯域に移動し、そこでそれらは標的配列が存在するかどうかの検出の可視線お よび対照配列のための検出の可視線を形成する。検出のその線は透明な視界窓２ １から視られる。図７参照。 第２のシリンダー２は０．００１〜２５ｍｌの容積を有する。サンプルは全血 、痰、血清、プラスマ、尿、糞便、組織、器官の一部分あるいは標的核酸配列を 含有する可能性がある任意の他の源である。サンプルはヒト、植物または動物か らのものでありそして自然の環境にあるものであってよい。 本明細書において開示された方法および装置は非常に迅速な経済的な核酸検出 を提供する。さらに、この自己充足装置は、増幅試薬もアンプリコンも取り扱わ れない点で、交差汚染の危険性を有意義に減少させる。必要とされる最小の追加 の機器、標準の加熱ブロックおよび実験計画の単純性は、どこにおいても、そし て最小の技術経験で、容易に試験を行うことを可能にする。例２： 微小粒子選択 この発明において使用される好ましい微小粒子はラテックスポリエチレン、ポ リプロピレン、ポリメタクリル酸メチルまたはポリスチレンのようなポリマー材 料からなる。しかしながら、種々の他の合成または天然の材料、例えばシリケー ト類、常磁性粒子およびコロイド金がまた、微粒子の製造において使用されるこ とが出来る。通常の形の微小粒子は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミンおよ びカルボキシレート基のような官能基の導入により修飾されることが出来る表面 サルフェート装入基を有している。官能基は広い種々のリガンドおよび受容体を 微小粒子に結合させるために使用される。これらの基は共有結合または吸着のい ずれかによりリガンドー受容体対の選ばれた要素との結合を容易にするそれらの 能力に基づいて選ばれる。受容体を微小粒子に付着させる好ましい方法は共有結 合である。 この発明において使用される微小粒子の大きさは標識化されるアンプリコン（ ａｍｐｌｉｃｏｎ）の結合および検出を最適化するように選ばれる。微小粒子は 直径において０．０１〜１０．０μｍ寸法範囲で有効である。本発明のこの態様 のための好ましい直径は０．０１〜１．０μｍの範囲であり、適当に決定される ものとして、それより大きいかまたはそれより小さい微小粒子の使用を特に排除 しない。微小粒子は、標的リガンドへの結合のために適当な受容体で活性化され る。本発明において好ましい微小粒子は着色化染料を含有するラテックスからな る。 本発明において、微小粒子結合受容体は増幅された核酸配列の末端に配置され た個別のハプテンに対して特異性である。受容体はそれらの特異性パートナー（ ハプテン）に結合することが出来なければならずそしてさらに好ましいビオチン およびジゴキシゲニンからの誘導化ハプテンを変化させることは受容体における 変化を必要とする。微小粒子への受容体の共役結合は共有結合によるかあるいは 適当な場合において、微小粒子の表面上への吸着により遂行される。微小粒子へ の受容体の吸着または共有結合のための技術は当業界において周知でありそして さらに説明する必要はない。 アンチ−ジゴキシゲニン被覆微小粒子を造るために、０．２５〜１．０ｍｇ／ ｍｌのアンチ−ジゴキシゲニンＦａｂが１．０％微小粒子／ｍｌの最終濃度を含 有する懸濁液を用いてインキュベートされる。微小粒子とジゴキシゲニンＦａｂ とを１５分間反応させ、その後に共有結合のために活性化剤で処理する。微小粒 子は、０〜２．５ｍＭの最終濃度でのＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチ ルアミノプロピル）カルボジアミド）で処理される。Ｆａｂおよび微小粒子は１ 時間室温で混合されそしてインキュベートされる。結合されていないＦａｂは連 続洗浄により除去されそして被覆された微小粒子は、貯蔵緩衝液中に再懸濁され る。 ０．０〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度での１．０μｌのストレプタビジン（ｓｔｒ ｅｐｔａｖｉｄｉｎ）の捕獲帯域でスポットされたナイロンまたはニトロセルロ ース膜上で側方流動アッセィが行われる。例３： 増幅化 本発明は、標的核酸配列の増幅を達成させるための種々の異なる酵素、例えば ポリメラーゼおよびリガーゼを使用する。ポリメラーゼは“プライマー分子”の ３’ヒドロキシ末端を延長するヌクレオシドトリホスフェートを導入するそれら の機能により定義される。本明細書において使用されるものとして、“プライマ ー”は、標的核酸分子へ混成化（ハィブリディゼーション）したときに、５’末 端でまたはその近くでポリメラーゼおよびハプテン標識により延長されることが 出来る３’ヒドロキシ末端を有するオリゴヌクレオチドである。ポリメラーゼに 関する一般的説明については、カリフォルニア州メンロパークのＷ．Ａ．Ｂｅｎ ｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．発行Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．等著のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ第４版（１９８７）参照。本明細書に おいて記載された方法に従って使用されることが出来るポリメラーゼの例は、Ｅ ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、“Ｋｌｅｎｏｗ”ポリメラーゼとして通常 知られているＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩの大きなたんぱく質分解的断片、Ｔａ ｑ−ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼお よび逆転写酵素を包含するが、しかしそれらに限定されない。上に記載されたよ うなポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸の増幅のための一般的原理および条件は 当業界において周知である。例４： ＮＡＳＢＡを用いる標識化増幅標的配列に関しての検出のための等温増幅法 この発明を用いる増幅化のための好ましい態様は、ＮＡＳＢＡ（米国特許第５ ，１３０，２３８号（この内容を特に本明細書に組み入れる））またはストラン ド転位アッセィ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｓｓａｙ）（Ｓ ＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ等によるＰＮＡＳ ８９：３９２（１９９２）（この内容 を特に本明細書に組み入れる））のような等温反応である。ＮＡＳＢＡの主要な 生成物は一本鎖ＲＮＡである。ＮＡＳＢＡ反応は、Ｔ７ポリメラーゼプロモータ ーを含有するプライマーを使用する。Ｔ７転写の後に、１００コピーまでの標的 ＲＮＡが生成される。これらのコピーは最初の標的ＲＮＡと同じ配列である。し たがって、それらは鋳型として役に立ち、サイクルが再び始まって最初の鋳型の １０億倍までの増幅を生ずる。 本明細書において開示された装置中にＮＡＳＢＡを組み入れるために、二機能 的にハプテン化された増幅生成物の形成を可能にするプローブが計画された。Ｎ ＡＳＢＡのために、２つの可能な戦略：即ち１）ハプテン化される増幅プライマ ーを計画すること；そして２）生成物ＲＮＡに結合する２種のハプテン化された 捕獲オリゴ（ｏｌｉｇｏｓ）を使用することである。例えば図８及び図９参照。 選ばれたモデルシステムはＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子に対するものである。 当該のＮＡＳＢＡハプテン化戦略において、Ｔ７転写酵素プロモーターおよび 結合されたフルオレセインを含有する、Ｔ７ＮＡＳＦＡＭハプテン化プライマー は標的ＲＮＡに結合する。逆転写酵素は図１４の例Ｂに例示されているように、 ＲＮＡのＤＮＡコピーを転写する。最初のＲＮＡストランドはＲＮａｓｅ Ｈ（ リボヌクレアーゼＨ）により消化される。結合されたビオチンを有する逆ハプテ ン化プライマー、Ｐ２ＮＡＳＢＩＯはアンチセンスＤＮＡに結合しそして逆転写 酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性により拡張される。ハプテン化プライマーは以下 のとおりである： Ｔ７ＮＡＳＦＡＭ（Ｔ７−プロモータープライマー）： ５’−フルオレセイン− Ｐ２ＮＡＳＢＩＯ（逆転プライマー）： ５’ビオチン− 得られた二本鎖ビ−ハプテン化ＤＮＡ中間体は図１４の例Ｄに例示される。こ の複合体は側方流動またはスライド凝集におけるシグナルを提供する。Ｔ７ Ｒ ＮＡポリメラーゼは図１４の例Ｆにおいて示されるように、マイナス−センスＲ ＮＡの多数のコピーを造るためにプロモーター領域に結合する。このＲＮＡは同 様な手段によるＤＮＡ中間体の製造に寄与する。各々がフルオレセインまたはビ オチンのいずれかＫ１つのハプテンを有する、２つの捕獲オリゴ（ｏｌｉｇｏｓ ）は二機能性ハプテン化複合体を提供する（−）センスＲＮＡ（複数）に結合す る。これらの複合体は側方流動又はスライド凝集においてシグナルを提供する。 マイナス−センスＲＮＡ生成物に結合するために計画されたハプテン化捕獲オリ ゴ（ｏｌｉｇｏｓ）は次のとおりである： 例５： ストランド転位アッセィを用いての二機能的に標識化された増幅標的配列に関し ての検出の等温増幅法 当該ストランド転位アッセィ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａ ｓｓａｙ）（ＳＤＡ）は微小粒子および二機能的に標識化された生成物を用いる ことにより検出されることが出来る等温増幅の例である。ＳＤＡ技術は、Ｂｅｃ ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに与えられた米国特許第 ５，４５５，１６６号（この内容を特に本明細書に組み入れる）に記載されてい る。ＳＤＡは、その認識部位からのヘミホスホロチオェートの非修飾ストランド を切断する（ｎｉｃｋ）制限酵素の能力および切れ目（ニック：ｎｉｃｋ）での 複製を開始しそして下流非−鋳型ストランドを転位（ｄｉｓｐｌａｃｅ）するた めのＤＮＡポリメラーゼの能力に基づく等温増幅である。制限酵素を切断するた めの認識部位を含有するプライマーは増幅されるべき配列の側面にある位置で標 的ＤＮＡの対生（ｏｐｐｏｓｉｔｅ）ストランドに結合する。標的断片は、セン ス反応から転位されたストランドがアンチセンス反応のための標的として役に立 つそしてその逆の場合も成り立つ、カップリングセンスおよびアンチセンス反応 により指数的に増幅される。 このセットの実験は、ビオチン、ファム（ｆａｍ）またはジゴキシゲニンで標 識化される複合延長プライマーを用いて行われる。バンパープライマー（ｂｕｍ ｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍ ｐａｎｙ（ニュージャージー州フランクリンレークス）に提供されるのと同じ配 列である。標的の配列、バンパープライマーおよび複合延長プライマーは次のと おりである： バンパープライマー： 複合延長プライマー： 標的配列： 反応は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．により開発され た好熱性ストランド転位増幅（ｔＳＤＡ）実験計画により行われる。標的生物は Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。先行的（パイ ロット）研究のために、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ外（バンパー）プラ イマーにより規定される、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムの９１ｎｔ配列 からなる人工標的鋳型が使用される。使用される増幅条件はｔＳＤＡのためにＢ ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎにより使用された条件と同じである。 この方法のために使用された膜は、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉ ｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入されたニトロセルロースであ る。１ｍｇ／ｍｌの濃度の線条（ｓｔｒｉｐｅ）のストレプタビジン（ｓｔｒｅ ｐｔａｖｉｄｉｎ）は膜の底部端から１ｃｍで線形試薬ストライパー（ｓｔｒｉ ｐｅｒ）（バーモント州、ノーススプリングフィールドのＩＶＥＫ Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ）を介して１μｌ／ｃｍの速度で適用される。ストレプタビジンの 適用後、膜を乾燥させそして１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）中の０．５％ カゼインにより非特異性結合のために遮断する。膜を水（ｄｄＨ₂Ｏ）で２回洗 浄しそして乾燥させる。次に、アンチ−Ｓ１（ビオチン標識なしのＳ１に相補性 ）および（または）Ｓ２プライマー（ジグ（ｄｉｇ）またはファム（ｆａｍ）標 識なしのＳ２に相補性）の３μｌは第２膜上にスポットされる。この膜は、微小 粒子またはストレプタビジン捕獲帯域のための生成物と競合する遊離のプライマ ーを捕獲するために第１膜上にサンドイッチされる。微小粒子はアンチ−ジゴキ シゲニンＦａｂまたはアンチ−ファム単クローン性ＩｇＧのいずれかを用いて、 例２において上に略述されたように造られる。微小粒子は、３５％スクロース溶 液で１：２に希釈されそして３μｌが膜に直接適用されそして乾燥される。 反応生成物（１０μｌ）が４５μｌのＳＤＡ緩衝液に加えられ、次に予めスト ライプされた（ｓｔｒｉｐｅｄ）膜に（５０μｌ）適用される。サンプルの適用 は、二機能的に標識化された生成物、およびアンチプライマー被覆膜を通過する ための競合性プライマーおよび乾燥微粒子を必要とする。標的が存在する場合、 膜上に可視線がある。標的が存在しない場合、可視線がない。そのような実験の 結果は図１１において示される。例６： 阻害アッセィ：側方流動膜上の可視シグナルの損失 サィクリングプローブ技術は標的配列を用いて混成化するためにデザインされ たＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ配列を導入する核酸プローブを包含する。例えば、図 １０参照。プローブはビオチンおよびファム（ｆａｍ）で二機能的に標識化され る。もしプローブが二本鎖核酸（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｎｕｃｌｅ ｉｃ ａｃｉｄ）を生成する標的を用いて混成化するならば、反応緩衝液中のＲ Ｎａｓｅ Ｈ（リボヌクレアーゼＨ）はプローブを開裂する。この開裂は、スト レプタビジンおよびアンチ−ファム（ａｎｔｉ−ｆａｍ）被覆の着色された微小 粒子の捕獲帯域を含有する膜に適用されるときに、シグナルの損失を生ずる。も し、標的が存在しなければ、膜上に可視線がない。 本例において使用される特異性プローブおよび標的はＭｉｃｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを検出するのに使用するためにＩＤ Ｂｉｏｍ ｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによりデザインされた。プローブは、プ ローブのＤＮＡ部分の５’（ファム（ｆａｍ））および３’（ビオチン）末端上 に標識を有する、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列の両方を含有するキメラ構造であ る。標的の単一ストランドへのプローブの結合は、ＲＮａｓｅ Ｈで開裂される 二本鎖核酸を生成し、したがって、プローブの二機能性を排除する。プローブの 配列は下に記載される： ＦＡＲＫ２Ｓ３Ｂプローブ： （低ケースはデオキシリボヌクレオシドを示す）。 標的の配列は下に記載される： ＡＲＫ２−Ｔ合成標的： 反応はＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより提供され た実験計画書に従って完成された。この方法のために使用される膜はマサチュー セッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購 入したニトロセルロースである。１ｍｇ／ｍｌの濃度での１線条（ｓｔｒｉｐｅ ）のストレプタビジンは、膜の底端から１ｃｍの線形試薬ストライパー（ｓｔｒ ｉｐｅｒ）（バーモント州ノーススプリングフィールドのＩＶＥＫ Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ）を介して１μｌ／ｃｍの速度で適用される。ストレプタビジンの 適用後、膜は乾燥されそして１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）中の０．５％ カゼインにより非特異性結合のために遮断される。膜は水（ｄｄＨ₂Ｏ）で２回 洗浄されそして乾燥される。使用された微小粒子は、アンチ−ジゴキシゲニンＦ ａｂをアンチ−ファム（ａｎｔｉ−ｆａｍ）単クローン性ＩｇＧと置き換えて、 例２において上に略述したとおりにして造られる。 反応生成物（１０μｌ）は、５μｌの０．１％アンチ−ファム被覆微小粒子（ ０．１％）および３５μｌの水に加えられ、次に予めストライプされた（ｓｔｒ ｉｐｅｄ）膜に適用（５０μｌ）される。標的へのプローブの結合、次のＲＮａ ｓｅ Ｈによるプローブの開裂はプローブの二機能性の損失を生ずる。標的が存 在するとき、膜上の可視線は存在しない。標的が存在しないとき、二機能的に標 識化されたプローブはアンチ−ファム被覆微小粒子および膜に結合されたストレ プタビジンに結合することが出来、可視線を生ずる。１つのそのような実験の結 果は図１２に示される。 増幅に関して、或る種の被験物は増幅反応に対して抑制的であり、偽りの陰性 の結果を提供する。この問題を避けるために、正の対照（全体的に関係のない核 酸配列に結合されたプライマー認識配列を有する対照核酸）が導入される。この 正の対照プライマーは本装置の第２のシリンダー中の核酸抽出試薬の成分であり 、かくしてサンプル抽出および送り出し（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）をコントロールし 並びに増幅欠陥を検出する。正の対照の好ましい具体例はラムダＤＮＡ配列であ る。対照核酸は標的核酸と一緒に抽出され且つ増幅されそして検出固体相上の１ 列の固定アンチ−ジゴキシゲニンビーズにより検出される。 この発明において使用される標的オリゴヌクレオチドプライマーおよび対照オ リゴヌクレオチドプライマーは、プラィミング反応において関与しない標識とし て少なくとも１種のハプテンを含有する。ハプテンは核酸プライマーの少なくと も１つの位置に結合される。核酸プライマーの誘導化のために、種々の方法が使 用されることが出来る。上記のＭａｎｉａｔｉｓの文献参照。ハプテンの導入は 酵素的に、化学的に、または光化学的に行われることが出来る。ハプテンはプラ イマーの５’末端に直接誘導化されることが出来るかまたは１〜３０原子の長さ のブリッジを含有することが出来る。好ましい態様においてそのブリッジは線状 である。しかしながら別の態様において、そのブリッジは鎖末端の少なくとも１ つにハプテン分子を有する分枝鎖からなる。分枝鎖の末端上の幾つかのハプテン 分子の存在により、検出感度が増大される。本発明のために好ましいハプテンは ビオチンおよびジゴキシゲニンであるが、しかしながら手に入れることが出来る 特異性結合剤として受容体を有する他のハプテン、例えばステロイド類、ハロゲ ン類および２，４−ジニトロフェニルが適当である。例７： 二機能的に標識化され、増幅された生成物の検出 この方法のために使用される膜は、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉ ｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入されたニトロセルロースであ る。１ｍｇ／ｍｌの濃度でのストレプタビジンの線条（ｓｔｒｉｐｅ）は膜の底 端から１ｃｍでの線形試薬ストライパー（ｓｔｒｉｐｅｒ）（バーモント州ノー ススプリングフィールドのＩＶＥＫ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を介して１μｌ ／ｃｍの速度で適用される。ストレプタビジンの適用後、膜は乾燥されそして次 に、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）中の０．５％カゼインにより非特異性 結合のために遮断される。膜は水（ｄｄＨ₂Ｏ）で２回洗浄されそして乾燥され る。 増幅生成物は０．００１〜１．０％微小粒子／ｍｌの希釈での着色受容体被覆 ビーズを有する膜に加えられる。この混合物を膜に浸出（ｗｉｃｋ）させる。正 の反応は、捕獲材料が適用される場所に着色線を生ずる。その反応に標的配列が 加えられない増幅反応は負の対照として役に立つ。これらの実験の１つの結果を 図１３に例示する。 もし標的核酸配列および対照核酸配列が存在するならば、受容体結合微小粒子 はハプテン（単一種または複数種）と相互作用して増幅された核酸を捕獲する。 その結果は、標的核酸についておよび対照核酸について膜上に視ることが出来る 染色された粒子の線である。もし標的が存在しないならば、染色された粒子は捕 獲されずそして視ることが出来ない。分析の結果が陰性である場合、対照核酸配 列は抽出および増幅が正しく行われたことを示す可視的でなければならない。例８： 単一標識化プライマーでの増幅、次に単一標識を含有するプローブでの混成化に よる検出 標的核酸配列は、２００〜１０００ｍＭのプライマー濃度、ＧｅｎｅＡｍｐＥ ＺｒＴｔｈＲＮＡＰＣＲキット（カリフォルニア州アラメーダのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．）および１０⁶コピー／ｍｌの標的ＨＩＶ ＲＮＡ配列 を用いるＰＣＲにより増幅される。４０のＰＣＲサイクル（各々のサイクルは、 １５分間６０℃、１５秒間９５℃そして６０秒間５５℃である）が行われる。 プライマーの配列は次のとおりである： ＳＫ３８Ｄｉｇプライマー ＳＫ３９プライマー 特異性ＰＣＲ反応条件は以下に記載される： 試薬 最終濃度 ５Ｘ ＥＺ 緩衝液 １ｘ Ｍｎ（ＯＡｃ）₂ ３ｍＭ ｒＴｔｈポリメラーゼ ５Ｕ ｄｎｔｐ’ｓ 各々２４０μＭ ＳＫ３８ １μＭ ＳＫ３９ １μＭ （ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｎ８０８−００ ９７からのもの） ＳＫ３８Ｄｉｇ．．．．ＳＫ３９アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）（５μｌ ）は１分間９５℃そして次に１分間５５℃で２５μＭ（１２５ｐモル）ＳＫ３９ ビオチンの５μｌとともにインキュベートされる。アンチ−ジゴキシゲニン微小 粒子に結合されたアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）は膜を通過してストレプタ ビジンラインに浸出（ｗｉｃｋ）しそしてビオチンおよびストレプタビジンの相 互作用により捕獲される。その結果は着色微小粒子の可視線である。 負の対照において、上に記載されたとおりにしてだが、しかし標的配列の添加 なしで方法が行われる。増幅反応において標的配列の存在なしで、二機能的に標 識化されたアンプリコンは生成されずそして検出の可視線は存在しない。１つの そのような実験の結果は図１５に示される。例９： 自己充足装置の別の態様 サンプルは核酸の抽出のために抽出室中に導入される。この室は核酸精製の迅 速な方法を提供する核酸抽出／固体相核酸結合実験計画を組み入れる。好ましい 抽出方法は、細胞膜を分断しそして核酸を抽出するためのグァニジンイソチオシ アン酸塩のようなカオトロピズムの（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）試薬を使用する。 たんぱく質はプロティナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）により分解される。抽 出された核酸は抽出室において固体相膜に結合する。核酸は溶離緩衝液の添加に より固体相から溶離される。固体相膜とシールとの間のフィッティング（ｆｉｔ ｔｉｎｇ）のデザインは、廃液が増幅室に入るのを防止する。 サンプルが抽出室に加えられた後に、第１フィッティングと第２フィッティン グとを接続することにより供給アセンブリユニットはプロセッサーアセンブリユ ニットの頂部に固定する。核酸抽出を可能にする１０〜１５分のインキュベーシ ョンの後に、４つのプランジャの第１のものが押し下げられる。区画室中の空気 は抽出混合物を押し進めて、核酸を結合する固体相膜中に通過させる。濾液は廃 液室に収集される。第２プランジャを押し下げると洗浄緩衝液区画室に貯えられ た洗浄緩衝液を、固体相膜を横切って押し進めそして濾液は廃液室に進む。固体 相膜の直下に配置されたシールは廃液の有効な収集を助ける角度に配置される。 第３のプランジャを押し下げると、区画室内に貯えられた空気を、固体相膜を横 切って押し進め、すべての洗浄緩衝液が除去されるのを確実にする。プロセッサ ーアセブリユニットはねじれ、同時にシールを破りそして廃液室導管の流れをせ きとめる。第４のプランジャを押し下げると、固体相から核酸を溶離するために 、区画室内に貯えられた溶離緩衝液を送り出しそして或る容量の核酸を増幅室中 に送り込む。 別の態様において、増幅室は増幅および混成化（ハィブリディゼーション）の ための試薬を含有する。追加の別の態様において、増幅および混成化のための試 薬は別々の室にある。この方法は、抽出後、サンプルが２種の異なる標識化オリ ゴヌクレオチドプライマーを用いて処理されることにより特徴づけられる。第１ のプライマーの配列は、標的核酸のストランドの部分配列に相補的でありそして ハプテン、例えばビオチンで標識化される。第２プライマーの配列は対照核酸の 部分配列に相補的でありそして第２ハプテン、例えばジゴキシゲニンで標識化さ れる。どちらのプライマーもプロモーター領域を含有してよい。混合物を増幅、 好ましくは等温増幅に付すと、ハプテン標識化された標的核酸およびハプテン標 識化された対照核酸を生ずる。これらの標識化され、増幅された核酸配列は、検 出のための適当な色および直径の微小粒子に共役結合されたオリゴヌクレオチド と反応する。微小粒子は、標的上の核酸配列と結合するために特異性のオリゴ（ ｏｌｉｇｏ）と共役結合される。微小粒子は対照上の核酸と結合するために特異 性のオリゴと共役結合される。混成化（ハィブリディゼーション）によりアンプ リコンに結合された、得られた微小粒子は検出室において検出される。例１０： ガラス（シリカジオキシド）上のチオシアンサングァニジニウムを用いての核酸 の抽出そして次の、シリカジオキシドからの溶離なしの増幅 シリカジオキシドを含有するためのフィルターとしてＡｎｓｙｓ０．４ｍｍ膜 および約１５秒でカラム中に緩衝液を引き入れるためのシリンジ装置を用いてカ ラムが構成された。５０μｌの血清、２μｌのＳｉＯ₂（０．５ｍｇ／μｌ）お よび４５０μｌのＧｕＳＣＮ溶解（ｌｙｓｉｓ）緩衝液を、渦立たせにより混合 しそして次に１０分間室温でインキューベートする。当該セットの実験のための 特別の溶解（ｌｙｓｉｓ）緩衝液は、１４．７１ｇのＧｕＳＣＮ（最終４Ｍ）、 ０．６１ｍｌの“Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００”、５．５ｍｌの０．２Ｍ ＥＤＴ Ａ（ｐＨ８．０）を含有しそして０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．４）で ３１．１１ｍｌにするのに十分な量にする。シリカジオキシドを５００μｌの７ ０％ＥｔＯＨで２回洗浄する。 次に、ＳｉＯ₂を有するフィルターをカラムから取り出しそして２０μｌの水 （ｄｄＨ₂Ｏ）を用いてＳｉＯ₂を膜から洗い流す。例８において上に詳細に記載 されたとおりにして、ＨＩＶモデルシステムのための標準の実験計画を用いて、 ５μｌのシリカジオキシドスラリをＰＣＲ反応に加える。 本発明は、自己充足装置を用いて、増幅された標的核酸配列を検出する迅速な 、簡単なそして正確な方法を提供する。本アッセィの感度および特異性は、増幅 処理中の、標識を導入することによるまたは標識化プローブの後での混成化（ハ ィブリディゼーション）による標的の標識化に基づいている。本方法は費用のか かる且つ複雑な機器を必要としないしまたは特別に熟練した人員を必要としない し、また健康上の害を全く示さない。 上記記載は多くの特異性を含有するけれども、これらは本発明の範囲を限定す るものと解釈されるべきでなく、むしろ本発明の好ましい態様の例示である。同 じ反応混合物において幾つかの標的サンプルを増幅する、新しく発見されたポリ メラーゼ及びリガーゼを使用する、等々のような多くの他の変更が可能である。 したがって、本発明の範囲は提供された例によるよりもむしろ、請求の範囲およ びそれらの法的均等性により決定されるべきである。 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【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年３月１３日 【補正内容】 明細書 核酸抽出、増幅および検出を統合する自己充足装置発明の分野 この発明は分子生物学および医療科学の一般的分野に関しそして特に自己充足 装置（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）において核酸を抽出し、 特異性標的配列を増幅しそして増幅された核酸配列を検出する方法に関する。し たがって、この出願は標的核酸配列の迅速な且つ正確な検出が出来る自己充足装 置を記載する。背景および先行技術 慣用の臨床実験室法における混成化（ハイブリディゼーション）に基づく核酸 プローブ試験の使用は感度の欠如により妨げられる。臨床サンプルからの核酸を 増幅する能力は非常に進歩した核酸プローブ技術を有し、非アイソトープアッセ イノ早期版において欠如している感度を提供する。核酸増幅を利用するオリゴヌ クレオチドプローブ試験により提供される感度は現在では任意の他の方法の感度 より優っている。核酸増幅の方法は、特異核酸配列の単一コピーを検出出来る。 特異性遺伝子配列の慣用の検出および確認は多くの生活環境および産業において 非常に広い適用範囲を有する。 技術を日常の分野の試験に移すのに対する主な障害は経済的で且つ使用し易い システムまたは装置が存在しないことである。今日の費用を意識する環境におい て競争するために、遺伝学をベースとする試験は、サンプルの交差汚染に起因す る偽りの正の結果を防止するために適当な制御および予防策を取り入れる一方で 、高い処理能力を提供しなければならない。 請求の範囲 １． ａ）開いている末端および閉じている末端を有し、さらに中に複数の室を 有する第１の中空の細長いシリンダーであって、各々の室が上部近位末端および 低部遠位末端を有する該第１の中空の細長いシリンダー、 ｂ）前記第１のシリンダーの内側で近接して配置されており、そして上部遠位 末端、および開口部と、介在されるシーリングリップとを有する低部近位末端を 有し、そして前記第１のシリンダーの各々の室の前記上部近位末端に下記第２の シリンダーの前記低部近位末端を、回転により接続している第２の中空の細長い シリンダーであって、このシリンダーの上部遠位末端上でお互いから等しい距離 で配置された３つの位置合わせノッチをさらに有する前記第２の中空の細長いシ リンダー、および ｃ）第１のシリンダーの開いている末端にちょうつがいで一体的に取り付けら れており、ナイフの刃と一体の反応ビーズ室を有するカバーであって、前記室は 膜で密閉されておりそして反応ビーズを包入しており、前記カバーは前記第２の シリンダーに対して前記の第１のシリンダーの回転中に、前記ノッチで位置合わ せをするためにちょうつがいに対して直径方向に配置された位置合わせピンをさ らに有する前記カバー を含む、核酸配列の抽出、増幅および検出のための自己充足装置。 ２． 前記第２の中空の細長いシリンダーが抽出手段および増幅手段をさらに含 む、請求項１に記載の自己充足装置。 ３． 前記抽出手段が核酸抽出のための乾燥溶解試薬を含む、請求項２に記載の 自己充足装置。 ４． 前記増幅手段がポリメラーゼまたはリガーゼを含む、請求項２に記載の自 己充足装置。 ５． 前記第１の中空の細長いシリンダーの複数の室が液貯め室および検出室を 含む、請求項１に記載の自己充足装置。 ６． 前記液貯めが前記第１の中空の細長いシリンダー、前記検出室および多孔 質膜の隣接側面により規定されており、前記膜は流体を通過させることが出来る 大きさの孔を有する、請求項５に記載の自己充足装置。 ７． 前記検出室が検出手段をさらに含む、請求項５に記載の自己充足装置。 ８． 前記検出手段が吸収剤パッド、および着色微小粒子と捕獲帯域とを有する ストリップを含む、請求項７に記載の自己充足装置。 ９． 増幅標的が、特異的な核酸配列である、請求項１に記載の自己充足装置。 １０． 前記膜がホィルおよびホィル／ポリマーからなる群から選ばれる、請求 項１に記載の自己充足装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ジャンコブスキー，リン ディー. アメリカ合衆国 80121 コロラド州 グ リーンウッド ビレッジ，ベルビュー レ ーン 19 (72)発明者 コズウィッチ，ダイアン エル. アメリカ合衆国 80110 コロラド州 イ ングルウッド，エス．ヒューロン ストリ ート 4915

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ）複数の室を有する、一末端で閉じている第１の中空の細長いシリンダ ーであって、各々の室が上部近位末端および低部遠位末端を有する該第１の中空 の細長いシリンダー、 ｂ）前記第１のシリンダーの内側で近接して配置されており、そして上部遠位 末端、および開口部と、介在されるシーリングリップとを有する低部近位末端を 有しそして前記第１のシリンダーの各々の室の前記上部近位末端に下記第２のシ リンダーの前記低部近位末端を、回転により接続している第２の中空の細長いシ リンダーであって、このシリンダーの上部遠位末端上で等方的に配置された３つ の位置合わせノッチをさらに有する前記第２の中空の細長いシリンダー、および ｃ）第１のシリンダーの開いている末端にちょうつがいで一体的に取り付けら れており、ナイフの刃と一体の反応ビーズ室を有するカバーであって、前記室は 反応ビーズを包入しておりそして膜で密閉されており、前記カバーは前記第２の シリンダーに対して前記の第１のシリンダーの回転中に、前記ノッチで位置合わ せをするためにちょうつがいに対して直径方向に配置された位置合わせピンをさ らに有する前記カバー を含む、核酸配列の抽出、増幅および検出のための自己充足装置。 ２． 抽出手段および増幅手段をさらに含む、請求項１に記載の第２の中空の細 長いシリンダー。 ３． 抽出手段が核酸抽出のための乾燥溶解試薬を含む、請求項２の抽出手段。 ４． 増幅手段がポリメラーゼまたはリガーゼを含む、請求項２の増幅手段。 ５． 前記複数の室が液貯めおよび検出室を含む、請求項１に記載の第１の中空 の細長いシリンダー。 ６． 前記液貯めが前記第１の中空の細長いシリンダーおよび前記検出室および 多孔質膜の隣接側面により規定されており、前記膜は廃液を通過させることが出 来る大きさの孔を有する、請求項５の液貯め。 ７． 検出手段をさらに含む、請求項５の検出室。 ８． 前記検出手段が吸収剤パッド、および着色微小粒子と捕獲帯域とを有する ストリップを含む、請求項７の検出手段。 ９． 増幅標的が特異的な核酸配列である、請求項１に記載の装置。 １０．前記膜がホィルおよびホィル／ポリマーからなる群から選ばれる、請求項 １の膜。