JPH04229171A - ミコスフェレラ種に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は診断植物病理学の分野に
関する。とりわけ本発明は病原菌のミコスフェレラ（Ｍ
ｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）属の種の検知に有用なモ
ノクローナル抗体に関する。モノクローナル抗体が製造
される対象となるミコスフェレラ種の一つ、すなわちミ
コスフェレラ　　グラミニコラ（Ｍ．ｇｒａｍｉｎｉｃ
ｏｌａ）　は、そのアナモルフ（無性世代）の名セプト
リア　　トリティシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ　ｔｒｉｔｉｃ
ｉ）でもっと一般的に知られている。

【０００２】

【従来の技術】病原菌（ｆｕｎｇａｌ　ｐａｔｈｏｇｅ
ｎｓ）菌は群として多くの植物病の原因となる。討論の
ために、菌は３大分類学的区分：担子菌類（Ｂａｓｉｄ
ｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｕｃｅｔ
ｅｓ）又は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）　の一
つに属するように分類することができる。

【０００３】担子菌類 この類のメンバーは、担子器として知られている有性胞
子形成構造の存在により確認される。病気形態には、黒
穂病（ｓｍｕｔｓ）　、さび病（ｒｕｓｔｓ）　及びき
のこのような肉様体裁（ｆｌｅｓｈｙ　ｓｐｅｃｉｅｓ
）が含まれる。例えば、小麦さび病、ストロブ松のコブ
病（ｗｈｉｔｅ　ｐｉｎｅ　ｂｌｉｓｔｅｒ）、レバノ
ンすぎ塊状銹（ｃｅｄａｒ−ａｐｐｌｅ　ｒｕｓｔ）、
及びトウモロコシ，　オート麦，　大麦，　玉葱及び小
麦における黒穂病の原因となる病気が含まれる。

【０００４】藻菌類 この類のメンバーは、子嚢菌類又は担子菌類のどちらの
メンバーよりも原始的であると考えられ、それらを区別
する形態学的特徴は、菌糸交差壁（ｍｙｃｅｌｉａｌ　
ｃｒｏｓｓｗａｌｌｓ）　が無いことである。該クラス
のメンバーにより引き起こされる病気の例には、ブドウ
及び他の宿主の黄斑性萎縮病（ｄｏｗｎｙ　ｍｉｌｄｏ
ｗｓ）　、馬鈴薯及びトマトの根腐病（ｒｏｏｔ　ｒｏ
ｔ）及びべと病（ｌａｔｅ　ｂｌｉｇｈｔ）が含まれる
。

【０００５】子嚢菌類 この類のメンバーは、減数分裂と有性胞子形成が起こる
特殊化された生殖構造（子嚢）を持っている。子嚢菌類
が病原因子として確認されている一層普通の植物病の例
には；穀類、果実及び多くの他の作物におけるうどんこ
病（ｐｏｗｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｏｗｓ）　；オランダに
れの木病（Ｄｕｔｃｈ　ｅｌｍｄｉｓｅａｓｅ）　；穀
粒の麦角病（ｅｒｇｏｔ）　：桃及びプラムの褐腐病（
ｂｒｏｗｎ　ｒｏｔ）　；バラの黒星病（ｂｌａｃｋ　
ｓｐｏｔｓ）　ならびに林檎腐敗病（ａｐｐｌｅ　ｓｃ
ａｂ）が含まれる。

【０００６】ミコスフェレラ病原体 本発明に関しては、ドチデア科（Ｄｏｔｈｉｄｅａｃｅ
ａｅ）、そして特にはミコスフェレラ属のメンバーが特
に興味深い。該属には１，０００　以上の種を含み、そ
の多くが大きな経済的重要性をもつ植物病原体である。 最近の米国の植物病原菌の編集書物には植物病原体とし
て２５８種のミコスフェレラが掲げられている〔Ｆａｒ
ｒ，Ｄ．Ｆ．，Ｂｉｌｌｓ，Ｇ．Ｆ．，Ｃｈａｍｕｒｉ
ｓ，Ｇ．Ｐ．，　＆　　Ｒｏｓｓｍａｎ，Ａ．　１９８
９，「　Ｆｕｎｇｉ　ｏｎ　Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｐｌ
ａｎｔＰｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ
　Ｓｔａｔｅｓ　」，　ＡＰＳ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｍｉｎ
ｎｅａｐｏｌｉｓ　：　１２５２　ｐｐ．〕。ミコスフ
ェレラの子実体（ｆｒｕｉｔｉｎｇ　ｂｏｄｙ）　は、
二重膜子嚢（ｂｉｔｕｎｉｃａｔｅ　ａｓｃｕｓ）に含
まれた８個の二細胞子嚢頂孔（ｔｗｏ−ｃｅｌｌｅｄ　
ａｓｃｏｓｐｏｒｅｓ）　を含んでいる孔口子嚢殻（ｏ
ｓｔｉｏｌａｔｅ，ｐｅｒｉｔｈｅｃｉｏｉｄ）の偽子
嚢殻（ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｃｉｕｍ）　である。多くの
場合、子嚢頂孔は、受け入れられる宿主植物の不存在下
、又は好ましくない環境条件下での病原ミコスフェレラ
種の主な生存機構である。また時々子嚢頂孔は、宿主穀
物における主な接種原として働く。またミコスフェレラ
種の多くは、無性分生子（アナモルフ）段階を生じる。 分生子は、分生子層（ａｃｅｒｖｕｌｉ）内の又は遊離
分生子柄（ｆｒｅｅ　ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅｓ）上
の分生子殻（ｐｙｃｎｉｄｉａ）中に発生できる。 多くの場合、分生子段階が自然界に最も多くしばしば見
出される。分生子段階は形態学に基づき有性段階とは別
に分類される。このようにミコスフェレラ属の種は不完
全菌の異なる属のメンバーとして分類される分生子段階
を有している。例えば、ミコスフェレラグラミニコラの
分生子段階はセプトリア　　トリティシであるが、別の
ミコスフェレラであるミコスフェレラ　　フィジエンシ
スの分生子段階はパラセルコスポラ　　フィジエンシス
（Ｐａｒａｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ
）である。他の幾つかの例を挙げれば次の通りである：
ミコスフェレラ　　ムシコラ（Ｍ．ｍｕｓｉｃｏｌａ）
〔シュードセルコスポラ　　ムサエ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅ
ｒｃｏｓｐｏｒａ　ｍｕｓａｅ）〕、ミコスフェレラ　
　フラガリエ（Ｍ．ｆｒａｇａｒｉａｅ）　〔ラムラリ
ア　　ブルネア（Ｒａｍｕｌａｒｉａ　ｂｒｕｎｎｅａ
）　〕、ミコスフェレラ　　ピノデス（Ｍ．ｐｉｎｏｄ
ｅｓ）　〔アスコキタ　　ピノデス（Ａｓｃｏｃｈｙｔ
ａ　ｐｉｎｏｄｅｓ）　〕、ミコスフェレラ　　タシア
ナ（Ｍ．ｔａｓｓｉａｎａ）〔クラドスポリウム　　ヘ
ルバルム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｈｅｒｂａｒｕ
ｍ）　〕。

【０００７】有性段階を自然界に見つけることが困難で
あり、また純粋培養に誘導することが困難であるので、
子嚢菌の無性段階の分類システムは一般的に人為的と考
えられているが実用上の理由で続いている。しかしなが
ら、相互の種の関連度は有性分類に反映されている；す
なわち、ミコスフェレラの２種はセプトリアの２種より
も相互に遺伝的により近く関連していると見られ、それ
は無性段階の形態学的類似に基づいて命名されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ミコスフェレラの病原
種（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｓｐｅｃｉｅｓ）は、植物
の地上部分に、最も頻繁には葉に病気を起こさせる。症
状は、作物に左右され規則的又は不規則的なパターンで
葉領域の大部分を含むかもしれない病変（ｌｅｓｉｏｎ
ｓ）　である。最も激しく世界中に経済的損害を与える
病気の幾つかは、ミコスフェレラ種によって引き起こさ
れ、耐性変種（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｖａｒｉｅｔｉｅ
ｓ）　の使用及び／又は防除用殺菌剤を必要としている
。 ブラックシガトカ病（Ｂｌａｃｋ　Ｓｉｇａｔｏｋａ　
ｄｅｓｅａｓｅ　：黒縞葉枯病）の原因動作主（ｃａｕ
ｓａｌ　ａｇｅｎｔｓ）：ミコスフェレラ　　フィジエ
ンシス及びミコスフェレラフィジエンシス変種ディフォ
ルミスは、中央アメリカのバナナ及びおおばこ（ｐｌａ
ｎｔａｉｎ）の育成地を覆って広範囲に広がっており、
結果として収量減又は害菌防除の経費という重大な経済
的結果を引き起こしている。ミコスフェレラ　　グラミ
ニコラは、その無性段階のセプトリア　　トリティシで
より普通に知られており、殺菌剤又は耐性変種により防
除されないと世界的に小麦に重大な収量減を引き起こす
。

【０００９】ミコスフェレラ種は感染後数日ないし数週
間の潜伏期間を示し、その間、病原体は組織中で成長す
るが、症状は現れない。殺菌剤は、重大な損害が起こる
前そして病気を広がらせる第二の接種原（ｓｅｃｏｎｄ
ａｒｙ　ｉｎｏｍｕｌａ）　が生まれる前のその潜伏期
間に施用する場合にこれらの病気に最も効果的である。 しかしながら、日常的な予防殺菌処理はいつも経済的に
又は環境的に正当化されず、そしてこれら病原体の、好
ましくは病気発達の潜伏期間中の非常に早期の発見を可
能にするシステムは、殺菌剤が適切にしようされ最大の
経済的利益が得られることを確実にするのに非常に有用
であろう。本発明は、ミコスフェレラ抗原の存在を検知
でき、それで病気の早期診断を可能にし、そして感染作
物の広範な損失を予防できるモノクローナル抗体を提供
することにより、そのようなシステムを実施に移すこと
を可能にする。

【００１０】種々の植物の病原体を確認できる多くのモ
ノクローナル抗体は既に生産されている。例えば米国特
許第４，８４５，１９７号には、ピシウム科（Ｐｙｔｈ
ｉａｃｅａｅ）の菌が原因の感染を診断できるモノクロ
ーナル抗体が開示されている。米穀特許第４，８０３，
１５５号には、菌のスクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉ
ｎｉａ）　属のメンバーに特異性のモノクローナル抗体
が開示されている。米穀特許第４，８７９，２１７号に
は、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）　属に特
異性のモノクローナル抗体が開示されている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】ミコスフェレラ種に特異
性を有するモノクローナル抗体は今まで報告されていな
い。しかしながら、本明細書にはミコスフェレラ　　フ
ィジエンシス又はミコスフェレラ　　グラミニコラと特
異的に反応するか或はミコスフェレラの１より多い種と
反応するが、他の属とは反応しないモノクローナル抗体
が開示されている；これらのモノクローナル抗体は、病
気症状が現れる前の感染早期段階のバナナ及び小麦にお
けるミコスフェレラ感染の特異的検知のために特に有用
である。

【００１２】このように、本発明は、ミコスフェレラと
特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマを提供する。好ましい具体例において、これら
の抗体はミコスフェレラ　　フィジエンシス及び／又は
ミコスフェレラ　　グラミニコラ種のメンバーと反応す
る。 これにより、ミコスフェレラと反応するモノクローナル
抗体はまた各々の無性段階からの抗原、例えばセプトリ
ア　　トリティシ（ミコスフェレラ　　グラミニコラ）
又はパラセルコスポラ　　フィジエンシス（ミコスフェ
レラ　　フィジエンシス）とも反応できることにも留意
されるべきであり；その段階名は本明細書を通じて代替
で使用される。本発明はまた、ミコスフェレラの１より
多い種と反応するＨＢ１０４１３及びＨＢ１０４１４の
、及びミコスフェレラ　　グラミニコラと特異的に反応
するＨＢ１０１８６の描写特性を有する特定のハイブリ
ドーマ、ならびにそれらのクローン及びサブクローンを
包含する。

【００１３】ハイブリドーマ細胞系は、初期クローン（
ｉｎｉｔｉａｌ　ｃｌｏｎｅ）　からクローニングによ
り得られ、また本発明に必須の初期クローンの特徴をま
だ有しているハイブリドーマを意味する。

【００１４】同様に本発明に包含されるのは、これらの
細胞系の各々の突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）　及び変
種（ｖａｒｉａｎｔｓ）であり、それらは自然に発生す
るか、さもなくば公知方法の手段で人工的に製造するこ
とができ、また出発材料の特性（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｓｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）　を有しており、言
わばそれらは今だ再生可能であり、好ましくはその環境
培地に本発明の抗体又はその誘導体を分泌する。

【００１５】本発明にまたも包含されるのは、ミコスフ
ェレラ属のメンバーと特異的に反応するモノクローナル
抗体及びその誘導体である。好ましい具体例において、
これらの抗体及び／又はその誘導体は、ミコスフェレラ
　　フィジエンシス及び／又はミコスフェレラ　　グラ
ミニコラ種のメンバーと反応する。これにより、ミコス
フェレラと反応するモノクローナル抗体はまた各々の無
性段階からの抗原、例えばセプトリア　　トリティシ（
ミコスフェレラ　　グラミニコラ）又はパラセルコスポ
ラ　　フィジエンシス（ミコスフェレラ　　フィジエン
シス）とも反応できることにも留意されるべきである。

【００１６】モノクローナル抗体の誘導体は、本発明の
範囲内において、例えばミコスフェレラ属のメンバーに
今だ高い特異性及び親和性を有する抗体フラグメント（
ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）　；例えば放射
性ヨウ素（１２５　Ｉ，１３１　Ｉ），炭素（１４Ｃ）
，硫黄（３５Ｓ），トリチウム（３　Ｈ）等で標識され
た放射性標識モノクローナル抗体（ｒａｄｉｏａｃｔｉ
ｖｅｌｙ　ｌａｂｅｌｌｅｄ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　
ａｎｔｉｂｏｄｙ）、モノクローナル抗体とビオチン（
ｂｉｏｔｉｎ）またはアビヂン（ａｖｉｄｉｎ）との抱
合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）；ホースラディシュパー
オキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉ
ｄａｓｅ），　アルカリホスファターゼ，　β−Ｄ−ガ
タクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコアミ
ラーゼ，炭酸脱水酵素，アセチルコリン−エステラーゼ
，リゾチーム，リンゴ酸脱水素酵素又はグルコース−６
−デヒドロゲナーゼのような酵素との抱合体；更にはモ
ノクローナル抗体と生物発光性の（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｔ）（例えばルシフェラーゼ：ｌｕｃｉｆｅｒ
ａｓｅ　），化学発光性の（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｎｔ）（例えばアクリジニウムエステル：ａｃｖｒ
ｉｄｉｎｉｕｍｅｓｔｅｒｓ　）又は蛍光性の（ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｔ）　（例えばフィコビリン蛋白質：ｐ
ｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ）薬剤との抱合体を
意味する。同様に二特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ
　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　及び架橋形成抗体（ｃｒｏｓｓ
−ｌｉｎｋｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　も本発明に包含
される。ここに掲げた可能な抗体の誘導体例は、単に本
発明を説明するために例示されたものであり、本発明の
主題の如何なる限定をも意味しない。

【００１７】これらのモノクローナル抗体を入手できる
ことは、植物（ｐｌａｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ）　に
おけるミコスフェレラ感染の診断手段を提供する。そう
いうわけで、興味ある病原体の抗原を含んでいると疑わ
れる植物サンプルと病原体に特異性を有する抗体とを接
触させ、そしてサンプル中の抗体−抗原反応の存在又は
不存在を観察することからなるそのような感染の診断方
法が提供される。好ましい具体例において、分析はサン
ドイッチ法（ｓａｎｄｗｉｃｈ）又は二抗体分析（ｄｏ
ｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｓｓａｙ）　で行われ
る：興味のある病原体と反応する最初の抗体を植物サン
プルと接触させ、次いで興味のある病原体と反応する第
二の抗体も加え、サンプル中に抗原が存在する場合に抗
体−抗原−抗体複合体を生じさせる。

【００１８】この事について、興味ある種（ｓｐｅｃｉ
ｅｓ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ）　と反応する好ましく
は固定化した抗体、及び興味ある種と反応する検知可能
に標識した抗体とからなる診断キット形態のミコスフェ
レラ検知用組成物も提供される。抗体の少なくとも１種
は本発明のモノクローナル抗体でなければならず、或る
具体例では両抗体が本発明のモノクローナル抗体であっ
てよい。

【００１９】本発明はさらに、少なくとも１種のミコス
フェレラと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞系の製造方法及びそれからモノ
クローナル抗体を得る方法を提供する。

【００２０】本発明のモノクローナル抗体は夫自体公知
の方法を用いて製造され、該方法はケーラー（Ｋｏｅｈ
ｌｅｒ）　及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１
９７５）により開発された方法に実質的に基づいている
。本発明のモノクローナル抗体を生産する上記方法も本
発明を構成する。

【００２１】産生された抗体は、型どうりに免役した動
物の血清から回収されたものとは全く異なっている。各
ハイブリッド細胞系は、動物が生体内で抗原に応じて合
成できる無数のタイプの抗体の一つを除いては均等な免
疫グロブリンを合成する。各免疫グロブリン−誘導クロ
ーン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉ
ｎｇ　ｃｌｏｎｅ）の特色は、それが産生する抗体の単
一タイプにあるので、モノクローナル抗体という語句が
採用されている。

【００２２】モノクローナル抗体の利点は多い：ａ）モ
ノクローナル抗体は大量供給で高純度に得られる； ｂ）モノクローナル抗体の製造が抗原反応性については
均質であり時間が過ぎてもそのように残る；ｃ）モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは数年及び数十
年間、それらの特性、即ち、それによる特異モノクロー
ナル抗体の産生を失わせずに貯蔵することができる； ｄ）モノクローナル抗体はポリクローナル抗血清よりも
標準試薬として使用するのに適している；その理由は、
後者が例えば次の点： α）抗血清を得るための免疫動物からの血液採取，β）
追加の免疫化のための物質のコンスタントな入手可能性
， γ）ドナー動物の限定された寿命 で広い変化範囲により悪影響を受けるからである。

【００２３】ハイブリドーマ／モノクローナル技術の原
理は、２体の細胞が融合された時に得られたハイブリド
ーマは両方の親細胞タイプの特性を示すことの観察のう
えに基づいている。モノクローナル抗体を産生する場合
、特別の抗体を合成する能力は、免疫したドナー動物か
ら採った免疫適格性細胞（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ　ｃｅｌｌ）（通常は脾臓細胞又は末梢血リンパ球
）から誘導されるが、一方、細胞培養における連続的に
分裂する能力は、他の融合相手（ｆｕｓｉｏｎ　ｐａｒ
ｔｎｅｒ）の癌細胞系（しばしば骨髄種）により与えら
れている。早期の融合は、骨髄種細胞系もモノクローナ
ル抗体を産生するという事実により複雑化する；このよ
うにハイブリッドは、しばしば２タイプのモノクローナ
ル抗体、骨髄種起源の１種と免疫適格性細胞の遺伝的形
成により統制された別種を産生する。 その後、それ自身のモノクローナル抗体を産生できる癌
細胞系、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４又はＸ６３−Ａｇ
８．６５３が使用され、それによって、得られた融合生
成物の分析が簡素化される。

【００２４】別の技術的問題には、２タイプの親細胞か
ら好結果の融合出来事（ｆｕｓｉｏｎ　ｅｖｅｎｔｓ）
　（ハイブリッド細胞）を選択するための論理的解釈が
含まれる。融合計画には常套的に各タイプの百万又はそ
れ以上の細胞が使用され、そして融合は１００％の頻度
で起こらないので、融合又は自己融合した両親の高背景
（ｈｉｇｈ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）　から融合生成物
の回収を試みる仕事は手に負えないほどである。上述し
たようにハイブリドーマは、短期生存抗体産生（脾臓）
細胞及び長期生存骨髄種細胞から形成される。望まれる
結果は、抗体を産生する長期生存細胞系である。脾臓細
胞は培養中、有限の寿命を有しているので、非融合又は
自己融合脾臓細胞の全てが死滅する適当な期間、ただ待
つだけでよい：しかしながら、得られた固体群（ｒｅｓ
ｕｌｔｉｎｇ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）からは、長期生
存抗体産生細胞（ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ　ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）　を非産生細
胞（ｎｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）　から
回収しなければならない。ハイブリッド細胞を選別する
ための普及している手段は、いわゆるＨＡＴ−選別シス
テムである。このシステムは、酵素：ヒポキサンチン−
グアニン−ホスフォリボシル　　トランスフェラーゼ（
ＨＧＰＲＴ）の使用を含んでいる。この酵素は哺乳動物
の細胞内のプリン再利用経路（ｐｕｒｉｎｅ　ｓａｌｖ
ａｇｅ　ｐａｔｈｗａｙ）で機能する。また、これらの
細胞は、プリンをドゥノボ合成（ｄｅ　ｎｏｖｏ　ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ）できる。殆どの条件下で、両経
路はたぶん或る限度まで作用する。細胞がＨＧＰＲＴを
欠いている場合、再利用経路は遮断され、プリンは非プ
リン物質から製造されなければならない。

【００２５】化学的８−アザグアニンは、プリン　　グ
アニンとして変装（ｍａｓｑｕｅｒａｄｉｎｇ）するこ
とができ、その通常の反応のいくつかにおいてそれと置
換できる代謝拮抗物質（ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ
）である。アザグアニンはＤＮＡ中に組み込まれ、通常
の成長パターンに干渉し、細胞を死に導く。アザグアニ
ンは再利用されなければならないので、ＨＧＰＲＴ活性
を欠く如何なる細胞もアザグアニンを利用できず、その
存在は発達するであろう。

【００２６】同じ酵素に作用するがＨＧＰＲＴ陽性細胞
が選択されるという意味では反対の選別システムは、ジ
ェイ．ダブリュ．リトルフィールド（Ｊ．Ｗ．Ｌｉｔｔ
ｌｅｆｉｅｌｄ）　により述べられている（１９６４）
。それはＨＡＴと呼ばれており、ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。アミノ
プテリンは、プリンのドゥノボ合成及びチミジレートを
生じるデオキシウリジレートのメチル化を防ぐ代謝拮抗
物質である。ヒポキサンチンは、チミジンがチミジレー
トのメチル化の必然性をバイパスしている間にアミノプ
テリンがドゥノボ・プリン生合成を阻止するという出来
事中で再利用プリンとして役立つことができる。このよ
うに、アミノプテリンの存在下、陽性のＨＧＰＲＴ活性
を有するどんな細胞も増殖するが、陰性のＨＧＰＲＴ活
性を有する細胞は死ぬ。

【００２７】ＨＡＴシステムの代わりは、ＨＡＴＨＡＴ
の代わりにＨＭＴを使用することである。ＨＭＴはアミ
ノプテリンの代わりにアメトプテリン（ａｍｅｔｈｏｐ
ｔｅｒｉｎ）（メトトレキセート：ｍｅｔｈｏｔｒｅｘ
ａｔｅ）を用いる。この方法も同じ原理で作用するが、
ＨＭＴ培地はやや毒性が少なく、従って細胞は培地上に
もっと長い時間放置され得る。

【００２８】本実施例による選別のために使用されるハ
イブリッドシステムにおいて、骨髄種細胞はアザグアニ
ンに対して抵抗性で、アメトプテリンに対して感受性（
ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ）　である：即ち、それらはＨ
ＧＰＲＴ陰性である。このようにそれらはアメトプテリ
ンの存在下で死ぬ。抗体産生細胞はＨＧＰＲＴ陽性であ
る。増殖系（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｌｉｎｅ）
を構成する骨髄種細胞はＨＧＰＲＴ活性が存在しこの活
性がＨＧＰＲＴ陽性細胞系により供給されなければなら
ない所でのみ成長できるので、細胞を融合しそれをアザ
グアニンの無いＨＭＴ培地（ＨＴ培地）で成長させるこ
とにより、効果的に融合した細胞が選別される。抗体産
生ＨＧＰＲＴ陽性細胞系はこの培地で殺されない。それ
らは当分の間生存するが増殖はしない。

【００２９】このように、ＨＡＴ又はＨＭＴ培地中で細
胞を融合することにより、骨髄種細胞及び抗体産生細胞
がハイブリッド細胞を生産するのに充分なほど長く成長
できるがハイブリッド細胞のみが生き残って増殖できる
システムが製造される。選別後、次いで各ハイブリドー
マクローンは興味のある特定の抗体を産生する能力につ
いてスクリーニングされる。

【００３０】本発明の好ましい具体例では、モノクロー
ナル抗体の産生に有用な菌エキスの製造のためにミコス
フェレラ　　フィジエンシスが使用される。特にミコス
フェレラ種のこま切れにした菌糸（ｃｈｏｐｐｅｄ　ｍ
ｙｃｅｌｉａ）（又はこま切れにした菌糸と分生子との
混合物）を抗体源として使用することができる。そのよ
うなエキスの製造方法は、実施例１．１に詳細に説明さ
れている。

【００３１】胞子エキスもまた、ミコスフェレラの１種
又はそれ以上と反応する抗体を誘導する抗原を生じさせ
ることができる。そのようなエキスはミコスフェレラグ
ラミニコラの発芽又は未発芽のどちらの胞子からも製造
することができるけれども、発芽した胞子が好ましい。 抽出操作の詳細は実施例２．１に示されている。

【００３２】そのようにして産生した抗体間の区別は適
当なスクリーニング操作によって行われ、概要は後に詳
述されている。接種用の製剤に仕上げるために、抗原エ
キスは適当なアジュバントと配合される。アジュバント
はこの目的のために当分野で一般的に使用されているも
のであれば何でもよい；しかしながら、良好な結果は、
最初の注射のためにはフロイント完全アジュバント（Ｆ
ｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ
）を、そしてその後のどんな注射のためにはフロイント
不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｉｎｃｏｍｐ
ｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）を用いることにより達成
されている。

【００３３】本実施例に記載されている抗体は、マウス
のような適当な宿主有機体（ｈｏｓｔ　ｏｒｇａｎｉｓ
ｍ）　を使用して作られた。しかしながら、実験動物の
同一性は限定されず、この目的のために一般的に使用さ
れている全ての動物、例えばラット、ウサギ又はヤギか
ら選択してよい。

【００３４】接種プログラムは限定されず、当分野でこ
の目的のために用いられている如何なるものであっても
よい。そのような手順は、例えばゴーディング（Ｇｏｄ
ｉｎｇ）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｔｉｃｅ（　モ
ノクローナル抗体：原理と実践）」アカデミックプレス
（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，１
９８３年に記載されている。

【００３５】有用なプログラムは、適当なアジュバント
と配合された抗原の最初の免疫化が腹膜組織内でなされ
るものである。次いで２週間隔で追加抗原刺激注射（ｂ
ｏｏｓｔｅｒ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）　が投与され得る
。２又はそれを越える追加抗原刺激が与えられてよい。 その動物は、興味のある抗原に特異的な抗体が血清中に
含まれているかを調べるために、尾で採血される。その
後動物は犠牲にされ、リンパ球源を提供するために脾臓
が取り出される。

【００３６】ハイブリドーマを作るための融合操作は当
分野でよく知られており、公知操作のどれもが、ミコス
フェレラ−特異モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマの製造に有用である。本実施例で用いられる操作
は、ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）　とミルスタイン（Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５）及びハンマーリング（Ｈ
ａｍｍｅｒｌｉｎｇ）（１９７７）により開発された方
法の変法である。

【００３７】効果的と証明されている操作の一つを簡単
にまとめると、脾臓細胞（又は代わりに末梢血リンパ球
）を免役した動物から単離し、細胞数を数える。支持細
胞層（ｆｅｅｄｅｒ　ｌａｙｅｒ）として細胞１億個／
培地１０ｍｌの濃度で使用されるＴ細胞は首尾よく用い
られた。適当な不死細胞系（ｉｍｍｏｒｔａｌ　ｃｅｌ
ｌ　ｌｉｎｅ）好ましくは骨髄種細胞系が選択され、リ
ンパ球に、リンパ球：骨髄種＝約１：４の割合で加えら
れる。有用な細胞系は、ＮＳ−１，ＳＰ２／０−Ａｇ１
４〔シュルマンら（Ｓｈｕｌｍａｎ　ｅｔａｌ．）１９
７８年〕又はＸ６３−Ａｇ８．６５３骨髄種細胞系から
なる群より選択された細胞系である。

【００３８】好ましい融合培地は、例えばＵＶ−不活性
化形態が適当なセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ　ｖｉ
ｒｕｓｅｓ）又は他のパラミクソウイルス（ｐａｒａｍ
ｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）　のような細胞を融合するため
に慣用されている１種の融合促進剤、カルシウムイオン
、例えばリソレシチン又はポリエチレングリコールのよ
うな表面活性液体を含む緩衝溶液である。本発明の範囲
内において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）好まし
くは６００ないし６０００の、特には１５００の平均分
子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、３
０％ないし６０％の濃度で使用するのが好ましい。４０
％〜５０％のＰＥＧ濃度が特に好ましい。最適融合温度
は１８度ないし３９℃である。室温が特に好ましい。

【００３９】合わせた細胞にポリエチレングリコールを
添加した後、反応混合物をＤＭＥＭで徐々に希釈する。 遠心分離後、予め温めたＨＭＴ培地を、再懸濁されたペ
レットに加える。そのサンプルをさらにＨＭＴ培地で更
に希釈し、そし少量のサンプルをマイクロ滴定プレート
（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）のウェル（ｗｅ
ｌｌ：窪み穴）に入れる。該プレートは次いでＣＯ２培
養に、好ましくは少なくとも湿度９５％の９％ＣＯ２　
培養に置く。約５〜７日後、細胞にＨＭＴ培地を再供給
する。約５〜７日後にハイブリドーマのクラスター構造
（ｃｌｕｓｔｅｒｓ）が現れ始める。ＨＴ培地は更に供
給される。

【００４０】本発明のハイブリドーマ細胞系を製造する
ための上記の簡単にまとめた操作は本発明の好ましい具
体例を表しているが、どのようにか限定されると解釈さ
れてはならない。

【００４１】上記のように製造される本発明のハイブリ
ドーマ細胞クローンは、適当なモノクローナル抗体の産
生のために、好ましくは例えば酵素結合免疫測定法（ｅ
ｎｚｙｍｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
）又は放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ）のようなこの目的に慣用されている免疫測定法
の一つを用いてスクリーニングされる。

【００４２】特に、ミコスフェレラに対する抗体を産生
するハイブリドーマは、興味のある特定種の調製された
菌材料（ｆｕｎｇａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ）例えばＥ
ＬＩＳＡフォーマットの菌糸，分生子又は発芽胞子の何
れかを用いて同定される。特に菌糸材料はミコスフェレ
ラ　　フィジエンシスからの有用な源（ｓｏｕｒｃｅ）
であるが、発芽胞子はミコスフェレラ　　グラミニコラ
からの有用な材料である。ＥＬＩＳＡにおいて陽性の応
答を示すウェルは、ハイブリドーマ細胞の純粋株を選別
するためにサブクローン化される。サブクローン系（ｓ
ｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｌｉｎｅｓ）　は、菌成分（ｆｕｎ
ｇａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）　に対する特異抗体活
性について再試験される。

【００４３】選別された抗体の特異性度（ｄｅｇｒｅｅ
　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）　を調べるために、
それらを、ミコスフェレラに関連しても関連しなくても
よい病原菌の集団（ｐａｎｅｌ）　に対してスクリーニ
ングするのが好ましい。例えばミコスフェレラ　　グラ
ミニコラ特異抗体を得るために、選別された抗体はミコ
スフェレラの別の種に対して、並びにもっと離れた関連
又は非関連種に対して試験されるべきである。

【００４４】本目的に役立つ主要な集団（パネル）の例
を表１及び表４に示す。或る抗体が一方のフォーマット
において有用でも、他方においてはそうでないこともあ
り得るので、単一及び二抗体フォーマット（ｓｉｎｇｌ
ｅ　ａｎｄ　ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｆｏｒ
ｍａｔ）　の両方でスクリーニングを行うことが一般的
に推奨される。

【００４５】本発明の更なる具体例は、このように、（
ａ）　ミコスフェレラのエキスでドナー動物を免疫し；
（ｂ）　その免疫ドナー動物から免疫適格性Ｂ細胞を単
離し； （ｃ）　そのＢ細胞と不死細胞系の細胞を融合し；（ｄ
）　融合精製物をスクリーニングし、そしてミコスフェ
レラに特異性を有する抗体を産生するものを確認し、（
ｅ）　段階（ｄ）　で単離された融合精製物をクローニ
ングして、ミコスフェレラに特異性を有するモノクロー
ナル抗体を産生する純粋なハイブリドーマ細胞系を得る
ことからなる、ミコスフェレラ属の少なくとも１種と特
異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞系の製造方法を含む。

【００４６】本発明にまた含まれるものは、モノクロー
ナル抗体の製造方法である。特にこれらのモノクローナ
ル抗体の製造方法は、本発明の抗体を合成し好ましくは
その環境培地に分泌する、上記詳述した特性を有する本
発明のハイブリドーマ細胞系、又はそれらのクローンも
しくはサブクローンを公知方法の手段によりインビボ又
はインビトロで培養することを特徴とする。

【００４７】本発明のハイブリドーマ細胞のインビトロ
培養は、好ましくは例えばダルベッコの改良イーグル培
地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇ
ｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ：ＤＥＭＥ）又はＲＰＭＩ　　１６
４０培地のような適当な培地で行われ、それら各々には
適当であれば例えば子牛血清のような哺乳動物の血清、
又は成長促進添加剤及び微量元素が追加補充される。

【００４８】モノクローナル抗体の単離は、例えば硫酸
アンモニウムを用いて、ハイブリドーマ培養体の特定の
上澄み液からの免疫グロブリン分画の沈澱とともにスタ
ートする。この後に、後処理及び例えばゲル濾過，イオ
ン交換クロマトグラフィー，ＤＥＡＥ−セルロースクロ
マトグラフィー，蛋白質Ａ又はイムノアフィニティクロ
マトグラフィー（ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ａ　ｏｒ　ｉｍｍ
ｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ）のようなクロマトグラフ法の使用を含む当分野の専
門化に知られている精製ステップが続けられる。

【００４９】しかしながら、インビボ法を使用して本発
明のモノクローナル抗体を大量に得ることも可能である
。

【００５０】このように、例えば抗体産生ハイブリドー
マ細胞クローンを適当な哺乳動物に注射することは可能
であり、それは処置した動物内に抗体産生腫瘍（ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｔｕｍｏｒｓ）　の
発達を誘導する。１ないし３週間後、このように処置し
た動物の体液から抗体を単離することができる。

【００５１】本発明の特殊な具体例では、適当であれば
例えばプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）のような炭化水
素で前処置された雌のバルブ／ｃマウス（Ｂａｌｂ／ｃ
　ｍｉｃｅ）　が本発明のハイブリドーマ細胞クローン
の腹腔内注射を受ける。ハイブリドーマ細胞クローンの
注射の１ないし３週後、腹水を集め、更に後処理する時
まで貯蔵する。

【００５２】モノクローナル抗体は、インビトロで培養
されたハイブリドーマの上澄み液からの既述した単離と
正に同様な方法で単離される。

【００５３】特許請求の範囲のいずれかの請求項の範囲
に含まれる多くの抗体は、個々に記載されているような
操作で産生される。最初に選別される抗体からの１以上
の抗体は各融合及びスクリーニングにより産生されてよ
いが、或る抗体はそれらの高レベルの特異性及び／又は
それらの或る分析フォーマット中の感受性のために特に
注目される。ミコスフェレラ同定のための抗体の中で好
ましいのはハイブリドーマＭｆｌ４Ｃ６及びＭｆｄｌ　
８Ｅ６より産生されるものである。ハイブリドーマＭｆ
ｌ４Ｃ６は、ミコスフェレラ種に高レベルの特異性を有
して非常に縁遠いリゾプス　　ストロニファー（Ｒｈｉ
ｚｏｐｕｓ　ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）　種にのみ交差反
応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する抗
体を産生する。この性質は、ミコスフェレラの検知にお
ける抗体の有用性に影響を与えない；更に、Ｍｆｌ４Ｃ
６は、二抗体フォーマット（ｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏ
ｄｙ　ｆｏｒｍａｔ）に非常に感受性である。Ｍｆｄｌ
　８Ｅ６抗体は、ミコスフェレラの様々な種に良好な活
性を示し、そして他属の種（ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｏ
ｔｈｅｒ　ｇｅｎｅｒａ）　との交差反応性を有しない
。これらの抗体はＩｇＧ１免疫グロブリンの下位分類（
ｓｕｂｃｌａｓｓ）に属する。

【００５４】ミコスフェレラ　　グラミニコラに関して
、特にハイブリドーマＭｇ３７Ｂ５は、高特異性でミコ
スフェレラ　　グラミニコラに感受性である下位分類の
ＩｇＧ３の抗体を分泌する。しかしながら、表１から判
かるように、これらの特性を有する他の抗体もまた産生
された。

【００５５】これらのタイプの抗体の各々を産生するハ
イブリドーマの例は、ブダペスト条約の規定に従い、米
国メリーランド，ロックヴィルのアメリカ模式培養蒐集
（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に寄託され、下記の受託
番号が与えられている：ハイブリドーマ　　　　　　　
　　　特異性　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　受託番号Ｍｆｌ４Ｃ６−Ｅ８　　　　ミコス
フェレラ種　　　　　　　　　　　　　　ＨＢ１０４１
３Ｍｆｄｌ　８Ｅ６　　　　　　　　ミコスフェレラ種
　　　　　　　　　　　　　　ＨＢ１０４１４Ｍｇ３７
Ｂ５　　　　　　　　ミコスフェレラ　　グラミニコラ
　　ＨＢ１０１８６

【００５６】上記寄託はただ例示の目的でなされている
こと理解されるべきであり、これによって本発明の特許
請求の範囲が限定されると解釈されてはならない。上記
操作の繰り返しにより類似の同様の抗体を製造できるこ
とは、当業者に容易に理解されるであろう。

【００５７】本発明は更に、植物病原菌のミコスフェレ
ラ属の種を検知するための慣用の免疫測定法の一つにお
ける本発明の抗体の使用に関する。

【００５８】上記したように、問題の病原体は、それに
感染された植物に重大な損傷を引き起こすことができ、
従って早期の診断が高く望まれている。今、本発明の抗
体は、何らかの目に見える病気の症状が植物上に現れる
前に病原体を植物材料中に発見できる方法を提供する。

【００５９】上記抗体は、植物材料中の特定の種の存在
を調べるための多くの異なる免疫測定法の基本試薬とし
て用いることができる。一般的に言うと、該抗体はどの
タイプの免疫測定法にも、定性的であれ定量的であれ用
いることができる。これには、単サイト（ｓｉｎｇｌｅ
　ｓｉｔｅ）　及び二サイト（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）の両
式又はサンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）式の非競合的
タイプの測定法、並びに伝統的な競合的結合測定法（ｃ
ｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙｓ
）が含まれる。

【００６０】検知の平易さ及びその定量性（ｑｕｎｔｉ
ｔａｔｉｖｅ　ｎａｔｕｒｅ）のためには、サンドイッ
チ測定又は二抗体測定（ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ　ａｓｓａｙ）　が特に好ましく、その数多くの変法
が存在し、本発明にはその全てが含まれることを意図し
ている。

【００６１】例えば代表的な前進分析（ｆｏｒｗａｒｄ
　ａｓｓａｙ）　において、非標識抗体は固体基剤上に
固定化され、結合した分子に試験されるべきサンプルが
接触させられる。 適当な期間培養した後、抗体−抗原二成分複合体を生成
させるのに充分な期間、検知可能なシグナルを誘導でき
るレポーター分子で標識された第二抗体が次いで加えら
れ、抗体−抗原−標識抗体の三成分複合体が生成するの
に充分な時間培養される。全ての未反応物質が洗い流さ
れ、抗体の存在がシグナルの観察により決定されるか、
又は既知量の抗原を含む対照サンプルとの比較で定量さ
れ得る。前進分析における変法には、両サンプルを結合
した抗体に同時に加える同時分析法（ｓｉｍｕｌｔａｎ
ｅｏｕｓ　ａｓｓａｙ）、又は、標識抗体及び試験され
るべきサンプルを最初に結合させ、培養しそして非標識
表面結合抗体に加える逆分析法（ｒｅｖｅｒｓｅ　ａｓ
ｓａｙ）　が含まれる。これらの技術は当業者によく知
られており、小変更（ｍｉｎｏｒ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
ｓ）の可能性は容易に理解される。ここで使用されてい
る“サンドイッチ測定”は、基本的な二サイト技術（ｔ
ｗｏ−ｓｉｔｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）における全ての
変法を含んでいるつもりである。

【００６２】本発明の免疫測定法として、唯一の限定的
要素は、少なくとも一つの抗体が必要な特異性を有する
ことである。かくして、多くの可能な組合せが可能であ
る。例えば一方の抗体がポリクローナルで、他方がモノ
クローナル抗体であってよい。代わりに、一つの抗体が
興味のある病原体と他の菌の両方に結合する一般的な抗
体である一方、第二の抗体が興味のある病原体に特異的
であればよい。また、両抗体が興味のある病原体に特異
的であってもよい。

【００６３】もっと特別な例として、代表的な前進サン
ドイッチ測定法において、一般的なミコスフェレラ−結
合抗体は固体表面に共有結合的か受動的に結合される。

【００６４】抗原を又は抗体を結合するのに適する固体
支持体材料の例は、ミクロ滴定プレート（ｍｉｃｒｏｔ
ｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）の又はテストチューブのプラス
チック表面、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化
ビニル、ガラス又はプラスチック製ビーズの表面、でな
ければフィルター紙、デキストラン、セルロース又はニ
トロセルロースの条片（ｓｔｒｉｐｓ）又は類似材料で
ある。後者は本発明のモノクローナル抗体の１種で又は
抗原で（それは簡単な吸着により引き起こされるべき支
持体材料への結合が可能である）、さもなくば、適当で
あれば支持体材料の活性化を高めた後に例えばグルタル
アルデヒド又はシアノゲンブロミドで被覆される。

【００６５】好ましい固体表面は通常ガラス又はポリマ
ーであり、最も普通に使用されるポリマーはセルロース
、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ
塩化ビニル又はポリプロピレンである。

【００６６】特別の上記支持体材料は、多様なデザイン
及びを持つことができ、特に意図する特別の使用目的に
依存した非常に異なるタイプの形状を持つことができる
。後者には例えばディッシュ、球体、プレート、ロッド
、セル、バイアル、チューブ、繊維、ネット、ビーズ、
ディスク又はマイクロプレート、或は免疫測定法を行な
うのに適するどんな他の表面も含まれる。

【００６７】結合プロセスは当分野でよく知られている
。結合後、固体相−抗体複合体は試験サンプルの製造に
おいて洗浄される。次いで試験される植物エキスの一部
試料（ａｎ　ａｌｉｑｏｕｔ）を固体相複合体に加え、
適当な温度好ましくは２５℃で、存在する全てのミコス
フェレラを抗体に結合させるのに充分な時間培養させる
。培養時間は変えられるが一般的に２分ないし１６時間
の範囲である。培養時間経過後、抗体−ミコスフェレラ
固体相は洗浄され、乾燥され、ミコスフェレラに特異性
の第二抗体とともに培養される。第二抗体はレポーター
分子に結合され、その視認できるシグナルはサンプル中
の何らかの抗原に第二抗体が結合したことを指示するの
に使用される。本明細書及び特許請求の範囲で使用され
ている“レポーター分子”は、その化学的性質により抗
原−結合抗体を検知させる分析的に検知可能なシグナル
を提供する分子を意味する。検知は少なくとも相対的に
定量可能でなければならず、サンプル中の抗原の量を定
量可能にするために、これは絶対値で計算されても、或
は既知の通常レベルの抗原を含む標準品（又は標準品群
）との比較により行なわれてもよい。

【００６８】このタイプの分析で最も普通に用いられる
レポーター分子は酵素、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ
ｅｓ）又は放射性核種含有分子である。酵素免疫測定法
の場合、酵素はしばしばグルタルアルデヒド又は過ヨウ
素酸塩で第二抗体に抱合される。しかしながら容易に認
識されるように、多様な異なる抱合技術が存在し、それ
は熟練技術者によく知られている。常用される酵素には
、中でもホースラディシュパーオキシダーゼ〔ｈｏｒｓ
ｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：山葵（わさび
）の過酸化酵素〕、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼが含まれ
る。特定の酵素と共に使用される基剤（ｓｕｂｓｔｒａ
ｔｅ）　は一般的に、対応する酵素による加水分解に依
存して、検知可能な変色を生じさせるために選択される
。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートはアルカリ
ホスファターゼ抱合体と共に使用するのに適している：
パーオキシダーゼ抱合体として、１，２−フェニレンジ
アミン又はトルイジンが普通に使用される。蛍光基剤（
ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）を使用
することも可能であり、それは上記の色素発光基剤（ｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）よりも
むしろ蛍光生成物を生じる。全場合とも、酵素で標識さ
れた抗原−特異抗体は最初に抗体−ミコスフェレラ複合
体に加えられ、該複合体に結合され、次いで過剰の試薬
が洗い流される。次いで適当な基剤を含む溶液が抗体−
抗原−標識抗体の第三複合体に加えられる。基剤は、第
二抗体に結合した酵素と反応し、定性的な目に見えるシ
グナルを生じ、それは更に、血清サンプル中に存在する
抗原の量を評価するために普通に分光測光的に定量され
てよい。

【００６９】他方、フルオレッセン及びロダミンのよう
な蛍光化合物は、それらの結合能力を変化させることな
く抗体に化学的に結合されてよい。特定波長の光で照射
することにより活性化された場合、蛍光色素−標識抗体
は、光エネルギーを吸収し、分子内に興奮性（ｅｘｃｉ
ｔａｂｉｌｉｔｙ）の状態を導き、続いて特徴的なより
長い波長で光を放出する。その放出は光顕微鏡で視認で
きる特徴ある色として現われる。ＥＩＡでのように、蛍
光標識ＰＬＦ−特異抗体は最初に抗体−フェリチン複合
体に結合させられる。非結合試薬を洗浄した後、残った
三体の複合体は次いで適当な波長の光にさらされ、観察
された蛍光は、興味のある存在を指示する。

【００７０】蛍光免疫測定法及びＥＩＡ技術は両方とも
当分野で非常によく確立されており、現方法として特に
好ましい。しかしながら、他のレポーター分子、例えば
放射性同位元素、化学発光性の又は生物発光性の分子も
また用いられてよい。その操作を要求された用途に合う
ように如何に変えるかは熟練技術者には明白であろう。

【００７１】更に、本発明は、本発明のモノクローナル
抗体及び／又はその誘導体に加えて適当であれば更に他
のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を、しか
し特には標識したモノクローナル抗体又はポリクローナ
ル抗体を、そして他の添加剤を含む試験キット形態のミ
コスフェレラの定性的及び定量的測定手段に関するる。

【００７２】本発明の範囲内において特に好ましいのは
、放射性免疫測定法，酵素結合免疫測定法及び化学発光
分析法よりなる群から選択される慣用免疫測定法の一つ
をベースとする試験キットである。非常に特に好ましい
試験キットは、ミコスフェレラの検知が競合的免疫測定
法、しかし特には酵素結合直接もしくは間接免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）に基づくものである。

【００７３】ミコスフェレラの放射免疫学的検知のため
の試験キットは例えば以下の成分を含むことができる：
（ａ）　被覆されていないか或は本発明の抗体の１種で
又は抗原抱合体で被覆されていてよい適当な支持体材料
；（ｂ）　適当であれば、本発明の抗体の１種及び／又
はその放射標識誘導体又は放射標識抗原の凍結乾燥もし
くは濃縮溶液又は抗原の標準溶液； （ｃ）　緩衝溶液及び （ｄ）　適当であれば、ポリペプチド，洗浄剤及び、例
えば非特異性吸着及び凝集形成を防ぐ他の添加剤，及び
（ｅ）　ピペット，反応容器、基準目盛図（ｃａｌｉｂ
ｒａｔｉｏｎ　ｐｌｏｔｓ）　、包装挿入物等。

【００７４】酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に基づ
くミコスフェレラの放射免疫学的検知のための試験キッ
トは例えば以下の成分を含むことができる：（ａ）　被
覆されていないか或は本発明の抗体の１種で又は抗原抱
合体で被覆されていてよい適当な支持体材料；（ｂ）　
適当であれば、本発明の抗体の１種及び／又は、測定さ
れる抗原に対して又は抗原を認識する抗体に対して指向
された第二の酵素−標識モノクローナル抗体又はポリク
ローナル抗体の凍結乾燥もしくは濃縮溶液；（ｃ）　固
体又は溶解した形態の酵素基剤；（ｅ）　抗原又は抗原
の標準溶液； （ｆ）　緩衝溶液； （ｇ）　適当であれば、ポリペプチド，洗浄剤及び、例
えば非特異性吸着及び凝集形成を防ぐ他の添加剤，及び
（ｈ）　ピペット，反応容器、基準目盛図、カラー表、
包装挿入物等。

【００７５】化学発光性試験（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅ　ｔｅｓｔ）に基づくミコスフェレラの検
知のための試験キットは例えば以下の成分を含むことが
できる： （ａ）　被覆されていないか或は本発明の抗体の１種で
又は抗原抱合体で被覆されていてよい適当な支持体材料
；（ｂ）　適当であれば、本発明の抗体の１種及び、本
発明の最初の抗体を認識しそして化学発光標識体に結合
する第二ポリクローナル抗体の凍結乾燥もしくは濃縮溶
液；（ｃ）　例えばＨ　　Ｏ　　及びＮａＯＨのような
光放出を導く成分を含む溶液； （ｄ）　緩衝溶液； （ｅ）　適当であれば、ポリペプチド，洗浄剤及び、非
特異性吸着及び凝集形成を防ぐ他の添加剤，及び（ｆ）
　ピペット，反応容器、包装挿入物等。

【００７６】本発明の範囲内で使用できる支持体材料は
主に、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル
、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、架橋デキス
トラン、フッ素化樹脂、アガロース、架橋アガロース、
ポリサッカライド等よりなる群から選択される不溶性ポ
リマー材料からなる。しかしながら、これらの他に、例
えばガラス、金属、ナイロン−ベース網布（ｎｅｔ　ｆ
ａｂｒｉｃ）のような他の材料も考えられる。

【００７７】特定の上記支持体材料は、多様なデザイン
を及び、特に意図する使用目的に依って非常に異なるタ
イプの形状を持つことができる。後者には例えばディッ
シュ、球体、プレート、ロッド、セル、バイアル、チュ
ーブ、繊維、ネット等が含まれる。

【００７８】試験キットの製造にたびたび使用されるも
のは、例えばポリ塩化ビニル又はポリスチレンのような
透明プラスチック材料で作られたマイクロ滴定プレート
であり、それは被覆されていないか、でなければ遊離抗
原（ｆｒｅｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）と共に本発明の抗体の
１種で、又は抗原抱合体で被覆されていてよい。ポリス
チレン及びポリスチレンラテックスのビーズ、チューブ
又はロッドも使用され、ポリスチレンラテックスの場合
、周囲のラテックス材料は遠心分離によりポリスチレン
から分離される。

【００７９】本発明の試験キットの別の成分は、複合体
−　形成反応、特には免疫学的反応の存在を検知可能に
する標識（ｌａｂｅｌｓ）又は指示薬（ｉｎｄｉｃａｔ
ｏｒｓ）からなり、それは好ましくは抗原−抗体複合体
か又は配位子−受容体複合体を結果として生じ、その場
合適当であれば定性的のみならず定量的情報を検知され
る抗原について得ることができる。適当な標識又は指示
薬は両方とも単一の原子又は分子であり、それらは検知
可能なシグナルの発生において直接的にか又は間接的に
かのいずれかで取り込まれ得る。これらの標識又は指示
薬は、検知されるべき抗原に又は本発明のモノクローナ
ル抗体の１種に直接結合するか、さもなくば後者に組み
込まれる。しかしながら、それらは単一物質又は、それ
自身検知される物質でも本発明のモノクローナル抗体の
１種でもないが例えば複合体生成の形で受容体分子と反
応することのできる分離した化合物の成分の形態であり
得る。

【００８０】これらの別々の化合物は、起源としてＳ．
ａｕｒｅｕｓ蛋白質Ａ等の完全な蛋白質又はそのフラグ
メントのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の
両方であり得る第二抗体分子の形態をとる。これらの別
々の化合物は、例えば検知されるべき抗原又は本発明の
モノクローナル抗体の１種（しかし、好ましくは複合体
の形態で存在する受容体分子）のような受容体分子を認
識し、特異的に結合する。多くの場合、標識と協同して
のみ検知可能なシグナルを導く追加の試薬が更に必要で
ある。これは、酵素が含まれる場合に特に適用される。

【００８１】本発明の範囲内において使用することので
切る標識又は指示薬は、免疫学及び免疫化学の分野の専
門化に非常に良く知られている。それらは例えば放射性
標識元素または物質、酵素又は化学発光物質からなる。 以下の可能な標識又は指示薬のリストは、実施例で使用
できる多様な物質及び試薬を単に例示するが、それによ
って本発明の主題がいかようにも限定されないこと意図
したものである。適当な標識又は指示薬の例は放射性元
素群の中に見い出すことができる。これに関し、特に好
ましい元素は、例えば１２４　Ｉ，１２５　，Ｉ１２８
　Ｉ１３２　，Ｉ５１Ｃｒのようなそれ自身γ線を放射
するもの、又は例えば１１Ｃ、１８Ｆ、１３Ｎのような
これらの線の放出を誘導する元素である。１１１　Ｉｎ
，１４Ｃ及び３　Ｈのような、いわゆるβ線放出物も適
当である。

【００８２】他の適当な標識には、化学発光物質特には
蛍光物質が含まれ、それは化学的手段によって、抗原に
又は抗体に後者を何ら変性させることなく非常に簡単に
結合することができる。生じた蛍光色素は、蛍光測定法
を用いて容易に検知することができる。この点に関し、
特記するに足るものは、フルオレッセン　　イソシアネ
ート、フルオレッセン　　イソチオシアネート、５−ジ
メチルアミノ−１−ナフタレンスルホニルクロライド、
テトラメチルロダミン　　イソチオシアネート、リサミ
ン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）　、ロダミン８２００スルホ
ニルクロライド等である。

【００８３】更に蛍光剤及び分析技術の記述は、デルカ
（ＤｅＬｕｃａ）「アンチボディ　　アズ　　アツール
（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ　／道具とし
ての抗体）　」中、“イムノフルオレッセンス　　アナ
リシス（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ）　”マーチャロニスら（Ｍａｒｃｈａｌ
ｏｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ）　、ジョン　　ワイリー　　ア
ンド　　サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎ
ｓ，Ｌｔｄ．）、第　１８９−２３１　頁（１９８２　
年）　に見い出すことができる。

【００８４】本発明の範囲内で、標識化又は指示薬物質
として酵素、例えばホースラディシュパーオキシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸脱水
素酵素、アセチルコリンエスエラーゼ、リゾチーム、リ
ンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−ホスフェートデヒ
デロゲナーゼ等のような酵素を使用するのが特に好まし
い。標識用物質として酵素を使用する場合、酵素活性に
よりフォローされる免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｍ
ｐｌｅｘ）を生成させる追加の試薬、及び適当であれば
酵素反応を停止できる停止剤（ｓｔｏｐ　ａｇｅｎｔ）
を加える必要がある。

【００８５】これに関して、特に好ましいのは呈色反応
を生じる試薬である。ホースラディシュパーオキサイド
の場合、この点で挙げられる例は、例えばジアミノベン
ジジン又はｏ−フェニレンジアミンのような追加の酸化
染料前駆体と合わさって、褐色又は黄色を生じるハイド
ロジェンパーオキシドである。グルコースオキシダーゼ
が標識用物質として使用される場合、物質として２，２
−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチオゾリン−６−
スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を使用することができる。

【００８６】従って，本発明は、病原菌ミコスフェレラ
属の種を迅速に効率よく定性的及び／又は定量的に検知
するための、少なくとも１種の本発明のモノクローナル
抗体を試薬として含む試験キットの使用に関する。

【００８７】

【実施例】非限定的具体例 以下の実施例は、本発明のハイブリドーマ及び抗体の製
造方法を示す。

【００８８】実施例１：抗原調製 １．１　　ミコスフェレラ　　フィジエンシスミコスフ
ェレラ　　フィジエンシスの分離株（ｉｓｏｌａｔｅｓ
）をＶ−８寒天プレート上で集合的に発育させる。Ｖ−
８寒天は次のように調製されている。 Ｖ−８ジュース〔野菜ジュース：トマト、ニ　　　　　
　　　１５０ｍｌンジン、セロリ、ほうれん草、赤かぶ
、パセ　　　　　　　　　　　　　　　　　　リ、レタ
ス（非明示）：Ｃａｍｐｅｌｌ　Ｓｏｕｐ　Ｃｏ．，　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃａｍｄｅｎ，
ＮＪ　０８１０３−１７０１〕　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
炭酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．５ｇ寒天　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８．０ｇ蒸留
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０Ｌ

【００８９】分離株がすでにＶ−８寒天プレート上に存
在する場合、７〜１４日経過したプレートに無菌蒸留水
１０ｍｌを注ぎ、無菌の細胞けずり器（ｃｅｌｌ　ｓｃ
ｒａｐｅｒ）又はガラスロッドを用いて分生子を駆逐す
る。分生子懸濁液の少部分標本（ａ　ｓｍａｌｌ　ａｌ
ｉｑｕｏｔ）　を無菌的に移し、顕微鏡下で典型的な長
細いコレスポラ様分生子（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ−ｌｉ
ｋｅ　ｃｏｎｄｉａ）の存在について観察する。懸濁液
０．１ｍｌ　をＶ−８寒天プレート上に置き、無菌の曲
げガラスロッドを用いて表面に平均的に広げる。プレー
トを連続光〔ＧＥ　　Ｆ４０；２０１　　白色蛍光灯、
露光時間　　２４時間〕下、室温で培養する（ｐａｒａ
ｆｉｌｍｅｄ）。分離株の連続的移転は過度に病原性（
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）　に影響するかもしれな
い。新鮮な分離株は３ヵ月ごとに液体窒素から蘇生され
なければならない。

【００９０】ミコスフェレラ　　フィジエンシスの分離
株はバイアルを室温で緩解（ｔｈａｗｉｎｇ）　し、そ
して寒天栓（ａｇａｒ　ｐｌｕｇ）　を濃縮Ｖ−８寒天
プレート上に覆うことにより液体窒素から蘇生させるこ
とができる。プレートを連続光下、室温で培養する。寒
天栓上に目に見える成長が現れた後（５〜７日）、無菌
の鉗子を用いて栓を無菌的に取り出し、その栓をＶ−８
寒天プレートの表面に広げる。

【００９１】抗原は、分生子又は細切れにした菌糸をブ
ロス培養における接種物（ｉｎｏｃｕｌａｎｔ）　とし
て使用することにより製造することができる：分生子接
種物（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）は、分生子懸濁液で接種した
Ｖ−８プレートを用いて上記のように製造される。接種
物プレートを連続光下７〜１４日間、室温で培養する（
文献では１０日が最適と報告されている）。プレートに
無菌蒸留水１０ｍｌを注ぎ、上記のように分生子を駆逐
する。懸濁液０．１ｍｌを無菌的に取り出し、血球計を
用いて計測される分生子の数及び分生子濃度を無菌的に
　１００，０００分生子／ｍｌ水　　に調整する。無菌
的に行なわれる場合、追加のＶ−８プレートを接種する
のに懸濁液０．１ｍｌが使用され得る。前もって　５０
０，０００ないし９００，０００　の範囲の分生子数が
単一寒天プレートから採取される。

【００９２】菌糸の接種物は、無菌のフィトン−デキス
トロース（Ｐｈｙｔｏｎｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）ブロス
５０ｍｌを含む２５０ｍｌ組織培養フラスコに、分生子
懸濁液（１００，０００ないし２００，０００　分生子
）　又は寒天プレートから取り出された菌糸の塊（ｃｈ
ｕｎｋｓ）を接種することにより製造される。フィトン
デキストロースブロスは次のように製造される：バクト
−ソイトン（Ｂａｃｔｏ−Ｓｏｙｔｏｎｅ）　〔Ｐｈｙ
ｔｏｎｅ；　　　　　　　　　　　　１０ｇＤｉｆｃｏ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｄｅｔｒｏｉｔ，　Ｍ
Ｉ　〕　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　デキストロース　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１Ｌ

【００９３】フラスコを正確に３日間培養し、次いで激
しく振り、そして約５〜７日間平静に置く。培養後、こ
の懸濁液を例えば無菌の５０ｍｌオムニミキサーチャン
バー（Ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ　ｃｈａｍｂｅｒ）　〔全混
合粉砕機のステンレススチール室（容量５０ｍｌ）、Ｏ
ｍｎｉ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｔｅｒｂｕ
ｒｙ，Ｃｏｎｎ．，ＵＳＡ〕に無菌的に移すことにより
物理的に処理し、菌糸を分裂させる。菌糸を充分に細切
れにするために、この懸濁物を３０秒間高度に粉砕する
。

【００９４】分生子２００，０００　又は細切れにした
菌糸の懸濁液０．５ｍｌを無菌的に、２５０ｍｌフラス
コ中のフィトン−デキストロースブロス５０ｍｌに加え
、水浴中２６℃及び８０ｒｐｍで震盪する。フラスコを
好ましくは８日間培養する。

【００９５】菌糸は、ミコスフェレラがチーズ布（ｃｈ
ｅｅｓｅｃｌｏｔｈ）を通過してよいブロス培養体中の
小球（ｃｏｍｐａｃｔ　ｓｐｈｅｒｅｓ）に成長してか
ら、ブッフネル漏斗（Ｂｕｃｈｎｅｒ　ｆｕｎｎｅｌ）
でコーヒーフィルター（６．４　×８．３　ｃｍ）　を
用い減圧下で採取する。

【００９６】１．２　：ミコスフェレラ　　グラミニコ
ラ抗原エキスは、発芽又は非発芽胞子から以下のように
して製造することができる：

【００９７】１．２．１　：非発芽胞子セプトリア　　
トリティシ（Ｓ．ｔｒｉｔｉｃｉ）　の分離株の分生子
をＣＤＶ８プレート〔Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘブロス，　
Ｄｉｆｃｏ　Ｃａｔ　♯０３３８−０１−２，　Ｃａｍ
ｐｅｌｌの“Ｖ−８”ジュースを補充〕に、接種用ルー
プを用いて画線接種する。プレートを、近ＵＶ光（ｎｅ
ａｒ　ＵＶ　ｌｉｇｈｔ）　下での１８℃培養に置く。 ５〜７日後の培養体に無菌蒸留水を注ぎ、無菌の接種用
ループを寒天の表面に擦ることにより分生子を穏やかに
駆逐する。得られた懸濁液中の分生子／ｍｌの数を血球
計を用いて測定する（胞子濃度は非常に高くなり得る．
曇った懸濁液には１：５０希釈が推奨される）。胞子懸
濁液を無菌蒸留水で最終濃度２百万分生子／ｍｌに希釈
する。

【００９８】酵母シュークロース培地（ＹＳＭ）〔酵母
エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０
ｇ：シュークロース１０ｇ；水１Ｌ〕５０ｍｌと接種物
１ｍｌを各々含む２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコ
を無菌的に培養する。ＹＳＭ接種フラスコを１８℃で周
囲光〔室内蛍光灯照明，点灯時間約１０時間〕下の震盪
器〔ｓｈａｋｅｒ：　高速，　約１４０ｒｐｍ〕上に置
き、９６時間後に５つのフラスコを回収する。残りのフ
ラスコは後に発芽胞子を製造するために使用する。フラ
スコ内容物を２５０ｍｌ遠心分離ボトルに注ぎ、３００
ｒｐｍで５分間遠心分離する。上澄み液を流出させ、ペ
レットを一度蒸留水で洗浄し、再び遠心分離する。ペレ
ットをＰＢＳ５０ｍｌに再懸濁し、ダイノ−ミル〔Ｄｙ
ｎｏ−ｍｉｌｌ　タイプ　　ＫＤＬ，細胞粉砕機：Ｉｍ
ｐａｎｄｅｓ，Ｉｎｃ．，　Ｍａｒｙｗｏｏｄ，ＮＪ　
０７０６７〕中で１５分間抽出する。

【００９９】１．２．２　：発芽胞子 上記操作からの残りの５つのフラスコを９６時間後に取
り出し、下記操作に従って発芽させる。

【０１００】各フラスコの内容物を無菌のファルコンチ
ューブ（Ｆａｌｃｏｎｔｕｂｅ）　に無菌的に移し、３
００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上澄み液を流出させ
、無菌蒸留水で一度洗浄し、そして再度遠心分離する。 ペレットを無菌蒸留水５０ｍｌに完全に再懸濁する。各
ファルコンチューブにおける懸濁液を無菌の２５０ｍｌ
エーレンマイヤーフラスコに移す。接種フラスコを１８
℃で周囲光下の震盪器〔ｓｈａｋｅｒ：　高速，　約１
４０ｒｐｍ〕上に７２時間置く。７２時間後、５つのフ
ラスコ内容物を２５０ｍｌ遠心分離ボトル内に注ぎ、胞
子を採取する（サンプル１ｍｌを分取し、血球計を用い
て発芽％を測定する）。サンプルを３０００ｒｐｍ〔Ｇ
Ｓ−３ローター，Ｓｏｒｖａｌｌ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇ
ｅ；１５２１ｇ〕で５分間遠心分離し、上澄み液を流出
させ、ペレットを一度蒸留水で洗浄し、再び遠心分離す
る。ペレットをＰＢＳ５０ｍｌに再懸濁し、ダイノ−ミ
ル〔Ｄｙｎｏ−ｍｉｌｌ　タイプ　　ＫＤＬ，細胞粉砕
機：Ｉｍｐａｎｄｅｓ，Ｉｎｃ．，　Ｍａｒｙｗｏｏｄ
，ＮＪ０７０６７〕中で１５分間抽出する。

【０１０１】１．３　：免疫化及び融合以下の記載はミ
コスフェレラ　　グラミニコラ免疫化についてであるが
、ミコスフェレラ　　フィジエンシスを用いるミコスフ
ェレラ免疫化は同一方法で達成される。

【０１０２】最初の免疫化は、バルブ／Ｃマウスに、フ
ロイント完全アジュバント０．２５ｍｌ中に乳化したＭ
ｇ３菌エキス〔ミコスフェレラ　　グラミニコラ分離株
３，第１．２．１　章に記載されているように製造〕を
腹腔内注射して行う。追加抗原刺激注射は、フロイント
不完全アジュバント中の同じ免疫原を用いて２週間隔で
行う。第４回目の注射である第３回追加抗原刺激注射は
、不完全アジュバント中のＭｇ３菌のエキスで行われ、
続いて同じ製剤の追加抗原（ｂｏｏｓｔｅｒ）　で２週
間以内に行われる。マウスを第１０日目に頸部脱臼によ
り犠牲にし、そしてリンパ球の抽出のために脾臓を切除
する。犠牲に先立ち、マウスの尾から採血し、免疫原に
特異的な抗体の存在について試験する。

【０１０３】マウスを頸部脱臼により犠牲にし、脾臓を
外科的に切除する。脾臓を、無菌の使い捨てのペトリ皿
中の８０メッシュ無菌篩上に置き、外科用メスでカット
し、３ｃｃ注射器の無菌プランジャーでマッサージする
。この操作中、脾臓をＤＭＥＭで数回洗浄する。細胞懸
濁液を無菌の５０ｍｌ使い捨て遠心分離チューブに移す
。篩（スクリーン）及び残りの組織断片を再びＤＭＥＭ
で洗浄し、洗濯物をチューブに加える。細胞懸濁液を２
０００ｒｐｍ以下から８５０ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｔａ
ｂｌｅＴｏｐ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　ＨＴ−４　ｒｏ
ｔｏｒ　）で１０分間回転させる（遠心分離は全て室温
で行われる）。上澄み液を傾斜捨て（デカンテーション
）し、ペレットを赤血球加水分解溶液（０．８３％ＮＨ
４　Ｃｌ，０．０１Ｍ・ＫＨＣＯ３　，０．１ｍＭ・Ｅ
ＤＴＡ）４ｍｌで９０秒間室温で洗浄する。加水分解反
応は、ＤＭＥＭでチューブ内容物を４５ｍｌに希釈する
ことにより停止する。内容物を再び２０００ｒｐｍ以下
ないし８５０ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｔａｂｌｅ　Ｔｏｐ
　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　ＨＴ−４　ｒｏｔｏｒ　）で
１０分間遠心分離する。上澄み液を傾斜捨てし、ペレッ
トをＥＤＴＡ１０ｍｌ中に再懸濁させる。細胞懸濁液の
サンプルを、細胞数計測のために保存する。懸濁液中の
生存細胞の総数は２．９８５×１０８　細胞である。

【０１０４】骨髄種細胞〔アメリカン　　タイプ　　カ
ルチャー　　コレクションから得たＰ３ＮＳ１／１−Ａ
ｇ４−１（ＮＳ１），ＡＴＣＣ♯ＴＩＢ−１８〕を、５
０ｍｌ遠心分離チューブ内での２０００ｒｐｍないし８
５０ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｔａｂｌｅ　Ｔｏｐ　Ｃｅｎ
ｔｒｉｆｕｇｅ　ＨＴ−４　ｒｏｔｏｒ　）で１０分間
の遠心分離により培地から取り出す。上澄み液を傾斜捨
てし、細胞数計測のためにペレットをＤＭＥＭ１０ｍｌ
に再懸濁する。脾臓細胞と骨髄種細胞の比を４：１とす
るには７．４６×１０７　個の骨髄種細胞が必要である
。適当量の骨髄種細胞を脾臓細胞懸濁液に加える。合わ
せた細胞を２０００ｒｐｍないし８５０ｇ（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ　Ｔａｂｌｅ　Ｔｏｐ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　Ｈ
Ｔ−４　ｒｏｔｏｒ　）で１０分間遠心分離する。遠心
分離に続いて、上澄み液を傾斜捨て（デカンテーション
）する。

【０１０５】ＰＥＧ〔Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　ｃａｔ．♯７
８３−６４１　〕１　ｍｌを室温でペレットに加える。 ２ｍｌピペット及び自動ピペッターで、細胞を非常に穏
やかに再懸濁する。１０ｍｌＤＭＥＭを、細胞を懸濁し
て保つための緩い渦状のチューブで１０分間にわたって
滴下添加することにより、細胞懸濁液を非常にゆっくり
と希釈する。次いで、ＤＭＥＭで懸濁液を４５ｍｌにゆ
っくりと希釈し、そして１５００ｒｐｍないし５００ｇ
で１０分間遠心分離する。上澄み液を傾斜捨てし、ペレ
ットをＤＭＥＭ１０ｍｌで穏やかに洗浄し、そして１５
００ｒｐｍないし５００ｇで１０分間再び遠心分離する
。上澄み液を傾斜捨てし、予め温めたＨＭＴ培地をチュ
ーブに加える。ペレットを再懸濁し、使い捨て無菌培養
フラスコに移し、ＨＭＴ培地でさらに８０ｍｌに希釈す
る。最終希釈物は、１０ｍｌピペットを用いて９６ウェ
ル・マイクロ滴定プレート〔Ｆａｌｃｏｎ，　ｃａｔ．
♯３８７０〕の内側６０個のウェルの各々に、１ウェル
当り２滴加える。次いで各プレートの外側列をＤＥＭＥ
＋抗生物質で満たす。マイクロ滴定プレートを、少なく
とも９５％の湿度を備えた９％ＣＯ２　培養器中に置く
。

【０１０６】５〜７日後に、細胞に下記組成のＨＭＴ培
地を再供給する。 　　　　　　ＨＭＴ培地　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　組成─────────
───────────────────　　ＤＭＥＭ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　７０．０ｍｌ　　Ｌ−グルタミン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１．０ｍｌ　　　ペニシリン−ストレプトマイシン
　　　　　　　　　　　　１．０ｍｌ　　　メトトレキ
セート［２２．７３ｇ］　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１．０ｍｌ　　　ヒポキサンチン／チミジン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｍｌ　　　
ウシ胎子血清　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２０．０ｍｌ　　　オリゲン−Ｈ
ＣＦ〔Ｏｒｉｇｅｎ−ＨＣＦ＊　〕　　　　　　　５．
０ｍｌ──────────────────────
───────＊　ハイブリドーマ細胞の成長を高める
ための組織培養用補充物の登録商標名．ハイブリドーマ
細胞の集団が５〜７日後に現われ始める。ＨＴ培地、メ
トトレキセートのないＨＭＴ培地と同じ組成物及びオリ
ゲン−ＨＣＦを更に供給する。

【０１０７】１．４　：ハイブリドーマのスクリーニン
グ１．４．１　：ミコスフェレラ　　グラミニコラ病原
菌への抗体を産生するハイブリドーマは、ＥＬＩＳＡフ
ォーマットにおいて調製されたミコスフェレラ　　グラ
ミニコラ３０％発芽胞子のエキス（蛋白質濃度５μ／ｍ
ｌ，炭酸塩緩衝液）を用いて同定される。ＥＬＩＳＡの
ウェル（ｗｅｌｌ）のうちで陽性の応答を示すウェルを
、ハイブリドーマの純粋株（ｐｕｒｅ　ｓｔｒａｉｎｓ
）を選別するためにサブクローニングする。サブクロー
ニング方法には、１ウェルからの細胞を、５％オリゲン
−ＨＣＦを伴うＨＴ培地１２ｍｌの細胞数＜１００細胞
に希釈することを含む。 この希釈細胞懸濁液をマイクロ滴定プレートに１ウェル
当り２滴で加える。サブクローニングプレートのウェル
を、菌成分に対する特異抗体活性について再試験する。 次いで陽性のウェルを大量培養用のもっと大きな培養器
に移す。

【０１０８】ＥＬＩＳＡ−−炭酸塩操作−−抗体５μｇ
／ｍｌを含む炭酸塩緩衝液３６０μｌを、マイクロ滴定
プレート（Ｎｕｎｃ，　ｃａｔ．＃４６８６６７）　の
各ウェル中に置き、室温で３時間培養する。該プレート
を炭酸塩緩衝液で３回洗浄する。そのウェルに阻止溶液
（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）　を満たし、
室温で３０分間培養する。残りの溶液を振り捨て、プレ
ートを紙タオルでたたき、機械式対流孵卵機（ｍｅｃｈ
ａｎｉｃａｌ　ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ　ｉｎｃｕｂａｔ
ｏｒ）　中、３７℃で一夜乾燥する。次いでプレートを
、乾燥用バッグを含む箔製小袋内に封入し、４℃で貯蔵
する。

【０１０９】プレートを貯蔵庫から取り出し、室温まで
暖める。上澄み液サンプル１００μｌを各ウェル内に置
き、マイクロプレート震盪機上で１０分間培養する。残
りの溶液を捨て、該プレートを洗浄緩衝液〔２０ｍＭ　
　トリス、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、０．５％ツイーン−
８０、０．０１％チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ
／ナトリウム　　エチル　　マーキュリチオサリチレー
ト；Ｆｌｕｋａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，　＃７１２３
０　）ｐＨ７．８〕で５回洗浄する。０．１％ＢＳＡ含
有ＰＢＳで１：１０００に希釈された過酸化酵素抱合ヤ
ギ抗マウスＩｇＧ〔Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐ
ｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．（ＫＰ
Ｌ），メリーランド　２０８７９、ｃａｔ．＃１４−１
８−０２〕１００μｌを各ウェルに加える。プレートを
振盪機上で１０分間、室温で培養する。残りの溶液を捨
て、該プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄する。ＡＢＴＳ
基剤１００ｍｌを各ウェルに置き、該プレートを上記用
に１０分間培養する。各ウェルに１．５％ＮａＦ５０μ
ｌを添加することにより酵素／基剤反応を停止させ、そ
して振盪機上で簡単に混合する。４０５ｎｍで吸収が見
られる。

【０１１０】必要とする溶液： １．炭酸塩緩衝液：０．１Ｍ炭酸塩、ｐＨ９．６は、Ｄ
Ｉ　　Ｈ２　Ｏ中のＮａ２　ＣＯ３　１．５６ｇ／ｌ及
びＮａＨＣＯ３　２．９３ｇ／ｌからなる。 ２．ＰＢＳ：ＤＩ　　Ｈ２　Ｏ中、Ｎａ２　ＨＰＯ４　
２．１９ｇ／ｌ，ＮａＨ２　ＰＯ４　０．５６ｇ／ｌ，
ＮａＣｌ　８．７６ｇ／ｌ，ｐＨ７．２。 ３．ＡＢＴＳストック：ＤＩ　　Ｈ２　Ｏ中、２，２’
−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸
）１５ｍｇ／ｍｌ。 ４．クエン酸塩緩衝液：クエン酸２３ｇ／ｌ，ｐＨ４．
５、次いで３０％Ｈ２　Ｏ２　０．５ｍｌを加える。 ５．ＡＢＴＳ基剤：ＡＢＴＳストック溶液１ｍｌをクエ
ン酸塩緩衝液２４ｍｌで希釈する。全ての緩衝液は、入
手できるならば無水試薬とＤＩ　　Ｈ２　Ｏで製造する
。

【０１１１】病原菌抗原の集団に対する多くの抗体の第
一スクリーニングの結果を表１に示す。 表１ モノクローナル抗体Ｍｇ３７Ｂ５，Ｍｇ３５Ｄ１０，Ｍ
ｇ３５Ｄ６，Ｍｇ３５Ｄ６に対するミコスフェレラ　　
グラミニコラ主要菌集団の単抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ）　スクリーン．　マイクロ滴定プレート
は抗原５μｇ／ｍｌでコートされた。

【０１１２】範囲を広げた関連病原菌の集団の分離株に
対して、並びにミコスフェレラ　　グラミニコラの幾つ
かの分離株に対して、抗体Ｍｇ３７Ｂ５を用いて単抗体
スクリーンが達成された。結果をそれぞれ表２及び表３
に示す。 表２ モノクローナル抗体Ｍｇ３７Ｂ５に関連及び非関連のミ
コスフェレラ　　グラミニコラ第二菌集団の単抗体（ｓ
ｉｎｇｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　スクリーン；　　マ
イクロ滴定プレートは抗原５μｇ／ｍｌでコートされた
。ＮＴ＝試験せず。 表３ モノクローナル抗体Ｍｇ３７Ｂ５に対するミコスフェレ
ラ　　グラミニコラの単抗体スクリーン；マイクロ滴定
プレートは抗原５μｇ／ｍｌでコートされた。

【０１１３】ミコスフェレラ　　グラミニコラ融合から
得られた３種の細胞系を、ミコスフェレラ　　フィジエ
ンシスのための第一交差反応性集団の菌分離株に対して
単抗体フォーマットで試験した。表４に示されているよ
うに、これら抗体（全てＩｇＧ１）の各々は、ミコスフ
ェレラ　　グラミニコラに反応性であるのと同様に、ミ
コスフェレラ種に強い交差反応性を示す。 表４ モノクローナル抗体Ｍｇ３９Ｇ８、Ｍｇ３５Ｄ１０及び
Ｍｇ３５Ｄ３に対するミコスフェレラ　　フィジエンシ
ス主要菌集団の単抗体スクリーン．マイクロ滴定プレー
トは抗原５μｇ／ｍｌでコートされた。

【０１１４】ハイブリドーマのモノクローナル抗体Ｍｇ
３７Ｂ５及び他のモノクローナルを、感染された小麦、
及び他の比較材料に対して二抗体フォーマット（ｄｏｕ
ｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｆｏｒｍａｔ）で更に以下
のように試験した：

【０１１５】モノクローナル抗体を
、蛋白質Ａ親和クロマトグラフィーによりハイブリドー
マ上澄み液から精製する。クロマトグラフィーカラムか
らの溶出液を二度交換のＰＢＳで１透析サイクル当り１
００倍以上の量で透析する。抗体溶液の蛋白質濃度を、
２８０ｎｍでの吸光度を１．４で割ることにより計算し
、濃度をｍｇ蛋白質／ｍｌで表示させる。

【０１１６】始めに精製した抗体溶液を適当な増感緩衝
液（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ）中で
希釈し、次いで各ウェル中に１００μｌを置くことによ
りマイクロ滴定プレートを増感させる。希釈後の抗体の
濃度は、各３種の増感緩衝液（炭酸塩緩衝液，ｐＨ９．
６，ＰＢＳ，ｐＨ７．２及び０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ
　，ｐＨ７．２）中で５μｇ／ｍｌである。マイクロ滴
定プレートを室温で３時間培養する。残りの溶液を捨て
、増感のために使用されるそれと同一の緩衝液で３回洗
浄する。そのウェルに阻止溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｓ
ｏｌｕｔｉｏｎ）　を満たし、室温で３０分間培養する
。残りの溶液を捨て、プレートを紙タオルでたたき、機
械式対流孵卵機（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｃｏｎｖｅｃ
ｔｉｏｎ　ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）　中、３７℃で一夜乾
燥する。次いでプレートを、乾燥用バッグを含む箔製小
袋内に封入し、４℃で貯蔵する。

【０１１７】プレートを貯蔵庫から取り出し、室温と平
衡にさせる。菌培養エキスを０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中
に希釈することにより又は感染した小麦の葉を同緩衝液
中で粉砕する事により抗原溶液を製造する。抗原溶液１
００μｌを各ウェルに加え、そのプレートを、マイクロ
滴定プレート震盪機上で１０分間培養する。残りの溶液
を捨て、該プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄する。過酸
化酵素抱合ヤギ抗−Ｍｇ３Ｇ〔０．５μｇ／ｍｌ，０．
１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）〕１００μｌを各ウェルに加える
。 プレートを上記のように培養する。残りの抱合溶液（ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を捨て、該プレ
ートを洗浄緩衝液で５回洗浄する。ＡＢＴＳ基剤〔２，
２’−アジノビス（３−エチル−ベンズチアゾリンスル
ホン酸）〕１００ｍｌを各ウェルに加え、そのプレート
を上記のように培養する。各ウェルに１．５％ＮａＦ５
０μｌを添加することにより１０分後に呈色反応を停止
させ、そして振盪機上で簡単に混合する。各々４０５ｎ
ｍで吸収が見られる。

【０１１８】表５に示した結果は、Ｍｇ３７Ｂ５のモノ
クローナル抗体が植物材料中のミコスフェレラ　　グラ
ミニコラの検知に有効であることを示している。 表５ 捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：抗体濃
度５μｇ／ｍｌ，希釈炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６）として
細胞系Ｍｇ３７Ｂ５を用いる二抗体試験．使用された抱
合体はヒツジ抗−ミコスフェレラ　　グラミニコラであ
った。試験された抗原はミコスフェレラ　　グラミニコ
ラに感染した小麦、健康な小麦、及びＭｇ３Ｇ分離株で
あった。

【０１１９】ミコスフェレラ　　フィジエンシスミコス
フェレラフィジエンシス融合から得られるハイブリドー
マのスクリーニングは、ミコスフェレラ　　グラミニコ
ラについて記載されているのと実質的に同じ方法である
。主なスクリーニング集団の結果を表６に示す。 表６ モノクローナル抗体Ｍｆｌ４Ｃ６、Ｍｆｌ８Ｅ６、Ｍｆ
ｄｌ　３Ｆ９、Ｍｆｄｌ　６Ｄ８、Ｍｆｄｌ　１Ｂ９、
Ｍｆｄｌ　８Ｃ１１及びＭｆｄｌ　７Ｄ１０に対するミ
コスフェレラ　　フィジエンシス主要菌集団の単抗体ス
クリーン．マイクロ滴定プレートは抗原５μｇ／ｍｌで
コートされた。ＮＴ＝試験せず。

【０１２０】範囲を広げた関連及び非関連の分離株集団
に対するミコスフェレラ抗体の交差反応性を試験する単
抗体分析の結果を表７及び表７ａに示す。これらのモノ
クローナル抗体と複数のミコスフェレラ　　フィジエン
シス分離株の反応性は表８及び表８ａに示す。 表７ モノクローナル抗体Ｍｆｌｌ　４Ｃ６，Ｍｆｌ８Ｅ６，
Ｍｆｄｌ　２Ｃ３及びＭｆｄｌ　７Ｄ１０に対するミコ
スフェレラ　　フィジエンシス第二菌パネルの単抗体ス
クリーン．マイクロ滴定プレートは抗原５μｇ／ｍｌで
コートされた。ＮＴ＝試験せず。 表７ａ モノクローナル抗体Ｍｆｄｌ　３Ｆ９，Ｍｆｄｌ　６ｄ
８，Ｍｆｄｌ１Ｂ９，Ｍｆｄｌ　８Ｃ１１に対するミコ
スフェレラ　　フィジエンシス第二菌パネルの単抗体ス
クリーン．マイクロ滴定プレートは抗原５μｇ／ｍｌで
コートされた。ＮＴ＝試験せず。 表８ モノクローナル抗体Ｍｆｌｌ　４Ｃ６，Ｍｆｌ８Ｅ６，
Ｍｆｄｌ　２Ｃ３及びＭｆｄｌ　７Ｄ１０に対するミコ
スフェレラ　　フィジエンシス（Ｍｆ　）、ミコスフェ
レラ　　フィジエンシス変種ディフォルミス（Ｍｆｄ）
及びミコスフェレラ　　ムシコラ（Ｍｍ　）の単抗体ス
クリーン．マイクロ滴定プレートは抗原５μｇ／ｍｌで
コートされた。 表８ａ モノクローナル抗体Ｍｆｄｌ　３Ｆ９，Ｍｆｄｌ　６ｄ
８，Ｍｆｄｌ１Ｂ９，Ｍｆｄｌ　８Ｃ１１に対するミコ
スフェレラ　　フィジエンシス（Ｍｆ　）、ミコスフェ
レラ　　フィジエンシス変種ディフォルミス（Ｍｆｄ）
及びミコスフェレラ　　ムシコラ（Ｍｍ　）の単抗体ス
クリーン．マイクロ滴定プレートは抗原５μｇ／ｍｌで
コートされた。

【０１２１】範囲を広げた関連及び非関連病原菌の集団
に対するミコスフェレラ　　フィジエンシスモノクロー
ナル抗体Ｍｆｌ４Ｃ６の二抗体スクリーンを表９に示す
。この表は、Ｍｆｌ４Ｃ６抗体の高レベルの特異性及び
、単抗体スクリーンと対比した二抗体におけるＭｆｌ４
Ｃ６のより大きな感受性の両方を示している。表１０は
、ミコスフェレラ　　フィジエンシスに感染したバナナ
の葉、及び純粋培養のミコスフェレラ　　フィジエンシ
ス並びに健康なバナナの葉に対するＭｆｌ４Ｃ６での二
抗体スクリーンの結果を示している。 表９ モノクローナル抗体Ｍｆｌ４Ｃ６に対するミコスフェレ
ラ　　フィジエンシス第二菌集団の二抗体試験．マイク
ロ滴定プレートにはＭｆｌ４Ｃ６を５μｇ／ｍｌで塗布
した。第二の免疫試薬は、ホースラディッシュパーオキ
シダーゼに対するヒツジ抗−Ｍｆｌ抱合体である。ヒツ
ジ抱合体は５μｇ／ｍｌで使用した。ＮＴ＝試験せず。 表１０ 捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：抗体濃
度５μｇ／ｍｌ，希釈炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６）として
細胞系Ｍ１４Ｃ６の上澄み液を用いる二抗体試験．使用
された抱合体はヒツジ抗−ミコスフェレラ　　フィジエ
ンシス（濃度５μｇ／ｍｌ，希釈剤０．１％ＢＳＡ／Ｐ
ＢＳ）。使用された抗原は、純粋培養のミコスフェレラ
　　フィジエンシス、ミコスフェレラ　　フィジエンシ
スに感染したバナナの葉、及び健康なバナナの葉であっ
た。 参考文献 ＤｅＬｃａ，“Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
　Ａｎａｌｙｓｉｓ　”，　ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ　
Ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ，　Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ　ｅｔ
　ａｌ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｌ
ｔｄ．，　ｐｐ１８９−２３１（１９８２）　Ｆａｒｒ
，ＤＦ　ｅｔ　ａｌ，　Ｆｕｎｇｉ　ｏｎ　Ｐｌａｎｔ
　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｎ　ｔｈ
ｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ，　ＰＡＳ　Ｐｒｅｓ
ｓ，　Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ：１２５２　ｐｐ．（１
９８９）　　Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａ
ｎｔｉｂｉｏｓ　：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｓ　ａｎｄ　Ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　
１９８３．　 Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．　７：７４３，　１９７７　） Ｋｏｅｈｌｅｒ　　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　　Ｎａ
ｔｕｒｅ，　２５６　：４９５−４９７，（１９７５）
．　 Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ　　ＪＷ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，
　　１４５　：７０９（１９６４）， Ｓｈｕｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ，　Ｎａｔｕｒｅ，　２７
６　：２６９−２７０（１９７８）．米国特許第４，８
４５，１９７号 米国特許第４，８０３，１５５号 米国特許第４，８７９，２１７号

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】　　少なくとも１種のミコスフェレラと特
   異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
   ドーマ細胞系。 【請求項２】　　抗体が、ミコスフェレラ　　フィジエ
   ンシス、ミコスフェレラフィジエンシス変種ディフォル
   ミス、ミコスフェレラ　　グラミニコラ及びミコスフェ
   レラ　　ムシコラよりなる群から選択される少なくとも
   １種と反応する請求項１記載のハイブリドーマ細胞系。 【請求項３】　　抗体が、ミコスフェレラの１種のみと
   反応する請求項１又は２のいずれか一項記載のハイブリ
   ドーマ細胞系。 【請求項４】　　抗体が、ミコスフェレラの１より多い
   種と反応する請求項１又は２のいずれか一項記載のハイ
   ブリドーマ細胞系。 【請求項５】　　種がミコスフェレラ　　グラミニコラ
   である請求項３記載のハイブリドーマ細胞系。 【請求項６】　　ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０１８６、又はそ
   の突然変異体もしくは変種の確認特性を有する請求項５
   記載のハイブリドーマ細胞系。 【請求項７】　　ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１３、又はそ
   の突然変異体もしくは変種の確認特性を有する請求項５
   記載のハイブリドーマ細胞系。 【請求項８】　　ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１４、又はそ
   の突然変異体もしくは変種の確認特性を有する請求項５
   記載のハイブリドーマ細胞系。 【請求項９】　　少なくとも１種のミコスフェレラと特
   異的に反応するモノクローナル抗体。 【請求項１０】　　ミコスフェレラ　　フィジエンシス
   、ミコスフェレラ　フィジエンシス変種ディフォルミス
   、ミコスフェレラ　　グラミニコラ及びミコスフェレラ
   　　ムシコラよりなる群から選択される少なくとも１種
   と反応する請求項９記載の抗体。 【請求項１１】　　ミコスフェレラの１種のみと反応す
   る請求項９又は１０記載の抗体。 【請求項１２】　　ミコスフェレラの１より多い種と反
   応する請求項９又は１０記載の抗体。 【請求項１３】　　種がミコスフェレラ　　グラミニコ
   ラである請求項１１記載の抗体。 【請求項１４】　　ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０１８６、又は
   その突然変異体もしくは変種の確認特性を有するハイブ
   リドーマ細胞系によって産生された請求項１３記載の抗
   体。 【請求項１５】　　ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１３、又は
   その突然変異体もしくは変種の確認特性を有するハイブ
   リドーマ細胞系によって産生された請求項１２記載の抗
   体。 【請求項１６】　　ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１４、又は
   その突然変異体もしくは変種の確認特性を有するハイブ
   リドーマ細胞系によって産生された請求項１２記載の抗
   体。 【請求項１７】　　ミコスフェレラ　　フィジエンシス
   の菌糸又は分生子のエキスに応じて産生された請求項１
   ２記載の抗体。 【請求項１８】　　ミコスフェレラ　　グラミニコラの
   発芽胞子のエキスに応答して産生された請求項１２記載
   の抗体。 【請求項１９】　　少なくとも１種のミコスフェレラと
   特異的に反応するモノクローナル抗体をサンプルに接触
   させ、そして抗体−抗原反応の存在又は不存在を観察す
   ることからなる、ミコスフェレラ抗原を含んでいると疑
   われるサンプル中のミコスフェレラの存在又は不存在を
   検知する方法。 【請求項２０】　　一方の抗体が固定化され他方の抗体
   がレポーター分子で標識されている少なくとも１種のミ
   コスフェレラと特異的に反応する２種のモノクローナル
   抗体をサンプルに接触させることからなる請求項１９記
   載の方法。 【請求項２１】　　抗体が、ミコスフェレラ　　フィジ
   エンシス、ミコスフェレラ　　フィジエンシス変種ディ
   フォルミス、ミコスフェレラ　　グラミニコラ及びミコ
   スフェレラ　　ムシコラよりなる群から選択される少な
   くとも１種と反応する請求項１９記載の方法。 【請求項２２】　　少なくとも一方の抗体が、ミコスフ
   ェレラ　　フィジエンシス変種ディフォルミス、ミコス
   フェレラ　　グラミニコラ及びミコスフェレラ　　ムシ
   コラよりなる群から選択される少なくとも１種と反応す
   る請求項２０記載の方法。 【請求項２３】　　抗体がミコスフェレラの１種のみと
   反応する請求項１９又は２１のいずれか一項記載の方法
   。 【請求項２４】　　少なくとも一方の抗体がミコスフェ
   レラの１種のみと反応する請求項２０又は２２のいずれ
   か一項記載の方法。 【請求項２５】　　抗体が、ミコスフェレラの１より多
   い種と反応する請求項１９又は２１のいずれか一項記載
   の方法。 【請求項２６】　　少なくとも一方の抗体が、ミコスフ
   ェレラの１より多い種と反応する請求項２０又は２２の
   いずれか一項記載の方法。 【請求項２７】　　種がミコスフェレラ　　グラミニコ
   ラである請求項２３記載の方法。 【請求項２８】　　種がミコスフェレラ　　グラミニコ
   ラである請求項２４記載の方法。【請求項２９　　一方
   の抗体がモノクローン性で他方の抗体がポリクローン性
   である請求項１９記載の方法。 【請求項３０】　　抗体が、ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０１８
   ６、又はその突然変異体もしくは変種の確認特性を有す
   るハイブリドーマ細胞系により産生される請求項２７記
   載の方法。 【請求項３１】　　抗体が、ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０１８
   ６、又はその突然変異体もしくは変種の確認特性を有す
   るハイブリドーマ細胞系により産生される請求項２８記
   載の方法。 【請求項３２】　　抗体が、ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１
   ３、又はその突然変異体もしくは変種の確認特性を有す
   るハイブリドーマ細胞系により産生される請求項２５記
   載の方法。 【請求項３３】　　抗体が、ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１
   ３、又はその突然変異体もしくは変種の確認特性を有す
   るハイブリドーマ細胞系により産生される請求項２６記
   載の方法。 【請求項３４】　　抗体が、ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１
   ４、又はその突然変異体もしくは変種の確認特性を有す
   るハイブリドーマ細胞系により産生される請求項２５記
   載の方法。 【請求項３５】　　抗体が、ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１
   ４、又はその突然変異体もしくは変種の確認特性を有す
   るハイブリドーマ細胞系により産生される請求項２６記
   載の方法。 【請求項３６】　　固体支持体に結合した抗体とレポー
   ター分子で標識された抗体〔両抗体はミコスフェレラと
   反応することができ、そして少なくとも一方はミコスフ
   ェレラと特異的に反応する。〕とからなる、診断キット
   形態でミコスフェレラ抗原を含んでいると疑われるサン
   プル中のミコスフェレラの存在又は不存在を免疫学的に
   検知するための組成物。 【請求項３７】　　ミコスフェレラ抗体が、ミコスフェ
   レラ　　フィジエンシス、ミコスフェレラ　　フィジエ
   ンシス変種ディフォルミス、ミコスフェレラ　　グラミ
   ニコラ及びミコスフェレラ　　ムシコラよりなる群から
   選択される少なくとも１種と反応する請求項３６記載の
   組成物。 【請求項３８】　　ミコスフェレラ特異抗体が、ミコス
   フェレラの１より多い種と反応する請求項３６又は３７
   のいずれか一項記載の組成物。 【請求項３９】　　ミコスフェレラ特異抗体が、ミコス
   フェレラの１種のみと反応する請求項３６又は３７のい
   ずれか一項記載の組成物。 【請求項４０】　　種がミコスフェレラ　　グラミニコ
   ラである請求項３９記載の組成物。 【請求項４１】　　ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０１８６、又は
   その突然変異体もしくは変種の確認特性を有するハイブ
   リドーマ細胞系によって産生された抗体を含有する請求
   項４０記載の組成物。 【請求項４２】　　ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１３、又は
   その突然変異体もしくは変種の確認特性を有するハイブ
   リドーマ細胞系によって産生された抗体を含有する請求
   項３８記載の組成物。 【請求項４３】　　ＡＴＣＣ　　ＨＢ１０４１４、又は
   その突然変異体もしくは変種の確認特性を有するハイブ
   リドーマ細胞系によって産生された抗体を含有する請求
   項３８記載の組成物。 【請求項４４】　　レポーター分子が酵素である請求項
   ３６又は３７のいずれか一項記載の組成物。 【請求項４５】　　酵素のための基剤も含む請求項４４
   記載の組成物。 【請求項４６】　　少なくとも一方の抗体がミコスフェ
   レラ　　フィジエンシスに特異的である請求項３９記載
   の組成物。 【請求項４７】　　少なくとも一方の抗体がミコスフェ
   レラ　　フィジエンシス変種ディフォルミスに特異的で
   ある請求項３８記載の組成物。 【請求項４８】　　（ａ）　ミコスフェレラのエキスで
   ドナー動物を免疫し； （ｂ）　その免疫ドナー動物から免疫適格性Ｂ細胞を単
   離し； （ｃ）　そのＢ細胞と不死細胞系の細胞を融合し；（ｄ
   ）　融合精製物をスクリーニングし、そしてミコスフェ
   レラに特異性を有する抗体を産生するものを確認し、（
   ｅ）　段階（ｄ）　で単離された融合精製物をクローニ
   ングして、ミコスフェレラに特異性を有するモノクロー
   ナル抗体を産生する純粋なハイブリドーマ細胞系を得る
   ことからなる、ミコスフェレラ属の少なくとも１種と特
   異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
   ドーマ細胞系の製造方法。 【請求項４９】　　下記のような抗体を産生することの
   できるハイブリドーマ細胞系を抗体産生誘導条件下で培
   養し、そうして産生した抗体を単離することからなる、
   少なくとも１種のミコスフェレラと特異的に反応するモ
   ノクローナル抗体の製造方法。 【請求項５０】　　ハイブリドーマ細胞系の培養をイン
   ビボ又はインビトロで行う請求項４９記載の方法。