JPS6131098A - コリンエステラ−ゼ定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、コリンエステラーゼ（以下ＣｈＥと略す、）
定量用試薬に関するものである。

現在臨床検査室などで用いられているＣｈＥの定量方法
には。

（１）アセチルコリンを基質として、ｐＨ変化を測定す
る方法。

（２）基質にチオコリンエステルを用い、遊離するＳＨ
基を測定する方法。

（３）ベンゾイルコリンなどを基質とし、遊離するコリ
ンをコリンオキシダーゼを用い、　Ｈｚ（ｈとして測定
する方法。

などがある。これらのうち、（１）の方法が古くから検
査室に取り入れられている標準的な方法であるが、至適
ｐｏを維持できないとか、　ｐＨ変化が必ずしも指示薬
の変色程度と平行しないことなどのために着炭が悪＜　
、　＜２１．　（ｓｌの方法にとってかわられつつある
のが現状である。しかし、（２）では共存ＳＨ化合物に
よる誤差、（３）ではＨっ０□定量にまつわる諸問題や
発色系のフェノールによる妨害などの問題があり、現在
のところいずれも満足できるまでに至っていない。

このような観点から、特開昭５８−１５５０９９号公報
には、アセチルコリン、酢酸キナーゼ、アデノシン三リ
ン酸を含有するＣｈＥ定量用試薬が１案されている。こ
の試薬を説明すると、基質としてアセチルコリンを使用
し、生体試料中のＣｈＥを作用させると、基質は酢酸と
コリンとに分解する。

ここに、酢酸キナーゼを作用させるとアデノシンニリン
酸（以下ＡＴＰという。）を補基質として酢酸は、アセ
チルリン酸に変化する。この反応式を下記に示す。

＋アデノシンニリン酸 この酢酸キナーゼの作用は、酢酸のみに基質特異性を有
するものであって、他の有機酸、無機酸などを共存して
いても作用するものではない。次いで、ここで生成した
アセチルリン酸又はアデノシンニリン酸（以下ＡＤＰと
いう。）を定量すればＣｈＥの定量は完了する。この際
、アセチルリン酸は適当な色源体と反応させれば、可視
部の比色法で定量可能であり、　ＡＤＰはピルビン酸キ
ナーゼと乳酸脱水素酵素との共役酵素系を使用すること
により定量可能である。特に、後者の方法は全反応系を
酵素系として行うものであり、共存物質の影響を受けに
（く１極めて有利な方法である。この場合の反応式を下
記に示す。

ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸 ピルビン酸キナーゼ ーーーーーーーーー→ＡＴＰ＋ピルビン酸（ただし、　
ＮＡＤＨは還元型β−ニコチンアミド−アデニン・ジヌ
クレオド、　　ＮＡＤ＋は、酸化型β−ニコチンアミド
−アデニン・ジヌクレオドを表す。）このＮＡＤＨの紫
外部（３４０ｎｍ）の吸光度を測定することにより、極
めて容易に高精度の定量を行うことができる。また、ピ
ルビン酸キナーゼの作用により生成ＡＤＰに再生するこ
とができるので、酢酸キナーゼの酢酸に対する作用が増
強され５極めて高感度の測定が可能となる。

この試薬を実際的に製品化するにあたっては。

酢酸キナーゼ、　ＡＴＰ、　ＮＡＤＨを主成分とする試
薬（以下第一試薬と呼ぶ。）と、基質であるアセチルコ
リンを主成分とする試薬（以下第二試薬と呼ぶ。）を各
々調整し、　ＣｈＥ測定の両試薬を混合しており。

第一試薬のｐｏはＣｈＥの至適ｐＨである７、０〜８．
０の間に管理されており、また第二試薬のｐＨは特に管
理されておらず、中性付近である。

この場合には、第一試薬においては、　ＮＡＤＨに由来
する３４０ｎ＋ｗにおける吸光度が、試薬保存中に低下
する傾向があり、また第二試薬においては、保存中にア
セチルコリンの自然分解が起こる傾向があった。このア
セチルコリンの自然分解が起こると、酢酸が生じ、第一
試薬と第二試薬とを混合した際に反応が進行し、　３４
０ｎｍにおける吸光度が低下することになる。

すなわち、上記試薬の測定原理は、最終的に３４０ｎｍ
における吸光度の減少速度を測定するものであるから、
第一試薬と第二試薬との混合時の第一試薬の吸光度及び
第一試薬と第二試薬とを混合したときの吸光度が少なく
とも１．０であることが望まれており、　３４０ｎｍに
おける吸光度は通常の分光光度針の性能上２．０が限界
であるので、２．０の吸光度が１．０付近まで低下する
期間が、調製後の試薬の使用期間ということになり、前
記した試薬は。

この点が十分でなく、一度の調製でできるだけ長期間使
用可能な試薬が望まれている。

本発明者らは、このような要求を満足すべく鋭意研究を
重ねた結果、第一試薬、第二試薬のそれぞれのｐＨを特
定の範囲に管理することにより２両試薬の調製後の安定
性が飛躍的に向上することを見出し１本発明に到達した
のである。

すなわち２本発明は酢酸キナーゼ、　ＡＴＰ、　ＮＡＤ
Ｈを主成分とする第一試薬とアセチルコリンを主成分と
する第二試薬とからなり、かつ第一試薬のｐＨが８．０
〜１０．０であり、第二試薬のｐＨが３．５〜５．５で
あることを特徴とするＣｈＥ定量用試薬である。

本発明の試薬は１例えば以下のように構成されている。

＋１１酵素試薬（凍結乾燥品） 酢酸キナーゼ３　ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素
、　ＡＴＰ、ホスホエノルピルビン酸、　ＮＡＤＨ（２
）基質剤（粉末） アセチルコリン、硫酸アンモニウム （３）酵素試薬溶解液 緩衝液、マグネシウム塩、カリウム塩、防腐刻 （４）基質剤熔解液 緩衝液、防腐剤 第一試薬、第二試薬を調製するには、（３）で（１）を
。

（４）で（２）を溶解することによって行えばよ＜、Ｃ
ｈＥ測定特定時一試薬、第二試薬を所定の比率で混合す
ればよい。

本発明において、第一試薬、第二試薬調製後のｐＨは前
者が８．０〜１０．０に、後者が３．５〜５．５に管理
することが必要である。

このｐＨからはずれると、第一試薬においては。

３４０ｒ＋＋＋＋における吸光度の低下が著しく、また
第二試薬においては、アセチルコリンの自然分解が多く
観察されるのである。この第一試薬のｐｏを８．０〜１
０．０に、第二試薬のｐＨを３．５〜５．５に管理する
には１例えば次の緩衝剤を用いて行うことができる。第
一試薬において使用する緩衝剤としては。

例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＩＩ
ｃＬ　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−マレ
イン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ゛−
エタンスルホン酸、ＮａＯＨ，グリシン−Ｍｏ１．）リ
エタノールアミン塩酸−ＮａＯＨなど通常の使用範囲が
ｐ）Ｉ　ｅ、ｏ〜１０．０のものであればよい。

また、第二試薬に使用する緩衝剤としては１例えば、フ
タル酸水素カリウム−）ＩＣＩ、クエン酸−クエン酸ナ
トリウム、マレイン酸−ＮａＯＨ＋　グリシン−ＨＣｌ
　、　３．３’−ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ，乳酸
−乳酸ナトリウムなど通常の使用範囲がｐＨ３，５〜５
゜５のものであればよい。

その他の試薬の使用量としては、アセチルコリン２０〜
２００ｍＭ、酢酸キナーゼ５〜１００　ｕ／ｍｌ、　Ａ
ＴＰ　１．５〜１５ａ＋Ｍ、　　ピルビン酸キナーゼ３
〜５０　ｕ／ｍｌ、乳酸脱水素酵素１〜２０　ｕ／ｍｌ
、　ＮＡＤＨＯ，１〜１．０ｍＭ、　ＮＡＤＨＯ１１〜
１゜抛り程度が適当である。

次にＣｈＥを定量するには、一定の比率で第一試薬と第
二試薬とを混合した後に目的物質であるＣｈＥの至適ｐ
Ｈである７、０〜８．０の間になるように第一試薬と第
二試薬を混合すればよい。

そのときの第一試薬と第二試薬の使用時の液比は、使用
するオートアナライザーによって異なるが、好ましくは
第一試薬；第二試薬がｚ：ｉ　−１０：ｌ　（容量比、
以下同じ。）であり９さらに好ましくは２：１〜８：１
であり、最も好ましくは２：１〜５：１である。また、
第一試薬、第二試薬の緩衝剤の濃度としては９例えば第
一試薬、第二試薬の液比を２：１〜５：１．第一試薬の
ｐＨが８．０〜１０．０．第二試薬のｐｎが３．５〜５
．５であり、さらに第一試薬、第二試薬を混合した時の
ｐＨが７．０〜８．０の間であるという条件を設定すれ
ば、Ｎ単な実験によって求めることができる。例えば、
第一試薬にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−
マレイン酸を、第二試薬にクエン酸−ＮａＯＨを用いた
場合、前者が２５〜７０ｍＭ、後者が９０〜１３０ｍＭ
とすればよい。

次に１本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ ＋ｌ）酵素試薬（凍結乾燥品） 酢酸キナーゼ　　　　　２Ｘ１０’ユニツトピルビン酸
キナーゼ　　ｌＸｌ０’ユニツト乳酸脱水素酵素　　　
　１×１０３ユニ７）ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　
　　　　　１　　　　ｇｒホスホエノールピルビン酸　
　０．０５　ｇｒＮＡＤＨ０，１４ｇｒ （２）基質剤（粉末） アセチルコリン　　　　　　　１．４　　ｇｒ硫酸アン
モニウム　　　　　　０．３３　ｇｒ（３）酵素試薬溶
解液 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−）ＩｃＩ　
（ρ）１９．０）　　　　　　３０　ｍＭ／Ｌ硫酸マグ
ネシウム　　　　　　１５　ｍＭ／Ｌ塩化カリウム　　
　　　　　　５０　ｍＭ／Ｌアジ化ナトジナトリウム　
　　１０　＋ＩＩＭ／Ｌ（４）基質側溶解液 マレイン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４，５）　　　　９５　ｍ
Ｍ／Ｌアジ化ナトジナトリウム　　　　５　ｍＭ／Ｌ酵
素試薬（１）を（３）の酵素試薬溶解液１００ｍ１で溶
解して第一試薬を調製し、また基質剤（２）を（４）の
基質側溶解液２５＋ｓｌで溶解して第二試薬を調製した
。両試薬を１０℃恒温槽中に７日間放置し、第一試薬の
３４０ｎｍにおける吸光度を調製直後ものと比較した。

また、７日間放置後の第一試薬、第二試薬を４対１の液
量比で混合した時、アセチルコリンの分解で生じた酢酸
による３４０ｎｍにおける初期吸光度の低下を測定し、
同じく調製直後ものと比較した。

その結果を表１に示す。

なお、ｌｌ製後の第一試薬、第二試薬のｐ）Ｉは３それ
ぞれ溶解液の緩衝剤のｐＨである９、０．４．５となり
３両試薬混合後のｐＨは７．５であった。

表１ 実施例２ 酵素試薬の溶解液の緩衝剤をトリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン−マレイン酸ｐＨ８，５５−３０ＩＩＩ
に、また基質剤の溶解液の緩衝剤をグリシン−１１ＣＩ
　ｐＨ４，０−７５＋＋＋Ｍを用いた以外はすべて実施
例１と同じ試薬を用い、実施例１と同様の安定性テスト
を行ったところ５表２に示す結果となった。

表２ なお、調製後の第一試薬、第二試薬のｐＨはそれぞれの
溶解液の緩衝剤のｐｎである８、５．４．０となり１両
試薬混合後のｐＨは７．３となった。

比較例１ 酵素試薬の熔解液の緩衝剤をＮ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎｏ−エタンスルホンｆｉｌ−ＮａＯＨｐ
Ｈ７，５−１００ｍＭを用い、基質剤の溶解液は緩衝剤
を使用せず水溶液とした以外はすべて実施例１と同じ試
薬を用い、実施例１と同様の安定性テストを行った。そ
の結果を表３に示す。

なお、第一試薬のｐＨは７．５で、第二試薬のｐＨは７
．０で１両試薬混合後の９８は７，５となった。

表３ 以上のごとく１本発明の試薬は、試薬調製後の安定性が
飛躍的に向上し５　これを長期間保存することができる
。

特許出願人　　ユニチカ株ｖｃ会社 株式会社ヤトロン

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）酢酸キナーゼ、アデノシン三リン酸、還元型β−
   ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを主成分と
   する第一試薬とアセチルコリンを主成分とする第二試薬
   とからなり、かつ第一試薬のｐＨが８．０〜１０．０で
   あり、第二試薬のｐＨが３．５〜５．５であることを特
   徴とするコリンエステラーゼ定量用試薬。