JPH04229199A - 蛍光産生トリプトファナーゼ基質 - Google Patents
蛍光産生トリプトファナーゼ基質Info
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- JPH04229199A JPH04229199A JP3178285A JP17828591A JPH04229199A JP H04229199 A JPH04229199 A JP H04229199A JP 3178285 A JP3178285 A JP 3178285A JP 17828591 A JP17828591 A JP 17828591A JP H04229199 A JPH04229199 A JP H04229199A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】（発明の分野）本発明は微生物の同定、よ
り詳細には、酸素含量の分析による微生物の同定に有用
な酵素基質に関する。 【０００２】（発明の背景）多くの疾病は生体の細胞組
織もしくは血液、尿、脳脊髄液または関節滑液のような
体液への微生物の侵入の結果である。このような感染に
対する有効な治療には、早期の診断が必要であり、病原
菌の正確な同定が行われて始めて正しい治療を開始する
ことができる。感染の初期の段階では病原菌の濃度が低
いためにこれが困難である。 【０００３】微生物同定のために、病院の細胞学実験室
で現在行われているいくつかの方法は、微生物の単離後
、同定に達するまで通常１８ないし２４時間以上を要す
る培養に基づく方法である。ある場合には、同定までの
この時間の長さが生命をおびやかすことがある。 【０００４】どの酵素が存在するかを測定することによ
る病原菌の同定が検討されている。この方法は、微生物
によって表現される酵素により蛍光産生基質または色素
産生基質を加水分解させることによるものであり、通常
、ある基質のパネルを植え付けて、得られる蛍光産生ま
たは色素産生分布を既知の微生物の同じパネルで発現す
る分布と関連づけることによって行う。この方法の典型
的なものはＢａｓｃｏｍｂの米国特許第４，６０３，１
０８号における開示である。 【０００５】ＧｏｄｓｅｙらはＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
１３，４８３（１９８１年）にβ−メチルウンベリフェ
ロン、β−ナフチルアミンおよび７−アミノ−４−メチ
ルクマリン（ＡＭＣ）からの蛍光産生基質を用いて、Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の菌株によって
表現される酵素の分布を測定する方法および装置を開示
している。 【０００６】トリプロファナーゼはあるバクテリア中に
存在し、トリプトファンをインドール、ピルビン酸およ
びアンモニアに転化させる酵素である。この酵素によっ
て発色団２−ニトロチオフェノールに開裂される基質Ｓ
−（２−ニトロフェニル）システインがＳｕｅｌｔｅｒ
らによって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ ８２，５６１（１９７９年）に開示されて
いる。 【０００７】細菌同定用酵素分布測定パネルに含まれる
と考えられるトリプトファナーゼの蛍光産生基質に対す
る要望がある。該基質は、特にＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａｃｅａｅ種の場合に、本法による細菌同定の精度
を著しく向上させるであろう。本発明が指向することは
この要望を実現することである。 【０００８】（発明の要約）トリプトファナーゼの蛍光
産生基質は、蛍光染料部分および染料の求核基がカルボ
ニル基またはチオカルボニル基によってアミノ酸のアミ
ノ基以外の求核基に結合されているアミノ酸部分を含ん
でいる。好ましい基質においては、アミノ酸がトレオニ
ン、システイン、またはもっとも好ましくはセリンであ
り、かつ蛍光染料部分がフルオレセイン、ローダミン、
β−ナフチルアミンまたは、好ましくはクマリン誘導体
である。もっとも好ましい染料はＡＭＣである。 【０００９】本発明の好適な基質は、それ自体非蛍光性
であるが、トリプトファナーゼによってアミノ酸とＡＭ
Ｃに開裂する。該基質は未知の微生物がトリプトファナ
ーゼを含むかどうかを測定するのに用いることができ、
酵素含量に基づいて、未知の微生物の同定を行う装置に
加えることができる。 【００１０】酵素含量の分布の測定および既知の微生物
の分布との比較による未知の微生物の同定はほとんどの
微生物の場合におおむね正確である。しかし、本法は現
在入手可能な基質を用いては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａｃｅａｅの場合には余り正確ではない。Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのある種はトリプトファ
ナーゼを表現し、他の種は表現しないので、分布測定装
置中に本発明の基質を包含させるとこのグループの微生
物の同定精度を向上させる。 【００１１】（詳細な説明）本発明は多種類の態様によ
って満足を与えられるけれども、本明細書では本発明の
好適な態様の詳細な説明を行うが、同時に本開示は本発
明の典型的な原理と考え、本発明を記載した態様に限定
するつもりではないことを理解すべきである。本発明の
範囲は添付クレームおよびその等価物によって示されよ
う。 【００１２】トリプトファナーゼはトリプトファンのイ
ンドール、ピルビン酸およびアンモニアへの転化を触媒
し、この酵素を含む微生物をインドール・ポジティブ（
ｉｎｄｏｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と呼ぶことが多い
。典型的なインドール・ポジティブ微生物はＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
ｄｉｖｅｒｓｕｓ，Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ，Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉおよ
びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａである。代
表的なインドール・ネガティブ（ｉｎｄｏｌｅ ｎｅ
ｇａｔｉｖｅ）微生物はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅ
ｕｎｄｉｉおよびＰｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉ
ｓである。 【００１３】未知の微生物がインドール・ポジティブか
インドール・ネガティブかの測定は未知物質の同定に有
用である。特に、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ
ｅ種の正確な同定は微生物のインドール区分の測定によ
って容易になる。 【００１４】本発明の基質は、尿、大便、外傷、首、性
器標品のような臨床標品もしくは血液、脳脊髄液または
関節滑液のような通常無菌の身体標品中の微生物のイン
ドール区分を測定するのに使用することができる。本発
明においては、微生物という用語はかび、イースト、好
ましくはバクテリアのような酵素を生成する微生物を包
含することを意図している。 【００１５】本発明の蛍光産生トリプトファナーゼ基質
は下記の構造Ｉ 【００１６】 【００１７】（式中、Ａは蛍光染料部分であることがで
き、Ｘ，ＹおよびＺは別個にＯ，ＳまたはＮＨであるこ
とができ、ｎは０ないし３であることができる）を有す
ることができる。典型的な適当な蛍光染料部分は下記の
通りである。 【００１８】（１）ＡＭＣ（式中、ＸがＮＨ）；（２）
７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（式中、ＸがＯ）
； （３）フルオレセイン（式中、ＸがＯ）；（４）ローダ
ミン（式中、ＸがＮＨ）；（５）β−ナフチルアミン（
式中、ＸがＮＨ）本発明の好適な基質は下記の構造ＩＩ 【００１９】 【００２０】（式中、ＡはフルオレセインまたはＡＭＣ
であることができ、Ｒ１ はＣＨ２ またはＣＨ２ Ｃ
Ｈ＝ＣＨであることができ、ＹおよびＺはＯまたはＳで
あることができる）に従うフルオレセインまたはＡＭＣ
のセリン、システインおよびトレオニン誘導体である。 もっとも好適な基質は、Ａが４−メチルクマリン、Ｙお
よびＺがＯ、かつＲ１ がＣＨ２ である。 【００２１】本発明の基質は周知の合成径路によって市
販の蛍光染料から合成することができる。好ましい径路
では、アミノ基で置換された染料を対応するイソシアノ
またはイソチオシアノ誘導体に転化させ、さらに下記の
構造ＩＩＩ 【００２２】 【００２３】（式中、ＹはＯＨ，ＳＨまたはＮＨ２ で
あることができ、ｎは０ないし３であることができ、Ｒ
２ およびＲ３ はカルボベンジルオキシ、ベンジル、
リチウムおよびトリメチルシリルエトキシカルボニル（
Ｔｅｏｃ）のような通常のアミノ酸保護基である）の適
切に保護されたアミノ酸と反応させる。好ましい保護基
はＲ２ としてリチウムおよびＲ３ としてＴｅｏｃで
ある（実施例Ｉに記載の通り）。この合成径路が、保護
基の脱離後、構造Ｉ：化１（ただし、ＸがＮＨおよびＺ
がイソシアノ置換染料からのＯ）および構造Ｉ：化１（
ただし、ＸがＮＨおよびＺがイソチオシアノ置換染料か
らのＳ）を生じることは明らかである。このように、た
とえばある基質（ただしＡがローダミン、ＸがＮＨ、Ｚ
がＳ、ＹがＯおよびＲ１ がメチレン）がローダミンイ
ソチオシアナートと二重保護セリンとの反応から生じる
であろう。 【００２４】次式に基質ＩＶ（ただし、ＸはＯ）の適切
な合成径路を示す。 【００２５】 【００２６】この式は発蛍光団７−ヒドロキシ−４−メ
チルクマリンのクロロホルミル誘導体への転化およびこ
の中間体と二重保護セリンとの反応の結果、保護基の離
脱後トリプトファナーゼ基質ＩＶが得られることを示す
。 【００２７】本発明のトリプトファナーゼ基質合成の他
の径路は当業者には明らかであろうし、もっとも好適な
下記の基質Ｖ 【００２８】 【００２９】を合成する詳細な実験方法を実施例Ｉに示
す。 【００３０】本発明の基質でトリプトファナーゼを表現
する微生物を培養すると、下記に示すように酵素によっ
て、それ自体蛍光性でない蛍光産生基質が開裂されて、
ピルビン酸、ＡＭＣ、ＣＯ２ およびアンモニアを生成
する。 【００３１】 【００３２】蛍光の検出は微生物をインドール・ポジテ
ィブと識別する。蛍光がない場合には微生物がインドー
ル・ネガティブとわかる。 【００３３】本発明の基質を未知の微生物の同定装置に
包含させることができる。本発明の基質を使用すること
ができる好適な装置は、参考資料として本明細書に収録
してある本願出願人の１９８８年６月２０日出願の同時
係属出願番号第２０９，６７７号に記載されている。 【００３４】出願番号第２０９，６７７号の装置に組み
込んで使用する場合には、本発明の基質を出願番号第２
０９，６７７号に開示されている担体と組み合わせるこ
とができる。細胞内酵素の体液試料中への遊離を速める
ために、好ましくは洗浄剤のような細胞膜攝動試薬で微
生物を処理した後に、基質を未知物質を含む疑いありと
見られる体液試料と接触させることができる。未知の微
生物がインドール・ポジティブである場合には、体液試
料中に存在するトリプトファナーゼが基質と反応して発
蛍光団を遊離する。本発明の基質を含む担体に蛍光がな
い場合には未知の微生物をインドール・ネガティブと識
別する。蛍光が発現する速度の測定は基質の加水分解速
度、従って微生物中のトリプトファナーゼの濃度に関す
る情報を与える。このように測定した未知の微生物のイ
ンドール反応を、前記装置内の他の担体に付着させた複
数の他の酵素基質を用いて発現させた未知物質の酵素含
量の分布の一部に含めて考えることができる。次に、分
布は、実質的に同一検定条件下で発現させた既知微生物
の分布と比較することができ、未知物質の分布にもっと
も近い既知微生物の分布によって未知物質を同定するこ
とができる。 【００３５】本発明のトリプトファナーゼ基質は、また
、出願番号第２０９，６７７号の装置に組み込んで、あ
る範囲の抗生物質に対する感受性の分布を測定すること
による未知の微生物の同定に使用することもできる。 出願番号第２０９，６７７号の複数の担体のそれぞれは
本発明の基質および異なる抗生物質を包含することがで
きる。担体は液体増殖培地に未知の微生物を植え付けて
培養することができる。抗生物質が未知物質に対して効
果的であれば、成育は阻止され、酵素は生成せず、基質
は加水分解せず、かつ蛍光は発現しない。抗生物質が効
果がなければ、未知の微生物は成育して、基質を加水分
解して、蛍光を生じる酵素を表現する。上記のように、
本発明のトリプトファナーゼ基質を用いて得られる情報
は、種々の抗生物質に対する未知物質の反応性の分布を
発現させるために他の酵素の基質を用いて得られる情報
と組合わせることができる。未知物質の感受性の分布を
既知微生物の分布と比較して同定することができる。 【００３６】本発明の基質は、また出願番号第２０９，
６７７号の装置を用いて、未知物質に対する種々の抗生
物質の最小抑制濃度（ＭＩＣ）を測定することもできる
。この適用の場合には、担体のパネルはある範囲の濃度
の抗生物質および本発明の基質を包含する。植え付け、
培養後、各担体における抗生物質濃度の有効性が蛍光の
レベルによって示される。無植付担体による対照値を上
回る最小レベルの蛍光を有する担体が未知の微生物に対
する抗生物質のＭＩＣを示す。 【００３７】下記の実施例は本発明をさらに説明するた
めのものであって、本発明を限定しようとするためのも
のではない。 【００３８】（日常分析方法）ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ
（Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ
）より入手した０．２５ｍｍ，５ｃｍ×２０ｃｍのアル
ミニウムを裏打ちしたシリカゲル板（型式番号５５３４
）を用いて分析用ＴＬＣを行った。Ｗａｔｅｒｓ Ｄ
ｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ−１８ １００Ａ，４．６
×２２０ｍｍカラム（ＳＮ−３３８Ｂ３１１６２）を用
い、フォトダイオードアレイ検出器（２００ないし６０
０ｎｍ）を有するＷａｔｅｒｓ ８６０ ２ポンプ
システムで分析用逆相ＨＰＬＣを行った。使用条件は、
０．２％トリフルオロ酢酸水溶液で６０分間最初の保持
後、１時間にわたり０．２％トリフルオロ酢酸ＴＨＦ溶
液にいたる直線傾斜に保持した。融点はＴｈｏｍａｓ−
Ｈｏｏｖｅｒ毛細菅融点測定装置（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐ
ｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて求め、補
正はしなかった。蛍光スペクトルはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ ＬＳ−５ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｒで記録した
。ＮＭＲスペクトルはＩＢＭ／Ｂｒｕｃｋｅｒ ＷＰ
−２００ＳＹ（２００ｍＨｚ）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で記録した。化学シフト
はテトラメチルシランに対して記述した。Ｄ．Ｓ．Ｍｉ
ｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔ
ｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ３０２
８，Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎｏｒｔｈ
Ｃａｒｏｌｉｎａ ２７７１０により高分解能質量分
光測定を行った。 【００３９】実施例Ｉ セリン−ＡＭＣ−カルバメート（Ｖ）の合成Ａ．４−メ
チル−７−イソシアノクマリンの合成ドライアイスコン
デンサーと磁器撹拌器を付けた２００ｍｌの三つ口丸底
フラスコに２０％ホスゲン／トルエン溶液２．０ｍｌお
よび無水ジオキサン８０ｍｌを充填した。この混合物に
固体のＡＭＣ２．０ｇ（０．０１１４モル）を加えて、
混合物を一夜間還流させた。混合物は黄色から変化して
白色固体沈澱物を生じた。さらに７．０ｍｌの２０％ホ
スゲン／トルエン溶液を加えて、混合物をさらに５時間
還流させると、溶液は透明になった。アルゴンガス導入
管をフラスコに取付けて、アルゴンを溶液中に吹込んで
、過剰のホスゲンおよび微量のＨＣｌを除去した。濁っ
た混合物を濾過して、未反応のＡＭＣを除去し、さらに
濃縮して所望の生成物である白色固型物２．０ｇ（収率
８７％）を得た。 【００４０】ＮＭＲ（ＣＤＣ１３ ）：ｐｐｍ ：２．
４３（ｓ，３Ｈ），７．０２（ｓ，１Ｈ），７．３９（
ｄｄ，３Ｈ）。 【００４１】ＩＲ：２２５０ｃｍ−１に強い吸収；３８
００から３５００ｃｍ−１には吸収なし。 【００４２】Ｂ．Ｎ−トリメチルシリルエチルオキシカ
ルボニル−Ｏ−カルボニルアミノ−７−（４−メチルク
マリニル）−Ｌ−セリンリチウム塩磁気撹拌器を取付け
た１００ｍＬの三つ口丸底フラスコにＮ−トリメチルシ
リルエチルオキシカルボニル−Ｌ−セリンリチウム塩（
Ｓｈｕｔｅら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１９８７年，３４６
）１．１６ｇ（４．１６ミリモル）およびアセトニトリ
ル２０ｍｌを充填した。この混合物に４−メチル−７−
イソシアノクマリン（Ａの生成物）０．８４ｇ（４．１
８ミリモル）をＴＨＦ１５ｍｌに溶解した液を加えた。 この混合物を室温で４８時間撹拌した。次にこの混合物
を濾過して、灰白色の固体１．３２ｇを得た。この固体
をヒドロサルフェートナトリウム飽和溶液に懸濁させて
１時間撹拌した。次いで懸濁物を濾過して０．８４ｇ（
１．８３ミリモル）の生成物を得た（収率４４％）。高
速原子衝撃マススペクトルでは〔ＭＨ＋Ｎａ〕＋ が４
７９であった。 【００４３】 ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６ ）：ｐｐｍ ：０．０（
ｂｓ，９Ｈ），０．９０（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｓ，
３Ｈ），４．０１（ｍ，４Ｈ），４．３０（ｍ，２Ｈ）
，７．０９（ｍ，４Ｈ），１０．２６（ｓ，１Ｈ）。 【００４４】ＨＰＬＣの保持時間９８分。 【００４５】Ｃ．セリン−ＡＭＣ−カルバメート，Ｖの
合成１０ｍＬのフラスコに無水トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）２．０ｍｌを充填して、アルゴン雰囲気下で０℃に
冷却した。この冷却したＴＦＡにＢで得た生成物０．２
４ｇ（０．５２５ミリモル）を加えた。この溶液を０℃
で４時間撹拌し、減圧下に回転蒸発器で濃縮した。残留
物をメタノールに溶解し、エタノールを加えると白色固
体が沈澱した。この白色固体を濾過して、生成物０．１
７８ｇ（収率８０．９％）を得た。 【００４６】融点＝１８５ないし１８６℃（分解）。 【００４７】 ＮＭＲ（ＣＤＣ１３ ＋ＣＦ３ ＣＯＯＨ）：ｐｐ
ｍ ：２．５４（ｓ，３Ｈ），４．８５（ｍ，３Ｈ），
６．４４（ｓ，１Ｈ），７．６６（４Ｈ）。 【００４８】ＨＰＬＣの保持時間７４分。 【００４９】 高分解能マススペクトル〔ＭＨ＋ 〕：Ｃ１４Ｈ１
５Ｎ２ Ｏ６ 、計算値３０７．０８４８、実測値３０
７．０９３７。 【００５０】実施例ＩＩ セリン−ＡＭＣ−カルバメートとトリプトファナーゼと
の反応セリン−ＡＭＣ−カルバメート１．１９×１０−
６Ｍをリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．２）１００ｍＭ
に溶解した液に５．０ｍｇ／ｍＬトリプトファナーゼ溶
液１００μＬを添加した。３６５ｎｍで励起させて、蛍
光の増加を４４０ｎｍで測定した。セリン−ＡＭＣ−カ
ルバメート溶液の最初の蛍光は２６相対単位であった。 酵素添加後、４４０ｎｍの蛍光は９７単位／分の割合で
増加した。この結果は酵素がセリン−ＡＭＣ−カルバメ
ートの７−アミノ−４−メチル−クマリンへの転化を触
媒していることを示した。酸素がない場合の蛍光の増加
は無視できた。 【００５１】実施例ＩＩＩ 微生物のインドール反応の測定ジメチルスルホキシドに
溶解した実施例Ｉの基質０．５％溶液２０マイクロリッ
トルの一部をセルロースの円板（型録番号７４０−Ｅ，
Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎ
ｃ．Ｋｅｅｎｅ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）に添
加した。真空乾燥してＤＭＳＯを除去した。乾燥した円
板を黒色ポリスチレン製ミクロウェルトレイ（ｍｉｃｒ
ｏｗｅｌｌｔｒａｙ）のウェルの中においた。４枚の円
板にそれぞれ、公知のインドール・ポジティブ微生物Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＣｉｔｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ｄｉｖｅｒｓｕｓならびに既知のインド
ール・ネガティブ微生物Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆ
ｒｅｕｎｄｉｉの１ｍｌ当り３×１０８ コロニー形成
単位を含む懸濁液を２５マイクロリットル植え付けた。 懸濁液はバクテリアを透過させるためにリン酸塩緩衝液
（ｐＨ８．４）５ｍｌ当り２滴の濃度のトルエンを含む
緩衝液でつくった。４枚の円板は対照として役立てるた
めに緩衝液のみを植え付けた。キセノンランプを用いて
円板を３６５ｎｍで励起させ、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ
ＩＩ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｃ
Ｌｅａｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２２１０２）記録計を
用いて４４０ｎｍの波長で１分間隔で１０分間蛍光を測
定した。各微生物について４個のチューブから得た結果
を平均して１分間当りの遊離ＡＭＣをナノグラム単位で
下表に示す。 【００５２】 【００５３】表１からインドール・ネガティブ微生物Ｋ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉは
対照とほぼ同様の蛍光の増加を示すのに対して、インド
ール・ポジティブ微生物Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｄｉｖ
ｅｒｓｕｓは遊離ＡＭＣの放出によって著しく大きな蛍
光の増加を示すことがわかる。
り詳細には、酸素含量の分析による微生物の同定に有用
な酵素基質に関する。 【０００２】（発明の背景）多くの疾病は生体の細胞組
織もしくは血液、尿、脳脊髄液または関節滑液のような
体液への微生物の侵入の結果である。このような感染に
対する有効な治療には、早期の診断が必要であり、病原
菌の正確な同定が行われて始めて正しい治療を開始する
ことができる。感染の初期の段階では病原菌の濃度が低
いためにこれが困難である。 【０００３】微生物同定のために、病院の細胞学実験室
で現在行われているいくつかの方法は、微生物の単離後
、同定に達するまで通常１８ないし２４時間以上を要す
る培養に基づく方法である。ある場合には、同定までの
この時間の長さが生命をおびやかすことがある。 【０００４】どの酵素が存在するかを測定することによ
る病原菌の同定が検討されている。この方法は、微生物
によって表現される酵素により蛍光産生基質または色素
産生基質を加水分解させることによるものであり、通常
、ある基質のパネルを植え付けて、得られる蛍光産生ま
たは色素産生分布を既知の微生物の同じパネルで発現す
る分布と関連づけることによって行う。この方法の典型
的なものはＢａｓｃｏｍｂの米国特許第４，６０３，１
０８号における開示である。 【０００５】ＧｏｄｓｅｙらはＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
１３，４８３（１９８１年）にβ−メチルウンベリフェ
ロン、β−ナフチルアミンおよび７−アミノ−４−メチ
ルクマリン（ＡＭＣ）からの蛍光産生基質を用いて、Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の菌株によって
表現される酵素の分布を測定する方法および装置を開示
している。 【０００６】トリプロファナーゼはあるバクテリア中に
存在し、トリプトファンをインドール、ピルビン酸およ
びアンモニアに転化させる酵素である。この酵素によっ
て発色団２−ニトロチオフェノールに開裂される基質Ｓ
−（２−ニトロフェニル）システインがＳｕｅｌｔｅｒ
らによって、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ ８２，５６１（１９７９年）に開示されて
いる。 【０００７】細菌同定用酵素分布測定パネルに含まれる
と考えられるトリプトファナーゼの蛍光産生基質に対す
る要望がある。該基質は、特にＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａｃｅａｅ種の場合に、本法による細菌同定の精度
を著しく向上させるであろう。本発明が指向することは
この要望を実現することである。 【０００８】（発明の要約）トリプトファナーゼの蛍光
産生基質は、蛍光染料部分および染料の求核基がカルボ
ニル基またはチオカルボニル基によってアミノ酸のアミ
ノ基以外の求核基に結合されているアミノ酸部分を含ん
でいる。好ましい基質においては、アミノ酸がトレオニ
ン、システイン、またはもっとも好ましくはセリンであ
り、かつ蛍光染料部分がフルオレセイン、ローダミン、
β−ナフチルアミンまたは、好ましくはクマリン誘導体
である。もっとも好ましい染料はＡＭＣである。 【０００９】本発明の好適な基質は、それ自体非蛍光性
であるが、トリプトファナーゼによってアミノ酸とＡＭ
Ｃに開裂する。該基質は未知の微生物がトリプトファナ
ーゼを含むかどうかを測定するのに用いることができ、
酵素含量に基づいて、未知の微生物の同定を行う装置に
加えることができる。 【００１０】酵素含量の分布の測定および既知の微生物
の分布との比較による未知の微生物の同定はほとんどの
微生物の場合におおむね正確である。しかし、本法は現
在入手可能な基質を用いては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａｃｅａｅの場合には余り正確ではない。Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのある種はトリプトファ
ナーゼを表現し、他の種は表現しないので、分布測定装
置中に本発明の基質を包含させるとこのグループの微生
物の同定精度を向上させる。 【００１１】（詳細な説明）本発明は多種類の態様によ
って満足を与えられるけれども、本明細書では本発明の
好適な態様の詳細な説明を行うが、同時に本開示は本発
明の典型的な原理と考え、本発明を記載した態様に限定
するつもりではないことを理解すべきである。本発明の
範囲は添付クレームおよびその等価物によって示されよ
う。 【００１２】トリプトファナーゼはトリプトファンのイ
ンドール、ピルビン酸およびアンモニアへの転化を触媒
し、この酵素を含む微生物をインドール・ポジティブ（
ｉｎｄｏｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と呼ぶことが多い
。典型的なインドール・ポジティブ微生物はＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
ｄｉｖｅｒｓｕｓ，Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ，Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉおよ
びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａである。代
表的なインドール・ネガティブ（ｉｎｄｏｌｅ ｎｅ
ｇａｔｉｖｅ）微生物はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅ
ｕｎｄｉｉおよびＰｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉ
ｓである。 【００１３】未知の微生物がインドール・ポジティブか
インドール・ネガティブかの測定は未知物質の同定に有
用である。特に、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ
ｅ種の正確な同定は微生物のインドール区分の測定によ
って容易になる。 【００１４】本発明の基質は、尿、大便、外傷、首、性
器標品のような臨床標品もしくは血液、脳脊髄液または
関節滑液のような通常無菌の身体標品中の微生物のイン
ドール区分を測定するのに使用することができる。本発
明においては、微生物という用語はかび、イースト、好
ましくはバクテリアのような酵素を生成する微生物を包
含することを意図している。 【００１５】本発明の蛍光産生トリプトファナーゼ基質
は下記の構造Ｉ 【００１６】 【００１７】（式中、Ａは蛍光染料部分であることがで
き、Ｘ，ＹおよびＺは別個にＯ，ＳまたはＮＨであるこ
とができ、ｎは０ないし３であることができる）を有す
ることができる。典型的な適当な蛍光染料部分は下記の
通りである。 【００１８】（１）ＡＭＣ（式中、ＸがＮＨ）；（２）
７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（式中、ＸがＯ）
； （３）フルオレセイン（式中、ＸがＯ）；（４）ローダ
ミン（式中、ＸがＮＨ）；（５）β−ナフチルアミン（
式中、ＸがＮＨ）本発明の好適な基質は下記の構造ＩＩ 【００１９】 【００２０】（式中、ＡはフルオレセインまたはＡＭＣ
であることができ、Ｒ１ はＣＨ２ またはＣＨ２ Ｃ
Ｈ＝ＣＨであることができ、ＹおよびＺはＯまたはＳで
あることができる）に従うフルオレセインまたはＡＭＣ
のセリン、システインおよびトレオニン誘導体である。 もっとも好適な基質は、Ａが４−メチルクマリン、Ｙお
よびＺがＯ、かつＲ１ がＣＨ２ である。 【００２１】本発明の基質は周知の合成径路によって市
販の蛍光染料から合成することができる。好ましい径路
では、アミノ基で置換された染料を対応するイソシアノ
またはイソチオシアノ誘導体に転化させ、さらに下記の
構造ＩＩＩ 【００２２】 【００２３】（式中、ＹはＯＨ，ＳＨまたはＮＨ２ で
あることができ、ｎは０ないし３であることができ、Ｒ
２ およびＲ３ はカルボベンジルオキシ、ベンジル、
リチウムおよびトリメチルシリルエトキシカルボニル（
Ｔｅｏｃ）のような通常のアミノ酸保護基である）の適
切に保護されたアミノ酸と反応させる。好ましい保護基
はＲ２ としてリチウムおよびＲ３ としてＴｅｏｃで
ある（実施例Ｉに記載の通り）。この合成径路が、保護
基の脱離後、構造Ｉ：化１（ただし、ＸがＮＨおよびＺ
がイソシアノ置換染料からのＯ）および構造Ｉ：化１（
ただし、ＸがＮＨおよびＺがイソチオシアノ置換染料か
らのＳ）を生じることは明らかである。このように、た
とえばある基質（ただしＡがローダミン、ＸがＮＨ、Ｚ
がＳ、ＹがＯおよびＲ１ がメチレン）がローダミンイ
ソチオシアナートと二重保護セリンとの反応から生じる
であろう。 【００２４】次式に基質ＩＶ（ただし、ＸはＯ）の適切
な合成径路を示す。 【００２５】 【００２６】この式は発蛍光団７−ヒドロキシ−４−メ
チルクマリンのクロロホルミル誘導体への転化およびこ
の中間体と二重保護セリンとの反応の結果、保護基の離
脱後トリプトファナーゼ基質ＩＶが得られることを示す
。 【００２７】本発明のトリプトファナーゼ基質合成の他
の径路は当業者には明らかであろうし、もっとも好適な
下記の基質Ｖ 【００２８】 【００２９】を合成する詳細な実験方法を実施例Ｉに示
す。 【００３０】本発明の基質でトリプトファナーゼを表現
する微生物を培養すると、下記に示すように酵素によっ
て、それ自体蛍光性でない蛍光産生基質が開裂されて、
ピルビン酸、ＡＭＣ、ＣＯ２ およびアンモニアを生成
する。 【００３１】 【００３２】蛍光の検出は微生物をインドール・ポジテ
ィブと識別する。蛍光がない場合には微生物がインドー
ル・ネガティブとわかる。 【００３３】本発明の基質を未知の微生物の同定装置に
包含させることができる。本発明の基質を使用すること
ができる好適な装置は、参考資料として本明細書に収録
してある本願出願人の１９８８年６月２０日出願の同時
係属出願番号第２０９，６７７号に記載されている。 【００３４】出願番号第２０９，６７７号の装置に組み
込んで使用する場合には、本発明の基質を出願番号第２
０９，６７７号に開示されている担体と組み合わせるこ
とができる。細胞内酵素の体液試料中への遊離を速める
ために、好ましくは洗浄剤のような細胞膜攝動試薬で微
生物を処理した後に、基質を未知物質を含む疑いありと
見られる体液試料と接触させることができる。未知の微
生物がインドール・ポジティブである場合には、体液試
料中に存在するトリプトファナーゼが基質と反応して発
蛍光団を遊離する。本発明の基質を含む担体に蛍光がな
い場合には未知の微生物をインドール・ネガティブと識
別する。蛍光が発現する速度の測定は基質の加水分解速
度、従って微生物中のトリプトファナーゼの濃度に関す
る情報を与える。このように測定した未知の微生物のイ
ンドール反応を、前記装置内の他の担体に付着させた複
数の他の酵素基質を用いて発現させた未知物質の酵素含
量の分布の一部に含めて考えることができる。次に、分
布は、実質的に同一検定条件下で発現させた既知微生物
の分布と比較することができ、未知物質の分布にもっと
も近い既知微生物の分布によって未知物質を同定するこ
とができる。 【００３５】本発明のトリプトファナーゼ基質は、また
、出願番号第２０９，６７７号の装置に組み込んで、あ
る範囲の抗生物質に対する感受性の分布を測定すること
による未知の微生物の同定に使用することもできる。 出願番号第２０９，６７７号の複数の担体のそれぞれは
本発明の基質および異なる抗生物質を包含することがで
きる。担体は液体増殖培地に未知の微生物を植え付けて
培養することができる。抗生物質が未知物質に対して効
果的であれば、成育は阻止され、酵素は生成せず、基質
は加水分解せず、かつ蛍光は発現しない。抗生物質が効
果がなければ、未知の微生物は成育して、基質を加水分
解して、蛍光を生じる酵素を表現する。上記のように、
本発明のトリプトファナーゼ基質を用いて得られる情報
は、種々の抗生物質に対する未知物質の反応性の分布を
発現させるために他の酵素の基質を用いて得られる情報
と組合わせることができる。未知物質の感受性の分布を
既知微生物の分布と比較して同定することができる。 【００３６】本発明の基質は、また出願番号第２０９，
６７７号の装置を用いて、未知物質に対する種々の抗生
物質の最小抑制濃度（ＭＩＣ）を測定することもできる
。この適用の場合には、担体のパネルはある範囲の濃度
の抗生物質および本発明の基質を包含する。植え付け、
培養後、各担体における抗生物質濃度の有効性が蛍光の
レベルによって示される。無植付担体による対照値を上
回る最小レベルの蛍光を有する担体が未知の微生物に対
する抗生物質のＭＩＣを示す。 【００３７】下記の実施例は本発明をさらに説明するた
めのものであって、本発明を限定しようとするためのも
のではない。 【００３８】（日常分析方法）ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ
（Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ
）より入手した０．２５ｍｍ，５ｃｍ×２０ｃｍのアル
ミニウムを裏打ちしたシリカゲル板（型式番号５５３４
）を用いて分析用ＴＬＣを行った。Ｗａｔｅｒｓ Ｄ
ｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ−１８ １００Ａ，４．６
×２２０ｍｍカラム（ＳＮ−３３８Ｂ３１１６２）を用
い、フォトダイオードアレイ検出器（２００ないし６０
０ｎｍ）を有するＷａｔｅｒｓ ８６０ ２ポンプ
システムで分析用逆相ＨＰＬＣを行った。使用条件は、
０．２％トリフルオロ酢酸水溶液で６０分間最初の保持
後、１時間にわたり０．２％トリフルオロ酢酸ＴＨＦ溶
液にいたる直線傾斜に保持した。融点はＴｈｏｍａｓ−
Ｈｏｏｖｅｒ毛細菅融点測定装置（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐ
ｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて求め、補
正はしなかった。蛍光スペクトルはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ ＬＳ−５ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｒで記録した
。ＮＭＲスペクトルはＩＢＭ／Ｂｒｕｃｋｅｒ ＷＰ
−２００ＳＹ（２００ｍＨｚ）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で記録した。化学シフト
はテトラメチルシランに対して記述した。Ｄ．Ｓ．Ｍｉ
ｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔ
ｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ３０２
８，Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎｏｒｔｈ
Ｃａｒｏｌｉｎａ ２７７１０により高分解能質量分
光測定を行った。 【００３９】実施例Ｉ セリン−ＡＭＣ−カルバメート（Ｖ）の合成Ａ．４−メ
チル−７−イソシアノクマリンの合成ドライアイスコン
デンサーと磁器撹拌器を付けた２００ｍｌの三つ口丸底
フラスコに２０％ホスゲン／トルエン溶液２．０ｍｌお
よび無水ジオキサン８０ｍｌを充填した。この混合物に
固体のＡＭＣ２．０ｇ（０．０１１４モル）を加えて、
混合物を一夜間還流させた。混合物は黄色から変化して
白色固体沈澱物を生じた。さらに７．０ｍｌの２０％ホ
スゲン／トルエン溶液を加えて、混合物をさらに５時間
還流させると、溶液は透明になった。アルゴンガス導入
管をフラスコに取付けて、アルゴンを溶液中に吹込んで
、過剰のホスゲンおよび微量のＨＣｌを除去した。濁っ
た混合物を濾過して、未反応のＡＭＣを除去し、さらに
濃縮して所望の生成物である白色固型物２．０ｇ（収率
８７％）を得た。 【００４０】ＮＭＲ（ＣＤＣ１３ ）：ｐｐｍ ：２．
４３（ｓ，３Ｈ），７．０２（ｓ，１Ｈ），７．３９（
ｄｄ，３Ｈ）。 【００４１】ＩＲ：２２５０ｃｍ−１に強い吸収；３８
００から３５００ｃｍ−１には吸収なし。 【００４２】Ｂ．Ｎ−トリメチルシリルエチルオキシカ
ルボニル−Ｏ−カルボニルアミノ−７−（４−メチルク
マリニル）−Ｌ−セリンリチウム塩磁気撹拌器を取付け
た１００ｍＬの三つ口丸底フラスコにＮ−トリメチルシ
リルエチルオキシカルボニル−Ｌ−セリンリチウム塩（
Ｓｈｕｔｅら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１９８７年，３４６
）１．１６ｇ（４．１６ミリモル）およびアセトニトリ
ル２０ｍｌを充填した。この混合物に４−メチル−７−
イソシアノクマリン（Ａの生成物）０．８４ｇ（４．１
８ミリモル）をＴＨＦ１５ｍｌに溶解した液を加えた。 この混合物を室温で４８時間撹拌した。次にこの混合物
を濾過して、灰白色の固体１．３２ｇを得た。この固体
をヒドロサルフェートナトリウム飽和溶液に懸濁させて
１時間撹拌した。次いで懸濁物を濾過して０．８４ｇ（
１．８３ミリモル）の生成物を得た（収率４４％）。高
速原子衝撃マススペクトルでは〔ＭＨ＋Ｎａ〕＋ が４
７９であった。 【００４３】 ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６ ）：ｐｐｍ ：０．０（
ｂｓ，９Ｈ），０．９０（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｓ，
３Ｈ），４．０１（ｍ，４Ｈ），４．３０（ｍ，２Ｈ）
，７．０９（ｍ，４Ｈ），１０．２６（ｓ，１Ｈ）。 【００４４】ＨＰＬＣの保持時間９８分。 【００４５】Ｃ．セリン−ＡＭＣ−カルバメート，Ｖの
合成１０ｍＬのフラスコに無水トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）２．０ｍｌを充填して、アルゴン雰囲気下で０℃に
冷却した。この冷却したＴＦＡにＢで得た生成物０．２
４ｇ（０．５２５ミリモル）を加えた。この溶液を０℃
で４時間撹拌し、減圧下に回転蒸発器で濃縮した。残留
物をメタノールに溶解し、エタノールを加えると白色固
体が沈澱した。この白色固体を濾過して、生成物０．１
７８ｇ（収率８０．９％）を得た。 【００４６】融点＝１８５ないし１８６℃（分解）。 【００４７】 ＮＭＲ（ＣＤＣ１３ ＋ＣＦ３ ＣＯＯＨ）：ｐｐ
ｍ ：２．５４（ｓ，３Ｈ），４．８５（ｍ，３Ｈ），
６．４４（ｓ，１Ｈ），７．６６（４Ｈ）。 【００４８】ＨＰＬＣの保持時間７４分。 【００４９】 高分解能マススペクトル〔ＭＨ＋ 〕：Ｃ１４Ｈ１
５Ｎ２ Ｏ６ 、計算値３０７．０８４８、実測値３０
７．０９３７。 【００５０】実施例ＩＩ セリン−ＡＭＣ−カルバメートとトリプトファナーゼと
の反応セリン−ＡＭＣ−カルバメート１．１９×１０−
６Ｍをリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．２）１００ｍＭ
に溶解した液に５．０ｍｇ／ｍＬトリプトファナーゼ溶
液１００μＬを添加した。３６５ｎｍで励起させて、蛍
光の増加を４４０ｎｍで測定した。セリン−ＡＭＣ−カ
ルバメート溶液の最初の蛍光は２６相対単位であった。 酵素添加後、４４０ｎｍの蛍光は９７単位／分の割合で
増加した。この結果は酵素がセリン−ＡＭＣ−カルバメ
ートの７−アミノ−４−メチル−クマリンへの転化を触
媒していることを示した。酸素がない場合の蛍光の増加
は無視できた。 【００５１】実施例ＩＩＩ 微生物のインドール反応の測定ジメチルスルホキシドに
溶解した実施例Ｉの基質０．５％溶液２０マイクロリッ
トルの一部をセルロースの円板（型録番号７４０−Ｅ，
Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎ
ｃ．Ｋｅｅｎｅ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）に添
加した。真空乾燥してＤＭＳＯを除去した。乾燥した円
板を黒色ポリスチレン製ミクロウェルトレイ（ｍｉｃｒ
ｏｗｅｌｌｔｒａｙ）のウェルの中においた。４枚の円
板にそれぞれ、公知のインドール・ポジティブ微生物Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＣｉｔｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ｄｉｖｅｒｓｕｓならびに既知のインド
ール・ネガティブ微生物Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆ
ｒｅｕｎｄｉｉの１ｍｌ当り３×１０８ コロニー形成
単位を含む懸濁液を２５マイクロリットル植え付けた。 懸濁液はバクテリアを透過させるためにリン酸塩緩衝液
（ｐＨ８．４）５ｍｌ当り２滴の濃度のトルエンを含む
緩衝液でつくった。４枚の円板は対照として役立てるた
めに緩衝液のみを植え付けた。キセノンランプを用いて
円板を３６５ｎｍで励起させ、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ
ＩＩ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｃ
Ｌｅａｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２２１０２）記録計を
用いて４４０ｎｍの波長で１分間隔で１０分間蛍光を測
定した。各微生物について４個のチューブから得た結果
を平均して１分間当りの遊離ＡＭＣをナノグラム単位で
下表に示す。 【００５２】 【００５３】表１からインドール・ネガティブ微生物Ｋ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉは
対照とほぼ同様の蛍光の増加を示すのに対して、インド
ール・ポジティブ微生物Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｄｉｖ
ｅｒｓｕｓは遊離ＡＭＣの放出によって著しく大きな蛍
光の増加を示すことがわかる。
Claims (9)
- 【請求項１】 下記構造 （式中、Ａは蛍光染料部分で、ＹはＯおよびＳより成る
群から選ばれ、ＸはＯおよびＮＨより成る群から選ばれ
、ｎは０ないし１である）の蛍光産生トリプトファナー
ゼ基質。 - 【請求項２】 Ａが４−メチルクマリン部分である請
求項１の基質。 - 【請求項３】 Ａ−Ｘが７−アミノ−４−メチルクマ
リン部分である請求項２の基質。 - 【請求項４】 Ａ−Ｘが７−ヒドロキシ−４−メチル
クマリン部分である請求項２の基質。 - 【請求項５】 Ａがフルオレセイン部分である請求項
１の基質。 - 【請求項６】 Ａがローダミン部分である請求項１の
基質。 - 【請求項７】 Ａがβ−ナフチルアミン部分である請
求項１の基質。 - 【請求項８】 下記構造 （式中、Ａは蛍光染料部分で、Ｘ，ＹおよびＺは別個に
Ｏ，ＳおよびＮＨより成る群から選ばれ、ｎは０ないし
３である）の蛍光産生トリプトファナーゼ基質。 - 【請求項９】 下記構造 の蛍光産生トリプトファナーゼ基質。
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