JPH04230861A

JPH04230861A - クラミジア　ハーフサンドイッチ　イムノアッセイ

Info

Publication number: JPH04230861A
Application number: JP10518991A
Authority: JP
Inventors: Koleen K Messenger; コリーン・ケー・メッセンジャー; Carol A Miller; キャロル・エー・ミラー; Harmesh K Sharma; ハーメッシュ・ケー・シャーマ; Stephan G Thompson; ステファン・ジー・トンプソン
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1990-04-12
Filing date: 1991-04-11
Publication date: 1992-08-19
Also published as: EP0451687A2; AU7120391A; CA2035646A1; EP0451687A3; AU625344B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【産業上の利用分野】本発明は、特に生物検体中のクラ
ミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａ
ｃｈｏｍａｔｉｓ　）の検出に関する。さらに本発明は
、ヒト泌尿生殖器試料中のクラミジア・トラコマティス
のイムノアッセイ検出に関する。【０００２】【従来の技術】クラミジア・トラコマティスは、多数の
ヒト疾患症候群における原因物質であるグラム陰性細菌
である。泌尿生殖路のクラミジア感染は、性的伝染病の
うち増殖が最も速い。感染はしばしば症候を伴わないた
めに、その検出は臨床上に重要である。ヒトクラミジア
感染の実験室検出及び診断の一般的な見解は、Ｂａｒｎ
ｅｓ，Ｃｌｉｎ．　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２
：１１９−１３６（１９８９）に示されている。【０００３】培養法、イムノアッセイ、及びＤＮＡプロ
ーブ検定を含むクラミジア・トラコマティス検出の種々
の方法が長年に亘って開発されてきた。クラミジア菌の
抗原の特異的検出に基づくイムノアッセイ法は、クラミ
ジア感染の臨床診断に最も一般的に用いられる。このよ
うなイムノアッセイ法としては、顕微鏡スライドに固定
させた細胞上に露出したクラミジア抗原を、蛍光標識抗
体の結合により検出する直接蛍光測定法、及び臨床検体
から放出したクラミジア抗原を、酵素標識抗体の結合に
より検出する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が挙げられる。【０００４】現在市販されているクラミジア用ＥＩＡ試
験は、一般に、サンドイッチＥＩＡと、米国特許第４，
４９７，８８９号に記載の方法の２種類に分けられる。【０００５】サンドイッチＥＩＡ法では、放出クラミジ
ア抗原を酵素標識抗体及び固相化抗体と反応させて、ク
ラミジア抗原、次いで固相化抗体に結合した標識抗体の
不溶性複合体を形成させる。結合していない標識抗体を
除去した後、試料中のクラミジア抗原存在による固相上
の酵素の存在を、発色基質を添加し、発色を観察するこ
とによって測定する。サンドイッチＥＩＡの実施には、
連続した、時間を要する多数の工程が含まれる。クラミ
ジア・トラコマティスを検出するためのサンドイッチＥ
ＩＡの実施例は、米国特許第４，７２７，０１９号及び
４，８３０，９６０号に記載されている。【０００６】別のＥＩＡ原理が、前述の米国特許第４，
４９７，８９９号に記載されている。この方法では、ク
ラミジア抗原は細胞試験試料から試験混合液中に遊離し
、裸固相担体として記載されているものに非特異的に吸
着されるが、その担体はサンドイッチＥＩＡ法で用いら
れる固相化抗体試薬の場合のようにクラミジア抗体を含
有しない。試験混合液から固相担体を分離後、酵素標識
抗体を添加し、これを担体に吸着しているクラミジア抗
原に結合させる。次に、固相担体上に存在する酵素を、
サンドイッチＥＩＡ法の場合のように発色基質で検出す
る。【０００７】このＥＩＡ法は、異なる検定原理で操作す
るが、サンドイッチＥＩＡ法の場合のように連続した、
時間を要する多数の工程の実施を必要とする。【０００８】【発明が解決しようとする課題】試薬及び検定工程を最
低数とするイムノアッセイ法を提供することが、本発明
の目的である。このような方法は、医者の診察室又は小
規模な臨床研究所の場合のような相対的に未熟練者によ
る、あるいは患者自身によるクラミジア検定の実施に特
に有益である。【０００９】【問題を解決するための手段】試験試料中のクラミジア
・トラコマティスの簡単且つ迅速なイムノアッセイ検出
は、（ａ）試料を処理して露出多価クラミジア・トラコ
マティス抗原を含有する試験混合液を生成し、（ｂ）露
出多価クラミジア抗原を、上記抗原に反応して免疫複合
体を形成する、例えば酵素により標識化した、抗体試薬
と接触させ、（ｃ）その結果生じる混合液を、このよう
な免疫複合体は実質的に通過させないが、有意な量の結
合してない標識抗体試薬を保持しないガラス繊維深層フ
ィルターに通して、（ｄ）工程（ｃ）終了後、その上に
存在する実質的にすべての非結合の標識抗体試薬を除去
するのに有効な洗浄液をガラス繊維フィルターに通し、
そして（ｅ）標識を観察又は測定することによって、例
えば酵素標識の場合は、発色基質をフィルターに通し、
そしてその結果生じる任意の色を観察又は測定すること
によって、フィルターに保持されたこのような免疫複合
体の存在を検出することができる。【００１０】本方法は、臨床検体、例えば感染ヒト細胞
を含有する可能性のある泌尿生殖器系検体中のクラミジ
アを検出するのに特に有用である。【００１１】抗原の露出は、通常、ヒト細胞を破裂させ
て、そこからクラミジア・トラコマティスを十分遊離し
、多価抗原が露出するように放出クラミジア・トラコマ
ティスの細胞質膜を破壊して検体を処理することによっ
て成し遂げられる。問題の多価抗原は、一般に、外膜の
蛋白質及びリポ多糖類（ＬＰＳ）中に見いだされる。【００１２】クラミジア抗原を２つの異なる試薬又は試
験手段（即ち、サンドイッチ法における標識及び固相化
抗体、並びに吸着法における標識抗体及び裸担体）にか
けるために多工程を必要とする従来技術のサンドイッチ
法、及び吸着ＥＩＡ法の両方と比較して、本方法は単一
検定工程、及び単一結合試薬（標識抗体）のみを要する
ために、本方法をここでは”ハーフサンドイッチ”イム
ノアッセイと言う。【００１３】その結果、本方法は、多くの有意な利点を
特徴とする。本方法は、より少ない試薬及び検定工程を
要し、特にユーザーが計時を必要とする工程が少なく、
このことは医者の診察室又は小規模な臨床研究所の場合
のような相対的に未熟練者による、あるいは患者自身に
よるこのようなイムノアッセイ法の実施において、非常
に重要である。検定に要する総時間は、従来技術の方法
と同じであるか、又は場合により少ない。さらに、本検
定は、従来技術の方法よりも感受性が高いことが立証さ
れており、確かに製作が容易であって、固相化抗体試薬
又は特別の裸担体、あるいはそれを保持する材料を調製
する必要がない。【００１４】抗クラミジア抗体試薬と、試験検体から放
出されるクラミジア抗原との結合によって形成される免
疫複合体が、ガラス繊維深層フィルターに実質的に保持
され、一方、非結合の標識抗体試薬が大体においてフィ
ルターを通り抜けるということが、本発明にとって重要
である。【００１５】以下でさらに明らかにするように、非結合
の標識抗体試薬と、結合した標識抗体試薬との完全な分
離は、検出するクラミジア抗原の性質、標識抗体試薬の
サイズ及び構造、ガラス繊維フィルターの多孔度、ある
いはフィルターに保持され、そして標識抗体と非特異的
に結合する、試験試料中の、又は試料処理工程で生成す
る、妨害物質の存在を含む多数の制御可能な要因に依る
ことが判明している。【００１６】その他の要因としては、含まれる試験試料
の性質、及び非結合の標識試薬と結合した標識試薬の分
離の完全性が挙げられるが、それは、本発明の方法が首
尾よく実施され、診断的に有意の結果がクラミジア・ト
ラコマティスの検出に関して得られる以前は、明らかで
はなかった。【００１７】本方法の第一工程は、本明細書では時とし
て試料処理工程と呼ぶ、検出可能量の多価クラミジア抗
原を露出するための試験試料の処理を含む。クラミジア
・トラコマティスは、独特の複相成長周期を示す真正細
胞内細菌である。この細菌の２つの代表的形態は、基本
小体（ＥＢ）及び細網小体（ＲＢ）である。代謝的に不
活性であるが感染性のＥＢ形態は被履柱状細胞を侵害し
、代謝的に活性なＲＢ形態に形質転換する。両形態の細
菌は、外膜のｐｏｒｉｎ構造、リポ多糖類（ＬＰＳ）抗
原、及びその他のもの（Ｂａｒｎｅｓ，上記）と形態学
的に関連する大型外膜蛋白質を含む多数の抗原性成分を
含有する。【００１８】任意のこのような抗原、あるいは試験試料
から生成され得る複合体又はその断片を、本方法におけ
る検出可能な、すなわちフィルターに保持可能な免疫複
合体を形成するように、多数の抗体試薬に結合可能とな
るように多価となる、抗原として供給する。【００１９】ヒト細胞を含有する臨床検体の場合、試料
処理工程は、次の２つの目的に貢献する：（１）細胞内
クラミジアＥＢ及びＲＢ形態を放出するためのヒト真核
細胞膜の破裂、そして（２）抗体試薬の結合に必要な抗
原部位又はエピトープを形成するための、放出ＥＢ及び
ＲＢの細胞質膜の、溶解に依ることもある破壊。したが
って、試料処理は、問題の抗原部位又はエピトープによ
って変化する。【００２０】従来技術の方法は一般に、膜成分を十分に
可溶化するために試料処理に関して相対的に厳しい条件
、例えば１Ｍ水酸化ナトリウム又は０．５Ｍジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）を用いる。このような従来技術の試
料処理剤は、イムノアッセイ試薬の付加前に洗い流せる
が、本方法は、標識試薬が直接そこに付加するため、処
理試験混合液中の残存試料処理剤が標識化抗体試薬に匹
敵することが必要である。【００２１】したがって、試料処理条件は、標識抗体と
このような遊離抗原との結合、又は例えば酵素などの標
識の検出可能な活性を、変性、干渉又は妨害することな
く、検出可能なクラミジア抗原の遊離を可能にするよう
に選択しなければならない。【００２２】これらを考慮すれば、一般の熟練研究者は
、好適なそして最適な試料処理剤、及び条件を経験的に
選択し得る。このような薬剤は、イオン性及び非イオン
性の、高及び低塩濃度の、高及び低ｐＨの、ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）及びジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）のような通常の有機溶剤、燐酸塩、炭酸塩、及び
硼酸塩等の緩衝イオンを含有する洗剤を含む。【００２３】一例として、露出される抗原が外膜蛋白質
である場合、有用な試料処理液は、ｐＨ約８〜約９で、
好ましくはトリス緩衝液（例えば約０．１Ｍで）に緩衝
する。このような蛋白質抗原を露出するのにさらに有用
なのは、一つ又はそれ以上の次に示す物質である：アセ
チルシステイン（例えば２００ｍＭ以下の濃度で）のよ
うな還元剤；コンドロイチナーゼ、ノイラミニダーゼ、
及びトリプシンのような酵素；ハロゲン化物の塩（例え
ば０．１〜１Ｍの濃度で）；過酸化水素のような酸化剤
；並びにＳａｒｋｏｓｙｌ（例えば０．５％以下の濃度
で）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（例えば０．
１％以下の濃度で）、及びトリトンＸ−１００（例えば
０．５％以下の濃度で）のような洗剤。還元剤と酸化剤
を共に用いる場合は、還元剤を先ず検体に加え、一定の
反応時間後、酸化剤を加える。【００２４】別の実施例としては、露出される抗原がＬ
ＰＳである場合、有用な試料処理液は、ｐＨ約６．５〜
約９で好ましくは燐酸塩緩衝液（例えば約０．１Ｍで）
を用いて緩衝する。このようなＬＰＳ抗原を露出するの
にさらに有用なのは、一つ又はそれ以上の次に示す物質
である：ＤＴＴ（例えば５０ｍＭ以下の濃度で）及びア
セチルシステイン（例えば１００ｍＭ以下の濃度で）の
ような還元剤；ハロゲン化物の塩（例えば０．５Ｍ以下
の濃度で）；並びにデオキリクロレート（例えば０．０
３５％以下の濃度で））のような洗剤。【００２５】臨床試験試料は、種々の形態で患者から得
られる。検体は他の部位からも採取されるが、しかし最
も有意なのは泌尿生殖器系検体の採取である。本方法に
よる試験のための試料の最も一般的な形態は、子宮頸管
又は尿道のスワブである。スワブは、上記のような試料
処理剤を入れた試料処理管、又はその他の適当な容器に
入れるのが便利である。【００２６】管から取り出す前に、一般に、スワブを、
出来るだけ多くの試料物質を試料処理液中に排出するよ
うに圧縮する。例えばスワブを試料処理管の内壁に絞り
出すか、あるいは管に十分にスワブを挿入するか又はそ
こから取り出すために、管は、スワブを押したり引いた
りするうね又はくびれのような構造を構成する。【００２７】標識抗体試薬は、ある工程では試料処理剤
とともに添加し得るし、あるいは任意に中間の又はその
後の濾過工程において試験試料に試料処理剤の作用によ
り、形成される、試験混合液に後から加えることもでき
る。試験検体、特に泌尿器検体のような臨床検体は一般
に種々の細胞破片並びに粘液を含有するために、液体試
験試料をガラス繊維深層フィルターに最終的に通す前に
、このような物質のいくらか又はすべてを濾過すること
がしばしば望ましいかあるいは必要である。【００２８】このような予備濾過工程によって、分離フ
ィルターは詰まることがなくなり、そこを通過する試験
混合液の流れは有意に減少又は阻止されることはなくな
る。さらに、数例においては、予備濾過しない場合は試
料破片は、分離フィルター上に残り、結合及び非結合の
標識抗体の分離を妨害し、標識抗体のフィルターへの非
特異的結合を増大し、あるいは標識からの非均一な信号
の発生を引き起こす。【００２９】検出するクラミジア抗原、又は標識抗体試
薬の添加後に予備濾過を実施する場合には、予備フィル
ターは、それらを実質的に除去することなく、試験試料
又は混合液から望ましくない又は不必要な試料物質を除
去するよう選択される。一般に、予備濾過は、ピストン
型予備フィルターを検体処理管、又は使用するその他の
容器の下に押し込んで、液体試験試料又は混合物を通し
、フィルター上に濾液を残して次の工程に可能なように
する。【００３０】標準孔サイズは、一般に、約１０〜約１５
０ミクロンの範囲である。多数の好適なフィルター、例
えば超高分子ポリエチレン深層フィルター（Ｐｏｒｅｘ
　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　　Ｃｏｒｐ．，Ｆａｉ
ｒｂｕｒｎ，ＧＡ，ＵＳＡから販売）、Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ，ＵＳＡ）
の＃９０３フィルター、Ｐａｌｌ　　Ｂｉｏｓｕｐｐｏ
ｒｔ（Ｇｌｅｎ　　Ｃｏｖｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）の親水性
ＨＤＣフィルター、及びＲｅｅｍａｙ，Ｉｎｃ．（Ｏｌ
ｄ　　Ｈｉｃｋｏｒｙ，ＴＮ，ＵＳＡ）から販売されて
いる不織ポリエステルフィルターＲｅｅｍａｙ等が市販
されている。予備濾過工程は、標識抗体試薬を液体試験
試料に添加する前か又は後に実施し得るが、前が好まし
い。【００３１】標識抗体試薬は試験混合液中のクラミジア
抗原に直接結合し、混合液をガラス繊維深層フィルター
を通過させる際に、標識試薬それ自体から分離可能とな
る標識化免疫複合体を形成する。本方法の簡易性及び容
易性に原則的に関与するのがこの相互作用である。標識
試薬を、これらの作用に留意して調製する。【００３２】本試薬は、処理試料中の多価クラミジア抗
原と共に形成される高分子免疫網状複合体を増やすため
に、多数の抗原結合部位を含むのが好ましいが、Ｆａｂ
のような一価の抗体断片も使用出来ることが示されてい
る。例えば、抗体又は抗体断片の重合又は凝集、例えば
合成又は天然ポリマー主鎖の担体分子と多価抗体又は抗
体断片との結合、あるいは例えば酵素などの標識が本目
的に適している場合はその標識又は多重標識との結合と
いった、標識抗体試薬の原子価の増加に関する種々の方
法が明らかになる。【００３３】抗体又は抗体断片を互いに、あるいは酵素
標識に、又は担体に結合するための合成方法は、当業界
で十分公知であって、繰り返し述べる必要はない。例え
ば、Ｉｓｈｉｋａｗａ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．ｏｆ　
　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　４（３）：２０９〜３２
７（１９８３）を参照するとよい。【００３４】本発明の研究過程で、酵素標識複合体を準
備する特に有益な方法が開発された。この好ましいアプ
ローチは、予備重合酵素の三量体を生じ、酵素がアルカ
リホスファターゼである場合に特に有益である。三量体
は、炭水化物架橋剤、例えばアジピン酸ジヒドラジドの
ようなジヒドラジドの存在下で酵素を反応させることに
よって生成される。反応物の量、並びに反応時間及び条
件を制御することにより、未反応成分、並びに二量体、
四量体、及びその他の重合形態の酵素から、ゲル濾過に
よって明らかに分離される三量体が生成される。【００３５】抗体又は抗体断片が結合するように、この
限定され、実質的に純粋な成分は、ホモ又はヘテロの二
重機能性試薬でさらに修飾される。酵素の糖部分で重合
化する三量体アルカリホスファターゼは、特に安定で、
大量に調製保存ができる。【００３６】標識抗体試薬の抗体成分の調製は、本分野
の普通の研究者が容易に成し得る。本明細書で用いる場
合、抗体及び抗体試薬という用語は、抗体結合部位を含
む任意の、しかしながら生成される物質を含むよう意図
される。このような用語の意図した意味においては、全
てのイムノグロブリン、並びにその適当な断片又は多機
能形態が含まれる。全イムノグロブリンの形態において
は、それは、ＩｇＧ、ＩｇＭ等のような任意の公知の種
及び亜種に属する。【００３７】機能性抗体結合部位を保持する任意のこの
ようなイムノグロブリンの任意の断片には、例えばＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２　として慣用的に公
知のＩｇＧの断片を用いてもよい。さらに、適当であれ
ば、イムノグロブリン又はその断片の凝集体、重合体、
誘導体、複合体、及びハイブリッドを用いてもよい。【００３８】抗体試薬のイムノグロブリン供給源は、任
意の有用な技法によって得られる。最も一般的には、こ
のような技法は、慣用的なポリクローン抗血清産生又は
モノクローン抗体法である（最近開発された組み合わせ
発現ライブラリアプローチも用いられるーＳｃｉｅｎｃ
ｅ（１９８９年１２月８日）ｐｐ．１２７５〜８１）。【００３９】宿主動物において所望のクラミジア抗原に
対する抗体を産生するように免疫原を用いる場合、この
ような免疫原は、全、無傷、処理（例えば変性、還元、
酸化等）又は未処理のクラミジアＥＢ又はＲＢ；このよ
うな細胞を破壊又は溶解して得られる混合液、又は精製
分画、又はそこからの物質、例えば大型外膜蛋白質又は
ＬＰＳ；クラミジアに特異的なエピトープを含有する、
合成的に調製されるペプチド、ポリペプチド、炭水化物
、糖ペプチド、リポペプチド等；並びに当業界で公知の
ものであり得る。この方法で得られる抗血清は、標識抗
体複合体の調製に直接用い得るか、又はさらに処理及び
、適当なリガンド、例えば問題のクラミジアエピトープ
を模倣した又は類似の合成ペプチドによるアフィニティ
ー精製のような精製を施される。【００４０】モノクローン法を用いてもよい。例えば、
マウスを上記のような免疫原で免疫する。クラミジアに
対する特異的な抗体の産生に関して任意に予備スクリー
ニングした免疫マウスから取り出したリンパ球を、次に
慣用条件下でネズミ科の骨髄腫細胞と融合し、その結果
生じたハイブリドーマを、必要とする特異性、親和性等
を有する抗体の分泌に関してスクリーニングする。【００４１】任意の有用な種類のイムノアッセイ標識を
本発明に用い得る。一般的に用いられるのは、酵素、蛍
光剤、染料（フィコビリ蛋白質のような）、染料凝集体
（金属ゾル、染料重合体、着色ラテックス等のような）
、化学ルミネッサー等である。酵素は、保持免疫複合体
の高感度検出を提供するのに特に有用であって、その例
としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
及びアルカリホスファターゼが挙げられるが、アルカリ
ホスファターゼが一般に好ましい。特に有用な標識複合
体は、多重抗体又は抗体断片と結合した多重酵素分子の
コアを含む。【００４２】概して、標識抗体試薬の相対的分子サイズ
及び正味電荷（標準ゲル電気泳動法を用いて測定される
）は、深層フィルターを通過させることによって結合し
た試薬と非結合の試薬を分離する場合に有意であること
が判明している。標識試薬の相対的サイズの選択におけ
る臨界性は、検出されるクラミジア抗原の選択、分離フ
ィルターの特性、試験混合液に及ぼす任意の予備濾過工
程の効果、及びその他の因子に依っていることは明らか
である。一方、一般に標識抗体試薬の相対的分子サイズ
は操作上約２００キロダルトン（ｋｄ）〜約３０００ｋ
ｄである必要があることが判明しているが、一般に好ま
しいのは約４００ｋｄ〜１５００ｋｄである。約１００
０ｋｄの複合体が特に有用であることが判明している。【００４３】標識抗体試薬と露出抗原のインキュベーシ
ョンの時間は、抗体試薬の相対的親和性、標識複合体の
サイズ及び原子価、並びに本試験のユーザーの要求又は
要望によって、広範に変化し得る。一般に、最大結合率
の半分が約３０分以内に達成され得るので、したがって
、１５〜２０分の範囲のインキュベーション時間で適当
な感度が得られる。本方法は最小の手作業工程を要する
ため、全体の検定時間は約２５分より短く、約１５分以
下の場合さえある。【００４４】分離フィルターは、クラミジア抗原と標識
抗体試薬間で形成される免疫複合体を実質的に通さない
が、一方、任意の有意量の非結合の標識試薬を保持しな
いように選択される。非結合の標識試薬は、試験試料中
のクラミジアの存在とは無関係な、望ましくないバック
グラウンドを構成するが、試薬、検定プロトコール、及
び分離フィルターの適切な選択によって受容可能な限界
以下に保たれる。【００４５】分離の機序は一般に重要ではないが、しか
し原則的に、分離は濾過の結果であると、即ち免疫複合
体のフィルター通過に対する物理的遮断であるとみなさ
れる。イオン性、疎水性、水素結合、又はその他の吸着
現象を含む他の力が同様に関与し得る。同様に、複合体
は、フィルターの表面及び／あるいは孔又は内部構造内
に保持され得る。決定的な正味の結果は、フィルターが
複合体を通さないことである。【００４６】実際上、ガラス繊維深層フィルターが最も
適していることが判明している。慣用的膜フィルターは
、一般に受容不可能なほど遅い流速を生じた。有用なガ
ラス繊維フィルターは、硼珪酸塩又は石英から成る、発
火又は非発火型のものを含む。【００４７】特定の例としては、ＤＢＳ　　Ｗｈａｔｍ
ａｎシリーズのガラス繊維フィルターからの１−ｐｌｙ
　　深層フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ　　Ｐａｐｅｒ　
　Ｌｔｄ．，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）がある。さらに、有用な
のは、Ｗｈａｔｍａｎ　　ＰＤ００８シリーズの、強化
剤としてポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するガ
ラスフィルター、並びに２−ｐｌｙＷｈａｔｍａｎフィ
ルター、例えばＰＤ００８−８Ｂ、ＧＤ１及びＧＤ２で
ある。ＧＣ−５０、ＧＢ１００、ＧＤ−１２０及びＱＲ
１００の名称でＭｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　　Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｕｂｒｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ
から販売されているガラス及び石英フィルターも有用で
あることが判明している。【００４８】上記のように、分離フィルターの多孔度の
臨界性は、概して、本検定のその他のパラメーターに依
っている一方、一般に約１〜約５ミクロンの範囲の多孔
度が好ましいことが判明しているが、しかしさらに好ま
しい選択範囲は、約１．５〜約３ミクロンである（特に
有用なのは約１．６〜２ミクロンである）。【００４９】試験混合液が分離フィルターを通過後、フ
ィルターを洗浄して任意の有意量の非結合の標識試薬を
除去する。好適な洗浄液の組成は、当業界で十分公知で
ある。一般的に、洗浄液は、保持免疫複合体と相溶性の
、特にそれに伴う標識と相溶性の緩衝液を含有する。緩衝液のｐＨは、これらを考慮して選択される。概して
、免疫複合体の保持を増加するにはアルカリ性ｐＨが望
ましいが、一方、ｐＨがわずかに酸性であるとバックグ
ラウンドが減少することが判明している。【００５０】緩衝液は、同様に塩、洗剤、安定剤等のよ
うなその他の成分を含有し得る。洗剤は、特に、酵素標
識の安定化において重要であり、例えばトリトンＸ−１
００（０．１％）は、アルカリホスファターゼ標識の場
合に、有意にバックグラウンドを減少することが判明し
ている。さらに、血液検体の使用に関して特に有用な洗
浄緩衝液は０．５Ｍ　　ＮａＣｌ、０．１Ｍ　　ＴＲＩ
Ｓ（ｐＨ６〜７）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１０
０である。【００５１】試験混合液がフィルターを通過し、フィル
ターを洗浄した後の、本方法の最終重要工程は、フィル
ターに保持された標識の検出である。これは選択される
標識の種類によって施される。酵素標識の好ましい場合
においては、検出工程は、フィルターに発色基質（酵素
によって作用して明確な発色物質を生成するもの）のよ
うな好適な基質を添加することを含む。【００５２】さらに、フィルター内又はフィルター上で
固定される物質を生成する発色基質は、検定の感度及び
読み取りやすさを増強する特に濃い色を提供する。その
例としては、公知のアルカリホスファターゼ発色基質が
挙げられるが、この物質は水不溶であり、したがって酵
素標識との反応時にフィルター上及び内に沈殿する。こ
れらは、当業者内のパラメータである。【００５３】本発明はさらに、ハーフサンドイッチ法を
実施するための試験キット及び試験具を提供する。これ
らは、（ａ）試料処理管又はその他の容器内に任意に含
有される試料処理剤、（ｂ）標識抗体試薬、及び（ｃ）
分離フィルターを含有する。試験キットの任意の成分と
しては、予備フィルター用具、洗浄液、及び基質液（酵
素標識の場合）が挙げられる。本方法を実施するための
このような手段は、別々の好適な容器中に試料処理剤及
び標識抗体を含む。分離フィルターは、好ましくは単一
又は多重検定を実施するための処理具又は装置の一部と
して成形されるが、これは取扱い、特に液体をフィルタ
ーにかけ、通過させることを容易にする。【００５４】相対的に未熟練者による試験の実施のため
に特に意図される好ましい態様においては、分離フィル
ターを試験試料、洗浄液及び現像液をかけるためにフィ
ルターの適当な円形又はその他の形の領域を露出した小
型自立プラスチック用具内に収容する。好ましくは、本
用具はさらに、分離フィルターを通過してその機能を実
行した後に、このような液体の流動及び収納を促すため
に、下方に、しかしフィルターと接触する液流中に封入
される吸着剤溜めを収容する。このような用具は、一般
に十分公知である（例えば、米国特許第４，６２３，４
６１号、第４，６３２，９０１号、第４，６９３，８３
４号、４，７２７，０１９号、及び第４，８１８，６７
７号を参照）。【００５５】本発明に適用し得るきわだって独創的な器
具を図に示す。図１〜３に示すように、試験用具（１０
）は基台部（１１）と、取外し式ろうとエレメント（１
２）からなる。基台部（１１）は、吸収ブロック（１４
）（たとえば米国バージニア州リッチモンドのＡｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｆｉｌｔｒｏｎａ　社から購入できるＴｒａ
ｎｓｏｒｂという商標名の蓄水剤のような高吸水性材料
の成型品、およびガラス繊維フィルター（１５）（たと
えば、英国ケント州のＷｈａｔｍａｎ　Ｐａｐｅｒ　社
から購入できるＰＤ−００８　　１２Ｂ１００を切った
もの）の双方を収納する空腔（１３）を有する。キャッ
プ（１６）は、内側にみぞをつけて型成形され、基台部
（１１）上の突起（１７）上にスナップフィットする（
ぱちんと嵌る）ようになっており、内壁（１９）の底縁
によって形づけられる円形開口部（１８）を有する。吸
収剤ブロック（１４）とガラス繊維フィルター（１５）
を組合わせた高さは、スナップフィットするキャップ（
１６）中の内壁（１９）の底縁によって、それらが正し
い位置にしっかりと保持されるよう、十分な寸法である
。キャップ（１６）中の内壁（１９）の底縁に取付けら
れて開口部（１８）を直径方向に横切って伸びているの
はコントロール試薬を包含した糸素子（２０）である。結果として、キャップ（１６）が基台部（１１）にぱち
りと嵌まると、糸状素子（２０）は蓋の開口部（１８）
中に露出しているガラス繊維フィルター（１５）の表面
と物理的に接触した状態に保持される。図５は、取外し
式ろうと（１２）を取り外した状態の、器具（１０）の
上面図である。キャップの開口部（１８）に露出してい
るガラス繊維フィルターの表面（５０）上を横切って糸
状素子（２０）が見える。【００５６】図３及び図４に示すように、ろうとエレメ
ント（１２）の底板（２１）は十字又はプラスの印（＋
）の形状をしている開口部（２２）を有する。さらに、
ろうとエレメント（１２）をキャップ（１６）に挿入し
た場合にしっかり定位置に保持されるよう、ろうとエレ
メント（１２）は環状フランジ（２３）及びペグ（２４
）を有する。ペグ（２４）はまた、ろうとエレメントが
キャップ（１６）にはまった時に、十字形開口部（２２
）のクロスしているすじの１つが、キャップの開口部（
１８）中に露出しているガラス繊維フィルター（１５）
の表面を横切って伸びているコントロール糸（２０）と
、ぴったり重なるように、方向決めするような働きをす
る。【００５７】クラミジア検出分析法での試験器具（１０
）の好ましい使用方法は次のように説明される。器具（
１０）とは別に、子宮頸管部綿球及び尿道部綿球のよう
な検体を検体処理液に浸け、もしも検体中にクラミジア
抗原がある場合には、この抗原を放出し、かつ露出させ
る。綿球を取除き、検体がクラミジア陽性である場合に
は多価のクラミジア抗原を含有している液体混合物を残
す。酵素標識した抗体試薬を液体混合物に加えて、好適
な時間、たとえば２０分間、クラミジア抗体との免疫複
合体の形成がなされるようにインキュベートする。液体
試験混合物を、次いで、場合によっては予備ろ過の後に
、組み立てた試験具（１０）のろうとエレメント（１２
）中に注いで、コントロール糸（２０）と接触させつつ
十字型開口部（２２）に流して通し、ガラス繊維フィル
ター（１５）を通過させ吸収剤ブロック（１４）へと注
ぐ。【００５８】結果として、標識された免疫複合体は、ガ
ラス繊維フィルター（１５）の露出表面上の十時型のパ
ターンで、ガラス繊維フィルターによって保持される。次いで、フィルター（１５）の露出面を洗浄し、結合し
ていない標識抗体および存在している可能性のある妨害
物質を、吸収剤ブロック（１４）へ送るために、洗浄液
を試験具へと注ぐ。最後に適当な基質／色原体指示薬溶
液を試験器具に注ぎ、その結果、糸コントロール素子上
に色が生じて（もし試験工程が正しく実施されかつ試薬
が機能しているなら）、そして陽性の検体である場合に
は、露出したフィルターの表面上に十字つまりプラス印
で色が生じる。【００５９】図６（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）は、キャップの開
口部（１８）の内部に見える露出表面（５０）の上に現
れる、起りうる試験結果を説明したものである。図６（
Ａ）はクラミジア陽性の検体に対する検査の結果の露出
試験表面の状態を示すものである。ろうとエレメントに
よって試験面上に露出された十字型部分（６０）は、コ
ントロール糸（２０）と同様に、発色する（ハッチング
によって表示）。図６（Ｂ）は本当に偽の検体の分析結
果である露出試験面の状態を示したものである。試験面
の露出した表面上には何ら色の応答が現れていないが、
しかしコントロール糸（２０）は発色しており、試験方
法が正しく行なわれ、かつ試薬類が機能的であったこと
を示した。最後に、図６（Ｃ）は誤って操作されたかま
たは機能しない試薬を用いた場合の分析の結果の露出試
験面の状態を示したものである。フィルターの露出面上
にも、コントロール糸素子上にも、偽のマイナスの結果
を示す発色したパターンはあらわれなかった。このよう
な試験結果は分析のやりなおしを必要とする。【００６０】以下の実施例により本発明をさらに説明す
るが、本発明はこれらに限定されない。【００６１】【実施例】Ａ．標識抗体試薬の調製（１）２２アミノ酸ペプチド−セファロース４Ｂアフィ
ニティー担体クラミジアの血液型亜型−特異性エピトー
プ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，ｅｔ　　ａｌ．，”Ａ　　Ｓｐ
ｅｃｉｅｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　　Ｍａｊｏｒ　　Ｏｕ
ｔｅｒ　　ＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎ　　Ｄｏｍ
ａｉｎ，”ｉｎ　　ＣｈｌａｍｙｄｉａＩｎｆｅｃｔｉ
ｏｎｓ，Ｏｒｉｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ　　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｇｒｅａｔ　　Ｂｒｉｔａｉｎ　　１９８６，ｐｐ
．１１０−１１３）を結合するヤギポリクローン抗体の
精製のために用いるアフィニティー担体を、以下の操作
によって調製した。【００６２】４グラムのＡＨ−セファロース（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を
５０ｍＬの０．５Ｍ塩化ナトリウム中で膨張させ、２０
０ｍＬの同塩化ナトリウムで洗浄し、次に０．１５Ｍ塩
化ナトリウム及び１．０ｍＭＥＤＴＡ（ＰＢＳ　　ＥＤ
ＴＡ）を含有する２００ｍＬの０．１Ｍ燐酸ナトリウム
，ｐＨ７．０で洗浄した。樹脂を２５ｍＬのＰＢＳ　　
ＥＤＴＡに溶解した１２０μｍｏｌのスルホスクシンイ
ミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ；Ｐｉｅｒｃ
ｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で活性化した。周囲温度で２時間振盪後、マレイミド活性化樹脂を３０
０ｍＬのＰＢＳ　　ＥＤＴＡで洗浄し、１６ｍＬのＰＢ
Ｓ　　ＥＤＴＡに再懸濁した。【００６３】次に樹脂をＳｔｅｐｈｅｎｓ　　ｅｔ　　
ａｌ．，（１９８６）が記載した、システインを有する
カルボキシル末端で終結する６スペーサー残基を有する
ペプチド−特異性エピトープを含有する１９．８ｍｇの
２２個のアミノ酸ペプチドと反応させた（ＯＣＳ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｔｏｎ，Ｔ
Ｘ，ＵＳＡ）。反応は、周囲温度で継続的に攪拌しなが
ら、一晩実施した。ペプチド−セファロースを０．１％
Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ　　ＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有する３
００ｍＬのＰＢＳ　　ＥＤＴＡで洗浄し、未反応ペプチ
ドを除去した。次に樹脂を３０ｍＬの６Ｍグアニジン　
　ＨＣｌ，ｐＨ５．５中に再懸濁し、４℃で保存した。【００６４】（２）クラミジアに対するヤギ抗体の精製
抗血清は、ＵＶ−不活性化基本体で免疫したヤギから得
られた。清澄化後、周囲温度で２時間、３３％硫酸アン
モニウム飽和溶液での沈殿によって、ＩｇＧを単離した
。沈殿物を集めて、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有す
る０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ），ｐＨ７．
０中に再溶解した。【００６５】次に、ＩｇＧを５０容積のＰＢＳに透析し
、透析緩衝液を２回取り替えた。０．８ミクロンのＡｃ
ｒｏｄｉｓｃフィルター（Ｇｅｌｍａｎ　　Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ　　Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳ
Ａ）を通して濾過してＩｇＧを清澄化後、１８ｍＬ　　
ＰＢＳに溶解した４７５ｍｇを、周囲温度でＰＢＳで平
衡させた６ｍＬペプチド−セファロースカラム（上記（
１）に記載）にかけた。本工程及び次の工程中、１８０
ｎｍでの吸光度をモニタリングした。【００６６】ＰＢＳで洗浄後、ペプチド−特異性ＩｇＧ
を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．０、０．１Ｍグ
リシン，ｐＨ３．０、及び６Ｍ　　グアニジン　　ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．０で順次、溶出した。１Ｍ　　Ｂｉｃｉｎ
ｅ，ｐＨ８．３で反応液を中和した。収率を表１に要約
する。【００６７】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表１　　　　　　　　　　分画　　
　　　　　　　　　　　　　　ＩｇＧ（ｍｇ）　　　　
　　　　　　収率　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ｐＨ　　４　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　９．６　　　　　　　　　　　　２．３
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｐＨ　　３
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．２　　　
　　　　　　　　　２．４　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　グアニジン　　ＨＣｌ　　　　　　　　
　　２．３　　　　　　　　　　　　０．５　　　　　
　　　　　【００６８】（３）抗体−アルカリホスファ
ターゼ複合体の調製ウシ粘膜アルカリホスファターゼ（Ｓｃｒｉｐｐｓ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　　Ｓａｎ　　Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ，ＵＳＡ）を、以下のようにチオール化した：５
．５ｍｇを、０．４Ｍトリエタノールアミン，ｐＨ８．
０及び０．１ＭＥＤＴＡを含有する緩衝液１．０ｍＬに
溶解した１．９６μｍｏｌの２−イミノチオラン（Ｐｉ
ｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）と反応さ
せた。【００６９】周囲温度で１時間後、反応混合液を、ＰＢ
Ｓで平衡させた新鮮な２８ｍＬ　　Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　　
Ｐ−６ＤＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ
，ＵＳＡ）カラムにかけた。チオール化酵素はボイド容
量（５．５ｍＬ）で溶出した。チオール数は、１酵素当
たり１７．４モルであると測定された。次にチオールを
、１．４ＳＨ基／酵素のみが残るまで室温（４．３時間
）で酸化させた。この時点で、チオール化及び重合化ア
ルカリホスファターゼを、酵素重合工程中にマレイミド
で修飾されたアフィニティー−精製ＩｇＧと結合した。【００７０】要するに、５．０４ｍｇのＩｇＧ（３％蛍
光化ＩｇＧを含む）を、０．９３ｍＬのＰＢＳ中で３７
８ｎｍｏｌｅのスルホ−ＳＭＣＣと反応させた。室温で
１．０時間後、反応体を同様のＢｉｏ−Ｇｅｌ　　Ｐ−
６ＤＧカラムで分離した。マレイミド化ＩｇＧはボイド
容量で溶出し、上記のように重合化酵素と混合された。【００７１】重合化酵素とマレイミド化ＩｇＧを、撹拌
しながら５℃で一晩、反応させた。２ｍＭ　　Ｎ−エチ
ルマレイミド（Ｐｉｅｒｃｅ）で未反応チオールをキャ
ッピング後、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ塩化マ
グネシウム、０．２ｍＭ塩化亜鉛及び０．０５％アジ化
ナトリウムを含有する０．１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
６．９）で平衡させた４１５ｍＬＢｉｏ−Ｇｅｌ　　Ａ
−１．５（２．５Ｘ８４ｃｍ）カラムに結合反応液を用
いた。【００７２】結合体を、同一緩衝液で、１時間当たり３
０ｍＬで溶出した。分画を、５１２ｎｍでの蛍光（４９
２ｎｍで励起）、及びアルカリホスファターゼ活性に関
して検定した。ピーク分画をプールし、５ｍｇ／ｍＬの
トリトンＸ−１００（Ｍａｌｌｉｍｃｋｒｏｄｔ，Ｐａ
ｒｉｓ，ＫＹ，ＵＳＡ）及び無プロテアーゼ　　ウシ血
清アルブミン（Ｍｉｌｅｓ　　Ｉｎｃ．，Ｋａｎｋａｋ
ｅｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を補充した。結合体を０．２ミク
ロンＡｃｒｏｄｉｓｃで濾過し、０．５μｇ／ｍＬロイ
ペプチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｎ
，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を加えた
。抗体：酵素の比は、１．７：１．０であった。【００７３】（４）抗体−アルカリホスファターゼ複合
体の好ましい合成抗体−酵素複合体を合成するための本方法は、重合工程
中に生じ得る副反応を回避するので、その結果、合成は
より再現性が高い。さらに、複合体はまた、検体中に見
いだされ得る、あるいは検体処理を促進し且つクラミジ
ア菌及びそのエピトープを露出するための抽出緩衝液中
に含まれる物質に対する感受性が低い。【００７４】酵素を重合化する前に、微量のグリセロー
ルをすべて除去するために、それを広範に透析しなけれ
ばならない。最終的には、１．０ｍＬ中の１７ｍｇのア
ルカリホスファターゼを、５℃で、０．１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含有する２５０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム，
ｐＨ５．５に対して透析した。緩衝液は３回取り替えた
。【００７５】次に、透析酵素を暗所で氷中で３０分間、
６．７ｍｇのナトリウムメタ−ペリオデートで酸化した
。その後、１５分間、０．１ｍＬのグリセロールと反応
させることによって反応を停止した。以前と同様にペル
オキシ化酵素を透析後、アルカリホスファターゼ１モル
当たり２．８モルのアジピン酸ジヒドラジド（Ａｌｄｒ
ｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）で重合し
た。【００７６】４℃で一晩反応後、反応混合液を０．１Ｍ
燐酸ナトリウム，ｐＨ７．０及び０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムで予め平衡させた１．５ｘ１１０ｃｍ　　Ｂｉｏ−Ｇ
ｅｌＡ−０．５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムにかけた。カ
ラムは、５℃で１時間当たり３０ｍＬで操作した。２ｍ
Ｌづつ画分を収集した。活性重合化画分は、＃３４でピ
ークであった。非重合化酵素は分画＃５０においてわず
かにピークを示した。重合化酵素を集め、濃縮して、冷
蔵保存した。相対ＭＷは約４２０，０００であり、した
がって、天然酵素の三量体である。【００７７】三量体化アルカリホスファターゼ（２．７
ｍｇ）を、０．５Ｍトリエタノールアミン，ｐＨ８．０
中０．４０ｍＬの酵素に対して９７μＬのジメチルホル
ムアミド中に投入した５０倍モル過剰のＮ−スルホスク
シンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエー
ト（スルホ−ＳＩＡＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。反応は、周囲温度で１．２５時間実施した。修飾酵素を
、０．０５Ｍ燐酸カリウム，ｐＨ７．３及び０．１５Ｍ
塩化ナトリウムで平衡させた小型の１．０ｘ２２ｃｍ　
　Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　　Ｐ−６ＤＧカラム上で未反応スル
ホ−ＳＩＡＢから分離した。次いで、Ｃｅｎｔｒｉｃｏ
ｎＴＭ３０マイクロ濃縮木Ａｍｉｃｏｎ）で１ｍＬ未満
まで濃縮した。酵素は使用するまで氷上に置いた。【００７８】アフィニティー精製ヤギ抗体（４ｍｇ）を
３％蛍光化ＩｇＧと混合し、０．１Ｍ燐酸塩、０．１５
Ｍ　　ＮａＣｌ，ｐＨ７．３；０．２０Ｍトリエタノー
ルアミン，ｐＨ８．０；２ｍＭ　　ＥＤＴＡ、及び５０
〜１００倍モル過剰に付加されたジチオトリエトールを
含有する１．０ｍＬ反応液中の２−イミノチオランの５
０〜１００倍モル過剰量でチオール化した。周囲温度で
１時間後、チオール化抗体を０．０５Ｍ燐酸カリウム，
ｐＨ７．３、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、及び１ｍＭ　
　ＥＤＴＡを含有する緩衝液で平衡させた新鮮な１．５
ｘ２２ｃｍＢｉｏ−Ｇｅｌ　　Ｐ−６ＤＧカラム上で脱
塩した。同緩衝液で溶出後、チオール化抗体をＣｅｎｔｒｉｃｏ
ｎ濃縮器中で１．０ｍＬに濃縮した。【００７９】ヨードアセチル化アルカリホスファターゼ
三量体（１．０ｍＬ中に２．７ｍｇ）を、３．０ｍｇ（
１．０ｍＬ）のチオール化抗体を反応させた。反応液は
さらに、１００μＬの０．５Ｍトリエタノールアミン，
ｐＨ８；並びに０．３Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化
マグネシウム、及び０．４ｍＭ塩化亜鉛を含有する１０
０μＬ混合液を含んだ。ＥＤＴＡの最終濃度は０．５ｍ
Ｍであった。反応は、周囲温度で攪拌しながら３０分実
施し、その後、（３）に記載した同緩衝液を用いて５℃
で一晩行なった。流速は１時間当たり３１ｍＬであった
。分画当たり２０滴を集めた。分画を蛍光及び酵素活性
に関して測定し、２つのプール中に合わせた。トリトン
Ｘ−１００及びウシ血清アルブミンを、１ｍＬ当たり５
ｍｇで、各プールに加えた。次いで、複合体を０．２２
μ　　Ａｃｒｏｄｉｓｃで濾過し、特性化した。ＩｇＧ
：アルカリ性ホスファターゼの比率は、１．８である。【００８０】Ｂ．クラミジアイムノアッセイの実施Ｐｅ
ｒｃｏｌｌ精製クラミジア基本体（ＥＢ）の標準製剤を
、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ及び５ｍｇ／ｍＬウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含有する１００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で順次希釈した。各希釈液の２
０マイクロリットルを０．５％トリトンＸ−１００、０
．５％　　ｎ−ラウリルサルコシン、０．５Ｍ　　Ｎａ
Ｃｌ及び５ｍｇ／ｍＬ　　ＢＳＡを含有する１００ｍＭ
　　トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）から成る４０
０μＬの検体処理緩衝液に加えた。その後直ちに、上記
Ａ．で調製したように（１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、２０
０μＭ　　ＺｎＣｌ２　、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、
及び５ｍｇ／ｍＬ　　ＢＳＡを含有する１００ｍＭ　　
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．９）中）、５０μＬのポリ
クローン抗体／アルカリホスファターゼ複合体を加えた
。その混合液を室温で２０分間インキュベートした。【００８１】この時間中、検定用具は上記本文中に記載
されているように組み立てた。それらはＷｈａｔｍａｎ
　　ＰＤ−００８　　１２Ｂ　　１００ガラス繊維フィ
ルター、クッションとしてのＳ＆Ｓ　　＃２４フィルタ
ー、及びＴｒａｎｓｏｒｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｆｉ
ｌｔｒｏｎａ）液溜めを含有した。【００８２】インキュベーション時間終了時に、反応混
合液を漏斗機素から注ぎ出した。漏斗機素を取り外し、
反応フィルターを、０．５Ｍ　　ＮａＣｌ及び０．１％
トリトンＸ−１００を含有する１ｍＬの１００ｍＭ　　
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で洗浄した。最後に、５０μ
Ｌの基質（７５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　を含有する１５０
ｍＭビス−トリス　　プロパン（ｐＨ９．８）に溶解し
た５ｍＭ　　５−ブロモ−４−クロロインドイルホスフ
ェート（ＢＣＩＰ））を反応に使用した。５分後、反応
フィルター上の青十字の存否を肉眼で調べた。【００８３】比較のために、各希釈液の２０μＬアリコ
ートも、Ｓｙｖａ　　ＭｉｃｒｏＴｒａｃｋ　　スライ
ド（Ｓｙｖａ　　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐａｌｏ　　Ａｌｔ
ｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に使用した。スライドを乾燥し、残
りの操作を標準Ｓｙｖａ　　プロトコールに従って実施
した。さらに、別の組の２０μＬアリコートをＡｂｂｏ
ｔｔＴｅｓｔＰａｃｋ　　クラミジア検定キット（Ａｂ
ｂｏｔｔ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　　Ｎｏｒｔ
ｈ　　Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）で操作した。予
備濾過工程を省いた以外は、メーカーの使用説明書に従
った。蛋白質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ　　ＢＣＡ蛋白質検
定キット（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ
．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて測定し
た。その結果を表２に示す。【００８４】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表２ＥＢ蛋白質　　　　　　　　　
　０　　　　　　　　　１．２５　　　　　　２．５　
　　　　　　５　　　　　　　　　１０　　　　　　　
２０　（ｎｇ／検定）　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓｙｖａ　Ｍｉ
ｃｒｏＴｒａｃｋ　　　　　０　　　　　　　　　１．
６　　　　　　　１．４　　　　　　　４．４　　　　
　　　７．２　　　　　ＮＤ２　（ＥＢ／視野）　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　Ａｂｂｏｔｔ　ＴｅｓｔＰａｃｋ　　　　　
−　　　　　　　　ＮＤ　　　　　　−　　　　　　　
　＋　　　　　　　　＋　　　　　　　　＋　　クラミ
ジア　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ハーフサンドイッチ　　−　
　　　　　　　−　　　　　　　　＋　　　　　　　　
＋　　　　　　　　＋　　　　　　　　＋　　　　検定
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１　　Ｓｙｖａ結果は、
１０視野に亘って計数されたＥＢの平均数である。２　　ＮＤ：　　測定しなかった＋：　　　　陽性試験結果 −：　　　　陰性試験結果＋：　　　　中間物質、擬陽性試験結果【００８５】本
発明は、特に上記し、例示した。本発明の精神及び範囲
を逸脱しない限りにおいて、他の多数の変更及び修正を
なし得ることは明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の試験キットの等角投影図である。

【図２】本発明の試験キットの分解図である。

【図３】本発明の試験キットの断面図である。

【図４】本発明の試験キットの平面図である。

【図５】取外し式ろうとエレメントを取り外した状態の
本発明の試験キットの平面図である。

【図６】本発明の試験キットを用いて行なった試験にお
いて、キャップ開口部の露出表面上に現われうる異なる
試験応答を示すものである。（Ａ）陽性の検体の試験結果を示す。（Ｂ）真に偽の検体の試験結果を示す。（Ｃ）誤操作又は機能しない試薬を用いた場合の試験結
果を示す。

【符号の説明】

１０…本発明の試験キット１１…基台部１２…取外し式ろうとエレメント１３…収納空腔１４…吸収剤ブロック１５…ガラス繊維フィルター１６…キャップ１８…キャップ開口部２０…糸状素子２２…十字状の開口部５０…露出面６０…ろうとエレメントにより、試験面上に露出された
十字型

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　試験試料中のクラミジア・トラコマテ
ィス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ　
）の存在を検出する方法であって、次の：（ａ）上記試験試料を処理して露出多価クラミジア・ト
ラコマティス抗原を含有する試験混合液を生成する工程
、（ｂ）この露出多価　　クラミジア・トラコマティス
　　抗原を、上記クラミジア・トラコマティス抗原に反
応して免疫複合体を形成する、検出可能な標識がされた
抗体試薬と接触させる工程、（ｃ）その結果生じた試験
混合液を、上記免疫複合体は実質的に通さないが、この
ような免疫複合体内に結合していない、有意な量の標識
抗体試薬は保持しないガラス繊維深層フィルターに通す
工程、（ｄ）工程（ｃ）の終了後、その上に存在する実
質的にすべての非結合の標識抗体試薬を除去するのに有
効な洗浄液を、このガラス繊維フィルターに通す工程、
及び（ｅ）フィルターに保持された標識を検出する工程
、を含む方法。
【請求項２】　　試験試料がヒト細胞を包含する臨床検
体であり、且つ、このような臨床検体を処理して試料中
のヒト細胞を十分破裂させてそこからクラミジア・トラ
コマティスを遊離せしめ、このような遊離クラミジア・
トラコマティスの細胞質膜を破壊して多価抗原を露出せ
しめる請求項１記載の方法。
【請求項３】　　臨床試験試料が泌尿生殖器系検体であ
る請求項２記載の方法。
【請求項４】　　試験試料をスワブ上に採取する請求項
２記載の方法。
【請求項５】　　露出クラミジア・トラコマティス抗原
が外膜蛋白質抗原を包含し、且つ、臨床検体を、約８〜
約９に緩衝化されたｐＨを有し、要すれば、還元剤、酸
化剤及び／又は洗剤を含有する検体処理液で処理する請
求項２記載の方法。
【請求項６】　　露出クラミジア・トラコマティス抗原
がリポ多糖類抗原を包含し、且つ、臨床検体を、約６．
５〜約９に緩衝されたｐＨを有し、要すれば、還元剤、
酸化剤及び／又は洗剤を含有する検体処理液で処理する
請求項２記載の方法。
【請求項７】　　工程（ａ）及び（ｂ）を単一工程とし
て併合する請求項１記載の方法。
【請求項８】　　工程（ｃ）の前に液体試験試料又は混
合液をフィルターに通して外来生の試料異物を除去し、
それによって試験媒質を予備濾過する請求項１記載の方
法。
【請求項９】　　予備濾過工程を工程（ａ）と工程（ｂ
）の間で実施する請求項８記載の方法。
【請求項１０】　　ガラス繊維深層フィルターが約１〜
約５ミクロンの多孔度を有する請求項１記載の方法。
【請求項１１】　　ガラス繊維深層フィルターが約１．
５〜約３．０ミクロンの多孔度を有する請求項１記載の
方法。
【請求項１２】　　工程（ｂ）から生じる試験混合液を
、上記ガラス繊維深層フィルターを包含し、その一側が
混合液を受け入れるために露出され、他側が吸収性の受
け材に液流接触し、それによって上記混合液がフィルタ
ーを通り流して上記吸収性物質に吸収される試験具に添
加することによって工程（ｃ）が成し遂げられる請求項
１記載の方法。
【請求項１３】　　標識抗体試薬が多価である請求項１
記載の方法。
【請求項１４】　　標識が酵素である請求項１記載の方
法。
【請求項１５】　　標識抗体試薬が、一つ又はそれ以上
のＩｇＧ抗体又はその断片に化学的に結合した一つ又は
それ以上の酵素を包含し、且つ約２００〜約３０００キ
ロダルトンの総相対分子量を有する請求項１４記載の方
法。
【請求項１６】　　標識抗体試薬が一つ又はそれ以上の
ＩｇＧ抗体又はその断片に化学的に結合した一つ又はそ
れ以上の酵素を包含し、且つ約４００〜約１５００キロ
ダルトンの総相対分子量を有する請求項１４記載の方法
。
【請求項１７】　　酵素がアルカリホスファターゼであ
る請求項１６記載の方法。
【請求項１８】　　酵素に対する発色基質を含有する溶
液をフィルターに通し、そしてフィルター上に生じる色
を観察することによって、フィルター上の酵素標識の存
在を検出する請求項１４記載の方法。
【請求項１９】　　試験試料中のクラミジア・トラコマ
ティスの存在を検出するための試験キットであって：（
１）多価クラミジア・トラコマティス抗原を露出できる
液体試料処理剤を保持する容器、（２）上記クラミジア
・トラコマティス抗原に結合して免疫複合体を形成する
ことができる、検出可能な標識がされた抗体試薬を保持
する容器、（３）上記標識抗体試薬と、上記試料処理剤
で処理される試験試料とを組み合わせて生じる試験混合
液を通す場合に、上記免疫複合体を実質的に通さないが
このような免疫複合体内に結合していない有意量の標識
抗体を保持しないガラス繊維深層フィルター、を含む試
験キット。
【請求項２０】　　ヒト細胞を含有する臨床検体中のク
ラミジア・トラコマティスを検出するための請求項１９
記載の試験キットであって、上記液体試料処理剤がこの
ような試料中のヒト細胞を十分破裂させてそこからクラ
ミジア・トラコマティスを遊離せしめ、遊離クラミジア
・トラコマティスの細胞質膜を破壊して多価抗原を露出
することができる試験キット。
【請求項２１】　　試料処理剤が、約６．５〜約９のｐ
Ｈを有し、要すれば、還元剤、酸化剤及び／又は洗剤を
含有する緩衝液である請求項１９記載の試験キット。
【請求項２２】　　上記試験混合液中の外部由来の試料
破片を除去できる予備フィルターをさらに含有する請求
項１９記載の試験キット。
【請求項２３】　　ガラス繊維深層フィルターが約１〜
約５ミクロンの多孔度を有する請求項１９記載の試験キ
ット。
【請求項２４】　　ガラス繊維深層フィルターが約１．
５〜約３．０ミクロンの多孔度を有する請求項１９記載
の試験キット。
【請求項２５】　　フィルターの一側が上記試験混合液
を受け入れるために露出され、他側が吸収性の受け材に
液流接触するように器具内にフィルターが収容されてい
る請求項１９記載の試験キット。
【請求項２６】　　標識抗体試薬が多価である請求項１
９記載の試験キット。
【請求項２７】　　標識が酵素である請求項１９記載の
試験キット。
【請求項２８】　　標識抗体試薬が一つ又はそれ以上の
ＩｇＧ抗体又はその断片に化学的に結合した一つ又はそ
れ以上の酵素を含有し、且つ約２００〜約３０００キロ
ダルトンの総相対分子量を有する請求項２７記載の試験
キット。
【請求項２９】　　標識抗体試薬が一つ又はそれ以上の
ＩｇＧ抗体又はその断片に化学的に結合した一つ又はそ
れ以上の酵素を含有し、且つ約４００〜約１５００キロ
ダルトンの総相対分子量を有する請求項２７記載の試験
キット。
【請求項３０】　　酵素がアルカリホスファターゼであ
る請求項２９記載の試験キット。
【請求項３１】　　上記酵素標識に対する発色基質の溶
液を保持する容器をさらに含有する請求項２７記載の試
験キット。
【請求項３２】　　洗浄液をさらに含有する請求項１９
記載の試験キット。
【請求項３３】　　抗体−酵素複合体の調製方法であっ
て、次の：（ａ）炭水化物架橋剤と反応させることによって選択さ
れた酵素を重合する工程、（ｂ）その結果生じる重合酵
素の三量体形態をゲル濾過によって分離する工程、（ｃ
）抗体又は抗体断片をこのような三量体に共有結合する
工程、（ｄ）上記三量体と抗体成分の複合体を単離する
工程を含む方法。
【請求項３４】　　酵素がアルカリホスファターゼであ
る請求項３３記載の方法。
【請求項３５】　　架橋剤がジヒドラジドである請求項
３４記載の方法。
【請求項３６】　　ジヒドラジドがアジピン酸ジヒドラ
ジドである請求項３５記載の方法。
【請求項３７】　　架橋剤がジヒドラジドである請求項
３３記載の方法。
【請求項３８】　　請求項３３記載の方法によって生成
される抗体−酵素複合体。
【請求項３９】　　請求項３４記載の方法によって生成
される抗体−酵素複合体。
【請求項４０】　　請求項３６記載の方法によって生成
される抗体−酵素複合体。