JPH04231870A - プラスミノーゲンアクチベーター、それらの阻害剤または活性化剤の検出方法 - Google Patents

プラスミノーゲンアクチベーター、それらの阻害剤または活性化剤の検出方法

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JPH04231870A
JPH04231870A JP3148202A JP14820291A JPH04231870A JP H04231870 A JPH04231870 A JP H04231870A JP 3148202 A JP3148202 A JP 3148202A JP 14820291 A JP14820291 A JP 14820291A JP H04231870 A JPH04231870 A JP H04231870A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生物学的検体中のプラス
ミノーゲンアクチベーターの、およびそれらの阻害剤（
インヒビター）および活性化剤（スティミュレーター）
の、機能活性の検出方法、およびこの方法のための試薬
に関する。
【０００２】
【従来の技術】血漿中のプラスミノーゲンアクチベータ
ー（ＰＡ）、それらの阻害剤（ＰＡＩ）または活性化剤
の機能測定はルーチン臨床診断にとってますます重要と
なってきている。このためには、数μｇ／ｌの濃度の前
記タンパク質を検出できる迅速かつ鋭敏なアッセイを開
発することが必要である。ＰＡＩおよびＰＡ活性化剤（
例えばｔＰＡに対するフィブリンモノマーおよびフィブ
リン（フィブリノーゲン）分解生成物）の場合には、血
漿検体は通常規定量のＰＡと混合しそしてその残留活性
または活性化された活性を測定する。
【０００３】アッセイ混合物に添加してあるプラスミノ
ーゲンのプラスミンへの活性化を介してＰＡ活性を測定
することにより感度を高める方法が開示されている（Ｄ
ｒａｐｉｅｒ，　Ｊ．　Ｄ．，　Ｔｅｎｕ，　Ｊ．　Ｐ
．，　Ｌｅｍａｉｒｅ，　Ｇ．，　Ｐｅｔｉｔ，　Ｊ．
　Ｆ．，　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　６１（１９７９）４６
３〜４７１）。生成プラスミンは例えば色素原基質を用
いて検出できる。Ｇｌｕ１−、Ｌｙｓ７８−プラスミノ
ーゲン、またはこれらプラスミノーゲン変異型の混合物
をこの方法に用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この方
法には血漿検体中に含まれるα２−抗プラスミンが生成
Ｇｌｕ１−またはＬｙｓ７８−プラスミンを迅速かつ非
可逆的に阻害するという重大な欠点がある。α２−抗プ
ラスミンのこの干渉作用はこの方法において希釈および
／または沈殿によって除かれるが、そのために操作は複
雑化しまた活性測定に要する時間が過度に長くなる。従
ってこの方法はルーチン診断にはほとんど適していない
。 別法として、α２−抗プラスミンは酸化によって失活さ
せることができるが、そのために付加的試薬のピペッテ
ィングが必要となる（ＤＥ　３７　２２　０８２）。さ
らに、α２−抗プラスミンの酸化失活の使用は、すべて
の必須成分の酸化に対する感受性がα２−抗プラスミン
よりも著しく低い測定方法に限られてしまう。
【０００５】従って本発明の目的は、簡易であってかつ
信頼性があり、また自動分析装置で行うこともできる、
プラスミノーゲンアクチベーター活性および阻害剤また
は活性化剤によるその変調の機能測定方法を見出すこと
にある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明により、使用ＰＡ
基質が、対応するプラスミン変異型に活性化された後、
α２−抗プラスミンによって仮に阻害されるとしてもほ
んの徐々にしか阻害されないプラスミノーゲン変異型で
ある、体液中のプラスミノーゲンアクチベーター活性お
よびその変調の機能測定方法が提供される。生成プラス
ミンまたはプラスミン変異型は好ましくは色素原基質を
用いて検出される。色素原プラスミン基質は自体当業者
に知られている（例えばＫＯＬＤＥ，　Ｈ．−Ｊ．　ｅ
ｔ　ａｌ．，　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄＨａｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ　５６（１９８６），　ｐａｇｅｓ　１
５５〜１５９参照）。
【０００７】プラスミノーゲンアクチベーター機能活性
の測定方法は自体当業者に知られている（例えばＤＥ　
３７　２２　０８２参照）。
【０００８】好ましい一方法は、生物学的材料、好まし
くは血漿を０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、特に好ましく
は０．１〜５μｍｏｌ／ｌの量のプラスミノーゲン変異
型と共に、好ましくはミニ−およびミクロ−プラスミノ
ーゲンと共に、そして色素原プラスミン基質（０．０１
〜１０μｍｏｌ／ｌ）、好ましくはＨＤ−Ｎｖａ−ＣＨ
Ａ−Ｌｙｓ−ｐＮＡまたはＨＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−ｐＮＡと共にインキュベートする方法である。ＰＡ
の阻害剤または活性化剤を測定するためにＰＡ類、例え
ばｔＰＡまたはウロキナーゼを付加的に添加することが
できる。評価は好ましくは遊離するクロモフォア（ｃｈ
ｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）の吸収媒質中で測定された吸光度
、または単位時間あたりの吸光度変化を検量線プロット
と比較することにより行われる。
【０００９】実施例に示される態様が格別に好ましい。
【００１０】本発明による方法に用いられるプラスミノ
ーゲン変異型は、対応するプラスミン変異型へ活性化さ
れた後、プラスミン活性を示し続けかつα２−抗プラス
ミンにより仮に阻害されたとしてもほんの徐々にしか阻
害されないものである。
【００１１】この関連において特に好ましい変異型はク
リングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）領域１−４が一部または完
全に存在しないものであり、また本発明方法において格
別に好ましいのはミニ−プラスミノーゲン（Ｖａｌ４４
２−プラスミノーゲン）およびミクロ−プラスミノーゲ
ン（Ｌｙｓ５３０−プラスミノーゲン）である。これら
のプラスミノーゲン変異型は自体当業者に知られた化学
的、酵素的または遺伝子工学的方法により製造できる（
例えばＢ．　Ｒ．　Ｍａｃｈｏｖｉｃｈ，　Ｗ．　Ｇ．
　Ｏｗｅｎ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８（１９
８９）４５１７〜４５２２，ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎ
ｏｇｅｎ；Ｇ．−Ｙ．　Ｓｈｉ．　Ｈ．−Ｌ．　Ｗｕ，
　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３（１９８８）
１７０７１〜１７０７５，　ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉ
ｎｏｇｅｎ参照）。
【００１２】本発明によるプラスミノーゲン変異型は自
体当業者に知られた方法によりアッセイ混合物中に直接
生成させることもできる。
【００１３】本発明によるプラスミノーゲンを用いるこ
とによりα２−抗プラスミンの濃度を低下させたり、あ
るいはそれを失活させたりすることは不必要となり、測
定方法は相当に簡素化される。プラスミンの検出方法お
よび定量方法は自体当業者に知られている。測定は好ま
しくは色素原基質例えばＨＤ−Ｎｖａ−ＣＨＡ−Ｌｙｓ
−ｐＮＡまたはＨＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ
を用いて行われる。
【００１４】測定は動態的に、あるいは終点法として行
うことができる。測定は１０〜４０℃、好ましくは２０
〜４０℃、格別に好ましくは３７℃で行うことができる
。
【００１５】従来技術（ＤＥ　３７　２２　０８２）に
比べて、本発明による方法はその簡単さおよび感度の点
で優れている（図１参照）。
【００１６】以下の実施例は本発明方法を例示するため
のものであって決して限定的なものとして解されてはな
らない。
【００１７】
【実施例】実施例　　１ ｔＰＡ活性測定におけるＬｙｓ−プラスミノーゲンおよ
びミニ−プラスミノーゲンの比較 ４５μｌの正常血漿プールを、ＨＥＰＰＳ緩衝液（５０
ｍＭ　Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′
−３−プロパンスルホン酸、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
−１００、ｐＨ８．４）中の０〜５０　ＩＵ／ｍｌ濃度
のｔＰＡ５０μｌ、および５μｌのフィブリンモノマー
（１Ｍ　ＫＢｒ中０．８ｇ／ｌ）と混合した。次いで１
００μｌのＬｙｓ−プラスミノーゲン（ＨＥＰＰＳ緩衝
液中２．３μＭ）または１００μｌのミニ−プラスミノ
ーゲン（ＨＥＰＰＳ緩衝液中１．１μＭ）および８００
μｌのプラスミン基質（ＨＥＰＰＳ緩衝液中、０．１９
ｍｍｏｌ／ｌのＨＤ−ノルバリル−シクロヘキシルアラ
ニル−リジル−ｐ−ニトロアニリド）を添加した。３７
℃で３０分間インキュベーションした後、２００μｌの
２０％酢酸で反応を止めた。遊離ｐ−ニトロアニリンの
４０５ｎｍにおける吸光度を水を標準として測定した。 図１では測定された吸光度が導入されたｔＰＡ活性に対
してプロットされている。いずれのプラスミノーゲン変
異型についても直線関係があるが、カーブの勾配、すな
わち感度は、ミニ−プラスミノーゲンの場合の方がＬｙ
ｓ−プラスミノーゲンを用いた（しかも前者の２倍を超
える濃度で用いた）場合よりも５倍以上も高い。
【００１８】実施例　　２ ＰＡＩ活性測定におけるＬｙｓ−プラスミノーゲンおよ
びミニ−プラスミノーゲンの比較 予め規定されたＰＡＩ活性を有する血漿検体をＢｅｈｒ
ｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ社製ＢｅｒｉｃｈｒｏｍＲＰＡ
ＩアッセイキットからのＰＡＩ標準Ｓ１（０　Ｕ／ｍｌ
）およびＳ２（５．９　Ｕ／ｍｌ）を混合することによ
り調製した。その血漿検体２５μｌを３７℃で５分間、
ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ　ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、１０
０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＨａｅｍａｃｃｅｌＲ（Ｂｅｈ
ｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
００、ｐＨ８．４）中の５Ｕ／ｍｌ濃度のウロキナーゼ
５０μｌと共にインキュベートした。次に１００μｌの
ミニ−プラスミノーゲン（ＴＲＩＳ緩衝液中６．３μＭ
）を添加しそして再びインキュベーションを３７℃で５
分間行った。２５０μｌのプラスミン基質（６００ｍＭ
　ＮａＣｌ／５０ｍＭ　ＴＲＩＳ／ｐＨ８．４中０．６
ｍＭ）を添加しそして改めてインキュベーション（３７
℃で５分間）を行った後、反応を５０μｌの５０％酢酸
で止めた。遊離ｐ−ニトロアニリンの４０５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。 標準にはウロキナーゼに代えてＴＲＩＳ緩衝液を添加し
た。比較のために、同じ検体についてＢｅｈｒｉｎｇｗ
ｅｒｋｅ　ＡＧ試薬（ＢｅｒｉｃｈｒｏｍＲ　ＰＡＩ）
を用いてＰＡＩ活性アッセイを行った。そのアッセイは
本質的に前述の如く行うが、ミニ−プラスミノーゲンに
代えてＬｙｓ−プラスミノーゲン（７．３μＭ）を用い
、また血漿検体中の干渉性α２−抗プラスミンを酸化に
より失活させるためにそのプラスミノーゲンと共にクロ
ラミンＴを添加しなければならない。図２では測定され
た吸光度が導入されたＰＡＩ活性に対してプロットされ
ている。いずれのプラスミノーゲン変異型についても直
線関係がある。しかしながら、Ｌｙｓ−プラスミノーゲ
ンを用いた実験とは対照的に、検体中に含まれるα２−
抗プラスミンは、ミニ−プラスミノーゲンを用いたＰＡ
Ｉ活性測定の場合にはクロラミンＴによっては失活して
いなかった。にもかかわらず、直線勾配、すなわち感度
はミニ−プラスミノーゲンの場合にはＬｙｓ−プラスミ
ノーゲンを用いた場合よりも２倍以上も高い。Ｌｙｓ−
プラスミノーゲンを用いた場合にクロラミンＴを添加し
ないときは、これらの条件下に機能的ＰＡＩ測定を行う
ことはできない。
【００１９】実施例　　３ ＰＡＩ活性の測定におけるＬｙｓ−プラスミノーゲンお
よびミクロ−プラスミノーゲンの比較 ミニ−プラスミノーゲンに代えて１３μＭミクロ−プラ
スミノーゲンを用いて実施例２に記載の実験を繰り返し
た。同様に、クロラミンＴによるα２−抗プラスミンの
失活を伴う“ＢｅｒｉｃｈｒｏｍＲ　ＰＡＩ”アッセイ
を標準法として行った。ミクロ−プラスミノーゲンを用
いた場合にもα２−抗プラスミンの酸化失活が不必要で
あることは図３から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｔＰＡ測定におけるＬｙｓ−およびミニ−プラ
スミノーゲンの比較のための図である。
【図２】ＰＡＩ活性測定におけるＬｙｓ−およびミニ−
プラスミノーゲンの比較のための図である。
【図３】ＰＡＩ活性測定におけるＬｙｓ−およびミクロ
−プラスミノーゲンの比較のための図である。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　生物学的材料の検体をプラスミノーゲ
    ンアクチベーター基質と共にインキュベートし、生成プ
    ラスミン変異型を測定することより成り、プラスミノー
    ゲンアクチベーター基質として、対応するプラスミン変
    異型に活性化された後、α２−抗プラスミンにより仮に
    阻害されるとしてもほんの徐々にしか阻害され得ないプ
    ラスミノーゲン変異型を用いることを特徴とする、体液
    中のプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）活性およ
    び阻害剤および／または活性化剤によるその変調の機能
    測定方法。
  2. 【請求項２】　　生成プラスミン変異型が色素原基質で
    検出される請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】　　生物学材料、好ましくは血漿、の検体
    を０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．１
    〜５μｍｏｌ／ｌ、のプラスミノーゲン変異型と共に、
    および０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌの色素原プラスミン
    基質、好ましくはＨＤ−Ｎｖａ−ＣＨＡ−Ｌｙｓ−ｐＮ
    ＡまたはＨＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、と共
    にインキュベートし、そして評価を好ましくは測定され
    た吸光度または吸光度変化を検量線と比較することによ
    り行う請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】　　ＰＡ類例えばｔ−ＰＡまたはウロキナ
    ーゼがＰＡ活性の阻害剤および／または活性化剤の測定
    のために付加的に添加される請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】　　クリングル領域１−４がプラスミノー
    ゲン変異型においては部分的にまたは完全に存在しない
    請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】　　プラスミノーゲン変異型がミニ−プラ
    スミノーゲンまたはミクロ−プラスミノーゲンである請
    求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】　　プラスミノーゲン変異型の請求項１記
    載の方法への使用。
JP03148202A 1990-05-25 1991-05-24 プラスミノーゲンアクチベーター、それらの阻害剤または活性化剤の検出方法 Expired - Lifetime JP3095255B2 (ja)

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EP (1) EP0458329B1 (ja)
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AU (1) AU653933B2 (ja)
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE3843422A1 (de) * 1988-12-23 1990-06-28 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung der plasminogenaktivator-aktivitaet in alpha-2-antiplasmin-haltigen proben

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EP0458329A1 (de) 1991-11-27
US5296357A (en) 1994-03-22
DE4016978A1 (de) 1991-11-28
DE59107327D1 (de) 1996-03-14
EP0458329B1 (de) 1996-01-31
CA2043215A1 (en) 1991-11-26
ATE133712T1 (de) 1996-02-15
JP3095255B2 (ja) 2000-10-03
AU653933B2 (en) 1994-10-20
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