JPH04234400A - 抗血友病因子（第ＶＩＩＩｃ因子）をほとんど含まない高純度のフォン・ヴィレブラント因子を生成する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、基本的に、非常に高い
純度を有するフォン・ヴィレブラント因子を生成する方
法、並びにその方法によって得られるフォン・ヴィレブ
ラント因子及びその因子を含有する医薬組成物に関する
。

【０００２】

【従来の技術】フォン・ヴィレブラント因子を生成する
様々な方法が従来から知られている。一般的にこれらの
方法は、主に、高純度の第ＶＩＩＩｃ因子を得ることに
向けられており、フォン・ヴィレブラント因子は副生成
物として得られていた。例えば、ヨーロッパ特許第０，
３５９，５９３号（ＣＲＴＳリル）は、ヒトまたは動物
の血漿の分画からタンパク質を分離する方法を示してお
り、これによって、繊維素原、フォン・ヴィレブラント
因子、フィブロネクチンなどの濃縮物とともに、Ａ型血
友病の治療に利用できる高純度の第ＶＩＩＩｃ因子の濃
縮物が得られる。この従来の方法によると、得られる第
ＶＩＩＩｃ因子は、フォン・ヴィレブラント因子から部
分的に取り除かれるだけで、これがこの方法の欠点とな
っていた。

【０００３】本件出願人のフランス特許第８９／０２，
１３６号には、非常に高い純度を有する抗血友病因子（
第ＶＩＩＩｃ因子）を生成するとともに、二次成分とし
てフォン・ヴィレブラント因子を得ることのできる方法
が記載されているが、その精製の方法については記載さ
れていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
本件出願人によるフランス特許第８９／０２，１３６号
にすでに記載された上記方法を出発点として、高純度の
フォン・ヴィレブラント因子を得ることである。

【０００５】本発明の目的は、良好な多産性が得られる
とともに産業的規模での大量生成を可能にしながら、し
かも比較的コストのかからない簡単な方法によって、高
純度のフォン・ヴィレブラント因子を提供することにあ
る。

【０００６】本発明は、この新たな技術的課題を、簡単
で、再生成可能で、充分であるが故に、研究所内に限ら
れていた従来の技術に対して、産業的規模で利用できる
とともに量的な制限なしに大量生成を可能にする方法に
よって、初めて解決することができたのである。

【０００７】さらに、本発明はウィルスによる不活性化
を現出する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】従って、第１の特徴によ
ると、本発明は、ゲルを含有する第１クロマトグラフィ
ーカラムを用いたイオン交換によって精製すること、及
び前記第１カラムのゲルに抗血友病因子（第ＶＩＩＩｃ
因子）のみを吸着することからなるとともに、その後こ
の因子を精製された形態で得るためにこれを脱着する一
方、第ＶＩＩＩｃ因子をほとんど含まないフォン・ヴィ
レブラント因子が非残留分画に含有されており、その後
この因子を精製された形態で得るためにこれを処理する
、抗血友病因子をほとんど含まない高純度のフォン・ヴ
ィレブラント因子を生成する方法において、フォン・ヴ
ィレブラント因子を含有する前記非残留分画が、０．１
〜０．１５モルの塩化ナトリウム溶液で得られるイオン
強度に対応するイオン強度が得られるまで、非残留溶液
のイオン強度を減少させるように処理されること、及び
、その後フォン・ヴィレブラント因子が、イオン強度の
低い非残留溶液のイオン強度とほぼ同じイオン強度を有
する第１溶離溶液でイオン強度の低い前記非残留溶液を
溶離する第２カラムのゲルに選択的に吸着された後、第
２カラムのゲルに吸着されたフォン・ヴィレブラント因
子が、第１溶離溶液よりもイオン強度の高い第２溶離溶
液によって脱着されて、そのことにより、主要な血漿夾
雑物とともに抗血友病第ＶＩＩＩｃ因子及びＴｗｅｅｎ
やＴＮＢＰなどの不活性剤をほとんど含まない高純度の
フォン・ヴィレブラント因子の精製溶液が得られること
を特徴とする方法を提供している。

【０００９】

【発明の効果】これによって、高純度のフォン・ヴィレ
ブラント因子を産業的規模で、低コストで生成すること
ができる。

【００１０】本発明による方法の好適な実施例によると
、非残留溶液のイオン強度は、好ましくは濃縮に先行さ
れるダイアフィルトレーションを行うことによって低下
される。このダイアフィルトレーションは、好ましくは
静脈注射が可能な第３緩衝液に対して行われることが好
ましい。ダイアフィルトレーションのためのこのような
第３緩衝液は下記の組成物を有する。

【００１１】 −　　塩化ナトリウム　　　　　　・・・・　　１００
ｍｍｏｌ−　　トリス　　　　　　　　　　　　　　・
・・・　　　　２０ｍｍｏｌ−　　ＣａＣｌ２　・２Ｈ
２　Ｏ　　・・・・　　１０ｍｍｏｌ−　　Ｌ−アルギ
ニン　　　　　　・・・・　　　　１７ｍｍｏｌ−　　
Ｌ−リシン　　ＨＣＬ　　・・・・　　　　２０ｍｍｏ
ｌ

【００１２】この溶液はまた、１２Ｎの濃塩酸で、ｐ
Ｈ７に調製される。

【００１３】本発明の特徴によると、ダイアフィルター
溶液の濃縮は、３０〜４０単位のフォン・ヴィレブラン
ト因子：ＲＣＯ（リストセチン補因子）を得るように行
われる。

【００１４】本発明による方法の実施例の好適な改変例
によると、フォン・ヴィレブラント因子の第２カラムの
ゲルへの選択的な吸着を可能にする第１溶離溶液は以下
の組成物を有している。

【００１５】 　　　　−　　塩化ナトリウム　　　　・・・・　　１
００〜１５０ｍｍｏｌ　　　　−　　トリス　　　　　
　　　　　　　・・・・　　　　　　　　　　　　２０
ｍｍｏｌ

【００１６】この溶液は、１２Ｎの濃塩酸で、
ｐＨ６．６に調整される。

【００１７】本発明による方法の別の特徴によると、以
下の組成物を有する溶液が、フォン・ヴィレブラント因
子の第２カラムからの脱着を可能にする第２溶離溶液と
して用いられる。この組成物は、１２Ｎの濃塩酸で、ｐ
Ｈ６．６に調製される。

【００１８】 −　　塩化ナトリウム　　　　・・・・　　３５０ｍｍ
ｏｌ−　　トリス　　　　　　　　　　　　・・・・　
　　　２０ｍｍｏｌ

【００１９】本発明による別の有利
な特徴によると、フォン・ヴィレブラント因子を選択的
に吸着するために、第２イオン交換クロマトグラフィー
カラムで用いられる精製ゲルは、下記の基本特徴を有す
るゲルである。

【００２０】つまり、特にビーズ状で約６％の濃度を有
する架橋アガロースに基づく、陰イオン型イオンを交換
するためのゲル。このゲルは、アガロースビーズに結合
された、特にスモールスペーサアームの端部に第四アミ
ノ基を保有するタイプ、例えばＣ１−Ｃ６アルキレンタ
イプであることが好ましい。

【００２１】これらの特徴に対応する市販されているゲ
ルは、登録商標Ｑセファロース・ファースト・フロウと
して知られており、スエーデンのファーマシア社によっ
て市販されている。そのビーズの直径は湿状態で４５〜
１６５μｍである。

【００２２】このゲルは、フォン・ヴィレブラント因子
に関して、ゲル１リットルあたりのフォン・ヴィレブラ
ント因子：Ｒａｇがほぼ５０単位の親和性を発揮するこ
とに留意すべきである。

【００２３】本発明による方法の特徴によると、好まし
くはヘパリンが添加され、水で溶解されたヒトの血漿か
ら抽出された寒冷沈降物が、フォン・ヴィレブラント因
子源として用いられる。それによって得られた溶液は水
酸化アルミニウムで処理される。水酸化アルミニウムの
混入率は重要ではなく、広範囲内で変更することができ
る。しかし、開始溶液の総容量に対して１０容量％以上
の比率を用いることが好ましい。現在の好適な比率は、
ほぼ１５容量％である。

【００２４】また、ヴィタミンＫ依存因子から開始溶液
を取り除くために、開始溶液から水酸化アルミニウムを
分離するよう、遠心分離を行うことが好ましい。しかし
、本発明による方法の実施例の好適な改変例によると、
初期にフォン・ヴィレブラント因子とともに第ＶＩＩＩ
ｃ因子を含有する溶液は、ヨーロッパ特許第０，１３１
，７４０号またはアメリカ特許第４，５４０，５７３号
に記載された溶剤／洗浄剤の混合物を含有する緩衝液を
用いて、ウィルスにより不活性化されることができる。

【００２５】これによって得られるウィルスにより不活
性化された未精製溶液はその後、ここに先行技術として
組み込んだ本件出願人のフランス特許第８９／０２，１
３６号に記載された方法により第ＶＩＩＩｃ因子から取
り除かれる。

【００２６】第ＶＩＩＩｃ因子結合ゲルを含有する第１
イオン交換クロマトグラフィーカラムへの吸着の段階へ
進む前に、第ＶＩＩＩｃ因子を結合するのに用いられた
第１カラムの溶離に使用されたのと同じ緩衝液を用いて
、未精製溶液のダイアフィルトレーションが行われるこ
とが留意されるであろう。

【００２７】第ＶＩＩＩｃ因子の選択的な吸着はこの第
１カラムで行われるが、フォン・ヴィレブラント因子は
、すでに述べた本発明の方法によって処理される非残留
溶離溶液に存在している。

【００２８】その後、第ＶＩＩＩｃ因子は、本件出願人
の上記フランス特許第８９／０２，１３６号に記載され
たように回収される。

【００２９】フォン・ヴィレブラント因子を含む非残留
溶離溶液のダイアフィルトレーションの好適な方法につ
いては、１００，０００の除去能力をもつ膜、例えばミ
リポア社のミリポア基準４ＰＴＨＫ型膜が用いられる。

【００３０】さらに、抗血友病第ＶＩＩＩｃ因子をほと
んど含まず、タンパク質１ｍｇあたりのフォン・ヴィレ
ブラント因子：ＲＣＯで５０以上の比活性度を表わす、
本発明による方法で得られる非常に純度の高いフォン・
ヴィレブラント因子の溶離溶液を保存するために、直径
が０．２２μｍの気孔を有する滅菌フィルタで滅菌濾過
が行われ、この滅菌され、精製されたフォン・ヴィレブ
ラント因子の溶液は、従来のガラス瓶に入れられる。

【００３１】第２の特徴において、本発明はまた、上述
した方法によって得られることを特徴とする高純度のフ
ォン・ヴィレブラント因子を提供する。本発明はまた、
ほとんど第ＶＩＩＩｃ因子を含有しない、好ましくは第
ＶＩＩＩｃ因子の含有量が２％以下であることを特徴と
する高純度のフォン・ヴィレブラント因子を含んでいる
。本発明によるフォン・ヴィレブラント因子の比活性度
が、タンパク質１ｍｇあたりのフォン・ヴィレブラント
因子：ＲＣＯで少なくとも５０単位であることが好まし
い。

【００３２】第３の特徴によると、本発明はまた、上述
した本発明による方法によって得られるフォン・ヴィレ
ブラント因子を含有することを特徴とする医薬組成物を
含んでいる。この医薬組成物は、使用時での注射用製剤
の調合を可能にする凍結乾燥状態のフォン・ヴィレブラ
ント因子を含有していることが好ましい。

【００３３】本発明はさらに、好ましくは第ＶＩＩＩｃ
因子の含有量が２％以下の、第ＶＩＩＩｃ因子をほとん
ど含まないフォン・ヴィレブラント因子が活性素因とし
て用いられることを特徴とする医薬組成物を生成する方
法を含んでいる。このフォン・ヴィレブラント因子は、
使用時での注射用製剤の調合を可能にする凍結乾燥状態
であることが好ましい。

【００３４】最後に、本発明は、フォン・ヴィレブラン
ト性疾患の患者を含む哺乳動物の治療方法であって、好
ましくは第ＶＩＩＩｃ因子の含有量が２％以下の、第Ｖ
ＩＩＩｃ因子をほとんど含まないフォン・ヴィレブラン
ト因子の治療学上の活性量がヒトを含む哺乳動物に投与
されることを特徴とする方法を含んでいる。一実施例に
よると、フォン・ヴィレブラント因子の比活性度は、タ
ンパク質１ｍｇあたりのフォン・ヴィレブラント：ＲＣ
Ｏで少なくとも５０単位である。このフォン・ヴィレブ
ラント因子は、実施例の一改変例によると、使用時にお
いて凍結乾燥状態から調合される非経口注射用製剤とし
ての形状をとっている。本発明によって得られたフォン
・ヴィレブラント因子では、適用投与量は、一日あたり
体重１ｋｇにつきｖＷ：ＲＣＯで３０〜４０単位が慣習
となっている。

【００３５】本発明の他の目的、特徴及び利点は、単に
例として示した、従って本発明の範囲を限定しない実施
例の一例を参照した、以下の説明から明らかになるであ
ろう。この例では、特に述べていない限りパーセンテー
ジは重量で示している。

【００３６】［例］３００ｍｌのヒトの血漿から得られ
る血しょうの３ｋｇの寒冷沈降物が、室内温度で、溶液
１ｍｌにつき３国際単位の比率でヘパリンが添加された
負性リムルス性の浸透精製された水溶液の容量の３．２
倍に溶解され、完全に溶解するため２時間攪拌する。

【００３７】最終容量を測定した後、ヴィタミンＫ依存
因子を取り除くために、この溶液の総容量に対して１５
容量％の比率で、水酸化アルミニウムがこの溶液に添加
される。この混合物は、ヴィタミンＫ依存因子の水酸化
アルミニウムへの吸着を達成するために、５分間攪拌さ
れ続ける。

【００３８】混合物はさらに、溶液から水酸化アルミニ
ウムを分離するために、６，０００ｇで遠心分離される
。

【００３９】第ＶＩＩＩｃ因子と所望のフォン・ヴィレ
ブラント因子を含有する未精製溶液は、ウィルス性不活
性化を現出するべく、ヨーロッパ特許第０，１３１，７
４０号及びアメリカ特許第４，５４０，５７３号に記載
された方法によって処理される。

【００４０】その後、第ＶＩＩＩｃ因子とフォン・ヴィ
レブラント因子を含有する未精製溶液のダイアフィルト
レーションが、下記の組成物を有し、第ＶＩＩＩｃ因子
を選択的に吸着するのに用いられる第１クロマトグラフ
ィーカラムの均一化及び溶解に使用されることになる緩
衝液に対して行われる。

【００４１】 −　　塩化ナトリウム　　　　　　　　・・・・　　２
５０ｍｍｏｌ−　　トリス　　　　　　　　　　　　　
　　　・・・・　　　　２０ｍｍｏｌ−　　ＣａＣｌ２
　・２Ｈ２　Ｏ　　・・・・　　　　１０ｍｍｏｌ

【０
０４２】この溶液は、１２Ｎの濃塩酸で、ｐＨ６．６に
調整される。

【００４３】このダイアフィルトレーションは、第ＶＩ
ＩＩｃ因子とフォン・ヴィレブラント因子を含有する未
精製溶液の量の２倍行われ、溶液は、これにより、ウイ
ルス性不活性化に用いられた生成物の大部分を除去する
ことによって不活性化される。ダイアフィルトレーショ
ンに用いられる膜は、１００，０００の除去能力を有す
るミリポア基準４ＰＴＨＫ膜である。第ＶＩＩＩｃ因子
とフォン・ヴィレブラント因子を含有する未精製溶液が
これによって得られ、この溶液は、不活性化され、ダイ
アフィルターされて、全溶液が１０ｌになるまで濃縮さ
れる。

【００４４】１０ｌまで濃縮されたこの溶液は、第ＶＩ
ＩＩｃ因子を選択的に吸着するために用いられた第１ク
ロマトグラフィーカラムの溶離緩衝液とほぼ同じイオン
強度を有している。クロマトグラフィーカラムは、例え
ば、ファーマシア社のＱセファロース・ファースト・フ
ロウ（登録商標）ゲルが３２ｌ導入された高さ２５ｃｍ
、直径４０ｃｍのカラムである。

【００４５】２８０ｎｍにおける吸光度をチェックする
ことによってタンパク質ピークがカラムからの流出量中
に観測されなくなるまで、同じ流量率で溶離緩衝液を注
入するために、２５ｌ／ｈの率で第ＶＩＩＩｃ因子とフ
ォン・ヴィレブラント因子を含有する１０ｌの未精製溶
液の注入を行う前に、ゲルは溶離溶液と均一化される。 前記ピークは、主に、フォン・ヴィレブラント因子を回
収するために別々に収集されることが望ましいフォン・
ヴィレブラント因子、フィブリノーゲン、アルブミン、
γ−グロブリンに対応する。

【００４６】カラムを溶離緩衝液で溶離した後、第ＶＩ
ＩＩｃ因子は、これによってこのカラムに選択的に吸着
される。さらに、非残留溶離溶液は、血漿不活性剤とと
もにフォン・ヴィレブラント因子、フィブリノーゲン、
アルブミン、γ−グロブリンを含有しており、その容量
は８０〜１００リットルである。

【００４７】フォン・ヴィレブラント因子は、本発明に
よる方法によって、下記のように、選択的に分離される
。

【００４８】まず、フォン・ヴィレブラント因子を含有
する非残留溶離溶液のダイアフィルトレーションが、下
記の組成物からなる第１緩衝液に対して行われる。

【００４９】 −　　塩化ナトリウム　　・・・・　　１００〜１５０
ｍｍｏｌ、好ましくは約１２０ｍｍｏｌ −　　トリス　　　　　　　　　　・・・・　　　　２
０ｍｍｏｌ

【００５０】この溶液は１２Ｎの農塩酸で、
６．６に等しいｐＨに調整される。

【００５１】この溶液は、総溶液のうち１０ｌの容量が
得られるまで同時濃縮を現出する状態において、１００
，０００の除去能力を有するミリポア基準４ＰＴＨＫ膜
でダイアフィルターされる。

【００５２】１０ｌまで濃縮されたフォン・ヴィレブラ
ント因子のこの溶液が、フォン・ヴィレブラント因子の
選択的な吸着に用いられる第２クロマトグラフィーカラ
ムの第１溶離緩衝液とほぼ同じイオン強度を有している
とがわかる。

【００５３】その後、フォン・ヴィレブラント因子の選
択的な吸着が、第ＶＩＩＩｃ因子の選択的な吸着に用い
られた第１クロマトグラフィーカラムと同じゲルを含有
する第２クロマトグラフィーカラムに対して行われるが
、これは、塩化ナトリウムに関して１００〜１５０ｍｍ
ｏｌのフォン・ヴィレブラント溶液のイオン強度に対応
するイオン強度と均一化されている。

【００５４】この第２カラムから抽出した、溶離された
非結合部は、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ア
ルブミン、γ−グロブリン、及び血漿不活性剤を含有し
ており、これらは一側に分布している。

【００５５】さらに、カラムに吸着されたフォン・ヴィ
レブラント因子は、よりイオン強度が高い、下記の組成
物を有した第２溶離溶液によって収集される。

【００５６】 −　　塩化ナトリウム　　・・・・　　３００〜３５０
ｍｍｏｌ、好ましくは約３５０ｍｍｏｌ −　　トリス　　　　　　　　　　・・・・　　２０ｍ
ｍｏｌ

【００５７】この溶液は１２Ｎの農塩酸で、ｐＨ
６．６に調整される。

【００５８】フォン・ヴィレブラント因子を結合するた
めの特性を有するこの第２クロマトグラフィーカラムに
おいては、ファーマシア社のＱセファロース・ファース
ト・フロウ（登録商標）ゲルを、そのゲルのはるかに高
い親和性のために、フォン・ヴィレブラント因子に対し
８ｌ用いれば充分である。

【００５９】精製されたフォン・ヴィレブラント因子を
含有するこの溶離溶液が、今度は、下記の組成物を有す
る第３緩衝液に対してこれをダイアフィルターすること
により濃縮される。

【００６０】 　　−　　塩化ナトリウム　　　　　　　　・・・・　
　約１００ｍｍｏｌ　　−　　トリス　　　　　　　　
　　　　　　　　・・・・　　　　　　２０ｍｍｏｌ　
　−　　ＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ　　　　・・・・　
　　　　　１０ｍｍｏｌ　　−　　Ｌ−アルギニン　　
　　　　　　・・・・　　　　　　１７ｍｍｏｌ　　−
　　Ｌ−リシン　　ＨＣＬ　　　　・・・・　　　　　
　２０ｍｍｏｌ

【００６１】この溶液は、１２Ｎの農塩
酸で、７に等しいｐＨに調整される。

【００６２】このアプローチにより、ナトリウムの含有
率を１００ｍｍｏｌ／ｌまで減少させ、溶液１ｍｌあた
りのフォン・ヴィレブラント因子：ＲＣＯで３０〜４０
国際単位に濃縮することができる。この段階で用いられ
るダイアフィルトレーション用膜は、１００，０００の
除去能力を有するミリポア基準４ＰＴＨＫ膜である。

【００６３】その後、フォン・ヴィレブラント因子の溶
液の滅菌濾過が、滅菌膜、例えば気孔直径が０．２２μ
のミリポア社製の基準ミリディスクの膜で行われる。

【００６４】非常に高い純度のフォン・ヴィレブラント
因子の滅菌溶液はこうして得られ、その溶液は生成物保
存のため、特に従来の方法で行われることのできる凍結
乾燥のために、ガラス瓶に移してもよい。タンパク質１
ｍｇあたりのフォン・ヴィレブラント：ＲＣＯで少なく
とも５０単位の比活性度を有するフォン・ヴィレブラン
ト因子がこれにより得られる。

【００６５】このフォン・ヴィレブラント因子は、よっ
て、フォン・ヴィレブラント性疾患を患っている患者に
この疾患を治療するに必要なだけの量を注射することが
できる非常に価値のある医薬組成物を構成するのであり
、これにより重要な技術進歩が達成される。

【００６６】実際には、本発明によれば、血漿１リット
ルあたりの回収率は、フォン・ヴィレブラント因子：Ｒ
ＣＯでほぼ３５０国際単位であり、フォン・ヴィレブラ
ント因子：Ｒａｇで６００国際単位である。

【００６７】さらに留意すべき点は、この生成物が、長
時間非常に高い安定性を呈していることである。特に、
フォン・ヴィレブラント因子の活性度が低下するのは、
凍結乾燥剤を溶解してから２４時間後でも５％以下であ
る。

【００６８】Ｒａｇはリストセチン抗原を意味する。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ゲルを含有する第１クロマトグラフィ
   ーカラムを用いたイオン交換によって精製すること、及
   び前記第１カラムのゲルに抗血友病因子（第ＶＩＩＩｃ
   因子）のみを吸着することからなるとともに、その後こ
   の因子を精製された形態で得るためにこれを脱着する一
   方、第ＶＩＩＩｃ因子をほとんど含まないフォン・ヴィ
   レブラント因子が非残留分画に含有されており、その後
   この因子を精製された形態で得るためにこれを処理する
   、抗血友病因子をほとんど含まない高純度のフォン・ヴ
   ィレブラント因子を生成する方法において、フォン・ヴ
   ィレブラント因子を含有する前記非残留分画が、０．１
   〜０．１５モルの塩化ナトリウム溶液で得られるイオン
   強度に対応するイオン強度が得られるまで、非残留溶液
   のイオン強度を減少させるように処理されること、及び
   、その後フォン・ヴィレブラント因子が、イオン強度の
   低い非残留溶液のイオン強度とほぼ同じイオン強度を有
   する第１溶離溶液でイオン強度の低い前記非残留溶液を
   溶離する第２カラムのゲルに選択的に吸着された後、第
   ２カラムのゲルに吸着されたフォン・ヴィレブラント因
   子が、第１溶離溶液よりもイオン強度の高い第２溶離溶
   液によって脱着されて、そのことにより、主要な血漿夾
   雑物とともに抗血友病第ＶＩＩＩｃ因子及びＴｗｅｅｎ
   やＴＮＢＰなどの不活性剤をほとんど含まない高純度の
   フォン・ヴィレブラント因子の精製溶液が得られること
   を特徴とする方法。
2. 【請求項２】　　前記非残留溶液のイオン強度が、好ま
   しくは濃縮に先行されるダイアフィルトレーションを行
   うことによって低下されることを特徴とする請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】　　前記ダイアフィルトレーションが、好
   ましくは静脈注射が可能な第３緩衝液に対して行われる
   ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】　　前記ダイアフィルトレーションのため
   の第３緩衝液が下記の組成物、 −　　塩化ナトリウム　　　　　　　　・・・・　　１
   ００ｍｍｏｌ−　　トリス　　　　　　　　　　　　　
   　　　・・・・　　　　２０ｍｍｏｌ−　　ＣａＣｌ２
   　・２Ｈ２　Ｏ　　・・・・　　　　１０ｍｍｏｌ−　
   　Ｌ−アルギニン　　　　　　　　・・・・　　　　１
   ７ｍｍｏｌ−　　Ｌ−リシン　　ＨＣＬ　　　　・・・
   ・　　　　２０ｍｍｏｌを有しており、この溶液が、１
   ２Ｎの濃塩酸で、ｐＨ７に調製されることを特徴とする
   請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】　　前記ダイアフィルター溶液の濃縮が、
   ３０〜４０単位のフォン・ヴィレブラント因子：ＲＣＯ
   を得るように行われることを特徴とする請求項２〜４の
   いずれかひとつに記載の方法。
6. 【請求項６】　　フォン・ヴィレブラント因子が第２カ
   ラムのゲルに吸着されることを可能にする第１溶離溶液
   が以下の組成物、 　　　　　　−　　塩化ナトリウム　　・・・・　　１
   ００〜１５０ｍｍｏｌ　　　　　　−　　トリス　　　
   　　　　　　　・・・・　　　　　　　　　　　　２０
   ｍｍｏｌを有しており、この溶液が、１２Ｎの濃塩酸で
   、ｐＨ６．６に調製されることを特徴とする請求項１〜
   ５のいずれかひとつに記載の方法。
7. 【請求項７】　　フォン・ヴィレブラント因子が第２カ
   ラムから脱着されることを可能にする第２溶離溶液とし
   て、以下の組成物、 −　　塩化ナトリウム　　・・・・　　３５０ｍｍｏｌ
   −　　トリス　　　　　　　　　　・・・・　　　　２
   ０ｍｍｏｌを有する溶液が用いられることを特徴とする
   請求項１〜６のいずれかひとつに記載の方法。
8. 【請求項８】　　フォン・ヴィレブラント因子を選択的
   に吸着するために、第２イオン交換クロマトグラフィー
   カラムに使用される精製ゲルが、特にビーズ状で約６％
   の濃度を有する架橋アガロースに基づく、陰イオン型イ
   オンを交換するためのゲルで、このゲルが、アガロース
   ビーズに結合された、特に小型スペーサアームの端部に
   第四アミノ基を保有するタイプ、例えばＣ１−Ｃ６アル
   キレンタイプであることを特徴とする請求項１〜７のい
   ずれかひとつに記載の方法。
9. 【請求項９】　　好ましくはヘパリンが添加され、水で
   溶解されたヒトの血漿から抽出された寒冷沈降物が、フ
   ォン・ヴィレブラント因子源として用いられ、この溶液
   が水酸化アルミニウムで処理されることを特徴とする請
   求項１〜８のいずれかひとつに記載の方法。
10. 【請求項１０】　　ヴィタミンＫ依存因子から開始溶液
    を取り除くために、開始溶液から水酸化アルミニウムを
    分離するよう、遠心分離を行うことを特徴とする請求項
    ９に記載の方法。
11. 【請求項１１】　　初期にフォン・ヴィレブラント因子
    とともに第ＶＩＩＩｃ因子を含有する前記溶液が、溶剤
    ／洗浄剤の混合物を含有する緩衝液を用いて、ウィルス
    により不活性化されることを特徴とする請求項９または
    １０に記載の方法。
12. 【請求項１２】　　第ＶＩＩＩｃ因子結合ゲルを含有す
    る第１イオン交換クロマトグラフィーカラムへの吸着の
    段階へ進む前に、第ＶＩＩＩｃ因子を結合するのに用い
    られた第１カラムの溶離に使用されたのと同じ緩衝液を
    用いて、未精製溶液のダイアフィルトレーションが行わ
    れることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかひとつ
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】　　フォン・ヴィレブラント因子を含む
    非残留溶離溶液のダイアフィルトレーションには、１０
    ０，０００の除去能力をもつ膜が用いられることを特徴
    とする請求項２〜１２のいずれかひとつに記載の方法。
14. 【請求項１４】　　滅菌濾過が、直径０．２２μｍの気
    孔を有する滅菌フィルタで行われた後、この滅菌され、
    精製されたフォン・ヴィレブラント因子の溶液が、従来
    のガラス瓶に入れられることを特徴とする請求項１〜１
    ３のいずれかひとつに記載の方法。
15. 【請求項１５】　　請求項１〜１４のいずれかひとつの
    方法によって得られることを特徴とする高純度のフォン
    ・ヴィレブラント因子。
16. 【請求項１６】　　ほとんど第ＶＩＩＩｃ因子を含まず
    、好ましくは第ＶＩＩＩｃ因子含有量が２％以下である
    とともに、比活性度が、タンパク質１ｍｇあたりのフォ
    ン・ヴィレブラント：ＲＣＯで少なくとも５０単位であ
    ることを特徴とする高純度のフォン・ヴィレブラント因
    子。
17. 【請求項１７】　　請求項１〜１４のいずれかひとつに
    記載の方法によって得られる、または請求項１５または
    １６に記載されたフォン・ヴィレブラント因子を含有す
    ることを特徴とする医薬組成物。
18. 【請求項１８】　　フォン・ヴィレブラント因子が、使
    用時での注射製剤の調合を可能にする凍結乾燥状態であ
    ることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。