JPH04234982A - 無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法 - Google Patents
無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法Info
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- JPH04234982A JPH04234982A JP2417059A JP41705990A JPH04234982A JP H04234982 A JPH04234982 A JP H04234982A JP 2417059 A JP2417059 A JP 2417059A JP 41705990 A JP41705990 A JP 41705990A JP H04234982 A JPH04234982 A JP H04234982A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は無血清培地、動物細胞の
培養方法および異種蛋白質の製造方法に関する。
培養方法および異種蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術・発明が解決しようとする課題】近年、ＤＮ
Ａの組換え技術の進歩により、細胞生成物（例えば、蛋
白質）を製造するための動物細胞の培養が次第に重要に
なっている。このような細胞培養を工業的規模で行うに
は、多量の培地が必要になる。
Ａの組換え技術の進歩により、細胞生成物（例えば、蛋
白質）を製造するための動物細胞の培養が次第に重要に
なっている。このような細胞培養を工業的規模で行うに
は、多量の培地が必要になる。
【０００３】従来、動物細胞を生育（増殖）させる際の
培地としては、極めて多種の培地、例えば、ＤＭＥＭ培
地〔Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｊ．Ｊ．（１９７０）Ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ ６，８９〕、Ｆ１２培地〔Ｈａｍ，Ｒ．Ｏ．
（１９６５） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ５３，２８８〕およびＲＰＭＩ１６４０培地
〔Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３９，２８５，ＪＡＭＡ １９
９（１９５７）５１９ 〕等が使用されてきた。しかし
、これらの培地を使用して動物細胞を生育（増殖）させ
るには、培地に血清を加えなければならない。このため
、一般には、ウシ胎児、ウマまたはヒト等の血清を１〜
１５％程度の濃度で使用しなければならなかった。
培地としては、極めて多種の培地、例えば、ＤＭＥＭ培
地〔Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｊ．Ｊ．（１９７０）Ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ ６，８９〕、Ｆ１２培地〔Ｈａｍ，Ｒ．Ｏ．
（１９６５） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ５３，２８８〕およびＲＰＭＩ１６４０培地
〔Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３９，２８５，ＪＡＭＡ １９
９（１９５７）５１９ 〕等が使用されてきた。しかし
、これらの培地を使用して動物細胞を生育（増殖）させ
るには、培地に血清を加えなければならない。このため
、一般には、ウシ胎児、ウマまたはヒト等の血清を１〜
１５％程度の濃度で使用しなければならなかった。
【０００４】しかし、血清含有培地を使用する際には以
下の様な問題があった。■ 血清自体が高価なためコ
スト高となる。■ 血清にはロット差があり、再現性
のある培養には不利である。■ 産生物の培養上清か
らの精製が困難となる。■ ウイルスやマイコプラズ
マの汚染源となる恐れがある。
下の様な問題があった。■ 血清自体が高価なためコ
スト高となる。■ 血清にはロット差があり、再現性
のある培養には不利である。■ 産生物の培養上清か
らの精製が困難となる。■ ウイルスやマイコプラズ
マの汚染源となる恐れがある。
【０００５】このような現状に鑑みて、培地中の血清濃
度を減少させる方法が検討されている。血清濃度の減少
によって細胞はその増殖性を著しく低下させるか死滅し
、所望の細胞生成物（例えば、蛋白質）の収量が著しく
減少するなどの問題があり、培地中の血清濃度の減少は
困難であった。
度を減少させる方法が検討されている。血清濃度の減少
によって細胞はその増殖性を著しく低下させるか死滅し
、所望の細胞生成物（例えば、蛋白質）の収量が著しく
減少するなどの問題があり、培地中の血清濃度の減少は
困難であった。
【０００６】このような理由から、細胞が増殖性を失わ
ずに培養されうる無血清培地に対して多大な関心が持た
れている。例えば、ＣＨＯ細胞の培養に適し、ハム（Ｈ
ａｍ）のＦ１２培地およびＤＭＥＭ培地を１：１の割合
で含有する血清不含培地であって、これにトランスフェ
リン、インシュリンおよび亜セレン酸塩の付加された培
地が知られている〔Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅ
ｖ． Ｂｉｏｌ．２１ （１９８５） ５８８ 〜５９
２ 〕。
ずに培養されうる無血清培地に対して多大な関心が持た
れている。例えば、ＣＨＯ細胞の培養に適し、ハム（Ｈ
ａｍ）のＦ１２培地およびＤＭＥＭ培地を１：１の割合
で含有する血清不含培地であって、これにトランスフェ
リン、インシュリンおよび亜セレン酸塩の付加された培
地が知られている〔Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅ
ｖ． Ｂｉｏｌ．２１ （１９８５） ５８８ 〜５９
２ 〕。
【０００７】しかし、公知の無血清培地は次の如き問題
点を有する。即ち、細胞の培養の間に若干の時間間隔で
ウシ胎児血清をしばしば追加する必要がある。同様に通
常、血清含有培地中で保持される基本培養物を無血清培
地に移すことも徐々の適応によってのみ可能である。
点を有する。即ち、細胞の培養の間に若干の時間間隔で
ウシ胎児血清をしばしば追加する必要がある。同様に通
常、血清含有培地中で保持される基本培養物を無血清培
地に移すことも徐々の適応によってのみ可能である。
【０００８】本発明の第１番目の目的は、取扱いが容易
で、安価かつ動物細胞の発育に適した無血清培地を提供
することである。
で、安価かつ動物細胞の発育に適した無血清培地を提供
することである。
【０００９】本発明の第２番目の目的は、効率的な動物
細胞の培養方法を提供することである。
細胞の培養方法を提供することである。
【００１０】本発明の第３番目の目的は、形質転換させ
た動物細胞より異種蛋白質を大量に製造する方法を提供
することである。
た動物細胞より異種蛋白質を大量に製造する方法を提供
することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため鋭意研究を重ねた結果、インスリン、ペ
プトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含有させ
た無血清培地が、動物細胞の培養に適していること、ま
た、この培地を使用することにより、異種蛋白質を大量
に生産できることを見出して本発明を完成した。
を達成するため鋭意研究を重ねた結果、インスリン、ペ
プトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含有させ
た無血清培地が、動物細胞の培養に適していること、ま
た、この培地を使用することにより、異種蛋白質を大量
に生産できることを見出して本発明を完成した。
【００１２】即ち、第１番目の本発明は、基礎培地にイ
ンスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミ
ンを含有させることを特徴とする無血清培地である。
ンスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミ
ンを含有させることを特徴とする無血清培地である。
【００１３】第２番目の発明は、上記第１番目の本発明
培地を使用する動物細胞の培養方法である。
培地を使用する動物細胞の培養方法である。
【００１４】第３番目の発明は、形質転換させた動物細
胞を上記第１番目の本発明培地で培養して異種蛋白質を
発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造方法であ
る。
胞を上記第１番目の本発明培地で培養して異種蛋白質を
発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造方法であ
る。
【００１５】本発明の無血清培地は、実質的に血清を含
有しないものであり、当該培地は、通常被培養物、例え
ば動物細胞が同化しうる炭素源、消化しうる窒素源およ
び無機塩等を含有させることができる。また、必要に応
じて微量栄養促進物質、前駆物質などの微量有効物質を
配合してもよい。炭素源としては、グルコース、マンニ
トール、グリセロール、フルクトースなどがあり、窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、カゼイン、コーンス
チープリカー、大豆粉、乾燥酵母などの有機窒素化合物
、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素化
合物が挙げられる。本発明の培地はかかる成分を含む培
地を基礎培地とし、さらに上記インスリン、ペプトン、
トランスフェリンおよびアルブミンを含有せしめた培地
である。かかる基礎培地としては、細胞培養のためのす
べての公知培地を使用することができ、例えばＤＭＥＭ
培地、Ｆ１２培地およびＲＰＭＩ１６４０培地が例示さ
れ、就中ＲＰＭＩ１６４０培地が好適である。
有しないものであり、当該培地は、通常被培養物、例え
ば動物細胞が同化しうる炭素源、消化しうる窒素源およ
び無機塩等を含有させることができる。また、必要に応
じて微量栄養促進物質、前駆物質などの微量有効物質を
配合してもよい。炭素源としては、グルコース、マンニ
トール、グリセロール、フルクトースなどがあり、窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、カゼイン、コーンス
チープリカー、大豆粉、乾燥酵母などの有機窒素化合物
、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素化
合物が挙げられる。本発明の培地はかかる成分を含む培
地を基礎培地とし、さらに上記インスリン、ペプトン、
トランスフェリンおよびアルブミンを含有せしめた培地
である。かかる基礎培地としては、細胞培養のためのす
べての公知培地を使用することができ、例えばＤＭＥＭ
培地、Ｆ１２培地およびＲＰＭＩ１６４０培地が例示さ
れ、就中ＲＰＭＩ１６４０培地が好適である。
【００１６】本発明の無血清培地における各種添加物の
量は、インスリン０．１〜５ｍｇ／Ｌ、就中０．１〜２
ｍｇ／Ｌ、ペプトン１〜１０ｇ／Ｌ、就中４〜６ｇ／Ｌ
、トランスフェリン５〜１５ｍｇ／Ｌ、就中９〜１１ｍ
ｇ／Ｌ、アルブミン０．１〜５ｇ／Ｌ、就中０．１〜２
ｇ／Ｌである。
量は、インスリン０．１〜５ｍｇ／Ｌ、就中０．１〜２
ｍｇ／Ｌ、ペプトン１〜１０ｇ／Ｌ、就中４〜６ｇ／Ｌ
、トランスフェリン５〜１５ｍｇ／Ｌ、就中９〜１１ｍ
ｇ／Ｌ、アルブミン０．１〜５ｇ／Ｌ、就中０．１〜２
ｇ／Ｌである。
【００１７】本発明において使用されるインスリンは、
その由来には特に制限はなく、好適にはウシ由来のもの
が使用される。本発明において使用されるペプトンは、
その由来には特に制限はなく、好適には牛肉由来ペプト
ン（ＢＰ）が使用される。本発明において使用されるト
ランスフェリンは、その由来には特に制限はなく、好適
にはヒトまたはウシ由来のものが使用される。本発明に
おいて使用されるアルブミンは、その由来には特に制限
はなく、好適にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）が使用される。
その由来には特に制限はなく、好適にはウシ由来のもの
が使用される。本発明において使用されるペプトンは、
その由来には特に制限はなく、好適には牛肉由来ペプト
ン（ＢＰ）が使用される。本発明において使用されるト
ランスフェリンは、その由来には特に制限はなく、好適
にはヒトまたはウシ由来のものが使用される。本発明に
おいて使用されるアルブミンは、その由来には特に制限
はなく、好適にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）が使用される。
【００１８】本発明の無血清培地には、必要により、更
にヒポキサンチン０．１〜１００ｍｇ／Ｌ、就中１０〜
１５ｍｇ／Ｌ、チミジン０．０１〜１００ｍｇ／Ｌ、就
中２〜５ｍｇ／Ｌ、セレン０．０１〜１００μｇ／Ｌ、
就中２〜５μｇ／Ｌ、α−トコフェロール（ビタミンＥ
）０．００１〜１０ｍｇ／Ｌ、就中０．１〜０．５ｍｇ
／Ｌを加えることができる。
にヒポキサンチン０．１〜１００ｍｇ／Ｌ、就中１０〜
１５ｍｇ／Ｌ、チミジン０．０１〜１００ｍｇ／Ｌ、就
中２〜５ｍｇ／Ｌ、セレン０．０１〜１００μｇ／Ｌ、
就中２〜５μｇ／Ｌ、α−トコフェロール（ビタミンＥ
）０．００１〜１０ｍｇ／Ｌ、就中０．１〜０．５ｍｇ
／Ｌを加えることができる。
【００１９】また、耐性遺伝子を有するベクターを含有
する形質転換された動物細胞を培養しようとする場合に
は、プラスミド形質転換の安定性を保つために該培地に
更にベクター中に含有された耐性遺伝子に相応する選択
剤を加えることもある。選択剤としては、当業者には周
知のもの、例えばネオマイシン、ヒグロマイシン、マイ
コフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチン、アミノ
ブチリンまたはメトトレキセイト（ＭＴＸ）およびその
誘導体が例示される。
する形質転換された動物細胞を培養しようとする場合に
は、プラスミド形質転換の安定性を保つために該培地に
更にベクター中に含有された耐性遺伝子に相応する選択
剤を加えることもある。選択剤としては、当業者には周
知のもの、例えばネオマイシン、ヒグロマイシン、マイ
コフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチン、アミノ
ブチリンまたはメトトレキセイト（ＭＴＸ）およびその
誘導体が例示される。
【００２０】本発明の無血清培地で培養可能な動物細胞
としては、細胞株として有用な例として、ＶＥＲＯ、Ｈ
ｅｌａ細胞、ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒ
ｙ（ＣＨＯ）Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ 、Ｗ１３８、ＢＨＫ
、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ｃ１２
７、ＨＫＧ、Ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙＣｅｌｌ ｌｉ
ｎｅなどが挙げられる。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１（チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞 ： ＡＴＣＣ ＣＣＬ
６１）、ＢＨＫ（新生子ハムスター腎細胞 ： ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ１０）、ＣＯＳ−７（ＣＶ−１ Ｏｒｉｇｉ
ｎ，ＳＶ−４０細胞 ： ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）
、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎細胞 ： ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−８１） などがある。
としては、細胞株として有用な例として、ＶＥＲＯ、Ｈ
ｅｌａ細胞、ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒ
ｙ（ＣＨＯ）Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ 、Ｗ１３８、ＢＨＫ
、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ｃ１２
７、ＨＫＧ、Ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙＣｅｌｌ ｌｉ
ｎｅなどが挙げられる。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１（チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞 ： ＡＴＣＣ ＣＣＬ
６１）、ＢＨＫ（新生子ハムスター腎細胞 ： ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ１０）、ＣＯＳ−７（ＣＶ−１ Ｏｒｉｇｉ
ｎ，ＳＶ−４０細胞 ： ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）
、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎細胞 ： ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−８１） などがある。
【００２１】本発明の無血清培地を使用する動物細胞の
培養方法は、通常次の通りにして行われる。即ち、本発
明の無血清培地を使用する動物細胞の培養には、培養用
としてよく知られているディッシュ、フラスコ、ローラ
ーボトル、スピンナーフラスコあるいは中空糸を用いた
培養装置などの培養容器が使えるがこれらに限定されな
い。培養方法としては、上記の培養容器などで通常行わ
れる継代培養のほか、培養槽内から、連続的に、あるい
は間歇的に古い培養液を細胞を含んだまま、あるいは細
胞と分離して抜き出しつつ、それと見合う量の新しい培
養液を供給して、長期間培養条件を一定に制御しつつ細
胞を培養する連続的な培養法などが挙げられるが、特に
限定されない。
培養方法は、通常次の通りにして行われる。即ち、本発
明の無血清培地を使用する動物細胞の培養には、培養用
としてよく知られているディッシュ、フラスコ、ローラ
ーボトル、スピンナーフラスコあるいは中空糸を用いた
培養装置などの培養容器が使えるがこれらに限定されな
い。培養方法としては、上記の培養容器などで通常行わ
れる継代培養のほか、培養槽内から、連続的に、あるい
は間歇的に古い培養液を細胞を含んだまま、あるいは細
胞と分離して抜き出しつつ、それと見合う量の新しい培
養液を供給して、長期間培養条件を一定に制御しつつ細
胞を培養する連続的な培養法などが挙げられるが、特に
限定されない。
【００２２】本培地の使用により、その生育（増殖）に
支持体を必要とする付着細胞（ＣＨＯ細胞など）を、支
持体を用いない単独浮遊状態でも培養が可能となる。
支持体を必要とする付着細胞（ＣＨＯ細胞など）を、支
持体を用いない単独浮遊状態でも培養が可能となる。
【００２３】本発明で使用される形質転換された動物細
胞は、自体既知の手段にて調製することができる。
胞は、自体既知の手段にて調製することができる。
【００２４】当該形質転換細胞による異種蛋白質の発現
も、自体既知の手段にて行えばよい。かかる手段として
は、たとえば特開昭６１−１７７９８７号公報、特開昭
６３−１４６７８９号公報等に記載の方法などがあげら
れる。
も、自体既知の手段にて行えばよい。かかる手段として
は、たとえば特開昭６１−１７７９８７号公報、特開昭
６３−１４６７８９号公報等に記載の方法などがあげら
れる。
【００２５】本発明の異種蛋白質の製造方法によれば、
たとえばアンチトロンビン−ＩＩＩ 、プロウロキナー
ゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータ、Ｂ型肝炎表面
抗原、プレＳ−Ｂ型肝炎表面抗原、インターフェロン−
γ、コロニー形成刺激因子などの異種蛋白質を製造する
ことができる。
たとえばアンチトロンビン−ＩＩＩ 、プロウロキナー
ゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータ、Ｂ型肝炎表面
抗原、プレＳ−Ｂ型肝炎表面抗原、インターフェロン−
γ、コロニー形成刺激因子などの異種蛋白質を製造する
ことができる。
【００２６】
【実施例】以下に、本発明をより詳細に説明するために
実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定さ
れるものではない。
実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定さ
れるものではない。
【００２７】実施例１
■ 無血清培地（ＧＣＭ００１培地）の作製基礎培地
としてＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ（
１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３９，
２８５，ＪＡＭＡ １９９（１９５７） 〕１０．２ｇ
を用い、添加物としてインスリン１ｍｇ、ＢＰ（牛肉由
来ペプトン）５ｇ、トランスフェリン１０ｍｇ、ＨＳＡ
（ヒト血清アルブミン）１ｇ、ヒポキサンチン１３ｍｇ
、チミジン４ｍｇ、α−トコフェロール０．１３ｍｇお
よびセレン４μｇを用いて無血清培地（以下、「ＧＣＭ
００１培地」という。）１Ｌを作製した。
としてＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ（
１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３９，
２８５，ＪＡＭＡ １９９（１９５７） 〕１０．２ｇ
を用い、添加物としてインスリン１ｍｇ、ＢＰ（牛肉由
来ペプトン）５ｇ、トランスフェリン１０ｍｇ、ＨＳＡ
（ヒト血清アルブミン）１ｇ、ヒポキサンチン１３ｍｇ
、チミジン４ｍｇ、α−トコフェロール０．１３ｍｇお
よびセレン４μｇを用いて無血清培地（以下、「ＧＣＭ
００１培地」という。）１Ｌを作製した。
【００２８】■ 無血清培養による変異ヒトプロウロ
キナーゼ産生ＣＨＯ細胞（Ｕ７−２細胞）（特開昭６３
−１４６７８９号公報参照）の細胞増殖性および変異ヒ
トプロウロキナーゼ産生性における添加物依存性ＧＣＭ
００１培地からそれぞれの添加物を除いた培地でＵ７−
２細胞を培養し、対数増殖期の細胞を２０×１０４ 細
胞／ウェルで６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ，３０４６）
の各ウェルに植え込んだ。３７℃、５％二酸化炭素下で
４日間培養し、細胞数をコールターカウンターおよび血
球計算盤を用いて計測した。また、変異ヒトプロウロキ
ナーゼ産生性を測定するため、培養上清中のプラスミノ
ーゲンアクチベーター活性を平板法で調べた。
キナーゼ産生ＣＨＯ細胞（Ｕ７−２細胞）（特開昭６３
−１４６７８９号公報参照）の細胞増殖性および変異ヒ
トプロウロキナーゼ産生性における添加物依存性ＧＣＭ
００１培地からそれぞれの添加物を除いた培地でＵ７−
２細胞を培養し、対数増殖期の細胞を２０×１０４ 細
胞／ウェルで６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ，３０４６）
の各ウェルに植え込んだ。３７℃、５％二酸化炭素下で
４日間培養し、細胞数をコールターカウンターおよび血
球計算盤を用いて計測した。また、変異ヒトプロウロキ
ナーゼ産生性を測定するため、培養上清中のプラスミノ
ーゲンアクチベーター活性を平板法で調べた。
【００２９】結果は、図１に示す通りである。細胞増殖
性についてはＢＰとインスリンに、変異ヒトプロウロキ
ナーゼ産生性についてはインスリン、トランスフェリン
、ＨＳＡに強い要求性が認められた。
性についてはＢＰとインスリンに、変異ヒトプロウロキ
ナーゼ産生性についてはインスリン、トランスフェリン
、ＨＳＡに強い要求性が認められた。
【００３０】■ Ｕ７−２細胞のＧＣＭ００１培地に
おけるインスリン依存性の検討 上記■と同様の方法で試験を行った。結果は、図２およ
び図３に示す通りである。上記■の結果と同様、細胞増
殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生性ともにイン
スリンの依存性が高いことが明らかになった。また、図
２から明らかなように、細胞増殖性に関してはインスリ
ンの濃度に依存性があり、１ｍｇ／Ｌにおける結果が最
も優れていた。
おけるインスリン依存性の検討 上記■と同様の方法で試験を行った。結果は、図２およ
び図３に示す通りである。上記■の結果と同様、細胞増
殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生性ともにイン
スリンの依存性が高いことが明らかになった。また、図
２から明らかなように、細胞増殖性に関してはインスリ
ンの濃度に依存性があり、１ｍｇ／Ｌにおける結果が最
も優れていた。
【００３１】■ 細胞増殖性と変異ヒトプロウロキナ
ーゼ産生性におけるＧＣＭ００１培地の効果について比
較として血清含有培地としてＨａｍ’ｓ Ｆ１２（日水
製薬 （株） 製）に１０％非働化ウシ胎児血清（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ ＧｍｂＨ，Ｌｏ
ｔ．６９８０７１ ０２）を加えた培地を使用した。 また、無血清培地としてＡＳＦ（味の素 （株） 製）
を使用し、上記■と同様の方法で試験を行った。
ーゼ産生性におけるＧＣＭ００１培地の効果について比
較として血清含有培地としてＨａｍ’ｓ Ｆ１２（日水
製薬 （株） 製）に１０％非働化ウシ胎児血清（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ ＧｍｂＨ，Ｌｏ
ｔ．６９８０７１ ０２）を加えた培地を使用した。 また、無血清培地としてＡＳＦ（味の素 （株） 製）
を使用し、上記■と同様の方法で試験を行った。
【００３２】結果は、図４および図５に示す通りである
。ＧＣＭ００１培地は、比較として使用した無血清培地
より細胞増殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生性
ともにはるかに優れ、血清含有培地と同等の効果を示す
ことが明らかになった。
。ＧＣＭ００１培地は、比較として使用した無血清培地
より細胞増殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生性
ともにはるかに優れ、血清含有培地と同等の効果を示す
ことが明らかになった。
【００３３】■ ＧＣＭ００１培地を用いたスピンナ
ー培養 ＧＣＭ００１培地が長期の浮遊培養に使用できるかどう
か調べるために、バッチ法によるスピンナー培養を行っ
た。培養開始１週間後の細胞の浮遊状態は、ほとんどが
単個の細胞であったが、それ以後、数百個の細胞からな
ると思われるクランプが増加していった。そして、約１
ヶ月後には、ほぼ大きさの等しいクランプが多数を占め
るようになった。このクランプは、プロペラの回転を止
めるとすぐに沈降し、十数分間の静置により１０％程度
の細胞数の損失で培地交換ができた。３〜４日毎に２／
３量の培地を交換し、約３ヶ月間培養を続けた。その間
の細胞数と培養上清中のｍ−ＰＰＡ活性を図６に示した
。これによると、細胞数は１０６ 個から２×１０６
個の間を維持しており、ｍ−ＰＰＡ活性は、多少変動は
認められるが、概ね１００ＩＵ／ｍｌ以上を維持してい
た。
ー培養 ＧＣＭ００１培地が長期の浮遊培養に使用できるかどう
か調べるために、バッチ法によるスピンナー培養を行っ
た。培養開始１週間後の細胞の浮遊状態は、ほとんどが
単個の細胞であったが、それ以後、数百個の細胞からな
ると思われるクランプが増加していった。そして、約１
ヶ月後には、ほぼ大きさの等しいクランプが多数を占め
るようになった。このクランプは、プロペラの回転を止
めるとすぐに沈降し、十数分間の静置により１０％程度
の細胞数の損失で培地交換ができた。３〜４日毎に２／
３量の培地を交換し、約３ヶ月間培養を続けた。その間
の細胞数と培養上清中のｍ−ＰＰＡ活性を図６に示した
。これによると、細胞数は１０６ 個から２×１０６
個の間を維持しており、ｍ−ＰＰＡ活性は、多少変動は
認められるが、概ね１００ＩＵ／ｍｌ以上を維持してい
た。
【００３４】以上の結果から、ＧＣＭ００１培地を用い
ることによりＵ７−２細胞の増殖性および変異ヒトプロ
ウロキーゼ産生性について血清含有培地と同等の効果を
示すことが明らかになった。加えて、元来、付着・伸展
性増殖をする細胞を浮遊状態でも培養することが可能と
なり、ここに高密度培養も可能な浮遊培養系が確立され
た。
ることによりＵ７−２細胞の増殖性および変異ヒトプロ
ウロキーゼ産生性について血清含有培地と同等の効果を
示すことが明らかになった。加えて、元来、付着・伸展
性増殖をする細胞を浮遊状態でも培養することが可能と
なり、ここに高密度培養も可能な浮遊培養系が確立され
た。
【００３５】実施例２
■ ＧＣＭ００１培地における変異ヒトプロウロキナ
ーゼ産生ＤＨＦＲ活性欠損ＣＨＯ細胞（Ａｓｎ２４−Ｐ
ＰＡ産生細胞）（特願平２−１２３５７３号公報参照）
の細胞増殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生性Ａ
ｓｎ２４−ＰＰＡ産生細胞は、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈ
ａｓｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ），７７：４２１６（１９８０） に記載の方法
で調製され増殖させたＤＨＦＲ活性欠損ＣＨＯセルライ
ンから作製した。実施例１で得たＧＣＭ００１培地を使
用してＡｓｎ２４−ＰＰＡ産生細胞を培養し、対数増殖
期の細胞を２０×１０４ 細胞／ウェルで６穴プレート
（Ｆａｌｃｏｎ，３０４６）の各ウェルに植え込む。３
７℃、５％二酸化炭素下で６日間培養し、細胞数をコー
ルターカウンターおよび血球計算盤を用いて測定した。 また、変異ヒトプロウロキナーゼ産生性を測定するため
、培養上清中のプラスミノーゲンアクチベーター活性を
平板法で調べた。
ーゼ産生ＤＨＦＲ活性欠損ＣＨＯ細胞（Ａｓｎ２４−Ｐ
ＰＡ産生細胞）（特願平２−１２３５７３号公報参照）
の細胞増殖性および変異ヒトプロウロキナーゼ産生性Ａ
ｓｎ２４−ＰＰＡ産生細胞は、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈ
ａｓｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ），７７：４２１６（１９８０） に記載の方法
で調製され増殖させたＤＨＦＲ活性欠損ＣＨＯセルライ
ンから作製した。実施例１で得たＧＣＭ００１培地を使
用してＡｓｎ２４−ＰＰＡ産生細胞を培養し、対数増殖
期の細胞を２０×１０４ 細胞／ウェルで６穴プレート
（Ｆａｌｃｏｎ，３０４６）の各ウェルに植え込む。３
７℃、５％二酸化炭素下で６日間培養し、細胞数をコー
ルターカウンターおよび血球計算盤を用いて測定した。 また、変異ヒトプロウロキナーゼ産生性を測定するため
、培養上清中のプラスミノーゲンアクチベーター活性を
平板法で調べた。
【００３６】結果は、図７および図８に示す通りである
。
。
【００３７】
【発明の効果】本発明の無血清培地を使用することより
、従来の無血清培地に比し、短期間で順化が可能となる
。血清含有培地を使用した場合と同等の細胞増殖性およ
び蛋白産生性を示すことができ、又、長期継代培養も可
能である。また、該培地を使用することにより、元来、
付着・伸展性増殖でしか培養できなかった細胞を浮遊状
態でも培養することが可能となる。
、従来の無血清培地に比し、短期間で順化が可能となる
。血清含有培地を使用した場合と同等の細胞増殖性およ
び蛋白産生性を示すことができ、又、長期継代培養も可
能である。また、該培地を使用することにより、元来、
付着・伸展性増殖でしか培養できなかった細胞を浮遊状
態でも培養することが可能となる。
【図１】細胞数とプラスミノーゲンアクチベーター活性
をＧＣＭ００１培地での場合に対する比率で示した図で
ある。
をＧＣＭ００１培地での場合に対する比率で示した図で
ある。
【図２】細胞増殖性に及ぼすインスリン濃度の影響を示
した図である。
した図である。
【図３】変異ヒトプロウロキナーゼ産生に及ぼすインス
リン濃度の影響を示した図である。
リン濃度の影響を示した図である。
【図４】Ｕ７−２細胞のＧＣＭ００１培地での細胞増殖
性を示した図である。
性を示した図である。
【図５】Ｕ７−２細胞のＧＣＭ００１培地での変異ヒト
プロウロキナーゼ産生を示した図である。
プロウロキナーゼ産生を示した図である。
【図６】ＧＣＭ００１培地を用いたＵ７−２細胞のスピ
ンナー培養での細胞数およびｍ−ＰＰＡ活性を示した図
である。
ンナー培養での細胞数およびｍ−ＰＰＡ活性を示した図
である。
【図７】ＧＣＭ００１培地におけるＡｓｎ２４−ＰＰＡ
産生細胞の細胞増殖性を示した図である。
産生細胞の細胞増殖性を示した図である。
【図８】ＧＣＭ００１培地におけるＡｓｎ２４−ＰＰＡ
産生細胞の変異ヒトプロウロキナーゼ産生を示した図で
ある。
産生細胞の変異ヒトプロウロキナーゼ産生を示した図で
ある。
Claims (3)
- 【請求項１】 基礎培地にインスリン、ペプトン、ト
ランスフェリンおよびアルブミンを含有させることを特
徴とする無血清培地。 - 【請求項２】 動物細胞を請求項１記載の培地にて培
養することを特徴とする動物細胞の培養方法。 - 【請求項３】 形質転換させた動物細胞を請求項１記
載の無血清培地で培養して異種蛋白質を発現させること
を特徴とする異種蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2417059A JP2990805B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | 無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2417059A JP2990805B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | 無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04234982A true JPH04234982A (ja) | 1992-08-24 |
| JP2990805B2 JP2990805B2 (ja) | 1999-12-13 |
Family
ID=18525205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2417059A Expired - Lifetime JP2990805B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | 無血清培地、動物細胞の培養方法および異種蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2990805B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998000521A1 (fr) * | 1996-06-28 | 1998-01-08 | The Green Cross Corporation | Milieux exempts de serum, methode de culture de cellules d'origine animale, et procede de production de substances physiologiquement actives |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109234223B (zh) * | 2018-11-21 | 2021-01-19 | 南京基蛋生物医药有限公司 | 低蛋白无血清细胞培养基 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6062981A (ja) * | 1983-09-13 | 1985-04-11 | Green Cross Corp:The | 線維素溶解酵素 |
| JPH025859A (ja) * | 1988-01-18 | 1990-01-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | 動物およびヒト細胞用血清不含培地および培養方法 |
-
1990
- 1990-12-27 JP JP2417059A patent/JP2990805B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6062981A (ja) * | 1983-09-13 | 1985-04-11 | Green Cross Corp:The | 線維素溶解酵素 |
| JPH025859A (ja) * | 1988-01-18 | 1990-01-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | 動物およびヒト細胞用血清不含培地および培養方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998000521A1 (fr) * | 1996-06-28 | 1998-01-08 | The Green Cross Corporation | Milieux exempts de serum, methode de culture de cellules d'origine animale, et procede de production de substances physiologiquement actives |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2990805B2 (ja) | 1999-12-13 |
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