JPH04236000A - ライノウイルスが細胞レセプターに付着することを阻止する微生物発現モノクローナル部分抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ＨＲＶの主要グループの付着を防げること
が知られた抗体と、免疫アフィニィティクロマトグラフ
ィーを用いて、９０キロドルトン（ｋＤａ）の糖タンパ
ク質がＨｅＬａの細胞膜から単離され、ついでこれが感
受性細胞へのＨＲＶの主要グループの付着に必要なレセ
プタータンパク質であることが示された。精製された９
０ｋＤａレセプタータンパク質の生化学的特徴は、それ
が酸性糖タンパク質であって７つのＮ結合グリコシル化
部位を含むことを示した。最近のｃＤＮＡクローニング
実験では、そのレセプターが細胞間接着分子−１（ＩＣ
ＡＭ−１）として同定された。ＩＣＡＭ−１はリンパ球
機能関連抗原−１付着レセプター（ＬＦＡ−１）に関す
る細胞表面リガンドであり、それが５つの相同的な免疫
グロブリン様ドメインを含むと予想されることから免疫
グロブリンスーパーファミリーの１つである。一部の配
列相同性がＩＣＡＭ−１と成人神経系の他の接着タンパ
ク質、即ち神経細胞接着分子及びミエリン関連糖タンパ
ク質との間に存在する。ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との
相互作用は、白血球接着と白血球接着で媒介される免疫
学的及び炎症機能の発現に関して重要な役割を果たす。 ＬＦＡ−１はリンパ球接着タンパク質のＣＤ１８群の１
つである。この接着の結果として、リンパ球は外来抗原
の監視を含めて重要かつ有益な免疫学的機能を果たすこ
とができる。しかしながら、この同じ接着活性は移植片
拒絶、他の自己免疫疾患状態及び炎症起因性合併症のよ
うな望ましくない効果ももたらす。

【０００２】ＩＣＡＭ−１は血管内皮細胞、胸腺上皮細
胞、他のある種の上皮細胞及び繊維芽細胞、マクロファ
ージ、Ｔリンパ芽球、胚中心Ｂ細胞並びにリンパ節の樹
状細胞を含めた様々な細胞タイプの表面上に存在する糖
タンパク質である。ＩＣＡＭ−１は、休止又は静止細胞
ではなく炎症部位で主に発現される。高レベルのＩＣＡ
Ｍ−１発現は皮膚繊維芽細胞においてγ−インターフェ
ロン又はインターロイキン−１のようなサイトカイン類
との接触で誘導されうる。

【０００３】主要ＨＲＶグループのレセプターは最近ク
ローニングされてＩＣＡＭ−１として同定された９０ｋ
Ｄａの糖タンパク質である［グリーブ，Ｊ．Ｍ．ら，１
９８９年，セル，第５６巻，第８３９−８４７頁（Ｇｒ
ｅｖｅ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，（１９８９），
Ｃｅｌｌ，　５６，ｐｐ．８３９−８４７）及びトマシ
ニ，Ｊ．（Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ，　Ｊ．）ら，１９８９
年，ＰＮＡＳ，第８６巻，第４９０７−４９１１頁］。 副グループに関する細胞レセプターはより不明確であり
、１２０ｋＤａタンパク質として仮に同定されている。

【０００４】免疫原としてＨｅＬａ細胞膜を用いて、主
要グループのＨＲＶがＨｅＬａ細胞に結合して感染する
ことを特異的に阻止する１Ａ６と命名されたマウスＩｇ
Ｇ−１　　ｍＡｂが単離された［コローノ，Ｒ．Ｊ．ら
，１９８６年，ジャーナル・オブ・バイロロジー，第５
７巻，第７−１２頁（Ｃｏｌｏｎｎｏ，　Ｒ．　Ｊ．　
ｅｔ　ａｌ．，（１９８６），Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，　
５７，ｐｐ．７−１２］。加えて、１Ａ６及びそのタン
パク質分解によるＦａｂ断片は、インビトロで細胞結合
ＨＲＶビリオンと置き換わることができ、長期接触させ
ても分裂細胞に対する細胞毒性を示さなかった。これら
の研究は、１Ａ６によるレセプター遮断が高ウイルス力
価接種原の侵襲で回避できなかったことから、感受性細
胞へのウイルスのアクセスがＩＣＡＭ−１レセプターと
の相互作用でのみ行われることも立証した。これらの結
果は、１Ａ６がヒトにおける普通感冒の予防又は治療に
抗ウイルス剤として有用であることを示唆した。この見
解は、経鼻投与された１Ａ６がチンパンジーのＨＲＶ感
染を阻止しかつヒト臨床試験でＨＲＶ感染の臨床症状を
コントロールする上で有効であることを示す研究により
支持された［ハイデン，Ｆ．Ｇ．，１９８８年，アンチ
バイラル・リサーチ，第９巻，第２３３−２４７頁（Ｈ
ａｙｄｅｎ，　Ｆ．　Ｇ．，（１９８８），Ａｎｔｉｖ
ｉｒａｌ　Ｒｅｓ．，　９，ｐｐ．２３３−２４７）］
。

【０００５】ＩＣＡＭ−１は喘息、慢性気管支炎、肺気
腫及び特発性肺線維症を含めた他の疾患にも関与してい
る可能性がある。ＩＣＡＭ−１は鼻炎、鼻ポリポーシス
、慢性じんま疹及びアトピー性皮膚炎を含めた好酸球浸
潤及び組織感作で特徴付けられる他の疾患の開始及び進
行にも関与している可能性がある。

【０００６】本発明の目的は自然抗体の抗原認識性を保
存した組換え宿主細胞で産生される抗体分子の部分を提
供することである。細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１
）に特異的で、組換え宿主細胞で産生される、抗体分子
の部分を提供することが本発明のもう１つの目的である
。本発明のもう１つの目的は、細胞レセプターＩＣＡＭ
−１への主要ＨＲＶグループの付着を妨げるか又は付着
したＨＲＶをそれから離すことができる抗体分子の部分
を提供することである。ＩＣＡＭ−１に結合し、かつ細
胞間接着分子としてのＩＣＡＭ−１の生物活性及び機能
を阻害でき、かつ組換え宿主細胞で産生される抗体分子
の部分を提供することも本発明の目的である。本発明の
もう１つの目的は、細胞レセプターＩＣＡＭ−１への主
要ＨＲＶグループの付着を妨げるか又は付着したＨＲＶ
をそれから離すことができる組換え宿主細胞で産生され
る抗体の部分を含有したヒト投与用医薬処方剤を提供す
ることである。本発明の他の目的は、ＩＣＡＭ−１に結
合しかつ細胞間接着分子としてのＩＣＡＭ−１の生物活
性及び機能を阻害でき、かつ組換え宿主細胞で産生され
る抗体分子の部分を含有したヒト投与用医薬処方剤を提
供することである。本発明のこれら及び他の目的は以下
の記載から明らかであろう。

【０００７】本発明を要約すると、ＩＣＡＭ−１に特異
的なｍＡｂの抗原認識領域をコードする相補的ＤＮＡ（
ｃＤＮＡ）断片がクローニングされた。これらのｃＤＮ
Ａは組換え宿主細胞で発現され、発現物は精製され、そ
れらが由来した自然抗体の抗体−抗原相互作用の生物学
的性質を有することが示された。特に、その組換え抗体
部分はＩＣＡＭ−１に結合して、主要ＨＲＶグループが
それらの細胞レセプターであるＩＣＡＭ−１へ付着する
のを妨げることができる。加えて、組換え抗体部分は付
着したＨＲＶをＩＣＡＭ−１から引き離す。これらの組
換え抗体断片は、炎症及び他の自己免疫疾患とＨＲＶ感
染を含めてＩＣＡＭ−１が関与する多くのヒト疾患の予
防又は改善用医薬処方剤において有用である。

【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。ＩＣＡＭ
−１はリンパ球機能関連抗原−１レセプター（ＬＦＡ−
１）に関するリガンドとして機能する細胞表面糖タンパ
ク質である。ＩＣＡＭ−１は感受性細胞における主要Ｈ
ＲＶグループの付着に関するレセプターでもある。ＩＣ
ＡＭ−１は５つの相同な免疫グロブリン様ドメインを含
むと予想されることから、それは免疫グロブリンスーパ
ーファミリー（超遺伝群）の１つである［シモンズ，Ｄ
．ら，１９８８年，ネーチャー，第３３１巻，第６２４
−２７頁（Ｓｉｍｍｏｎｓ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，（
１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，　３３１，ｐｐ．６２４−２
７）］。ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との相互作用は、白
血球接着と、白血球接着で媒介される免疫学的及び炎症
機能の発現に関して重要な役割を果たす。ＬＦＡ−１は
リンパ球接着タンパク質のＣＤ１８群の１つである。Ｃ
Ｄ１８リンパ球接着タンパク質に結合する抗体は、内皮
細胞への顆粒球の接着を含めて接着に依存したリンパ球
機能をインビトロで阻害することが示された［スミス，
Ｃ．Ｗ．ら，１９８８年，ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・インベスティゲーション，第８２巻，第１７４６−
５６頁（Ｓｍｉｔｈ，　Ｃ．　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，（
１９８８），Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　８
２，ｐｐ．１７４６−５６）］。

【０００９】更に、遺伝性遺伝子欠陥である白血球接着
不全疾患の個体はＣＤ１８関連タンパク質を産生しない
。その結果、これら個体の顆粒球は、前記抗ＣＤ１８抗
体の存在下の正常顆粒球で観察されたのと同じ接着不能
を示す。したがって、ＣＤ１８は白血球が他の白血球、
血管内皮細胞及び他の非血管細胞を含めた様々な細胞に
接着することを可能にする。ＣＤ１８タンパク質が付着
のために結合するリガンドはＩＣＡＭ−１である。

【００１０】炎症は特異的抗原に対する宿主免疫系の反
応及び応答から生じる。ある種の自己免疫疾患及びＴ細
胞媒介遅延型過敏症がこのタイプの炎症例である。白血
球接着は移植片拒絶及び組織移植片拒絶を含めた他の病
状にも関与する。白血球接着に起因する望ましい免疫機
能の一部としては抗体産生と、ウイルス感染細胞の破壊
がある。

【００１１】したがって、ＩＣＡＭ−１は白血球が様々
な機能を発揮するために結合しうる細胞基質である。Ｉ
ＣＡＭ−１分子は遅延型過敏症を含めた炎症部位で高レ
ベルで発現されるため、ＩＣＡＭ−１で媒介される細胞
付着を遮断することにより炎症応答を変えることができ
る。

【００１２】抗体又は組換え発現された抗体分子部分が
ＩＣＡＭ−１と結合できるならば、抗体又は組換え発現
された抗体分子部分は炎症応答の減少又は消失に関して
有意の治療価値を有する。抗体又はその組換え産生部分
は炎症応答の前又は最中に個体に投与されて、その結果
を緩和する。

【００１３】抗原認識決定基を有するｍＡｂのタンパク
質ドメインは残りの抗体分子から切り離されても、それ
らの抗原結合能力を保持していることが可能である。抗
体（例えばＩｇＧ）のＦａｂ部分は全抗体の約１／３（
約５５キロドルトン）であって、一価の抗原結合能力を
示す（図１参照）。Ｆａｂの構造は全免疫グロブリン分
子よりも著しく簡単であり、Ｆａｂは全ＩｇＧ分子でみ
られる１６ジスルフィド結合のうち５のみを有する（図
１参照）。Ｆａｂ部分は抗原結合部位を含み、２本の異
なるポリペプチド鎖、即ち第一定常ドメイン及びヒンジ
領域の一部を含むＨ鎖可変ドメインと、全Ｌ鎖から構成
される。２本の鎖（Ｈ及びＬ）は各鎖の定常ドメイン間
で単一のジスルフィド結合により共有結合されている。 Ｆａｂは更に分断されて、Ｆｖと表示された一価で抗原
と結合しうる小さな（約２５ＫＤ）分子を生じる（図１
参照）。Ｆｖは抗原結合部位を含み、非共有結合的に連
関したＨ及びＬ鎖可変ドメインのみから構成される。全
Ｆｖ部分の抗原アフィニティは対応Ｆａｂと一致し、こ
の対応Ｆａｂのアフィニティはその対応免疫グロブリン
分子と一致する。

【００１４】Ｆａｂ及び一本鎖Ｆｖ部分の双方は哺乳動
物細胞培養物及び大腸菌を含めた組換え宿主細胞で発現
された。Ｆａｂ及びＦｖは、それらの小さなサイズのお
かげで更に効率的に組織境界を透過しうる点で、治療及
び診断用として完全抗体よりも有利である。更に、大腸
菌のような組換え宿主において発現できるということは
Ｆａｂ及びＦｖの高レベル産生へのスケールアップを極
めて容易にする。加えて、組換えＤＮＡ技術を抗体部分
の構造を変えるために用いることができる。このような
変換の例はマウス抗体分子のマウス定常領域をヒトの定
常領域に変換することであって、“ヒト化”抗体又は抗
体部分を形成する。ヒト定常領域は、マウス定常領域を
含んだ抗体の場合よりも、その抗体部分をヒト被験者に
投与した場合免疫応答を誘導しにくいようである。

【００１５】組換えＤＮＡ技術により、異なる種、異な
る免疫グロブリンクラス、あるいは抗原特異性の異なる
供給源からのＬ及びＨ鎖部分を組合わせたり、可変及び
定常領域間の融合箇所を変えて、抗体分子又はその部分
に更に変更を加えることができる。抗体又はその部分は
、例えば更に高い抗原アフィニティを有したり、別の定
常領域で見出された改良点を取込むように組立てること
ができる。

【００１６】これらのタンパク質が大腸菌で発現される
場合、変性、再生、さらにＨ及びＬ鎖が適切な二次及び
三次構造の生物活性分子を形成するために適正な比率で
混合することを要する。これらの問題の解決に役立てる
ため、Ｆｖの２成分（Ｈ及びＬ鎖）は融合ポリペプチド
鎖として宿主細胞で組換え合成できる。加えて、ジスル
フィド結合形成を除くためシステイン残基はヌクレオチ
ド置換で除去しうる。

【００１７】感受性細胞上のウイルスレセプターへのＨ
ＲＶの結合を阻止するｍＡｂを得るため、マウスを全ヒ
ト細胞及びＨＲＶレセプター部位に富むヒト細胞膜、例
えばＨｅＬａ細胞で免疫した。ハイブリドーマは免疫マ
ウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合させて産
生された［コロノら，ジャーナル・オブ・バイロロジー
，第５７巻，第７−１２頁，１９８６年（Ｃｏｌｏｎｎ
ｏ　ｅｔａｌ．，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，５７，ｐｐ．
７−１２，１９８６）］。各々が感受性細胞のレセプタ
ー部位へのＨＲＶの付着を阻止できる３種のｍＡｂ、即
ち１Ａ６、２Ｃ２及び１８Ｂ９が選択された（図２）。 この分析から１Ａ６、２Ｃ２、１８Ｂ９は感受性細胞へ
の少なくとも９１種の異なる血清型のＨＲＶ付着を阻止
しうる能力があることが実証された。各々のｍＡｂの存
在下で感染できない特定ウイルス血清型及び感染できる
ウイルスの血清型は表１で示されている。

【００１８】これらの実験から、ＨＲＶは主要グループ
及び副グループからなることがわかった。主要グループ
はこれらｍＡｂの存在下で感染できず、一方副グループ
はｍＡｂの存在下で感染できる。これらのｍＡｂは感受
性細胞と強く結合し、既に細胞と結合したＨＲＶよりも
細胞レセプターに対して大きな結合活性を有することも
わかった（コロノ，Ｒ．Ｊ．ら，１９８６年，ジャーナ
ル・オブ・バイロロジー，第７−１２頁）。

【００１９】ｍＡｂ及びその組換え発現された部分（例
えば、Ｆａｂ及び一本鎖Ｆｖ）は、ＨＲＶ感染の予防又
はＨＲＶ感染の持続期間及び重篤度を改善するために有
用である。ｍＡｂ又はＦａｂ及び一本鎖Ｆｖを含めたそ
の組換え発現部分で感受性細胞を処置すると、過剰抗体
の除去後５０時間までもの期間にわたり細胞をＨＲＶ感
染耐性にする。

【００２０】ＩＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡがクロ
ーニングされて特徴付けられた［トマシニ，Ｊ．Ｅ．ら
，１９８９年，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ），第８６巻
，第４９０７−１１頁］。ＩＣＡＭ−１　　ｃＤＮＡの
断片はインビトロで転写かつ翻訳され、一連のＣＯ２Ｈ
末端切除がおこる。ｍＡｂの１Ａ６、２Ｃ２及び１８Ｂ
９を用いたこれらＩＣＡＭ−１断片の免疫沈降は、ＩＣ
ＡＭ−１におけるｍＡｂ結合部位を確認するために用い
られた。

【００２１】ＩＣＡＭ−１ポリペプチドのサブセットを
用いた実験では、ｍＡｂの１Ａ６、２Ｃ２及び１８Ｂ９
が成熟ＩＣＡＭ−１分子の最初の８２アミノ酸を表すＮ
Ｈ２末端ＩＣＡＭ−１断片を認識かつ免疫沈降できるこ
とを明らかに示した（図７参照）。ＩＣＡＭ−１のこの
部分は成熟ＩＣＡＭ−１の５つの予想ドメインのうちド
メイン１のみを含む。したがって１Ａ６、２Ｃ２及び１
８Ｂ９はＩＣＡＭ−１のドメイン１に特異的である。

【００２２】全鎖長ｃＤＮＡクローン（ｐＨＲＶｒ１）
は、５３２アミノ酸をコードしかつ１３３３ヌクレオチ
ドの３’非コード領域を含んだヌクレオチド７２で始ま
る単一の大きなオープン読取枠を有することが示された
。シグナル配列及び膜貫通配列はそれぞれ分子のＮＨ２
及びＣＯ２Ｈ末端領域近くに存在すると予想される。全
鎖長サブクローンがｐＧＥＭ４Ｚ転写ベクターに挿入さ
れてｐＧＥＭ−ＩＣＡＭが形成された。クローン化され
る配列の向きは、５’末端がファージＳＰ６プロモータ
ーのすぐ下流となるようになっている。このため、特定
ＩＣＡＭ−１　　ｍＲＮＡがＳＰ６　　ＲＮＡポリメラ
ーゼで直鎖化プラスミドＤＮＡから転写できる。転写前
に、プラスミドＤＮＡはＩＣＡＭ−１レセプター分子の
選択ドメインについてコードするＲＮＡ断片を形成しう
る好都合な制限酵素で開裂された。

【００２３】ウサギ網状赤血球溶解物中における、得ら
れたＲＮＡのインビトロ翻訳により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で測定したところ予想分子量のポリペプチドを生成した
。ＩＣＡＭ−１は膜タンパク質であって７つのＮ結合グ
リコシル化部位を含むことが示されたことから、イヌミ
クロソーム膜がＩＣＡＭ−１分子の二次構造形成を最適
化するため翻訳混合物に加えられた。

【００２４】ミクロソーム膜及び２ｍＭ酸化グルタチオ
ンの存在下における全鎖長ＩＣＡＭ−１　　ｍＲＮＡの
翻訳で、分子サイズ約５５及び７０ｋＤａの２つの主タ
ンパク質バンドを得た。高分子量側のバンドは、おそら
くミクロソーム膜に関連したグリコシル化活性に起因し
ているであろう。１６ｋＤａポリペプチドを常に形成す
るドメイン１断片を除く、他のＩＣＡＭ−１　　ＲＮＡ
の場合にも、大きい方のタンパク質種が各々観察された
。この結果は、ドメイン１アミノ酸配列がグリコシル化
可能部位を欠くことから予想された。

【００２５】免疫沈降実験が行われ、ミクロソーム膜存
在下で合成されたＩＣＡＭ−１ポリペプチド断片の各々
が各ｍＡｂで特異的に沈降されることが立証された（図
７）。８２アミノ酸ほどの短いポリペプチドの放射線標
識タンパク質でもなお３種すべてのｍＡｂで認識された
。２種の抗体特異性コントロールがこれらの実験に組込
まれた。第一コントロールはＣＤ４レセプターを認識す
るｍＡｂ　　ＯＫＴ４の並行試験であり、第二コントロ
ールは各免疫沈降サンプルへの放射線標識グロビン又は
酵母接合因子の添加であった。ｍＡｂ　　ＯＫＴ４はＩ
ＣＡＭ−１ポリペプチドを認識できずかつグロビンは抗
ＩＣＡＭ−１　　ｍＡｂで免疫沈降されなかったことか
ら、これら双方のコントロールは免疫沈降が特異的であ
ることを示した。

【表１】

【００２６】ｍＡｂ、又はＦａｂ及び一本鎖Ｆｖを含む
その組換え発現部分は、ドロップの形で又はスプレーと
して投与に適した局所処方剤に製造される。抗体分子の
組換え部分は注射目的用の医薬組成物として投与しもよ
い。適切な液体の補助で、組換え抗体断片は液体の形で
注射製品に用いることができる。これらの医薬組成物は
薬学上許容されるキャリアと共に薬学上有効量の組換え
タンパク質を含有している。患者は炎症を直すか又は少
なくとも炎症度を減少させる上で有効な炎症減少量の組
換えタンパク質を用いて例えば非経口的に治療できる。 用量は患者の年令、体重及び一般的身体状態のような医
者によく知られかつ理解される因子に応じて勿論変わる
。一般に患者体重ｋｇ当たり抗体部分約１ｐｇ〜１０ｍ
ｇの用量範囲で投与されるが、更に高い又は低い用量も
用いてよい。

【００２７】経鼻エアゾール吸入で投与される場合、処
方剤はベンジルアルコールもしくは他の適切な保存剤、
生体利用性を高める吸収促進剤、フッ化炭素及び／又は
当業界で公知の他の溶解もしくは分散剤を用いて塩水溶
液として製造してもよい。投与量は約１μｇ〜約１ｍｇ
の範囲内であり、約２〜約１２時間の間隔で投与される
。典型的な処方剤では安定剤、例えば２０％ＳＰＧＡを
含有したＰＢＳ中で本発明のｍＡｂ断片を用いる。

【００２８】１Ａ６、２Ｃ２及び１８Ｂ９ハイブリドー
マＨ及びＬ鎖の全鎖長ｃＤＮＡクローンが単離され、ポ
リメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて大腸菌内発現
用に修正された。ＦａｂＨ鎖（当業界でＦｄと称される
）及びＬ鎖の発現のため、唯一のＮｄｅＩ部位及び開始
メチオニンコドンがＨ及びＬ鎖どちらにおいてもシグナ
ルペプチダーゼ開裂部位をコードする配列のすぐ５’側
に挿入された。Ｈ鎖クローンにおいて、終止コドンとそ
れに続くＢｇｌＩＩ部位は、Ｈ及びＬ鎖を正常に架橋す
るシステインの１残基先のアミノ酸２３６［カバット・
ナンバリング・システム（Ｋａｂａｔ　ｎｕｍｂｅｒｉ
ｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）］［カバット，Ｅ．Ａ．ら、１９
８７年、免疫学的に重要なタンパク質の配列（Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），第４版、米
政府印刷局、ワシントン　Ｄ．Ｃ．］の後に挿入された
。Ｌ鎖発現のために、ＢｇｌＩＩ部位が自然終止コドン
の３’側に導入された。Ｈ及びＬ鎖双方のＤＮＡは発現
ベクターｐＥＴ−３ａ［ローゼンバーグ，Ａ．Ｈ．ら、
１９８７年、ジーン、第５６巻、第１２５−１３５頁（
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，　Ａ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，（１
９８７），Ｇｅｎｅ，５６，ｐｐ．１２５−１３５）］
に組込んでクローニングされ、ｐＧ１（Ｈ鎖、図３）及
びｐＫ１（Ｌ鎖、図４）を形成した。ＩＰＴＧによる遺
伝子発現の誘導で、約１４０ｍｇ／ｌ培養物（５ｇ／ｌ
湿潤細胞ペレット重量）又は全細胞タンパク質の約３５
〜４０％に達する予想タンパク質の高レベル発現を得た
。パルス標識実験では、これらのタンパク質が誘導期に
合成された全タンパク質の９０〜１００％を占めること
を示した。誘導されたタンパク質の同一性はペプチド由
来抗血清を用いたウエスターンブロット法及びＮＨ２末
端配列分析で確認された。発現された抗体断片の各々は
ＩＰＴＧ誘導後に不溶性封入体として蓄積され、６Ｍグ
アニジンＨＣｌ存在下で可溶化され、還元及び酸化グル
タチオン含有緩衝液中希釈条件下で再生された。次いで
組換えＦａｂは破壊細胞ペレットからのＨ及びＬ鎖を等
量混ぜてそれらを還元、再酸化及び透析に付すことによ
りアセンブリーされた。最終精製はＨＰＬＣゲル濾過で
行われ、純度（９５％以上）はＳＤＳ−ＰＡＧＥで視覚
的に判定された。

【００２９】組換えＦａｂが生物活性を有するかどうか
を調べるため、ＨｅＬａ細胞膜への３５Ｓ−メチオニン
標識ＨＲＶ−１５の結合を阻止しうるそれらの能力が測
定された（図６）。組換えＦａｂ及び完全抗体からタン
パク質分解で誘導されたＦａｂ断片は再生後も生物活性
であり、各々０．３及び０．２ｐｍｏｌ／４０μｌでウ
イルス結合の最大阻害の２分の１を示した。完全抗体は
０．１ｐｍｏｌ／４０μｌ反応液で最大阻害の２分の１
を示した。

【００３０】発現されたタンパク質の複雑性を減少させ
るため、Ｌ可変ドメイン（ＶＬ）のＣＯ２Ｈ末端がＨ可
変ドメイン（ＶＨ）のＮＨ２末端に共有結合された組換
え一本鎖Ｆｖが組立てられた。一本鎖ＦｖにおいてＨ可
変ドメインのＣＯ２Ｈ末端がＬ可変ドメインのＮＨ２末
端に共有結合されるようにＨ及びＬ可変ドメインの順序
が交換されてもよいことは、当業者にとって容易に明ら
かである。第一のこのような組換えｐＳＣＶ１（図５）
において、Ｌ鎖Ｇｌｕ−１２４がＨ鎖Ｇｌｕ−１に直接
結合された。適正なＶＬ−ＶＨ相互作用にとって十分な
伸縮柔軟性を維持しながらペプチドリンカーを伸ばすた
めに、更に二つの組換え体ｐＳＣＶ２及びｐＳＣＶ３が
組立てられた。これらはＬ鎖Ｓｅｒ−１２２とＨ鎖Ｇｌ
ｕ−１との間に伸縮柔軟性リンカー配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを各々モノマー（ｐＳＣＶ２）又はダ
イマー（ｐＳＣＶ３）としてコードする。これらの組換
え体もＬ及びＨ　Ｆａｂ鎖よりやや少ない量（約５０ｍ
ｇ／ｌ培養物）であるがＳＤＳ−ＰＡＧＥでみたところ
期待されたサイズ（約２５ＫＤ）のタンパク質を発現し
た。一本鎖ＦｖもＦａｂに関して前記されたように溶解
、再生及び精製された。組換えＦａｂ及び一本鎖Ｆｖの
最終回収量は各々４〜５ｍｇ／ｌ及び１０〜１２ｍｇ／
ｌ培養物であった。

【００３１】ｐＳＣＶ１でコードされたタンパク質は一
本鎖Ｆｖの最も活性の低いものであり、４ｐｍｏｌ／４
０μｌ反応液で最大阻止の２分の１を示した。ｐＳＣＶ
２及びｐＳＣＶ３でコードされたタンパク質は約３倍高
い活性を有し、１．５ｐｍｏｌで最大阻害の２分の１を
示した。モノマー又はダイマーＧｌｙ４Ｓｅｒリンケー
ジ一本鎖Ｆｖ間の活性に関して有意差はなく、このこと
はドメイン間リンカーペプチドの許容鎖長に関して著し
い伸縮柔軟性があることを示唆している。したがって、
リンク部分の長さのわずかな変更で実質上異なる又は新
たな性質又は活性のある一本鎖Ｆｖの形成をおこさない
ことは当業者にとって容易に明らかである。

【００３２】抗体分子のＦｖ部分を構成する各Ｈ及びＬ
鎖は、個別的に発現された後、溶解、再生及び精製に関
する同様の操作を用いてＦａｂに関して行われた場合と
同様にＦｖにアセンブリー化してもよい。したがって、
本発明の一本鎖Ｆｖが一本の連続ペプチド分子として発
現されたことは必須でない。

【００３３】ＨｅＬａ単層細胞は実施例５で記載される
ように各抗体部分で個別的に前処理され、連続希釈され
、しかる後ＨＲＶ−１４を感染させた。３４℃で２４時
間のインキュベート後、単層細胞はＨＲＶの細胞溶解性
感染に起因する細胞変性効果の徴候に関して試験された
（図６参照）。完全１Ａ６は８４ｎｇ／ｍｌ（０．６ｎ
Ｍ）ほどの低濃度で防御効果があった。組換えＦａｂ及
び完全抗体からタンパク質分解で得られた自然Ｆａｂ断
片は双方とも７４０ｎｇ／ｍｌ（１６ｎＭ）の濃度まで
保護的であった。一本鎖Ｆｖは有意の活性を示し、２．
２〜６．７μｇ／ｍｌ（８４〜２５０ｎＭ）以上の範囲
で保護的であった。

【００３４】最初に発現したＨ及びＬ鎖は各々５つのシ
ステイン残基を含んでいた。各鎖においてシステイン残
基のうち４つは通常免疫グロブリンドメインを形成する
鎖内ジスルフィド架橋に関与するが、一方５番目はＨ及
びＬ鎖を共有結合させる鎖間ジスルフィド結合に関与す
る。オリゴヌクレオチド特異的変異が、Ｃｙｓ−２１４
を欠失させるためＬ鎖ｃＤＮＡクローンに、Ｃｙｓ−２
３５をＡｌａに変えるためＨ鎖ｃＤＮＡにそれぞれ導入
された。これらの修正はＨ及びＬ鎖を正常に連結するジ
スルフィド結合を欠失させる。発現及び再生後、ジスル
フィド欠損Ｆａｂ（Ｆａｂ（−ＳＳ））はＨＰＬＣゲル
濾過で自然及び組換えＦａｂと同じ保持時間を示したが
、これはＨ及びＬ鎖間の非共有結合相互作用を示唆する
。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥではＦａｂ（−ＳＳ）のＨ及
びＬ鎖はモノマーとして移動し、一方コントロールのタ
ンパク質分解によるＦａｂ及び組換えＦａｂはダイマー
として移動することを示した。この結果は、Ｆａｂ（−
ＳＳ）のＨ及びＬ鎖が非共有結合相互作用で互いに保た
れていることを示す。Ｆａｂ（−ＳＳ）はウイルス結合
アッセイで野生型組換えＦａｂと区別できず（図６）、
これは鎖間ジスルフィド結合が抗体−抗原結合にとり重
要でないことを実証した。

【００３５】これらの結果は、ＩＣＡＭ−１に特異的な
免疫グロブリン鎖の組換え産生サブ部分が大腸菌で豊富
に発現され、効率的に精製されて、組換え部分抗体がＩ
ＣＡＭ−１に結合する点で生物活性を維持した部分抗体
分子に再生しうることを示す。

【００３６】ＩＣＡＭ−１に特異的なｍＡｂの組換え部
分をコードする本発明の新規アミノ酸配列は、ＩＣＡＭ
−１に結合しうる抗体分子の組換え部分をコードする一
連のアミノ酸配列の例であることが理解される。他の変
異アミノ酸配列も同様のＩＣＡＭ−１結合効果を有する
。例えば、本発明の抗体分子の組換え部分の配列におけ
る保存的アミノ酸置換にも本発明の原則及び実施のいか
なる実質的又は新たな修正もおこさない。保存的置換は
公知である：エルファシー，Ｅ．ら、ジャーナル・オブ
・セオレティカル・バイオロジー、第１２１巻、第３７
１頁、１９８６年［Ｅｌｆａｓｓｉ，　Ｅ．　ｅｔ　ａ
ｌ．，　Ｊ．　Ｔｈｅｏｒ．　Ｂｉｏｌ．，　１２１，
ｐｐ．３７１（１９８６）］参照。一方、本発明の組換
えタンパク質の内部又はいずれかの末端における小さな
挿入又は欠失も本発明の原則及び実施に影響を与えない
。本出願においてＩＣＡＭ−１と結合しうる抗体分子の
組換え部分は、抗体分子の組換え部分が精製後にＩＣＡ
Ｍ−１と免疫化学的に反応性である限り、保存的アミノ
酸置換、挿入、欠失又は他のプロセスによるかどうかに
かかわらずアミノ酸配列においてこのようないかなる変
更も含んでよいことが理解されるであろう。

【００３７】下記実施例は本発明について示すが、しか
しながら本発明をそれに限定するわけではない。 実施例１ ウイルス増殖及び精製 ＨＲＶ−１４はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ
　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州ロックビル
）ＡＴＣＣ　　ＶＲ−２８４及び標準技術で精製された
プラークから得た［イン（Ｙｉｎ）ら、１９７３年、ジ
ャーナル・オブ・バイロロジー、第１２巻、第１０８−
１１３頁］。プラーク精製ＨＲＶは標準操作で誘導され
たＨｅＬａ細胞のサブクローンＨｅＬａＲ１９細胞で増
殖させた［コラーら、１９８３年、ハイブリドーマ、第
２巻、第９１−９６頁（Ｃｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，
　（１９８３），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，　２，ｐｐ．９
１−９６）］。細胞は増殖培地（ＧＭ）、即ち１０％牛
胎児血清、３０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、２０単位／ｍｌペ
ニシリン及び２０μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有マ
ッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地でルーチン的に増殖させ
た。ＨｅＬａ　　Ｒ１９単層培養をＭＯＩ１で感染させ
、細胞がフラスコ表面から遊離したとき（通常１６〜２
４時間）に回収した。細胞懸濁物を凍結及び急速に解凍
して、細胞からウイルス粒子を放出させた。遅い速度の
遠心による清澄化後（４℃，４０００ｘｇで５分間）、
ポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ−６０００）
及びＮａＣｌを各々７％及び２．２％の濃度まで加え、
混合物を４℃で４〜１６時間攪伴した。沈降ウイルスを
遠心（４℃、１０，５００ｘｇで１５分間）により回収
し、１０ｍＭ　　Ｒ緩衝液［ｐＨ７．５の１０ｍＭトリ
スＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）
、０．２Ｍ　　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２及び
１０％グリセロール］に懸濁した。デオキシコール酸ナ
トリウム及びポリオキシエチレン（９）オクタフェノー
ルを各々０．３％及び０．６％の濃度まで加え、氷上で
３０分間インキュベートし、懸濁液を遠心（４℃、４０
００ｘｇで５分間）により清澄化した。上澄（７．５ｍ
ｌ）を無グリセロールＲ緩衝液中４０〜６０（ｗ／ｖ）
メトリザミドの５ｍｌ直線密度勾配にのせた。ウイルス
サンプルの等密度バンド化を１５０，０００ｘｇで２４
時間の遠心により行った。ウイルスバンドは勾配中で通
常肉眼で最も濃いバンドであり、底穿刺で人手により回
収した。 Ｒ緩衝液で３倍希釈後、ウイルスを２００，０００ｘｇ
で２時間の遠心により再びペレットとした。

【００３８】実施例２ ＨｅＬａ　Ｒ１９細胞によるマウスの免疫５０ｍＭ　　
ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３７℃、２０分
間の処理により組織培養単層から回収されたＨｅＬａ　
　Ｒ１９細胞を含有する溶液を成熟ＢＡＬＢ／Ｃマウス
に腹腔内（ＩＰ）注射した。各マウスは０．５ｍｌ容量
の完全フロイントアジュバントに懸濁された３×１０６
細胞を受容した。３８日間後、マウスを容量０．５ｍｌ
不完全フロイントアジュバント中の１×１０７　　Ｈｅ
ＬａＲ１９細胞でＩＰ再接種した。

【００３９】ＨＲＶ−１４感染から細胞を保護する抗体
（実施例１４参照）に関して血清が陽性であるマウス３
匹は１１６日目、細胞融合の４日前に２ＯＤ２８０単位
／マウスの注射で感作された。動物の死亡時に集められ
た血清は、ＨＲＶ−１４注射からＨｅＬａ細胞を保護で
きる抗体の存在を示した。もう一つの実験では成熟ＢＡ
ＬＢ／Ｃマウス３匹を下記スケジュールで免疫した：１
日目及び４２日目に細胞膜調製物を用いた２回のＩＰ接
種しかる後２１４日目に膜＋不完全フロイントアジュバ
ントの最終皮内接種を行い、３日後に細胞融合を実施例
１４で記載するように行った。

【００４０】実施例３ ＨｅＬａ細胞膜の調製 ＨｅＬａ　　Ｒ１９細胞単層を３７℃で２０分間５０ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで処理した。細胞を低速遠心
で回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をペレット化し
、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に再懸
濁し（８×１０７細胞／ｍｌ）、氷上に２５分間おいた
。次いで細胞をドーンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモゲナイザ
ー内において２０ストロークで破壊し、核を遠心（４℃
１０００ｘｇで５分間）で除去した。上澄を捨て、膜を
４℃、１４２，０００ｘｇで１時間かけペレット化した
。上澄を捨て、粗膜ペレットを４２ＯＤ２８０単位／ｍ
ｌでＰＢＳに溶解し、−７０℃で貯蔵した。

【００４１】実施例４ 免疫マウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞の融合によ
るハイブリドーマの産生 マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０）は凍結種ストック
からＨＴ培地で増殖させた。各１００ｍｌのＨＴ培地は
ダルベッコ改良イーグル培地６６ｍｌ、牛胎児血清（Ｆ
ＣＳ）２０ｍｌ、イーグル平衡塩含有ＮＣＴＣ１０９［
ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）］１０ｍｌ、２００ｍＭ　　Ｌ−
グルタミン２ｍｌ、蒸留水３００ｍｌ中ヒポキサンチン
４０８ｍｇ及びチミジン１１４ｍｇ含有溶液１ｍｌ、Ｏ
ＰＩ原液（水１００ｍｌ中シス−オキサロ酢酸１．５ｇ
、ピルビン酸０．５ｇ、牛インシュリン２０００単位）
１　ｍｌ並びにペニシリン（１０，０００μｇ／ｍｌ）
及びストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）混
合物０．２ｍｌを含有していた。ＨＲＶ−１４（実施例
１）で免疫されたマウスから脾臓を頸部脱臼後に摘出し
、室温で無血清ＨＴ培地中においた。脾臓をプラスチッ
ク製ペトリ皿におき、細胞をプラスチックのスクレーパ
ーで脾臓からかき取った。プレートを無血清ＨＴ培地５
ｍｌで洗浄し、細胞を１５ｍｌプラスチック製円錐管に
プールし、大きな粒子を１分間かけて沈降させた。次い
で上澄を１５ｍｌプラスチック丸底管に移し、細胞を室
温、３５０ｘｇで１０分間の遠心によりペレット化した
。上澄を捨て、細胞を無血清ＨＴ培地（１０ｍｌ／２脾
臓）に再懸濁し、生存細胞の総数をトリパンブルー排除
法で調べた。

【００４２】生存ＳＰ２／０ミエローマ細胞の数も調べ
、その細胞をミエローマ細胞より１０倍多い脾臓細胞と
混ぜた（即ち、５０ｃｃねじ口プラスチック管に２×１
０８脾臓細胞及び２×１０７ＳＰ２／０細胞をいれた）
。細胞を３５０ｘｇで１０分間の遠心によりペレット化
し、細胞ペレットを無血清ＨＴ培地１０ｍｌに再懸濁し
た。この操作を２回繰返し、無血清ＨＴ培地１０ｍｌに
最終再懸濁後、細胞を１５ｍｌ丸底管に移した。細胞を
３５０ｘｇで１０分間かけてペレット化した。

【００４３】ポリエチレングリコール（ＰＥＧ／ＤＭＳ
Ｏ／ＨＴ平均分子量＝１０００ｄ）を４５℃で液化し、
３５％ＰＥＧ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度になるよう無血
清ＨＴ培地と混ぜた。ＰＥＧ／ＨＴ培地混合物を３ｍｌ
シリンジに装備された０．２２ミクロン膜フィルターに
通して滅菌し、しかる後ＰＥＧを３７℃で維持した。ジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を最終濃度５％となる
ようＰＥＧ／培地混合液に加えた。ＰＥＧ／ＤＭＳＯ／
ＨＴ培地混合物を２×１０８細胞につき０．８ｍｌ用い
て脾臓−ミエローマ細胞ペレットに滴下し、その際培養
管の側面をたたき振盪することで細胞を穏やかに再懸濁
した。細胞とＰＥＧとの全接触時間が６分間となるよう
に細胞を室温、２５０ｘｇで遠心した。上澄を吸引し、
細胞をＨＴ培地１０ｍｌに再懸濁した。細胞を（３５０
ｘｇで１０分間かけて）ペレット化し、最終濃度３．５
×１０５細胞／ｌまでＨＴ培地に穏やかに再懸濁した。 次いで細胞を０．１ｍｌ／ウエルで９６穴マイクロタイ
タープレートにいれ、５％ＣＯ２及び湿度９６％の水ジ
ャケットインキュベーター中３７℃でインキュベートし
た。２４時間後、ＨＡＴ培地（ＨＴ培地＋アミノプテリ
ン０．３５２ｍｇ／ｌ）０．１　ｍｌを各ウェルに加え
た。ウェルに４〜５日毎に新鮮ＨＡＴ培地０．１ｍｌを
再供給した。 集密率１５％以上（通常４０〜８０％）の培養ウェルか
らの細胞一部をＨＲＶ−１４に対する抗体の産生に関し
て試験した。他の実験では、集密率１５％以上の増殖陽
性ウェルからの細胞の一部を実施例５で記載された細胞
保護アッセイで細胞レセプターへのＨＲＶ−１４の付着
を阻止する抗体の産生に関して試験した。上記アッセイ
で高活性を有する細胞を限界希釈を２回サイクル行って
サブクローニングした。これらのサブクローンから精製
されたｍＡｂを標準的操作で免疫グロブリンサブタイプ
及び分子量を調べた。

【００４４】実施例５ 細胞保護アッセイ 保護アッセイではＨｅＬａ　　Ｒ−１９細胞の４８穴ク
ラスタープレートを利用した（１．２５×１０５細胞／
ウェル）。培地除去後、単層を新鮮培地、即ちハイブリ
ドーマ組織培養液０．１ｍｌと共に３４℃で１時間イン
キュベートした。インキュベート後、培地５０μｌ中２
×１０５ＰＦＵのＨＲＶ−１４を処理された単層に加え
、細胞をＣＯ２インキュベーター中３４℃で１６〜２４
時間インキュベートした。ウェルは細胞変性効果の徴候
がコントロールと比較して明らかでない場合に陽性とし
て評価し、３種の防御抗体が確認された。更にアッセイ
を行い、これらのｍＡｂが他の血清型のＨＲＶによる感
染から細胞を保護するかどうかについて調べた。陽性の
保護効果は、９０種の異なる血清型のＨＲＶ、未知血清
型の臨床単離株１株並びにコクサッキーウイルスタイプ
Ａ１３、Ａ１８及びＡ２１で得られた（表１参照）。こ
れら血清型のすべては同一の細胞レセプターを有するこ
とが知られている。異なるレセプターを有する１１血清
型のＨＲＶはｍＡｂで阻止されなかった。これらのｍＡ
ｂはサビン（Ｓａｂｉｎ）タイプ１ポリオウイルス並び
にコクサッキーウイルスタイプＢ２及びＢ３からも細胞
を保護できなかった。

【００４５】実施例６ 組織培地及び腹水からのモノクローナル抗体の精製ｍＡ
ｂは個々の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養物
から採取された組織培養液から精製した。下記操作を用
いたが、これはエミニ（Ｅｍｉｎｉ）ら，ジャーナル・
オブ・バイロロジー，第４３巻，第９９７−１００５頁
，１９８２年に本質的に記載されている。これら各ハイ
ブリドーマ細胞系からの組織培養液１Ｌをワットマン１
ＭＭ濾紙、ガラスウール含有カラム及び最後にセファロ
ース６Ｂカラムで連続的に濾過した。ｐＨをｐＨ８．０
の１００ｍＭトリスＨＣｌの添加で約８．０に調整し、
しかる後プロテインＡセファロースカラム（液体２Ｌ当
たりベッド容積４〜６ｍｌ）に通した。カラムを１０倍
ベッド容積のｐＨ８．０の１０ｍＭトリスＨＣｌで洗浄
した。次いでｐＨ３．０のグリシン（１００ｍＭ）を加
え、カラムから結合免疫グロブリンを溶出させた。抗体
を安定化させるためｐＨ８．０の１００ｍＭトリスＨＣ
ｌを含有した管内に各分画を集めた。カラムからピーク
タンパク質分画をプールし、蒸留水に対して透析し、完
全抗体として用いるか又は更に処理してＦａｂを得た。

【００４６】それぞれのｍＡｂのＦａｂを得るため、前
記のようにプロテインＡカラムで精製されたｍＡｂ　１
０〜１５ｍｇを凍結乾燥し、しかる後ｐＨ７．２の１０
０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭシステインに溶解し
た（２ｍｌ／２０ｍｇ抗体）。パパイン１０〜１５単位
／ｍｇを酵素対抗体の重量比１：１００で加えた。この
反応液を３７℃で一夜１６時間インキュベートし、最終
濃度３０ｍＭまでヨードアセトアミドの添加により反応
停止させた。次いで切断されたｍＡｂを４℃で架橋デキ
ストラン（セファデックスＧ−７５）カラム（２．５×
２０ｃｍ）によりクロマトグラフィーに付し、各分画を
２８０ｎｍの吸光度についてモニターした。大部分のＦ
ａｂを含有した２番目のＡ２８０ピークをプールし、し
かる後プロテインＡセファロースカラムに通して、汚染
Ｆｃ断片又は未切断ｍＡｂをすべて除去した。プロテイ
ンＡカラムからのＦａｂのピーク分画をプールし、蒸留
水に対して透析し、２００μｇずつ凍結乾燥し、−８０
℃で貯蔵した。

【００４７】実施例７ 抗体のＮＨ２末端アミノ酸配列の決定 １Ａ６、２Ｃ２及び１８Ｂ９のＨ及びＬ鎖のＮＨ２末端
を各遺伝子のｃＤＮＡクローニングに用いられるオリゴ
ヌクレオチドプローブの合成用にアミノ酸データを得る
ために配列決定した。抗体Ｈ及びＬ鎖を還元条件下８％
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。タ
ンパク質をファンデコルコホフら、１９８５年、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第１
５２巻、第９−１９頁［Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ
　ｅｔ　ａｌ．，（１９８５）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１５２，ｐｐ．９−１９］の方法に従いポリ
ブレン被覆ガラス繊維フィルター上に移した。各鎖を含
んだストリップを切出し、ＮＨ２末端配列を気相マイク
ロシークエネーター［アプライド・バイオシステムズ（
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）］でヒュウィ
ック（Ｈｅｗｉｃｋ）ら、１９８１年の方法に従い決定
した。ｍＡｂ　　１Ａ６、２Ｃ２及び１８Ｂ９のＨ及び
Ｌ鎖のアミノ酸配列は各表３、４、５及び６で示されて
いる。

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【００４８】実施例８ ハイブリドーマｍＲＮＡの単離及び精製懸濁培養物中で
増殖するハイブリドーマ細胞（１Ａ６、２Ｃ２及び１８
Ｂ９）を４℃、１０００ｘｇで１０分間の遠心により増
殖培地からペレット化した。ペレット化細胞（１０９）
を氷上で３０分間かけて低張緩衝液（１０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃｌ、５ｍＭ　　ＭｇＣｌ、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリ
スＨＣｌ、５％スクロース、０．５ｍｇ／ｍｌヘパリン
）２０ｍｌ中で膨潤させ、しかる後１１０ｍＭ　　Ｎａ
Ｃｌ、７．５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、７．５％スクロース
、ｐＨ７．５の７５ｍＭトリスＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｍ
ｌヘパリンからなる１０ｍｌを加え、細胞をドーンスホ
モジナイザーで破壊した。細胞砕片及び核を４℃、１０
００ｘｇで２分間遠心してペレット化した。上澄を０．
２５％ＮａＤｏｃ及び０．５０％ＮＰ−４０で処理し、
しかる後ミトコンドリアを４０００ｘｇで１０分間遠心
してペレット化した。ポリソームを４℃、２００，００
０ｘｇで６０分間、スクロースクッション（１Ｍスクロ
ース、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、
ｐＨ７．５の２０ｍＭトリスＨＣｌ）２．５ｍｌ上で遠
心して清澄化上澄からペレット化した。ポリソームペレ
ットをｐＨ７．５の１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、０．３％ドデシル硫酸リチウムに再懸濁し、
しかる後３７℃で１０分間プロティナーゼＫ　１ｍｇで
処理した。ＲＮＡを沸騰水浴中で１分間かけて熱変性さ
せ、氷上で急速冷却した。ＮａＣｌを０．５Ｍになるよ
う加え、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ　
　ＥＤＴＡ、０．３％ドデシル硫酸リチウム、０．５Ｍ
　　ＮａＣｌ中で平衡化したオリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス［タイプＩＩ、コラボレイティブ・リサーチ（Ｃｏｌ
ｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）］０．６ｇ
を含有したカラムで混合物のクロマトグラフィーを行っ
た。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを加温蒸留水（５６℃）でカ
ラムから溶出させた。

【００４９】実施例９ ｃＤＮＡライブラリーの製造 二本鎖ｃＤＮＡはアマーシャムｃＤＮＡシンセシス・プ
ラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ’ｓ）ｃＤＮＡ　　Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ　ｐｌｕｓ）試薬を用いてガブラー，Ｕ．ら、
１９８３年、ジーン，第２５巻，第２６３−６９頁［Ｇ
ｕｂｌｅｒ，　Ｕ．　ｅｔ．　ａｌ．，（１９８３）Ｇ
ｅｎｅ，　２５，ｐｐ．２６３−６９］の方法でポリ（
Ａ）＋ＲＮＡから合成した。合成は最初に定常領域ｃＤ
ＮＡを得るためオリゴ−ｄＴでＲＮＡをプライミングし
、しかる後全鎖長ｃＤＮＡを得るため公知定常領域に相
補的な内部オリゴヌクレオチド１２及び１３（表２）又
は市販可変領域プライマー［ファルマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）のＣ−ガンマ１５及び表２のオリゴヌクレオ
チド１４］でＲＮＡをプライミングすることにより行っ
た。二本鎖ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカー［ニュー・イ
ングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｂｉｏｌａｂｓ）］をブラント末端結合し、しかる後Ｅ
ｃｏＲＩで切断した。過剰のリンカーをセファデックス
Ｇ−１５０（ファルマシア）カラムクロマトグラフィー
で除去した。ファージライブラリーはラムダＺＡＰ脱リ
ン酸化ＥｃｏＲＩアーム［ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）］に精製ｃＤＮＡを結合させて作製し、製
造業者の指示に従いストラタジーン・ギガパック・プラ
ス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕ
ｓ）　抽出物中にパッケージ化した。適切な細胞株に３
７℃で１０分間かけファージライブラリーを感染させ、
しかる後３５，０００ＰＦＵ／１５０ｍｍルリア（Ｌｕ
ｒｉａ）寒天プレートにまいて、３７℃で一夜インキュ
ベートした。

【００５０】実施例１０ ｃＤＮＡライブラリーからの抗ＩＣＡＭ−１抗体ｃＤＮ
Ａクローンのクローニング ｃＤＮＡライブラリーをベントン，Ｗ．Ｄ．及びデービ
ス，Ｒ．Ｗ．，１９７７年，サイエンス，第１９６巻，
第１８０−１８２頁［Ｂｅｎｔｏｎ，　Ｗ．　Ｄ．　ａ
ｎｄ　Ｄａｖｉｓ，Ｒ．　Ｗ．，（１９７７），Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，　１９６，ｐｐ．１８０−１８２］の方法に
従いフィルターハイブリダイゼーションによりスクリー
ニングした。ニトロセルロースフィルター［シャイチャ
ー・アンド・シェウル（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　
Ｓｃｈｅｕｌｌ）］上へリフトした多数のファージＤＮ
Ａを、用いたオリゴヌクレオチドの計算Ｔｍ以下の１０
℃で一夜、６×ＳＳＣ、５×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ）、０．５％ＳＤＳ、５０ｍＭ　　ＮａＰＯ４
及び０．２ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中において３２Ｐ
標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ
た。

【００５１】オリゴヌクレオチドプローブの配列は、γ
−グロブリン−１　　Ｈ鎖の定常領域における保存ＤＮ
Ａ配列（オリゴヌクレオチド１５、表２）及びラムダＬ
鎖の不変領域における保存ＤＮＡ配列（オリゴヌクレオ
チド１６、表２）から、またｍＡｂのＬ及びＨ鎖から得
られたアミノ酸配列を用いて予想した。ハイブリッド形
成後、フィルターを２３℃で５分間しかる後ハイブリッ
ド形成温度で１０分間６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで洗
浄した。ハイブリッド形成陽性ファージを希釈プレーテ
ィング及び再スクリーニングでプラーク精製した。プラ
スミドをファージから取出し、ＥｃｏＲＩインサートを
ｐＧｅｍベクター［プロメガ・バイオテック（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）］に組込んでクローニングし
、プラスミドｐ１Ａ６Ｌ（Ｌ鎖）及びｐ１Ａ６Ｈ（Ｈ鎖
）を得た。

【００５２】実施例１１ 大腸菌における抗ＩＣＡＭ−１抗体Ｌ鎖の発現プラスミ
ドｐ１Ａ６ＬをＳｃａＩで直鎖化し、フェノール抽出し
、エタノール沈降し、パーキン・エルマー／シータス・
ジーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ
ＧｅｎｅＡｍｐ）ＤＮＡ増幅試薬キットを用いて、製造
業者指定の操作に従いポリメラーゼチェインリアクショ
ン（ＰＣＲ）で増幅させた。プライミングは合成オリゴ
ヌクレオチド１及び２（表２、実施例１３）で行った。 ２５サイクル増幅をパーキン・エルマーＤＮＡサーマル
・サイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）で行っ
たが、各サイクルは９４℃で１分間、３７℃で２分間及
び７２℃で３分間のインキュベートからなる。各サイク
ルにおいて、７２℃のインキュベートは前サイクルより
も２秒間延長された。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を０．７％
シープラーク・アガロース（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ　Ａｇ
ａｒｏｓｅ）（ＦＭＣ）ゲルで分離し、切出し、６５℃
で溶融し、製造業者指定の操作に従いＮＡＣＳプレパッ
クカラム（ＢＲＬ）で精製した。精製された断片をＮｄ
ｅＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、フェノール抽出し、エタ
ノール沈降し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断されかつ
前記のようにゲル精製された等モル量のプラスミドｐＥ
Ｔ−３ａ（１０μｇ／ｍｌ最終濃度）に結合させた。４
℃で１５時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いた連結後、コン
ピテント大腸菌ＡＧ１（ストラタジーン）１００μｌを
製造業者指定の操作に従い連結混合物２μｌで形質転換
し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＬＢプレー
ト［ｌ当たりバクト−トリプトン１０ｇ、ディフコ（Ｄ
ｉｆｃｏ）酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、及びバクト
アガー１５ｇ含有］上にまいた。３７℃で一夜インキュ
ベート後コロニーをニトロセルロースフィルターディス
クに移し、コロニーハイブリダイゼーション用に調製し
た。 コロニーを実施例１０に記載されたように５５℃で３２
Ｐ標識オリゴヌクレオチド３（表２、実施例１３）に対
してハイブリダイズさせた。フィルターを５５℃におい
て６×ＳＳＣ（０．９Ｍ　　ＮａＣｌ、０．０９Ｍクエ
ン酸ナトリウム）で４回各々３分間洗浄し、風乾し、オ
ートラジオグラフィーに付した。プラスミドＤＮＡのＤ
ＮＡ配列決定及び制限エンドヌクレアーゼマッピングに
より、望ましいプラスミド構造を確認した。

【００５３】ｐＫ１と命名されたプラスミド（図４）を
単離し、ハナハンの操作でコンピテント化された大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換するために用いた。１０
０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢプレート上３７℃で
一夜培養後、単一コロニーを用いてｌ当たりバクト−ト
リプトン１０ｇ、ＮａＣｌ　５．５ｇ、グルコース４ｇ
、Ｎａ２ＨＰＯ４　　６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　　３ｇ、Ｎ
Ｈ４Ｃｌ　１ｇ、ＭｇＳＯ４　１２０ｍｇ及びＣａＣｌ
２・２Ｈ２Ｏ　１５ｍｇ含有のＭ９ＴＢ培地５００ｍｌ
に接種した。増殖及び組換えタンパク質のＩＰＴＧ誘導
は前記のとおりであり、発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認
した。

【００５４】実施例１２ 大腸菌における抗ＩＣＡＭ−１抗体Ｆｄ断片の発現プラ
スミドｐ１Ａ６ＨをＳｃａＩ切断で直鎖化し、Ｈ鎖コー
ド領域を実施例１１で記載されたようにＰＣＲ増幅させ
た。但し合成オリゴヌクレオチド１１及び４（表２、実
施例１３）をプライマーとして用いた。生成物をゲル精
製し、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、実施例１１で
記載されたようにｐＥＴ−３ａに組込んでクローニング
した。組換えコロニーは実施例１０で記載されたように
６０℃で３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド５（表２、実施
例１３）に対するコロニーハイブリダイゼーションによ
り同定した。得られたｐＥＴ−３ａ／Ｆｄ組換え体ｐＧ
１（図３）を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に移し、
発現を実施例１１で記載されたように調べた。

【００５５】実施例１３ 大腸菌における一本鎖Ｆｖの発現 プラスミドｐＫ１をＳｃａＩで直鎖化し、プライマーと
してオリゴヌクレオチド１及び６（表２、実施例１３）
を用いてＰＣＲ増幅させた。生成物（断片１）をＮｄｅ
Ｉ及びＸｈｏＩで切断し、１％シープラークプレパラテ
ィブアガロースゲルで精製した。プライマーとしてオリ
ゴヌクレオチド７及び１０、８及び１０又は９及び１０
（表２、実施例１３）を用いて、プラスミドｐＧ１をＰ
ＣＲ増幅させ、生成物（各々断片２Ａ、２Ｂ又は２Ｃ）
をＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、しかる後１％シー
プラークアガロースゲルで精製した。異なる一本鎖Ｆｖ
は、精製断片１と２Ａ、１と２Ｂ又は１と２Ｃの等モル
混合物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで既に切断されたプラ
スミドｐＥＴ−３ａの等モル量と結合させて得た。組換
えプラスミドをスクリーニングし、大腸菌ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）細胞に移し、組換えタンパク質の発現を実施例１
１で記載されたように調べた。

【表６】

【００５６】実施例１４ 組換え抗ＩＣＡＭ−１抗体断片の精製及び再生培養物５
００ｍｌから得た細胞ペレットを４℃で、２μＭ　　Ｔ
ＡＭＥ、２μＭペプスタチン及び１ｍＭ　　ＰＭＳＦ含
有細胞緩衝液（０．０５ＭトリスＨＣｌ、０．０２Ｍ　
　ＮａＣｌ、０．００１Ｍ　　ＥＤＴＡ二ナトリウム塩
、ｐＨ８．１）１５〜２０ｍｌに再懸濁した。細胞懸濁
物をスタンステッド（Ｓｔａｎｓｔｅｄ）高圧ホモジナ
イザーに３回通した。プールしたホモジネートを４℃、
１２，０００ｘｇで４５分間遠心した。ペレットを、湿
ペレット重量約１００ｍｇ／ｍｌ緩衝液で細胞緩衝液に
再懸濁した。上澄及びペレットのサンプルをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（１２．５％）で分析した。抗体断片はホモゲネ
ートのペレットフラクションに検出された。

【００５７】ペレット懸濁液（５００μｌ）を１０，０
００ｘｇで５分間遠心した。得られたペレットをｐＨ８
．２の５ＭグアニジンＨＣｌ、０．１ＭトリスＨＣｌ、
０．００１Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．０２Ｍ　　ＮａＣｌの
３００μｌに再懸濁し、時々ホルテックスミキサーにか
けながら室温で１５分間インキュベートし、しかる後１
０，０００ｘｇで５分間遠心した。上澄のタンパク質濃
度は標準タンパク質としてＩｇＧを用いブラッドフォー
ド（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法により調べた。

【００５８】タンパク質を、ｐＨ８．３の６Ｍグアニジ
ンＨＣｌ、０．１Ｍトリス、０．０２Ｍ　　ＮａＣｌ、
０．００１Ｍ　　ＥＤＴＡからなる緩衝液Ｉに５ｍｇ／
ｍｌとなるよう懸濁した。溶液にＮ２を慎重に５分間通
し、しかる後β−メルカプトエタノール（シグマ）を０
．１Ｍになるよう加え、４０℃で４５分間加熱した。 次いで２回目のβ−メルカプトエタノールを最終濃度０
．２Ｍとなるよう加え、サンプルをＮ２雰囲気下で更に
４５分間加熱した。

【００５９】組換えＦａｂのために、Ｌ及びＨ鎖ペレッ
トを緩衝液Ｉに再懸濁し、双方のタンパク質を当量混ぜ
た。タンパク質サンプルは一本鎖還元に関して記載され
たようにβ−メルカプトエタノールを加えて還元した。

【００６０】再酸化及び再生は、１ＭグアニジンＨＣｌ
、０．０２ＭトリトリスＨＣｌ、０．０２Ｍ　　ＮａＣ
ｌ、０．０００１Ｍ　　ＥＤＴＡ（二ナトリウム塩）か
らなる緩衝液（ｐＨ８．１）で還元タンパク質を２０μ
ｇ／ｍｌの濃度まで希釈することにより行った。還元及
び酸化グルタチオンを各々２ｍＭ及び０．２ｍＭの最終
濃度で加え、タンパク質溶液を分子排除範囲１２，００
０〜１４，０００のスペクトラ−ポア−２（Ｓｐｅｃｔ
ｒａ−ｐｏｒ−２）透析膜中４℃で１６〜２０時間イン
キュベートした。その膜は蒸留水に室温で３０分間浸漬
し、タンパク質溶液を適用する前に脱イオン水で十分に
洗浄した。

【００６１】緩衝液交換は脱イオン水で１：３希釈され
た２００倍過剰のＰＢＳに対して透析することにより行
った。２回の緩衝液交換を４〜５時間毎に行い、しかる
後２回の緩衝液交換を１０〜１２時間毎に行った。

【００６２】透析されたサンプルを１〜２ｍｌの容量ま
で濃縮した。次いで濃縮サンプルを１０，０００ｘｇで
５分間遠心し、上澄をペレットから分離した。再生タン
パク質含有上澄液を、最適のタンパク質分離能を得るた
めに連結されたバイオシル（Ｂｉｏｓｉｌ）ＴＳＫ−１
２５及びバイオシルＴＳＫ−２５０［バイオラッド（Ｂ
ｉｏｒａｄ）］のサイジング（Ｓｉｚｉｎｇ）カラム高
性能液体クロマトグラフィーに付した。カラムは０．２
２ミクロンフィルターに通して滅菌されたＰＢＳを用い
て展開した。抗体断片含有ピークを濃縮し、還元及び非
還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２〜５％）により分
析した。

【００６３】実施例１５ ＩＣＡＭ−１断片の形成 ＩＣＡＭ−１　　ｃＤＮＡクローンｐＨＲＶｒ１［トマ
シニ，Ｊ．Ｅ．ら，１９８８年，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（Ｕ
ＳＡ），第８６巻，第４９０７−１１頁］の５’末端非
コード領域及び完全コード領域を、制限酵素ＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩによる切断で切出した。次いでＩＣ
ＡＭ−１コード領域をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで
既に切断された転写ベクターｐＧＥＭ４Ｚに結合させて
、ｐＧＥＭ−ＩＣＡＭを形成させた。次いでＩＣＡＭ−
１の全鎖長ＲＮＡコピーは製造業者（プロメガ・バイオ
テック）指定の操作に従い、ＨｉｎｄＩＩＩ　によりｐ
ＧＥＭ−ＩＣＡＭを切断した後インビトロ転写を行って
得た。同様に、ＩＣＡＭ−１の連続的カルボキシ末端側
切除体はＢｇｌＩ、ＮａｒＩ、ＭａｅＩ及びＲｓａＩで
各々ｐＧＥＭ−ＩＣＡＭを切断し、しかる後インビトロ
で各々転写することにより得た。各ＲＮＡをフェノール
−クロロホルムで抽出し、２．７５Ｍ酢酸アンモニウム
存在下エタノールで沈降させた。

【００６４】ＩＣＡＭ−１のドメイン１断片をコードす
る新規構築体をポリメラーゼチェインリアクション増幅
により作製した。ＤＮＡはセンス鎖に相同的でかつＳＰ
６プロモーターの上流に位置するオリゴヌクレオチド（
５’−ＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ
Ａ−３’）により５’末端でプライム化した。ＤＮＡは
ＩＣＡＭ−１　ｃＤＮＡに相同的でかつ４つのＭｅｔ残
基をコードする更に１２の塩基を含んだアンチセンスオ
リゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧ
ＴＡＣＡＣＧＧＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＴＡＧＣ−３
’）を用いて３’末端でもプライミングした。ポリメラ
ーゼチェインリアクションはＤＮＡサーマル・サイクラ
ー（シータス−パーキン−エルマー）で製造業者の指示
に従い行った。

【００６５】実施例１６ ＩＣＡＭ−１　　ＲＮＡの翻訳 沈降ＲＮＡを水に１ｍｇ／ｍｌで懸濁し、翻訳反応で用
いるまで−２０℃で貯蔵した。最終容量０．１ｍｌ中の
翻訳反応混合物はメチオニン以外の各必須アミノ酸０．
０２ｍＭ、子牛肝臓ｔＲＮＡ０．０５ｍｇ／ｍｌ、ＲＮ
ａｓｉｎ８００Ｕ／ｍｌ、３５Ｓ−メチオニン（アマー
シャム社）７．５ｍＣｉ／ｍｌ、各プロテアーゼ阻害剤
（ペプスタチンＡ、アンチパイン及びロイペプチン）２
μｇ／ｍｌ、吸光度２８０ｎｍにおけるイヌ膵臓ミクロ
ソーム膜［デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）、ＮＥＮリサーチ
・プロダクツ（ＮＥＮ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ）］１６Ｕ／ｍｌ、ウサギ網状赤血球溶解物０．
６ｍｌ／ｍｌ反応混合液、２ｍＭ酸化グルタチオン（ｍ
ＲＮＡ添加直前に加えられる）及びｍＲＮＡ５μｇを含
有していた。反応を３０℃で３０〜６０分間行い、リボ
ヌクレアーゼＡ　０．１ｍｇ／ｍｌの添加で停止し、し
かる後３０℃で更に１０分間インキュベートした。放射
能標識タンパク質は、翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
った後オートラジオグラフィーにより分析した。

【００６６】実施例１７ 翻訳産物の免疫沈降 翻訳後、反応混合物を氷冷し、フェニルメチルスルホニ
ルフルオリドを２ｍＭ加え、０．５％となるようノニデ
ット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０を加えることで膜小胞
を破壊した。プロテインＡ−アガロースの５０％スラリ
ー［ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）］２０μｌを加え、混合物を４℃で１０
分間回転させた。混合物を１０，０００ｘｇで２分間遠
心してペレット化し、上澄のサンプルをｍＡｂ０．５μ
ｇ含有管に移し、０．２５％ノニデットＰ−４０含有ト
リス緩衝液で最終容量０．１ｍｌに戻した。４℃で一夜
免疫沈降後、プロテインＡ−アガロース２０μｌを加え
、この物質を４℃で３０分間混ぜた。アガロースビーズ
を穏やかに遠心してペレット化し、しかる後０．５％ノ
ニデットＰ−４０含有トリス緩衝ＰＢＳで２回ついでト
リス緩衝液ＰＢＳ単独で１回洗浄した。 ペレット化されたアガロースビーズを２×レムリタンパ
ク質ゲル負荷用緩衝液［レムリ、Ｕ．Ｋ．，１９７０年
、ネーチャー、第２２７巻、第６８０−５頁（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ、２２
７，ｐｐ．６８０−５）］に懸濁し、１００℃で３分間
インキュベートした。次いで溶出されたタンパク質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーにより分析
した。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　Ａは完全免疫グロブリン分子（ＩｇＧ）；
Ｂは免疫グロブリン分子のＦａｂ部分；Ｃは一本鎖Ｆｖ
の概略図。Ｃにおける点線はＨ及びＬ鎖を結合するペプ
チド架橋について表す。

【図２】　　感受性細胞へのＨＲＶ付着の抗体媒介阻害
。 ４８穴プレート内におけるＨｅＬａ細胞の集密化単層細
胞を二連で指示量のｍＡｂ　　１Ａ６、２Ｃ２又は１８
Ｂ９で３０分間３４℃において処理した。３５Ｓ標識Ｈ
ＲＶ−３６を加え、細胞を１時間インキュベートした。 未結合ＨＲＶ及び結合ＨＲＶの量を測定し、阻害率を決
定した。

【図３】　　ＡはプラスミドｐＧ１、矢印は転写方向を
示す；ＢはプラスミドにおけるＨ鎖ｃＤＮＡの結合部の
詳細及びカバットナンバリング表示による対応アミノ酸
配列を示す。

【図４】　　ＡはプラスミドｐＫ１、矢印は転写方向を
示す；ＢはプラスミドにおけるＬ鎖ｃＤＮＡの結合部の
詳細及びカバットナンバリング表示による対応アミノ酸
配列を示す。

【図５】　　ＡはプラスミドｐＳＣＶ１、矢印は転写方
向を示す；ＢはプラスミドにおけるＨ及びＬ鎖ｃＤＮＡ
の結合部の詳細並びにＨ及びＬ鎖双方のカバットナンバ
リング表示による対応アミノ酸配列を示す。

【図６】　　組換え抗体断片によるＨＲＶレセプター遮
断を示す図である。ＨｅＬａ細胞膜を様々な量の抗体又
は組換え抗体断片と共に２０分間インキュベートし、し
かる後３５Ｓ標識ＨＲＶ−１５を加え、１時間インキュ
ベートした。膜を遠心分離し、膜に吸着された３５Ｓ標
識ＨＲＶ−１５の量を測定し、ウイルス結合の減少率と
して示した。●−１Ａ６抗体、▽−自然Ｆａｂ、□−組
換えＦａｂ、△−Ｆａｂ（−ＳＳ）、▲−ｐＳＣＶ１、
○−ｐＳＣＶ２、■−ｐＳＣＶ３。

【図７】　　１ＣＡＭ−１ドメイン１の無細胞翻訳及び
免疫沈降を示す図（電気泳動写真）である。ポリメラー
ゼチェインリアクション増幅したドメイン１断片の修飾
物をインビトロ転写したＲＮＡを添加ミクロソーム膜の
存在下で翻訳し、ついで免疫沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析を行う前にインビトロ翻訳酵母α接合タンパク質（
プロメガ・バイオテック）を添加した。コントロール列
は酵母α接合タンパク質単独の位置を示し、一方列１は
コントロールタンパク質及びＩＣＡＭ−１ドメイン−１
を一緒に示す。列１で示された物質はｍＡｂのＯＫＴ４
（列２）、１Ａ６（列３）、２Ｃ２（列４）及び１８Ｂ
９（列５）との免疫沈降に利用された。低分子量マーカ
ーの位置（ＫＤ）が列Ｍに示されている。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 【化１】 【化２】 からなる群より選択されるペプチド。
2. 【請求項２】　　請求項１記載のペプチド（Ａ）及びペ
   プチド（Ｂ）から本質的になるペプチドの組成物。
3. 【請求項３】　　請求項１記載のペプチド（Ｃ）及びペ
   プチド（Ｄ）から本質的になるペプチドの組成物。
4. 【請求項４】　　請求項１記載のペプチド（Ｅ）及びペ
   プチド（Ｆ）から本質的になるペプチドの組成物。
5. 【請求項５】　　下記アミノ酸配列： 【化３】 を有するペプチド。
6. 【請求項６】　　免疫グロブリン分子のＦｖ部分に相当
   する請求項５記載のペプチド。
7. 【請求項７】　　呼吸系ウイルスの細胞レセプターに特
   異的な免疫グロブリン分子のＦａｂ又はＦｖ部分に相当
   するペプチド又はペプチドの組成物。
8. 【請求項８】　　ライノウイルスの細胞レセプターに特
   異的である、請求項７記載のペプチド又はペプチドの組
   成物。
9. 【請求項９】　　感受性細胞に対する大部分の血清型の
   ライノウイルスの付着を阻止することができる、請求項
   ８記載のペプチド又はペプチドの組成物。
10. 【請求項１０】　　ライノウイルスビリオンが感受性細
    胞と結合する場合にそのビリオンに置き換わることがで
    きる、請求項８記載のペプチド又はペプチドの組成物。
11. 【請求項１１】　　ライノウイルス感染の予防及び治療
    用に請求項７記載のペプチドを含有した医薬組成物。
12. 【請求項１２】　　ライノウイルス感染の予防及び治療
    用のための請求項７記載のペプチドの鼻内滴下用処方剤
    。
13. 【請求項１３】　　細胞間接着分子−１　　ＩＣＡＭ−
    １に結合できる免疫グロブリン分子のＦａｂ又はＦｖ部
    分に相当するペプチド又はペプチドの組成物。
14. 【請求項１４】　　リガンドがＩＣＡＭ−１に結合する
    ことを妨げる、請求項１３記載のペプチド。
15. 【請求項１５】　　ＩＣＡＭ−１のドメイン１に結合す
    る、請求項１４記載のペプチド。
16. 【請求項１６】　　請求項１４記載のペプチドを含有し
    た医薬組成物。
17. 【請求項１７】　　細胞間接着分子−１に結合してそれ
    を不活性化することができる、請求項１４記載のペプチ
    ド又はペプチドの組成物。
18. 【請求項１８】　　請求項１７記載のペプチドを含有し
    た医薬組成物。