JPS6147191A - ヒト・ライノウイルスｒｎａおよびたんぱく - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト・ライノウイルス（ＨＲＶ）は、ピコルナウィルス
（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ　Ｊ　　族に属し九少なく
ともＩＩ５［の抗原性が異なる血清型を含む。ピッルナ
ウィルス族はポリオビールスおよびＡ型肝炎ビールスを
も包含する。ライノウィルスは普通の風邪のウィルスと
して見出される最も重要なものである。その塩１ライノ
ウィルス”は、これらウィルスによる感染で鼻が浸され
ることが多いことを反映している。抗原性の異なるライ
ノウィルスの類は非常に多いので、人が、毎年異なるラ
イノウィルスに感染しても、−生の間に既知の型金てを
経験し得ない程である。

ＷＲＹけ、４つのペプチド鎖からなる６０個の同一のサ
ブユニットを利用した正六面体対称をもつキャプシド構
造（２０−４０ｎｍ）として存在する。ピリオンは、エ
ーテルに抵抗性で酸忙不安定である。ＨＲＶは長さほぼ
７、２００塩基の感染性、１本鎖ゲノムＲＮＡ會含んで
いる。感受性細胞中に侵入すると、そのＲＮＡけ宿主細
胞翻訳機構を用いて、分子ｆｔ２４０．ｏｏｏのポリた
んばくに直ちに翻訳される。このポリたんばくは、その
後細胞およびビールスによシコードされるプロテアーゼ
によりプロセスされ、感染周期を完了させるのに必要な
構造および非構造たんばくを生成する。

多数の血清型があシ、生育が不良であり、また過去に用
いられたＨＲＶの精製方法が理由となって、ＨＲＶに関
してなされた研究は限られていた。加えて、直接ＲＮＡ
およびたんばくの配列を決定するのに用いられた過去の
手法は、労力と時間を費すものであった。

しかしながら、核酸のクローニングと、配列決定におけ
る最近の技術的な進歩により、ＨＲＶの分子的な特性づ
けが可能となった。これらの技＃を用いて、ＷＲＹの全
ゲノムＲＮＡおよび対応するアミノ酸配列が決定し得た
。

この知見は、特異的な抗ウィルス剤を開発するだめのウ
ィルスのもつ有意な標的領域（すなわち、たんばくの開
裂部位）を明らかにするであろう。このことはまた、ラ
インウィルスの多数の血清型の間で共通なゲノム領域を
決定するためのプローブとして利用し得るＤＮＡ断片の
単離を可能にした。これにより、ライノウィルス放向で
の共通および特異配列のゲノム地図を構成することも可
能となろう。

ヒト・ライノウイルスのゲノムＲＮＡを代表するＤＮＡ
を単離し、クローニングするための方法を提示すること
が本発明の目的である。もう一つの目的は、Ｉ（ＲＶＩ
４型ゲノムＲＮＡのヌクレオチドおよび由来するアミノ
酸配列を決定することである。第３の目的は、ポリたん
ば〈プロセシングの間に用いられる前Ｉ駆たんばくのア
ミノ酸配列を決定することである。さらにもう一つの目
的は、適当な宿主中でクローン化したＤＮＡを発現させ
ることによｆｉＨＲＶたんばくまたはそのサブユニット
を産生させる方法を提示することである。

もう一つの目的は、ＨＲＶにたいする抗体を作らせるた
めの抗原として有用であるようなＨＲ’／たんばくまた
はそのサブユニットを提供することである。さらにもう
一つの目的は、ＨＲＶ１４型ゲノムＲＮＡ１たはその一
部を代表するＤＮＡを含むベクターを提供することであ
る。次の目的は、適当な宿主中に置かれたとき、感染性
をもつウィルス粒子を生成し得るような感染性ＣＤＮＡ
プラスミドの構成を提供することである。もう一つの目
的は、ラインウィルスの主要群の結合を妨害し得るモノ
クローナル抗体を生産することである。

次の目的１ｒｉ、ウィルスの感染性を中和するライノウ
ィルス構造たんば（（ＶＰＩ、ＶＦ６およびＶＦ３）に
だいするモノクローナル抗体を生産することである。本
発８ＡＫおける、これらおよび他の目的は、以下の記載
から明らかになろう。

ＨＲＶ１４ゲノムＲＮＡの全９２１２ヌクレオチドをコ
ードするＤＮＡ断片が分子的にクローン化され、そのヌ
クレオチド配列が完全に決定された。感染性ＨＲｖ−１
４ピリオンを中和する８種のモノクローナル抗体が単離
された。加うるに１少ぐとも７５の抗原性の異なる血清
型の）ＩＲＶが、細胞レセプターに付着するのを特異的
に妨害するマウス、モノクローナル抗体が単離された。

プラークで純化したヒト・ライノウイルス１４型を生育
させ、メトリザミド（２−［３−アセタミド−５−Ｎ−
メチルアセタミド−２，４，６，−トリヨードベンツア
ミドクー２−デオキシ−〇−グルコース）勾配中の密度
平衡帯広によシ精製した。精服したウィルスは界面活性
剤によシ破壊され、キャプシドたんばくはプロテア−ゼ
にで消化された。ゲノムＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロ
ース・クロマトグラフィーによシ単離され、蔗糖勾配中
の沈降速度によシ精製された。リポソームＲＮＡ指標に
たいする相対値で３５ｓに沈降するＲＮＡが果められ、
エタノールで沈減させた。

回収され九ゲノムＲＮＡは、少なくとも原ゲノムＲＮＡ
の一部に対応する２本鎖ＤＮＡ分子を生成させるための
相補鎖合成における鋳型として用いられた。２本鎖ＤＮ
Ａは１粘着末端”を与えるように修飾され、細菌プラス
ミドｐＢＲ３２２中に置かれた。漁核生物が生成したベ
クターにさらされ、そのベクターを安定に取シ込んだも
のが同定され単離された。

ベクターＤＮＡはこれら宿主よシ抽出され、この物質の
性質が解析された。ベクターは先ず挿入ＨＲＶ　ＣＤＮ
Ａの大きさについて解析され、最大の挿入を含むベクタ
ーはウィルスＲＮＡゲノムおよび相互の関係についてマ
ツプされた。ＷＲＹゲノムＲＮＡの全長を代表するＤＮ
Ａ配列を含む選ばれたベクターは、既知の配列決定法を
用いて配列決定がなされた。これらベクターの前片は、
配列決定に先立って、放射能で珈識され単離された。こ
れら前片から得られた配列を重複させることにより、全
ＨＲＶＩ　４の配列が決定された。その後のＤＮＡ配列
のＲＮＡおよびたんはくへの変換はコンピューターによ
りなされた。アミノ酸配列の決定によりウィルスの構造
を決定し、その構造および非構造たんばくを同定するこ
とが可能となる。ウィルス構造に関する知見により、ウ
ィルスレセプター部位、たんばく開裂部位および、ウィ
ルス中和部位と思われるところの推定が可能となる。ク
ローン化したＤＮＡは、遺伝的解析および修飾において
、そして抗ウィルス化合物の開発における利用において
有用である。適当な宿主内での発現は、抗ウィルス化合
物またはサブユニット・ワクチンの開発のための多量の
ウィルスたんばくをもたらすであろう。

組換えＤＮＡ手法の利用は、多くの出版物、例え岐、マ
ニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｉ　）　　ａか、分子クロー
ニング、実験室手引き（ＭｏＬｅｃｕｌｅｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ　）
　　コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク。

１９８２年に記載されている。

これらの文献を参考のために挙げておく。

ＨＲＶ１４の感染性を中和したシ、多くのＨＲＶ血清型
が感受性細胞上のウィルスレセプターに結合するのを妨
害するようなモノクローナル抗体をつくるために、マウ
スが精製されたピリオンまたは例えばＨｅＬｅＪｌ［ｌ
胞のような、細胞またはＨＲＶ受容器部位の富化された
細胞膜によシ免疫にされた。ハイブリドーマが、免疫に
されたマウスの脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞との融合
によってつくられた。そのようにして得られたハイブリ
ドーマ細胞系よシ、ＷＲＹ−１４を中和し得る８種のモ
ノクローナル抗体が単離された。加うるに、少なくとも
ＨＲＶの７５ｓの異なる血清型が、感受性細胞上のレセ
プター部位に付着するのを妨害し得るモノクローナル抗
体が選択された。そのモノクローナル抗体の存在下で感
染することの出来ない特異的な血清型は、本発明のモノ
クローナル抗体の存在下で感染し得る血清型とともに表
■中に示しである。

これら実験の結果として、ヒト・ライノウイルスが、主
要群と、少数群とからなることが決定された。主要群は
、モノクローナル抗体によシ中和され、感染し得なくな
るのにだいし、少数群は、そのモノクローナル抗体によ
シ影響されないように思われる。

本発明のモノクローナル抗体は、感受性細胞に強く結合
し、実際に、細胞処結合したヒト・ライノウイルスの主
要群を置侠する程、より大きな結合力を有することも判
明している。本発明の抗体のこの特性は図に示されてい
る。８３５メチオニンで標識でれたヒト・ライノウイル
スが試験管内で感受性細胞膜に結合され、結合しなかっ
たウィルスは洗浄によシ除かれた。

そのＭ　Ｋ　、本発明のモノクローナル抗体を漸増添加
し、結合したウィルスの遊離する量が測定された。

本発明のモノクローナル抗体は、ＨＲＶ感染の予防また
は感染の持続および重篤度の軽減に有用である。本発明
のモノクローナル抗体により感受性細胞を処理すること
により、その細胞は過剰抗体を除去した後１２時間まで
の間ウィルス感染に抵抗性となる。そのモノクローナル
抗体は、滴下または噴霧の形で投与するための適当な局
所処方でル勾製しうる。

投与型は、約１．５から約１５０μｆの範囲で、約２時
間から約１２時間の間隔で、またよシ通常は、約５から
２０μｔの範囲で、４．８または１２時間の間隔で与え
られよう。典型的な処方は、例えば２０％Ｓ　ＰＧＡの
ような安定剤を含むＰＨ３中の本発明のモノクローナル
抗体を用いる。

以下の例示は、本発明を説明するものである。しかしな
がら、それに限定するものではない。以下の例中の各文
献は参考のために挙げたものである。

世１１．ビールスの生育と精製 ＦＴＲＶ１４は、米国標準ゐ株保有施設（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｏｅ　Ｃａ１ｔａｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ　）（ロックビル、メリーランド州）、ＡＴＣＣＶＲ
−２８４から入手され、標準技法（ｙｉｎほか、ウィル
ス学雑誌（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）　１２巻：１０８−１
１３頁、１９７３年）〈よりプラーク精製された。プラ
ーク精製したＨＲＶは標準手法（Ｃｏ１１ａｒ　　ほか
、ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）　２巻：９
１−９６頁、１９８３年）によシ得られ九Ｈｅ　Ｌａ細
胞のサブローンであるＨｅ　Ｌａ　Ｒ１９細胞上で増殖
させた。細胞は定常的に生育培地（ＧＭＩ：１０％牛脂
児血清、３０　ｍＭ　ＩＶｇα２および２０単位／−ペ
ニシリンおよび２０μｆ／＋ｄストレプトマイシンを含
むマツコイ（Ｍｅ　Ｃｏｙ　）の５Ａ培地中で増殖させ
た。単層ＨｅＬａＲ１９は、ＭＯｌ、１で感染され、細
胞がフラスコ表面から自由に剥離したときに収穫された
（通常１６−２４時間）。細胞懸濁液は凍結さｒｔ、ウ
ィルス粒子を細胞から遊離させるために、急速に融解さ
れた。低速度での遠心（４０００Ｘｆ、５分間、４℃）
により清澄化した後、ポリエチレン・グリコール６００
０　（ＰＥＧ−６０００）およびＮａαを各々７％およ
び２．２％の濃度まで添加し、混合物を４℃で４−１６
時間攪拌した。沈降したウィルスは、遠心（１０５，０
００×９．１５分、４℃）により回収され、１０ｍＭＲ
−ｊｆｊ−衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨｃｚｐＨ７，
５。

１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　〔エチレンジアミン・四酢酸〕、
０．２　Ｍ　Ｎａ　Ｃ１，５０ｍＭＡ４ｇα２　および
１０％グリセロールを含む溶液）中に再懸濁された。

デオキシロール酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン
（９）オクタフェノールを各々０３％および０６％氷上
で３０分間添加し、＠　ｆ＠液を遠心（４０００Ｘｒ、
５分、４℃）によシ清澄化した。その上澄液（７，５ｍ
ｅ、　）は、５−のグリセロールを欠くＲ−緩衝液中４
０−６０％（Ｗ／ｌメトリザミド直線状密度勾配上に重
層された。ウィルス試料の密度平衡帯形成は、ベックマ
ン５Ｗ４０ローター中１５０．０００　ｘ　ｆ　　２４
時間の遠心によりなされた。ウィルス・バンドは、一般
に勾配中の可視バンドの最も濃いもので、底に穴をあけ
、手により収穫された。Ｒ−緩衝液中で３倍稀釈の後、
ウィルスは２００．００　Ｘ　ｔ　２時間の遠心により
再ペレット化された。

例２ゲノムＲＮＡの単離 ４０個の１５０ｃｒＡフラスコのＨｅＬａＲ１９細胞か
ら精製されたＨＲＶ］４は、０．９ｍｌノ１　０　　ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ　　Ｈα、　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　　
０．３ＸＳＤＳ（ドデシル・硫酸・ナトリウム）　ｐＨ
７，５中に再懸濁された。プロテイナーゼＫが終濃度０
．５■／　ｍｅに添加され、ウィルスたんばくは３７℃
３０分間消化された。消化された混合物は９５℃工分間
加熱され、次に水浴中で急冷された。Ｎａαが０．５Ｍ
まで添加され、溶液は１傭Ｘ　Ｑ、　７　ｃｒ＋カラム
のオリコ゛（ｄＴンセルロース・カラム（コラボレイテ
イブ、リサーチ（Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　）、レキシントン、マサチュセツツ州）を
通された。カラム中に保持されたゲノムＲＮＡはＨ，Ｏ
で溶出され、エタノールで一２０℃で沈澱された。

ペレット化したＲＮＡは１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　１
ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＯ８，ｐＨ７，５を含む溶液
０、３　ｍｅ中に再懸濁され、１２−の０．１　Ｍ　Ｎ
ａαを含む同一緩衝液、中、１５％ｕｔ７Ｗ蔗糖の既に
形成した勾配上に重層された。１８３および２８ＳＲＮ
Ａ（ベセスダ・リサーチ・ラボ（Ｂｅｔｈｅｓｄｍ　Ｒ
ｅ５ａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、　）ベセスダ、マリーランド
州）を含む並行の勾配が同時に遠心された。勾配は、ｌ
５ｃｏ勾配分画機にょシ分画され、各分画のＯｎｚｓｏ
が測定された。並行の指標勾配中の１８８および２８８
の位置に対する相対値から３５８に沈降するウィルスＲ
ＮＡの主要ピークがまとめられ、−２０℃でエタノール
によ９２回沈澱された。

例３．　ＣＤ　Ｎ　Ａ合成 ペレット化しｆｃ３５ＳＲＮＡは、ＳμｔのＲ２０中に
再Ｒ濁され、３０秒間煮沸され、次に水浴中で象、冷さ
れた。次いで以下のものが添加された　９５μｔのオリ
ゴ（ｄＴ９−＋ｚ）プライマーｌグ／−溶液、５μｔの
ＩＭＴｒｒｓＨｃｌ、ｐＨ８，３，２Ａｔの２５０　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２．７μｔの］　ＭＫＣｔ、　Ｉ　ａｔの
２０ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）、２μｔのＲＮ
ａｓｉｎ（プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｉ
Ｈｏｔｅｃｈ）。

マジソン、ウィスコンシン州）、各２．５βｔの　２０
ｍＦ、４　　　ｂＣＴＰ、　　　２０ｍＭ　　　ｄＧＴ
Ｐ、２０ｍＭｄＴＴＰおよび１０ｍＭ　ｄＡＴＰ、１２
１１１の〔α３２Ｐ〕標識ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　（１１５ｕ
Ｃｉ　）（アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）　）　ｏ
反応は、氷上で１０分間プリインキュベートされ、続い
て３μｔの逆転写酵素＜４０単位）（ライフ・サイエン
ス（Ｌｉｆ＋　５ｃｉｅｎｃｅ　）　、フロリダ州）が
添加された。反応は４２℃２時間インキュベートされ、
次いで５μｔの０．５　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａおよび５μ
ｔの５　Ｍ　Ｎａ　ＯＨの添加により停止された。さら
に３７℃３０分おいた後、合成され＆ＣＤＮＡは、セル
ロース（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　ＣＦ　−１
１）カラム・クロマトグラフィー（Ｆｒａｎｋｌｉｎ　
、　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　８．５５巻°５６５頁、１９６
６年）によシ単離され、−２０℃でエタノール沈澱され
た。

ＣＤＮＡはペレット化され、４０μｔのＲ２０および５
０μｔの０．２　Ｍ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ６，９，２０ｍ
Ｍ　１４ｇＣ１２，５ｍＭ　ＤＴＴ、　０．１４ＭＫα
および各１　ｍＭのｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ、　ｄ　ＣＴ　Ｐ、
ｄＧＴＰｌｄＴＴＰを含む溶液中に再＠滴された。１０
μｔのＤＮＡポリメラーゼ■犬断片、５０単位にュー・
イングランド・バイオラブ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ　）　）の添加によシ、第２のＤＮＡ鎖が
合成された。反応混合物は１５℃１６時間インキュベー
トされ、２μｔの０．５Ｍ、ＥＤＴＡ添加によシ停止さ
れた。２本鎖ＤＮＡはフェノール／クロロホルム抽出さ
れ、エタノールで沈澱された。第２鎖合成の完結を助け
る目的で、２本鎖ＤＮＡは３ｏμｔのＨ，０，５Ａｔの
Ｉ　ＭＴｒｉａ　ｐＨ８，３，７ｌｉｔのＩＭＫα、２
μｔの２５０　ｍＭ　Ｍｌα２、各２．５１１１の２０
ｍＭ　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ。

および１０ｍＭ　ｄＡＴＰ、２ＡＬの２−メルカプトエ
タノール、および２μｔ　（３０単位）の逆転写酵素中
に再懸濁された。反応は４２’Ｃ１時間インキュベート
され、２μｔの０１５Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ添加により停
止された。２木調ｃＤＮＡは一２０℃でエタノール沈澱
された。

亘４ｃＤＮＡ”ヘアピン構造”の直鎖型への変換 クローン化の目的でｃ　ＣＮ　Ａをプラスミド・ベクタ
ー中に挿入するために、合成の間に形成した″ヘアピン
構造“を開裂し、分子の各末端に受容末端を有する直鎖
型にする必要がある。これは以下のようになされた；例
示３で既に合成されたｃｃＮＡが７９μｔのＨ２Ｏ、お
よび２０μｔのＩ　Ｍ　Ｎａα、０．２５Ｍ酢酸ナトリ
ウムｐＨ４，５，５ｍＭ　ＺｎＳＯ４および２．５　珂
ｖ／ｖ　グリセロールを含む浴液中に再懸濁された。Ｓ
、７７　レアーゼ、２９０単位（ＰＬバイオケミカルズ
（ＰＬＢｏｃｈｅｍｉｃａｌａ）、ビス力タウエイ、二
ニー・シャーシー州）が添加され、反応は３７℃３０分
間インキュベートされた。反応は２μｔの０．５　Ｍ　
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ添加によシ停止され、フェノール／クロ
ロホルム抽出され、ＤＮＡａフランクリン（Ｆｒａ−ｎ
ｋｌｉｎ、上述）、に述べられたようにセルロース・カ
ラム（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　ＣＦ　−１１
）上のクロマトグラフィーにより精製された。

例５．ｃＤＮＡの３′末端へのオリゴｄａの付加オリゴ
・デオキシグアノシン（ｄＧ）の“′尾をつけた”ｐＢ
Ｒ３２２中へのｃＤＮＡの挿入を可能とするために１例
４．からのｃＤＮＡにオリゴ・デオキシシチジン（ｄａ
）の゛尾″が付加された。エタノール沈澱に続いて、ｃ
ＤＮＡ（約２μ？）は１４９μｔのＨ２Ｏ，４０μｔの
ＩＭカコジル酸カリウム緩衝液ｐｉｆ　７．　Ｏ１４μ
ｔの０．　Ｉ　Ｍ　Ｃｏα２．２μｔの０，１Ｍ２−メ
ルカプトエタノール、１μｔの０．１Ｍ［：３Ｈ）ｄＣ
ＴＰ（１５０μＣｉ　）および４μｔ　（６０単位）末
端デオキシ転移酵素（ＰＬバイオケミカルズ（ＰＬ　Ｂ
ｉｏｅｈｅｍｉ　−ｃａｌｓ　）　）　　中に再？ａ濁
された。反応は３７℃でインキュベートされ、１分（８
０μｔ）、２分（８０μｔ）、および３分（４０μｔ）
に試料が除去され、氷上でまとめられた。

６尾のついた”ｃＤＮＡは一２０℃でエタノール沈澱さ
れた。

例６、ベクター／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａアニール化および細
胞の形質転換 例示５．からの尾のついたｃ　Ｄ　Ｎ　ＡをｐＢＲ３２
２中に挿入するために、２５　ｎｇ　　のｐＢＲ３２２
オリゴｄＧクローニング・ベクター（ＢＲＬ、ベゼスダ
、マリーランド州）が、１３．２６および３９　ｎｇ　
のオリゴｄａの尾のついたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａと、４０μｔ
の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨｃｔｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴ
Ａおよび０１Ｍ　Ｎａαを含む溶液中で６５℃５分およ
び５６℃９０分で７ニールされた。アニール化の後、各
反応混合物は０℃に冷却され、２００μｔのカルシウム
処理Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ株（Ｍａｎｉ−ａｔｉ
ｓほか、前掲、２５０頁）に添加された。

氷上で３０分インキュベーションの後、反応は４２℃２
分加熱され、１−のし−ブロス（バクト・トリプトン１
０２、バクト・酵母エキス５ｔ、およびＮａα５ｆ、蒸
留水でＩＬにする）が加えられ、形質転換反応は３７゜
３０分インキュベートされた。各形質転換反応は、４枚
のテトラサイクリン（１５μｆ／　ｍｌ　）を宮むガ大
平板（Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ほか、前掲７０−７２頁）
上だ拡げられた（２５０μｔ）、３７℃１６時間のイン
キュベーションの後裔平板は約３０集落（コロニー）を
生じた。

例７６選択されたクローンの特性 例示６．からの集落（３５４）は、楊子でつつかれ、９
６穴の血清学用平板中の１２μ々−テトラサイクリンを
含むＬブロス２００μｔに植えるのに用いられた。３７
℃１６時間のインキュベーションに続き、２０μｔの新
生育培養が、１２　ｎｇ　　Ｎａ２ＨＰＯ４，６ｎｇ　
ＫＨ２ｐ０４、ｌ　ｎｇ　Ｎａ　ｃＩ！、２　ｎｇ　Ｎ
Ｈｉｃｔｓおよび４μ？グルコースを含む２ｄＬブロス
忙植えるのに用いられた。３７℃１６時間の振盪の後、
’９．５＋ｄが、１５％までグリセロールを添加した後
に凍結され一７０℃で貯蔵された。残シの１．５−は１
２．０００Ｘｒで１分ベレット化され、上澄液は捨てら
れた。ペレットは、０．１５ｍの８％Ｗ／Ｖ　Ｍ糖、５
０ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈαｐｎ　ｓ
、　Ｏ，０，５％ｖ７ｖ　ポリオキシエチレン（９）オ
クタフェノールおよび０．６グ／−リゾチームを含む浴
液中に再懸濁され、２５℃で５分間インキュベートされ
た。

次に細菌は沸騰浴中に４０秒間置かれ、直ちに水浴中に
突っ込まれた。１２．０ＯＯＸ２１５分間の遠心に続い
て、ペレットは楊子で除去され捨てられた。上澄液に等
量のインプロパツールが添加され、溶液は混合され一２
０℃に１０分間置かれた。１２．０００Ｘりで５分間ペ
レット化の後、上澄液が除かれ、ペレットは７０ＸＶ／
Ｖ　エタノールで洗浄され乾燥された。得られたプラス
ミドＤＮＡは５０μｔ　ＨｚＯ中に再Ｒｆ１４され一２
０℃に貯蔵された。

各挿入ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａの大きさを決定するために、各プ
ラスミド試料１０μｔが、制限エンドヌクレアーゼｐｓ
ｔ　Ｉ　（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）インディアナポリス、イ
ンディアナ州）で製造業者によシ述べられたように消化
された。消化物は１％アガロースゲル中の°厄気泳動に
より述べられたように（Ｍａｎｉａｔｉｇ　　ほか、前
掲、１００頁）解析された。７．５７および１８６と命
名された３つのｃＤＮＡクローンが、大きさく２０００
ｂｐ）および７（３２００ｂｐ）および１８６（３２０
０ｂｐ　）　　が重複しないことおよび５７（２０００
ｂｐ）　　が、７と１８６の両方にまたがっていること
を示したコロニー・パイプリダイゼイション解析（グラ
ンスタイン）（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　）およびホグネス
（Ｈｏｇｎｅｓｇ　）。

米国科学アカデミ−紀要（（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）　７２巻：３９６１−３
９６５頁、１９７５年）を基として選択された。

例８．欠失サブ・クローンの構成 ２０μ２のクローン７および１８６（例７．）が、総量
３０μを中で２０μｔの制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
ｉで、製造業者によシ述ぺられたように消化された。１
％低融点アガロース・ケル（ＦＭＣ社（ＦＭＣＣｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ　＞。

ロックランド、メイン州）上でプラスミドＤＮＡをビー
ルスｃＤＮＡから分別した後、各挿入ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが
Ｔａｕｔ２および１ｅｎ２　　（分析生物化学（Ａｎａ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　　１３２巻、１４−１９頁
、１９８３年）の方法で抽出された。

２０μ２の細菌プラスミドｐＵＣ９ＤＮＡ（Ｖｉｅｉｅ
ｒｉほか、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１９巻：２５９−２６８
頁、１９８２年）が、上述のようにＰｓｔ　■で消化さ
れ、２０単位のアルカリ性フォスファターゼ（ベーリン
ガー・マンハイム）を含むＴｒ　ｉ　ｓ−ＨαｐＨ８，
０１Ｍ溶液３０μｔと６５℃２時間混合された。混合物
はフェノール／クロロホルムで２回抽出され、ｐＵＣ９
ＤＮＡはエタノ・−ル沈澱された。ｌμｆ（０，５ｐモ
ル）の単離されたクローン７および１８６の挿入部の両
方が別々に２．８μ２（ｔａｐミルモル消化されたｐ　
Ｕ　ＣＤ’　Ｎ　Ａと１０μｔの５　ｍ　Ｍ　ＴｒＩｓ
−ＨαｐＨ８，ＯｌｌｏｍＭＭｙ　（ｊ２．２０　ｍ　
Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｎ　　１　ｍ　Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐ　１０
．００１％ポリオキシエチレン（９）オクタフェノール
を含む溶液中で、２．５単位のＴ、　Ｄ　Ｎ　Ａ　　リ
ガーゼ（ＢＲＬ、ガイサスバーブ（Ｇａｉｔｈｅｒ−ｓ
ｂｕｒｇ　）＋　　メリーランド州）で、１５℃、２時
間ライゲートされた。

Ｅ、ｃｏｌｊ　ＨＢ　１０１株　（遺伝子６巻；２３−
２８頁、１９７９年）が上記ライゲーション混合物の各
々で形質転換され、形質転換体は１００μｆ／−アンピ
シリンを含む寒天平板上で選択された。ｐＵＣ９プラス
ミド中の各挿入部の方向性はＬＡＣ遺伝子の方向性との
関連で決定された。挿入部の方向性″Ａ＃はＬＡＣ遺伝
子と同じ方向性であり“Ｂ”は逆である。２００μ２の
ＰＵＣ９（７Ａ）およびＰＵＣ９（１８６Ｂ＞がＤＮａ
ｍｅＩ（べ一リンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ　Ｍａｎｎ−ｈ＠ｊｍ）　　でＩｎ＋ＭＡ４α２　
存在下に直鎖化され、ＤＮＡはＨｏｎｇ　　（分子生物
学雑誌（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ）１５８巻：５３９−５４９頁、１９８２年）
の方法に従ってＰＥＧ６０００で沈澱された。全長ＤＮ
Ａがゲル電気泳動（上述）によシ分離され、ヴイースラ
ンダ−（Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ（分析生化学（Ａｎａｌ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　　９８巻、３０５頁、１９
７９年））の方法によりアガロースから回収された。１
０μｔ　の直鎖化されたＰＵＣ９（７Ａ）またはｐ　Ｕ
　０９　（１８６Ｂ）は、２０単位の制限エンドヌクレ
アーゼ５ａｔＴ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭｍｎｎｈｅｌｍ　）　）　　で、４０μ
を中製造業者によシ述べられたように消化された。反応
混合物は次に６５℃５分間加熱され、３μｔの１．ＯＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨαｐＨ７，５，１，５ｆｉｔの０．２５
Ｍ綺α２．１２μｔの各０．１　ｍ　ＭのｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む溶液、２．５μ
ｔのＨｌｏ、および１μｔ（２，５単位）のＤＮＡポリ
メラーゼ１大断片′（ペーリンガー・マンハイム）が添
加され３７℃、３０分間インキュベートされた。６５℃
１０分間のインキュベーションに続き、ＤＮＡｋ′ｉ６
０μｔの１０％ＰＥＧ−６０００および１，２５Ｍ　Ｎ
ａαの添加によシ沈械され、氷上で１．５時間インキュ
ベートされた。ＤＮＡは遠心（１２，０ＯＯＸＩＦ）１
０分間により集められ、５０μｔの１０　ｍ　Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨαｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡおよび１０　ｍ
　Ｍ　Ｎａαを含む溶液中に溶解された。ＤＮＡは次に
フェノール／クロロホルムで抽出され、−７０℃１０分
間エタノール沈澱された。最後の沈澱は１０μｔの１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨαｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡおよび
１０　ｍ　Ｍ　Ｎａαを含む溶液中に溶解され、１．１
　ｌｉｔの０．５　Ｍ　Ｔｒｉａ−Ｈ（ｊ　ｐＨ８，０
。

０．１ＭＭｐαｍ、　０．２ＭＤＴ’ｒ、０．ＯＩＭＡ
ＴＰ１および０．０１％ポリオキシエチレン（９）オク
タフェノールを含む溶液および１μｔ（１０単位）の７
４ＤＮＡリガーゼ（二ニー・イングランド・ヌクレアー
（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮａｅｌｅａｒ　）と混合さ
れた。混合物は１５℃４時間インキュベートされ、上述
のようにＥ。

ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１株を形質転換するのに用いられ
た。１０μりの、１ｌＵｃ９　（７Ａ）およびＰＵＣ９
（１８６Ｂ）から、各４１０．ＯＯＯおよび１７．００
．０の形質転換体が得られた。

欠失クローン（形質転換体）は、例７．で述べられたよ
うにスクリーンされ、各挿入ＤＮＡの大きさはＮ　　Ｂ
　Ａ　Ｍ　　ＨＩ　　（ｐ　Ｕ　Ｃ９（１８６Ｂ）クロ
ーン〕およびＰｓｔ　ＩとＢａｍ　Ｈｒ　ＣＰＵＣ（７
Ａ）クローン〕Ｋよる制限酵素エンドヌクレアーゼ消化
により決定された。

例９．挿入ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの核酸配列決定クローン７．
５７および１８６、およびそれらの欠失クローンのサブ
セット（例８．）を各種市販の入手可能な制限酵素によ
り消化した結果、重複するＤＮＡ断片のサブセットが祷
られた。これら断片は、二つの方法の一つで放射能標識
された。

制限酵素消化が２本鎖ＤＮＡ中に５′突出部をもたらす
とき（例えば、ＸＢＡＩ）、２５μｔのＤＮＡは、８０
μｔの５０ｍＭＮａα、６ｍＭＴｒｉｓ−Ｈαｐｔｌ　
７．５．６　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ２，６ｍ　Ｍ　２−メルカ
プトエタノールおよび突出部により規定される最初のヌ
クレオチドを代表する１５０−２００ＡＩＣ＋［α３２
Ｐ〕デオキシヌクレオチド３燐酸、および５単位のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）　）　”大断片
″を含む溶液中に再懸濁し、１５℃２時間インキュベー
トすることによシ標識された。もう一つの場合は、制限
＃素消化がＤＮＡ中に３′突出部をもたらすとき（例え
ば、Ｐｓｔ　■）　ＤＮＡは４０μｔの０．２Ｍカコジ
ル酸カリウムｐＨ７，０，２ｍ　Ｍ　Ｃａ　ｃｔ２．２
ｍＭ２−メルカプトエタノール、２５０μＣｉ　（α”
Ｐ：］　　ｄｄＡＴｐ（アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
　）、シカゴ、イリノイ州）および２０単位の末端デオ
キシ転移酵素（ＰＬバイオケミカルズ（ＰＬ　ＩＨｏｃ
ｈｅｍｉ　−ｃａｌｇ　＞　）　　を含む溶液に再懸濁
し、゛３７℃１時間インキュベートすることにより３′
末端標識された。

両反応は４μｔの０．５　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ添加によ
り停止され、標識されたＤＮＡは１エルチツプ（Ｅｌｕ
ｔｉｐ　）　　”　　（シュライヒヤーとシュエル（５
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｏｈｕｅｌｌ　）　、
　　キーン、ニューハンンプシャー州）を供給者のプロ
トフールを用いて通すクロマトグラフィーによ）、取シ
込まれなかった３燐酸塩から分離された。

Ｎ製されたＤＮＡはエタノールで沈澱され、放射能標識
された末端の間で非対称的に切断し、各標識断片につき
少くとも２つの断片を生成する第２の制限エンドヌクレ
アーゼで再切断された。切断片は、４２−の２９％ψア
クリルアミド（バイオ・ラド（ＢｉｏＲａｄ　）　）−
１Ｘ　ｗ／ｖ　　Ｎ　、　Ｎ’−ビス−アクリリルシス
タミン（バイオ・ラド（、Ｂｉｏ　Ｒａｄ　）　）　、
　Ｑ、　Ｉ　ＸＷ／ｖ過硫酸７　ン−１１−二’）　ｂ
、０．３８ＸＮ、　Ｎ　。

Ｎ’　、　Ｎ’−テトラメチレン−ジアミン（バイオラ
ド（ＢｉｏＲａｄ）　）、　９０ｍＭＴｒｉｓ　　塩基
、１４０ｒｎＭホウ酸、および１　ｒｎ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　
Ｔ　Ａを含む５％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミド・ゲル［１
５Ｘ１５Ｘ０．０１５ｃｍ）中で２０ｍＡ３時間の電気
法ｆ＃によυ分画された。ゲルは１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣｔｐＨ７，５、Ｉ　ｍＭＥＤＴＡおよびｌμが４臭化
エチジウムを含む溶液中で３０分間染色され、ＤＮＡバ
ンドはＵＶ光により視覚化された。適当なバンドが切り
出され、ＤＮＡはアクリルアミド・ゲル片を１ｍｌの０
．２　Ｍ　Ｎａα、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７゜４．１ｍ
ＭＥＤＴＡおよび４０　ｍ　Ｍ　２〜メルカプトエタノ
ールを含む溶液に２５℃１５分間溶解することにより回
収された。溶解されたゲル溶液は次Ｋ”エルチップ（Ｅ
ｌｕｔｉｐ　）　　”　　（上参照）を通してクロマト
グラフされ、回収されたＤＮＡはエタノール沈澱された
。

例１０配列決定 例示９で述べられたように一方の末端のみを（３２ｐ）
で標識されたＤＮＡ断片は、マキサム（Ｍａｘａｍ　）
およびギルバート（Ｇ１１ｂｅｒｔ　）（酵素学手法（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　、Ｅｎｚｙｒｎｏｌｏｇｙ　）
　。

６５巻、１９８０年）によ、シ述べられた化学的ＤＮＡ
配列決定法を用いて配列解析がなされた。合成デオキシ
ヌクレオチド・プライマーおよびサンガー（Ｓａｍｇｅ
ｒ　）　　（ツイマーン（Ｚｉｍｍｅｒｎ　）ほか、Ｐ
、　Ｎ、　Ａ、　８．７５巻：４２５７−４２６１頁、
１９７８年）ダイデオキシ配列決定技法は、核配列の決
斌を完成させるのく用いられた。７．２０ヌクレオチド
の連続的ＤＮＡ配列は、インテリジエネテイクス・ソフ
トウェア−・パッケイジ（Ｉｎｔｓｌｌｉｇｅｎｅｔｉ
ｃｓｓｏｆｔｗａｒｅ　ｐａｋａｇｅ　）を用いて得ら
れた。このヌクレオチド配列およびそれから推定された
アミノ酸が以下にある。

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ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＧＡ↑＾ＣτＣＡＡ　＾Ｃ’ｌ’　Ａ
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ＲＶ１４たんばくにたいするヌクレオチドおよび対応す
るアミノ酸配列が示されている。用いられた命名法は、
ポリオウィルスに用いられたものに基づいている。ＨＲ
Ｖ１４にたいする中和エピトープは、各ｖＰ１、ｖＰ２
およびＶＰ３ウィルス構造たんばくにマツプされている
。ウィルス・プロテアーゼは、ポリたんばくの適切なた
んばく分解的な開裂に要求される；その活性の阻害（例
えば、ｚｎ＋＋による）は、ウィルス複製の阻害をもた
らす。ウィルスによシコードされたレプリカーゼおよび
ｖＰ−２はゲノムＲＮＡのプラスおよびマイナス鎖の双
方の合成に要求される；その活性の阻害はつ・イルス複
製を妨否する。

成熟ＢＡＬＢ／Ｃマウスの後フットバッド（ｆｏｏｔｐ
ｔＬｄ　）に例１．に従って得られた精製全１（ＲＶ　
−１４ｔｌ−注射した。各マウス・フットパッドは、０
．１　ｍのフロイントの（Ｆｒｅｕｎｄ’ｇ　）完全ア
ジュバント中に浴解した５μ２　の精製ＨＲＶ−１４を
受けた。マウスは、３０日回目第２回目の投与（５μｒ
１０．０５−／フットパッド）を受けた。ウィルス注射
１４日後に各マウスの一方の目から血清が集められ、中
和検定法（例１４．）によりＨＲＶ−１４Ｋｆｃいｆる
抗体が試験された。

中和検定法（例１４．に述べられているようＫ）で抗−
ＨＲＶ−１４抗体について陽性であったマウスは、尾静
脈中に５μ２の精製ＨＲＶ−１４（水溶液中、０．１　
ｍｅ　／　７ウス）を注射することにより、細胞融合の
３日前にプライミングされた。細胞融合に用いられた２
匹の動物から、死亡した際に染められた血清は、中和に
よシ１（ＲＶ−１４にたいする抗体の検定がなされ、陽
性であることが見出された。

成Ｑ）Ｉ　Ｂ　Ａ　ｔ、　Ｂ／　ｃマウスが、５０　ｍ
　Ｍ　Ｅ　ＤＴＡを含む燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
で、３７℃２０分処理することによシ組織培養単層から
回収された。ＨｅＬａＲ１９細胞（例１．）を含む溶液
を腹腔内に注射された。各マウスが、０．５−のフロイ
ントの（Ｆｒ５ｕｎｄ’ｓ）完全アジュバント中に懸濁
された３　Ｘ　１０’　個の細胞を受けた。３８日後に
、マウスは０．５　＋ｎｌのフロイントの（Ｆｒｅｕｎ
ｔｌ　ｓ　）不完全アジュバント中Ｉ　Ｘ　１０’　　
個のＨｅＬａＲ１９細胞を腹腔内に再投与された。

ＨＲＶ−１４感染にたいし細胞を保護する（例１４．参
照）抗体について陽性の３匹のマウスが、２０　Ｄ２ｇ
ｏ単位／マウスの粗ＨｅＬａ細胞膜（例１３．参照）尾
静脈中に注射（水溶液中、０．０５　ｍｌ／マウス）に
よシ細胞融合の４日前、１１６日目回目ライミングされ
た。用いられた３匹の動物の死亡時に集められた血清は
、ＨｅＬａ細胞をＨＲＶ−１４感染から保護し得る抗体
の存在を示した。

もう一つの実験では、３匹の成熟ＢＡＬＢ／Ｃマウスが
以下のスケデュールを用いて免疫された：１日回目よび
４２日回目おける、細胞膜調製品を用いての２回の腹腔
的投与、続いて２１４日目回目ける膜とフロイント（Ｆ
ｒ５ｕｎｄ’ｓ　）不完全アジュバントの最終皮内投与
、３日後に例１４．に述べられたように細胞融合が行な
われた。

例１３．ＨｅＬａ細胞膜の調製 ＨｅＬ’ａＲ１９細胞単層は、５０ｍＭＥＤＴＡを含む
ＰＢＳで３７℃２０分処理された。

細胞は低速度遠心で集められ、ＰＢＳで３回洗藤された
。細胞はペレット化され、１０ｍＭ燐酸緩衝液中Ｋｌ！
濁（８Ｘ１０’　細胞／−）され、氷上に２５分間置か
れた。細胞は次にダンス（Ｄｏｕｎｅａ　）　　ホモゲ
ナイザー中、２０ストローク（５ｔｒｏｋｅ　）　　で
破壊され、核は遠心（１０００ｘｔ４℃５分）Ｋよシ除
去された。上澄液は除去され、膜はベックマンＴｌ６０
ローター中１４３．０００　ｘ２４℃１時間でペレット
化された。上澄液は捨てられ、粗膜ヘレットは４２０Ｄ
ｔｓｏ単位／−ＫＰＢＳ中に溶解され一７０℃で貯蔵さ
れた。

！ マウス骨髄腫細胞は、ＨＴ培地中の凍結保存細胞から生
育させた。各１ＯＯ−のＨＴ培地は、６６ｔＲｔのダル
ベツコの改変イーグルの培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉａ　）　
：２０−の牛胎児血清（Ｆｅ２）：１０＋ｄのＮＣＴＣ
とイーグルの（Ｅａｇｌｅ’ｓ）調整塩；２艷の２００
ｍＭＬ−グルタミン；１−の３００−蒸溜水に４０８１
Ｐヒポキサンチンと１１４岬チミジンを含む溶液；そし
て１−の保存０ＰＩ（１００ｄｌ（、Ｏ中１，５２シス
ーオギザロ酢酸、０．５μ？　ピルビン酸、２０００単
位牛インシュリン）；そして、０．２−のペニシリン（
１０，０００単位／−）およびストレプトマイシン（１
０，０００μｆ／−）混合物を含んだ。頚部脱臼の後に
ＷＲＹ−１４（例１２．）で免疫された個体からのマウ
ス膵臓が除去され、室温で無血清ＩＴ培地中に置かれた
。膵臓はプラスチック・ペトリ皿上に置かれ、細胞はプ
ラスチック・かき棒で膵臓からかき出された。平板は５
−の無血清ＨＴ培地で洗われ、細胞は１５−の円錐管中
に貯められた；大粒子は１分間沈むままＫされた。次に
上清社１５−の丸底管に移され、細胞は室温で３５０ｘ
ｔｌＯ分の遠心によシペレット化された。上澄液は捨て
られ、細胞は無血清ＨＴ培地中に再懸濁（１０ｓｇ／２
牌臓）され、総生細胞がトリパン・ブルー排除により決
定された。

生５Ｐ２１０骨髄腫細胞数も決定され、骨髄腫細胞よシ
１対数多い肺細胞を用いて（例えば５０ＣＣネジ・フタ
つきプラスチック管中に２Ｘ１０’　肺細胞と２Ｘ１０
７ＳＰ２１０細胞が置かれた）併合された。細胞は３５
０×２１０分間の遠心によシペレット化され、細胞ペレ
ットは１０−の無血清ＨＴ培地中に再懸濁された。この
ペレット化と再ｇｔＭ−洗浄過程は６５２回繰返された
。そして１０ｍの無血＆ＨＴ培地中に最終的に懸濁され
た後細胞は１５−の丸底管に移された。細胞は３５０Ｘ
ｒｌＯ分でペレット化された。

ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ；分子量平均＝ｌＯ
００ｄ）が４５℃で液化され３５％ＰＥＧ　（体積／体
積）の濃度まで無血清ＨＴ培地と併合された。Ｐ　Ｅ　
Ｇ／ＨＴ培地混合物は、３−注射筒の末端に装着された
０、２２ミクロン・メングラン・フィルターを通過させ
ることにより無菌化された；次いでＰＥＧは３７℃に保
たれた。ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）がｐｇｃ
、’培地混合物に最終濃度５％に添加された。２Ｘ１０
”　細胞に１＠養管壁をたたいて細胞を渦巻かせること
により緩やかにＰ＋懸濁させつつ０．８　＋ＩｔのＰＥ
Ｇ／ＤＭＳＯ／ＨＴ培地混合物を脾臓−骨髄腫細胞ペレ
ットに滴下した。細胞のＰＥＧにたいする総接触時間が
６分になるように細胞ペレットは室温で２５０Ｘｆで遠
心された。

次にｐｇｃ上清は吸い出され、細胞は１０ｍ／のＨＴ培
地中ＫＦ＋懸濁された。細胞はペレット化’ｌ’Ｌ（３
５ＱＸＰ１０分）、最終製置３．５Ｘ１０ｇ　骨髄腫細
胞／ｓｇＫ　ＨＴ培地中に緩やかに再懸濁された。次に
細胞は９６穴微量滴定平板中にピペットで０．１＋ｄ／
穴に撤がれ、５ＸＣＯ２および９６％湿度で水包波（Ｗ
ａｔｅｒ−ｊａｃｋａｔｅｄ　）　ＣＯ２インキユベー
タ−９３７℃でインキュベートされた。

２４時間の後０．１−のＨＡＴ培地（アミノプテリン０
．３５２岬／リツトル加Ｉ（Ｔ培地）が各穴に添加され
た。穴は４から５日ごとに０．１−の新鮮ＨＡＴ培地を
再添加された。

１５％またはそれ以上（通常４ｏから８０％）のフンフ
ルエンシー（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ　）　　Ｋある培養
穴から一部の細胞が、ＨＲＶ−１４にたいする抗体の産
生のために、または、例１５に述べられた中和検定法に
よシ試馴された。

他の実験では、１５％またはそれ以上のフンフルエンシ
ーである生育−陽性穴からの一部の細胞が、例１５．に
述べられた細胞保護検定法におけるＨＲＶ−１４の細胞
レセプターへの付着を妨害する抗体の産生について試験
された。

例１２．の３匹のマウスの第一セットから、８３７の生
育−陽性穴が得られ、例１２．の３匹のマウスの第二セ
ットから、６９３の生育−陽性穴が得られた。総数１５
３０の穴からの培養液の検索の結果、ヒト・ライノウイ
ルス主要群の感受性細胞への付着を妨害し得る抗体を産
生ずる２つのバイプリドーマ培養、各３匹のマウスのセ
ットから１つが同定された。

上の検定法で高活性を有する細胞は、２巡の限界稀釈に
よシサブ・クローン化された。

高ＨＲＶ−１４中和活性を有する８つのサブクローン（
Ａ−Ｈ）および、細胞保護検定法で１つのサブクローン
（Ｉ）が選択された。これらサブクローンからの精製さ
れたモノクローナル抗体は、標準手法によシ免疫グロブ
リン・サブタイプおよび分子量に関して解析された。以
下の結果が得られた。

Ａ　　　　ＩｆＧ−２Ａ　　　４９．０００　　２７．
０００Ｂ　　　　ＩｔＧ−２Ａ　　　４９．０００　　
２７．０００ＣＩｆＧ−２Ａ　　　４９．０００　　２
７．０００Ｄ　　　　ｒｆＧ−２Ａ　　　４９．０００
　　２７．０００Ｅ　　　　ＩｆＧ−１４９，０００２
７，０００Ｆ　　　　ＩｆＧ−２Ａ　　　４９．０００
　　２７．０００ＣＩｆＧ−２Ａ　　　４９．０００　
　２７．０００ＨＩｆＧ−２１４９，０００２７，００
０Ｉ　　　　ｒｔＧ−１４９，０００２７，０００例１
５中オロ／細胞保護検定 中和検定は以下のように笑施された：ＨＲＶ−１４（１
０’　　ＰＦＵ）Ｕ、４０　ｌｉｔ　（Ｍｕ清またはパ
イブリドーマ組織培養液と総量０２−のＧＭと２５℃１
時間インキュベートされた。次に溶液は２４−大群平板
中のＨｅＬａＲ１９細胞単層（２，５Ｘ１０５　細胞）
に移され、ＣＯ２インキユベータ−９３４℃で１６−２
４時間インキュベートされた。対照と比較して細胞病変
効果が明らかでない穴は陽性と算定された。

保護検定は４８−大群平板のＨｅＬａＲ−１９細胞（１
，２５ｘ１０５　細胞／穴）を用いた。

培地を除去した後、単層はｏ、　ｉ　＋ｎｔの血清また
はバイプリドーマ組織培養と３４℃で１時間インキュベ
ートされた。インキュベーションの後、２Ｘ１０’　　
ＰＦＵａの５０　ｔｔｌ、培地中ＨＲＶ−１４が処理さ
れた単層に添刀口され、細胞はＣＯ２インキユベータ−
９３４℃で１６−２４時間インキュベートされた。対照
と比較して細胞病変効果が明らかでない穴は、陽性と算
定された。このＨｅＬａ受容器抗体が、他の血清型のＨ
ＲＶａによる感染にだいし細胞を保題するかどうかがさ
らに検定された。

ＨＲＶ３，５，９，１１，１２，１４，１５゜１７．２
２，３２．３６．３９，４１，５１゜５８．５９，６０
，６６．６７．６８型および未知血清型の臨床分離株お
よびＡ１３．Ａ１８およびＡ２１型コクサツキー・ウィ
ルスに陽性の保護結果が得られた。これらの全血清型が
同一の細胞レセプターを共有することが知られている。

異なるレセプターを共有する４つのライノウィルス血清
型（ＩＡ、２゜４４、および４９型）は、抗体により妨
害されなかった。このモノクローナル抗体は、セイビン
（５ａｂｉｎ　）　１型ポリオ・ウィルスおよびＢ２お
よびＢ３型コクサッキー・ウィルスにも細胞保護するこ
とができなかった。

冥朕に用いられたモノクローナル抗体は、谷抗体を産生
ずるバイプリドーマ細胞の生育培養から得られた組織培
養液よシ精製された。

以下の手法が採用され、これは基本的にエミニ（ｌｉ：
ｍ１ｎｉ　）ほか（ウィルス学雑誌（Ｊ、ＶＩｒｏｌ、
）４３巻：９９７−１００５頁、１９８２年）に述べら
れたものである。特定のハイプリドーマ細胞系からの組
織培養液１リツトルがワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｎ　
）　　Ｉ　Ｍ　Ｍ濾紙、グラス・ウールを含むカラム、
そして最後に７ガロース（セファロース（Ｓａｐｈａｒ
ｏｇａ　）　６　Ｂ　）で濾過された。次に組織培養液
は１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｈα、ｐＨ８，Ｏの添加によ５
　ｐｉ（８，Ｏに調整され、次にプロティンＡ−セファ
ロースカラム（２リツトルの液につきベッド体積４から
６−）上を通された。カラムは、１０ベッド体積の１０
　ｍＭＴｒｉｓ−Ｈα（ｐＨｌｓ、ｏ）で洗浄された。

次に結合した免疫グロブリンをカラムから溶出するため
に、グリシン（１００ｍ　Ｍ　）　ｐｔｌ　３．０が添
加された；分画は抗体を安定化するために、ｐＭがグリ
シンの酸性ｐｈからよシ＾いｐＨＫ変化するよう、各区
ｍＷの底に１００ｍＭＴｒｒｓ−ＨＣＩ　（ｐｔｌ８．
０　）を入れたものに集められた。カラムからのピーク
・たんばく分画はまとめられ、蒸溜Ｈ２０にたいして透
析され、総抗体として用いられるか、Ｆａｂ断片を得る
ためにさらに処理された。

各モノクローナル抗体のＦａｂ断片を得るために１上述
のようにプロティンＡからＡカラムを用いて精製された
１０から１５岬の抗体は凍結乾燥され、次に１００ｍＭ
燐酸ナトリウム、１０ｍＭシスティン、ｐｉｆ　７．２
中に溶解さｈｆｃ（２ｍｔ／２ｏη抗体）。パパイン、
ｉ当シ１０−１５単位が酵素と抗体の重埼比Ｉｇｌｏｏ
になるように添加された。この反応は３７℃で通夜１６
時間インキュベートされ、最終濃度３０ｍＭのヨード・
アセタミドの添加によシ停止された。消化きれた抗体は
、次に４℃で、架橋したデキストラン（セファデックス
（５ｅｐｈａｄｘ　）　Ｇ　−７５）カラム（２，５×
２０ｃｔｎ１幅×高さ）上にクロマトグラフされ、分画
は存在するたんばくの算定に２８０ｎｍ　の吸光歴が測
定され次。大部分のＦａｂ断片を含むカラムから出た２
査百のピークが１とめられ、次に、プロティンＡカラム
に結合する混在するＦｃ断片または消化され々かった抗
体を排除するためにプロティンＡ−セファロース・カラ
ムを通された。プロティンＡカラムからのＦａｂ断片ピ
ーク分画はまとめられ、蒸溜Ｈ２ｏにたいして透析され
、次に、２００μｍＨに凍結され一８０℃に貯蔵された
。

例１７モノクローナル抗体のＨＲＶへの架橋ＨＲＶ１４
を対象とする中和モノクローナル抗体は、ヘテロン官能
分子であるトルエン−２，４−ジイソシアネート（ＴＤ
Ｉ）を用い、Ｅｍｉｎｉ−か（ウィルス学雑誌（Ｊ、　
Ｖｉｒｏｌ、　）４３巻：９９７−１００５頁、１９８
２）の方法を以下のように少し逼りさせた方法でウィル
スへ架橋させた。燐酸ナトリウム緩衝液＜　　Ｉ　　Ｏ
ｍ　　Ｍ　　、　　ｐＨ７，２ン　が、　ｍ＠　常ノｌ
　終Ｄ　ＩＩ　　０．　５μｆ／　ｌｌｔ　Ｋなるよう
に、乾燥したモノクローナル抗体のＦａｂ析片前片えら
れた。次にＴＤＩが、工１μＬ／２００μを抗体姫加さ
れた。抗体−Ｆａｂ断片は次いでＴＤｒと４℃または室
温でインキュベートされた。反応は種々の時間、通常１
０分以下、に部分を４！シ、これらｆＩ：０℃１０分イ
ンキュベートしてＴＤＩを（支）化することにより停止
された。ＴＤｒけ固化したＴｒ）Ｉを０℃２．０００　
Ｘ　ｒでペレット化し、さらに０℃インキュベーション
とペレット化を繰返すことによシ除去された：最終上澄
液は次に取られ、ＨＲＶが抗体に添加された。

ＨＲＶは、３０００から７０００　ｃｐｍのＳ３５標Ｈ
ＨＲＶとしても添加された。そのウィルスは抗体と共に
室温で３０分間インキュベートされた。

ｐＨを９６に上昇させるために１飽和３塩基燐酸緩衝液
が、室温で１０分間添加された。

次にｐｌＩを７．０に低下させるために飽オロ１塩基燐
酸が必≦加された。試料は次にｄ　Ｈ，Ｏにだいし通夜
透析され、水が３回交換された。各試料は乾燥するまで
凍結され、ポリアクリルアミド・ゲル（ラエムリ（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ　）自然（Ｎａｔｉｖｅ　）　２２７巻、６
８０−６８５頁、１９７０年）で泳動された。電気泳動
に続いてゲルは乾燥され、次に種々の期間Ｘ−線フィル
ムに露光された。各たんばくにたいする架橋の８度を決
定するために、Ｘ−線フイルムのデンシトメーターによ
る追跡が実施され、これは種々のウィルスのピークの定
量測定類をもたらした。中和モノクローナル抗体はＶＰ
ｌ、ＶＦ６またはＶＦ６と架橋することが見出された。

【図面の簡単な説明】

図は本発明の抗体の特性を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヌクレオチド及び対応するアミノ酸の下記配列を有
   するＨＲＶ１４型のゲノムＲＮＡを代表するＤＮＡ 〔【ＤＮＡ配列があります】〕。 ２、ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸の下記配列を
   有するＨＲＶ１４型のＶＰ４のゲノムＲＮＡを代表する
   ＤＮＡ 〔【ＤＮＡ配列があります】〕。 ３、ヌクレオチド及びアミノ酸の下記配列を有するＨＲ
   Ｖ１４型のＶＰ２のゲノムＲＮＡを代表するＤＮＡ 〔【ＤＮＡ配列があります】〕。 ４、ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸の下記配列を
   有するＨＲＶ１４型のＶＰ１のゲノムＲＮＡを代表する
   ＤＮＡ 〔【ＤＮＡ配列があります】〕。 ５、ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸の下記配列を
   有するＨＲＶ１４型のプロテアーゼのゲノムＲＮＡを代
   表するＤＮＡ 〔【ＤＮＡ配列があります】〕。 ６、ヌクレオチドおよび対応するアミノ酸の下記配列を
   有するＨＲＶ１４型のレプリカーゼのゲノムＲＮＡを代
   表するＤＮＡ 〔【ＤＮＡ配列があります】〕。 ７、哺乳動物骨髄腫細胞を、ＨＲＶのヒト・ライノウイ
   ルスの主要群の血清型またはそのたんぱくサブユニット
   で免疫された哺乳動物からの脾臓細胞と融合することに
   より作製されたハイブリドーマ細胞。 ８、たんぱくサブユニットがＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ
   ３である場合の特許請求の範囲第７項のハイブリドーマ
   細胞。 ９、特許請求の範囲第７項のハイブリドーマ細胞により
   生産されたＨＲＶに対するモノクローナル抗体。 １０、哺乳動物骨髄腫細胞を、ａ）ヒト・ライノウイル
   スの主要群の血清塵に対するレセプター部位を含む細胞
   でまたはｂ）ヒト・ライノウイルスの主要群の血清型に
   対するレセプター部位を含む細胞膜でまたはｃ）ヒト・
   ライノウイルスの主要群の血清型に対するレセプター部
   位を含む細胞および細胞膜で免疫された哺乳動物からの
   脾臓細胞と融合することにより作製されたハイブリドー
   マ細胞により生産されたモノクローナル抗体。 １１、脾臓細胞が、ヒト・ライノウイルスの主要群の血
   清型に対するレセプター部位を含む細胞で免疫された哺
   乳動物からのものである場合の特許請求の範囲第１０項
   のモノクローナル抗体。 １２、脾臓細胞が、ヒト・ライノウイルスの主要群の血
   清型に対するレセプター部位を含む細胞膜で免疫された
   哺乳動物からのものである場合の特許請求の範囲第１０
   項のモノクローナル抗体。 １３、脾臓細胞が、ヒト・ライノウイルスの主要群の血
   清型に対するレセプター部位を含む細胞および細胞膜で
   免疫された哺乳動物からのものである場合の特許請求の
   範囲第１０項のモノクローナル抗体。 １４、哺乳動物骨髄腫細胞が齧歯類からのものである場
   合の特許請求の範囲第１０項の抗体。 １５、齧歯類が、マウスである場合の特許請求の範囲第
   １４項の抗体。 １６、ヒト・ライノウイルスの主要群の血清型が感受性
   哺乳動物細胞へ付着するのを阻止する特許請求の範囲第
   １０項の抗体。 １７、抗体が、付着を約１２時間まで阻止する場合の特
   許請求の範囲第１６項の抗体。 １８、ヒト・ライノウイルスの主要群の血清型が哺乳動
   物細胞に結合した際に少くともその一部と置換し得る能
   力をもつ特許請求の範囲第１０項の抗体。 １９、特許請求の範囲第１０項の抗体の酵素消化により
   生産されるＦａｂ断片。 ２０、特許請求の範囲第１０項の抗体を分泌する連続的
   なハイブリドーマ細胞系からなる試験管内組成物。