JPH0424037B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞ 本発明は発酵法によるピルビン酸の製造方法に
関するものである。 ピルビン酸は生体代謝の重要な中間体であり、
各種医・農薬などの有効な合成原料であるのみな
らず酵素法によるＬ−トリプトフアン、Ｌ−シス
テイン、Ｌ−チロシンなどのアミノ酸合成の主要
原料である。よつて安価に製造し得れば、種々の
合成原料として有用である。 ＜従来の技術＞ トルロプシス属微生物を用いて、発酵法により
ピルビン酸が製造できることは、既に知られてい
る（日本農芸化学会誌第32巻第573ページ、特開
昭62−14789号公報）。 ＜発明が解決しようとする問題点＞ しかしながら、かかる従来方法においてはピル
ビン酸の蓄積量、収率が低く、工業的に実用化す
ることができない。すなわち、日本農芸化学誌第
32巻第573ページによると、トルロプシス・キヤ
ンデイダを用いたピルビン酸の蓄積量は高々0.5
ｇ／と低い。また、特開昭62−14789号による
と、トルロプシス・エツチエルシーを用いたピル
ビン酸の蓄積量は高々5.1ｇ／と低い。 ＜問題点を解決するための手段および作用＞ したがつて本発明者らは、上記問題点を解決す
ることができ、さらに生産性の高いピルビン酸の
製造方法について鋭意研究した結果、トルロプシ
ス属に属し、ピルビン酸生産能を有する微生物
に、イソロイシンとバリンを同時に要求する性質
を付与することにより、ピルビン酸の蓄積濃度、
生成収率が著しく向上することを見出し、本発明
に到達した。 すなわち、本発明の上記目的は、トルロプシス
属に属し、ピルビン酸生産能を有する微生物のう
ち、イソロイシンおよびバリン二重要求株を培養
することにより、培地中にピルビン酸を生成蓄積
させ、これを採取することにより達成されるので
ある。 すなわち、本発明はトルロプシス
（Torulopsis）属に属し、生育のためにイソロイ
シンとバリンを同時に要求し、かつピルビン酸生
産能を有する変異株を培養液中にピルビン酸を生
成蓄積せしめ、培養液中よりピルビン酸を採取す
ることを特徴とする発酵法によるピルビン酸の製
造方法である。 次に、本発明を詳細に説明する。 本発明に用いられる変異株は、ピルビン酸生産
能を有し、生育のためにイソロイシンとバリンを
同時に要求するトルロプシス属に属する微生物で
あればいかなるものであつてもよい。 本発明に用いられる変異株の代表的なものとし
ては、たとえばトルロブシス・グラブラータｘ−
68（FERM BP−1426）（ニコチン酸、チアミン、
ピリドキシ、ビオチン、イソロイシン、バリン要
求性）が挙げられる。この変異株はトルロブシ
ス・グラブラータTR−2026（FERM BP−1425）
（ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン、ビオチ
ン要求性）を親株として通常の変異処理方法によ
つて誘導されたものである。 このような変異株は、生育のためにイソロイシ
ンおよび／またはバリンを要求しない野生株また
は親株に紫外線照射、あるいはＮ−メチル−Ｎ−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理、エチルメ
タンスルホネート（以下、EMSと略す）処理な
どの通常の変異処理を施することによつて容易に
得ることができる。 ここにいうイソロイシンおよびバリン二重要求
性とは、広義の意味であり、不完全欠失型（いわ
ゆるLeaky型）も含むものである。さらにイソロ
イシンとバリンの生合成前駆物質で要求性が満足
される場合も含むものである。 本発明で用いられる培地は発酵に通常使用され
る炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類などを
ほどよく含有するものであればよいが、炭素源と
しては、グルコースなどの糖質、有機酸、エタノ
ール、メタノールなどの使用酵母菌が利用し得る
ものが使用される。窒素源としては硫安、硝安、
塩安、尿素、ペプトン、肉エキス、味液、その他
の有機および無機窒素化合物が使用されるが、望
ましくはアミノ酸をバランスよく含む有機窒素化
合物がよい。無機塩類としてはリン酸カリウム、
硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、その他の無機
塩類が用いられ、さらに必要に応じてチアミン、
ナイアシン、ピリドキシン、ピオチンなどの要求
ビタミン、またはこれらを含有する酵母エキス、
コーンスチープリカー、その他の天然物を添加し
た培地を使用すればよい。 培養中はピルビン酸の生成蓄積にともない、PH
の低下が起こるので炭酸カルシウム、苛性ソー
ダ、苛性カリなどのアルカリでPH３〜７に調節す
ることがピルビン酸生産には有効である。培養中
の温度は22℃〜32℃が適当である。培養終了後、
系内に蓄積したピルビン酸は常法により、単離採
取することができる。 例えば、酸性エーテル抽出、フエニルヒドラゾ
ン化して沈澱単離する方法なども採用することが
できる。 ＜実施例＞ 以下、実施例によつて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ （Ｌ−イソロイシンおよびバリン二重要求性変
異株の取得） トルロブシス・グラブラータTR−2026
（FERM BP−1425）（ニコチン酸、チアミン、
ピリドキシン、ビオチン要求）の菌体を常法によ
りEMS処理（1W／Ｖ％、30℃で３時間）したの
ち、栄養寒天培地（GP寒天培地、大五栄養化学
株式会社製）に接種し、30℃で２日間培養し、
Bacto Yeast Carbon Base（DIFCO(株)製、以下、
YCB培地と略す）に、硫安５ｇ／を加えた寒
天培地(A)とYCB培地に硫安５ｇ／、Ｌ−イソ
ロイシシンとバリンを各々100mg／を加えた寒
天培地(B)に各々レプリカした。次に30℃で３日間
培養し、寒天培地(B)で生育し、寒天培地(A)で生育
しないコロニーを釣菌分離した。次に、寒天培地
(B)からＬ−イソロイシンまたはＬ−バリンを各々
除いた各培地で生育するコロニーを除いて、Ｌ−
イソロイシンおよびＬ−バリン二重要求性変異株
トルロブシス・グラブラータＸ−68（FERM BP
−1426）を取得した。 実施例 ２ （イソロイシン、バリン要求性の検定） 下記第２表に示す各菌株を、GP寒天斜面培地
で24時間培養しその菌体をごく微量かきとり、
Ｌ−イソロイシンとＬ−バリンを添加しない
YCB寒天培地およびＬ−イソロイシンのみ
0.01％、Ｌ−バリンのみ0.01％、Ｌ−イソロ
イシンとＬ−バリンを各々0.01％を含むYCB寒
天培地にうすく塗布し、30℃で４日間培養しその
生育の有無を観察した。Ｌ−イソロイシンおよび
Ｌ−バリン無添加、Ｌ−イソロイシンのみ添加、
およびＬ−バリンのみ添加の寒天平板培地で生育
できず、Ｌ−イソロイシンとＬ−バリン同時添加
寒天平板培地で生育するものをＬ−イソロイシン
およびバリン二重要求性変異株とした。 結果は第２表に示すとおりであり、本発明方法
で使用するＬ−イソロイシン／バリン二重要求性
株トルロブシス・グラブラータＸ−68は、親株の
トルロブシス・グラブラータTR−2026との比較
より明らかに、Ｌ−イソロイシンとＬ−バリンの
二重要求性を獲得している。

【表】 (注) ＋：生育あり −：生育なし
Ile：イソロイシン Val：バリン
実施例 ３ （ピルビン酸の生産） グルコース10％、硫安0.3％、リン酸−カリウ
ム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物0.05％、
ポリペブトン0.5％、ニコチン酸２mg／、ピリ
ドキシン・塩酸塩400ｇ／、チアミン・塩酸塩
20ｇ／、ビオチン５ｇ／を含む発酵培地を１
のマイヤーフラスコに40mlづつ分注し、滅菌
後、別滅菌した炭酸カルシウム４％を添加し、親
株トルロプシス・グラブラータTR−2026および
イソロイシン、バリン二重要求変異株トルロブシ
ス・グラブラータＸ−68を各々接種し、30℃で60
時間培養した。ただし、変異株は発酵培地にＬ−
イソロイシンとＬ−バリン各々0.01％を添加して
培養した。培養液中に生成したピルビン酸を高速
液体クロマトグラフイーにて定量した。 結果を第１表に示す。

【表】 なお、収率は消費グルコースに対するピルビン
酸の重量で表わした。 本発明のトルロブシス・グラブラータＸ−グラ
ブラータＸ−68を用いた方法は、蓄積濃度、ピル
ビン酸生成収率ともいずれも親株より顕著に向上
している。 次に、Ｘ−68の培養液200mlを除菌後、上澄液
に塩酸を加えPH2.0とし、エチルエーテルで抽出
し、次いで苛性ソーダでPHを5.5に中和した後40
℃で減圧濃縮し、５ml程度とした。この濃縮液に
エタノールを滴下させピルビン酸ソーダ5.91ｇ
（純度97％）を得た。 ＜発明の効果＞ 本発明方法によれば、ピルビン酸の蓄積量、収
率が向上し、より安価なピルビン酸の生産が可能
になつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ トルロプシス（Torulopsis）属に属し、生
   育のためにイソロイシンとバリンを同時に要求
   し、かつピルビン酸生産能を有する変異株を培養
   して、培養液中にピルビン酸を生成蓄積せしめ、
   培養液中よりピルビン酸を採取することを特徴と
   する発酵法によるピルビン酸の製造方法。