JPH04242661A - ナチュラルキラー細胞濃縮剤、濃縮装置および濃縮方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リンパ球のサブクラス
であるナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞ともいう
）を濃縮するＮＫ細胞濃縮剤、濃縮装置および濃縮方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫担当細胞の中心をなすのは、抗原特
異的レセプターを備えて抗原を認識し、体液性、細胞性
の特異抗体を産生するエフェクター細胞まで分化する能
力を持つリンパ球であり、免疫適格細胞（ｉｍｍｕｎｏ
ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　　ｃｅｌｌ）と呼ばれる細胞であ
る。しかしながら、生体内での免疫応答をリンパ球のみ
で行うことは不可能であり、抗原を処理してリンパ球に
提示する免疫反応の上行脚では、マクロファージ亜群の
樹状細胞が必要である。また、抗原抗体反応の最終効果
である異物処理や、血管反応を中心とした炎症反応は、
免疫応答の下行脚にあたり、マクロファージ（単球）の
他、顆粒球、肥満細胞等が関与している。

【０００３】多様な免疫担当細胞は、複雑な免疫反応の
要求に対して、局所への動員と増殖により速やかに対応
することが特徴であり、刺激に対する増殖と分化は、生
体の他の細胞系における機能調節にあたる役割を持って
いる。

【０００４】リンパ球には、次のようなサブクラスがあ
る。すなわち、胸腺の影響を受けて成熟するＴリンパ球
と、ファブリキウス嚢、あるいは哺乳類ではこれに相当
する器官（肝、骨髄等の造血巣）の影響を受けて成熟す
るＢリンパ球と、ヌル細胞のようなその他のリンパ球と
に大別される。

【０００５】Ｂリンパ球の場合、抗原刺激を受けた後は
、抗体産生細胞への分化増殖と抗体の産生といういわば
単一方向への変化を示すのに対し、Ｔリンパ球のそれは
単一ではなく、１つの抗原刺激によって数種類の種々の
機能を持つＴリンパ球に変化が起り、あるものはエフェ
クター細胞へ、またあるものは制御（分化増殖の促進ま
たは抑制）細胞として機能する。

【０００６】すなわち、Ｔリンパ球には、その機能面に
おいてサブセットが存在する。いわゆるヘルパー／イン
デューサーＴリンパ球（ＴＨ／Ｉ）、サプレッサー／サ
イトトキシックＴリンパ球（ＴＳ／Ｃ）、遅延型アレル
ギーに関与するＴリンパ球（ＴＤＴＨ）等のサブセット
である。

【０００７】また、Ｂリンパ球においても、その表面に
存在する免疫グロブリンのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）により分類されるサブセットが
あると考えられている。

【０００８】ヌル細胞群は、表面に特徴的なマーカーを
持たない細胞群であり、これに属するものとしては、Ｎ
Ｋ細胞とＫ細胞（Ｋｉｌｌｅｒ　　ｃｅｌｌｓ）が知ら
れている。

【０００９】ＮＫ細胞は、胸腺の存在に依存せず（成熟
Ｔ細胞ではない）、細胞質にも膜上にも免疫グロブリン
をもたず（Ｂ細胞ではない）、貧食機能や付着能も示さ
ない（マクロファージではない）が、形態的には明らか
にリンパ球であって、造血系の分化した諸細胞とも区別
することができる。そして、ＮＫ細胞は、特定の抗原刺
激によらないである種の腫瘍細胞を殺す働きがあること
が知られている。

【００１０】上記サブセットやヌル細胞群の存在は、マ
ーカーとなる表面抗原に対する抗体（モノクローナル抗
体）による分類とその機能との相関によって示されてい
る。

【００１１】近年、このように重要な機能を有するリン
パ球を分離、分画し、免疫科学的基礎研究あるいは各種
の診断や治療に利用する試みがなされているが、従来、
リンパ球の分離法としては以下に述べるような種々の方
法が知られている。

【００１２】すなわち、［１］細胞の大きさの差を利用
した速度沈降法などの方法、［２］細胞の比重差を利用
した比重遠心法などの方法、［３］細胞表面電荷量の差
を利用した細胞電気泳動法などの方法、［４］貧食活性
を利用したカルバニール鉄による単球の除去、［５］細
胞の非特異的付着活性の差を利用した、ナイロンウール
、ガラスウールなどを充填したカラムを用いる、あるい
はガラス、プラスチック等のシャーレを用いるなどの方
法、［６］細胞の特異的結台能を利用したアフィニティ
ークロマトグラフィー、［７］細胞のロゼット形成を指
標とするロゼット沈降法、［８］細胞膜表面の特異抗原
、免疫グロブリンと標識抗体との反応を利用したフルオ
レセンスアクチベイテッドセルソーター（Ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅ　　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　Ｃｅｌｌ　　
Ｓｏｒｔｉｎｇ，ＦＡＣＳ）法などである（例えば、矢
田純一、藤原道夫編著、新リンパ球機能検索法、１９８
７年、中外医学社などを参照）。また、支持体や固定相
を使用しない多段分離の手段として、［９］フィールド
フローフラクショネーション（Ｆｉｅｌｄ−Ｆｌｏｗ　
　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ，ＦＦＦ）法が検討され
ている。

【００１３】しかしながら、［１］〜［３］におけるよ
うな物理的な細胞分離法は、Ｔリンパ球とＢリンパ球と
の間に比重、密度等の物理的諸物性に際だった差がない
ため、分離回収された細胞の収率あるいは純度に高い精
度が要求できないものであり、特に、［２］の比重遠心
法においては、媒体の価格が高価になってしまうか、あ
るいは安い場合でも操作に熟練を要し、また［３］の細
胞電気泳動法においては、細胞の成熟度によって移動度
が異なること、細胞機能に与える電場の影響が解明され
ていないこと、大量処理が困難であるといった欠点も有
するものであった。

【００１４】また、［６］〜［８］におけるような細胞
膜表面の特異抗原、レセプター、免疫グロブリンなどを
指標とする細胞分離法は、いずれも処理細胞が生物学的
に特異性の高い強固な結合や刺激を受けるため、インタ
クトな状態で目的細胞を回収するのが難しく、かつ大量
処理に適さないものであり、特に、［６］のアフィニテ
ィークロマトグラフィーは、高価な抗体を必要とし、ま
た、［８］のＦＡＣＳ法は、細胞を標識する等の前処理
が煩雑であり、高価な抗体と装置を必要とするといった
欠点を有するものであった。

【００１５】また、［９］のＦＦＦ法は、回転軸を介し
て溶離液を連続的に流入、流出する装置的な困難さと共
に、ローター状分離セルと流路の材質が細胞の接着を招
くために、細胞の相互分離を実用化するところまでには
至っていない。

【００１６】これに対し、［５］の細胞の非特異的付着
特性を利用した方法は、処理細胞の機能を損傷するおそ
れが少なく、また価格、操作性、および大量処理性の面
でも適当なものであるが、目的細胞に対する選択性およ
び回収率の面では不十分なものであり、さらに前記した
カラム法などにおいては、分離操作を行なう場合の経験
的技術的習熟が必須であるという大きな課題も存在して
いるものであった。

【００１７】このような非特異的付着特性を利用する分
離剤および分離方法としては、疎水性材料（特公昭５９
−１７３８７号、同５９−３６９６３号、同６２−４５
２０６号、特開昭５７−２０４４５４号）、酸性官能基
を有する材料（特公昭５９−３６９６１号、特開昭５６
−１４０８８６号、同５６−１５２７４０号）、塩基性
官能基を含有する重合体（特開昭５９−２１６５８４号
、同６０−１０５４９０号）、ヒドロキシアパタイト繊
維（特開昭６３−２８４号）、特定の高分子体（特開昭
６１−２２１１２３号、同６４−３４２８５号）を用い
ることも提唱されているが、これらのものにおいても目
的細胞に対する選択性および回収率の面では未だ十分な
ものではなかった。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、Ｎ
Ｋ細胞を効率よく分離でき、かつ細胞機能を損なうこと
なく回収することができるＮＫ細胞濃縮剤、濃縮装置お
よび濃縮方法を提供することを目的とするものである。

【００１９】

【課題を解決するための手段】このような目的は、下記
（１）〜（７）の本発明により達成される。

【００２０】（１）ナチュラルキラー細胞に対し低接着
性であり、かつ被検液中の他の細胞の少なくとも１種に
対し親和性を有する有機物を水不溶性固体物質に固定化
してなることを特徴とするナチュラルキラー細胞濃縮剤
。

【００２１】（２）前記有機物は、植物由来の多糖また
は糖タンパク質である上記（１）に記載のナチュラルキ
ラー細胞濃縮剤。

【００２２】（３）前記植物由来の多糖は、サトイモの
茎から分離した分子量２０万〜１００万の多糖である上
記（２）に記載のナチュラルキラー細胞濃縮剤。

【００２３】（４）前記植物由来の糖タンパク質は、レ
クチンである上記（２）に記載のナチュラルキラー細胞
濃縮剤。

【００２４】（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記
載のナチュラルキラー細胞濃縮剤を充填した容器を有す
ることを特徴とするナチュラルキラー細胞濃縮装置。

【００２５】（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記
載のナチュラルキラー細胞濃縮剤にナチュラルキラー細
胞を含む被検液を接触させ、被検液中の前記他の細胞の
少なくとも１種を前記ナチュラルキラー細胞濃縮剤に吸
着させることにより被検液中のナチュラルキラー細胞を
濃縮することを特徴とするナチュラルキラー細胞濃縮方
法。

【００２６】（７）上記（５）に記載のナチュラルキラ
ー細胞濃縮装置の容器内にナチュラルキラー細胞を含む
被検液を通過させ、被検液中の前記他の細胞の少なくと
も１種を前記ナチュラルキラー細胞濃縮剤に吸着させる
ことにより被検液中のナチュラルキラー細胞を濃縮する
ことを特徴とするナチュラルキラー細胞濃縮方法。

【００２７】

【作用】本発明のＮＫ細胞濃縮剤は、ＮＫ細胞に対し低
接着性であり、かつ被検液中の他の細胞の少なくとも１
種に対し親和性を有する有機物、特に植物由来の多糖ま
たは糖タンパク質を、水不溶性固体物質に固定化（結合
）したものであるから、このＮＫ細胞濃縮剤に例えば血
液のような被検液を接触させると、前記有機物と親和性
を有するＮＫ細胞以外の細胞がＮＫ細胞濃縮剤に吸着さ
れ、ＮＫ細胞を高い効率で濃縮し、かつ収率良く他の細
胞から分離することができる。

【００２８】この作用をより詳しく説明すると、細胞膜
表面抗原レセプターは、糖タンパク質、糖脂質、タンパ
ク質、脂質で構成されているので、ある種の有機物、特
に植物由来の多糖または糖タンパク質は、ＮＫ細胞以外
の特定の細胞の膜表面の糖構造を認識し、選択的な吸着
が生じると考えられる。これらの特異的相互作用力を物
理化学的に解析すると、特定の細胞に親和性を有する有
機物と、特定の細胞の膜表面とは、ファン・デル・ワー
ルス力（この力の中身として、配向効果、誘電効果およ
び分散効果の三つの効果が考えられている）を基本にし
て、水素結合、イオン結合（クーロン力）、イオン−双
極子間力、配位結合および疎水結合の分子間力が組み合
わさって相互作用し、さらに表面分子が形成する空間的
構造が鍵と鍵穴のごとく、立体的に適合しているものと
推測されるものである。

【００２９】前述したように、リンパ球は、免疫担当細
胞として、種々の免疫疾患に密接な係わりを有しており
、特にＮＫ細胞は、ある種の腫瘍細胞を殺す（融解）作
用がある。

【００３０】従って、ＮＫ細胞を高い収率で他の細胞か
ら分離、濃縮することができれば、免疫学的研究のみな
らず、癌疾患の診断や治療にも役立つものと考えられる
。

【００３１】

【実施例】＜発明の構成＞以下、本発明のＮＫ細胞濃縮
剤、濃縮装置および濃縮方法について詳細に説明する。

【００３２】本発明のＮＫ細胞濃縮剤は、ＮＫ細胞に対
し低接着性であり、かつ被検液中の他の細胞の少なくと
も１種に対し親和性を有する有機物（以下、単に有機物
という）を水不溶性固体物質に固定化したものである。

【００３３】この有機物としては、ＮＫ細胞の濃縮性が
特に優れるという点で、糖類が好ましく、特に、植物由
来の多糖または糖タンパクが好ましい。

【００３４】本発明において用いられる植物由来の多糖
は、サトイモの茎から分離した分子量２０万〜１００万
、特に３０万〜８０万の多糖が好適である。

【００３５】サトイモの茎は、古来より副食や非常食と
して、現在では健康食品として、食されており、多糖が
多量に含まれている。サトイモの中では、特に茎にえぐ
みの少ない唐芋、八頭などの赤茎のもの、ずいき専種の
蓮芋の葉柄が好ましいものとして挙げることができる。 茎の乾燥品は、芋柄と呼ばれることが多いが、えぐみが
少なく、特に好適に用いられる。

【００３６】分子量２０万〜１００万が好適な理由は、
このような分子量とすることにより、分子鎖が適度に長
くなり、細胞との接着が生じ易く、また細胞との相互作
用に利用される側鎖や官能基が適度な表面密度になるか
らである。

【００３７】このようなサトイモの茎由来の多糖は、リ
ンパ球の大半を占めるＴリンパ球、特にそのサブセット
であるヘルパー／インデューサーＴリンパ球に対し高い
親和性を有しており、かつＮＫ細胞に対しては接着性が
低いため、ＮＫ細胞を効率良く濃縮することができる。

【００３８】なお、多糖としては、上記サトイモの茎か
ら分離したものに限らず、例えばシイタケから抽出した
もの、ビャクジュウ、トウキ、サンヤク等の生薬から抽
出したもの、あるいは、海藻に含まれる多糖でもよい。

【００３９】本発明における植物由来の糖タンパク質と
しては、レクチン、酵素、ホルモン、エクステンシンな
どの細胞壁成分等が挙げられるが、そのなかでも、特に
レクチンが好適である。

【００４０】レクチンとは、糖と相互作用するタンパク
質または糖タンパク質であり、細胞を凝集し、あるいは
多糖類や複合糖質を沈降させるが、免疫学的産物でない
ものをいう。

【００４１】このようなレクチンの代表例としては、次
のようなものが挙げられる。

【００４２】１）Ｌ−フコース結合性レクチン：Ｌｏｔ
ｕｓ　　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（ミヤコグサ）
、Ｕｌｅｘ　　ｅｕｒｏｐａｅｕｓ−Ｉ、ウサギ血清な
ど。

【００４３】２）Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ
−ガラクトサミン結合レクチン：Ｖｉｃｉａ　　ｖｉｌ
ｌｏｓａ（ヘアリーベッチ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ　　ｃｏ
ｍｍｕｎｉｓ（ヒママメ）、Ａｒａｃｈｉｓ　　ｈｙｐ
ｏｇａｅａ（ピーナッツ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ　　ｍａｘ
（ダイズ）、Ｂａｕｈｉｎｉａ　　ｐｕｒｐｕｒｅａ（
モクワンジュ）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　　ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ（インゲンマメ）。

【００４４】３）Ｄ−マンノース結合レクチン：Ｃａｎ
ａｖａｌｉａ　　ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ
；コンカナバリンＡ）、Ｌｅｎｓ　　ｃｕｌｉｎａｒｉ
ｓ（レンズマメ）、Ｐｉｓｕｍ　　ｓａｔｉｖｕｍ（エ
ンドウマメ）、Ｖｉｃｉａ　　ｆａｂａ（ソラマメ）。

【００４５】４）ジ−Ｎ−アセチルキトビオース結合レ
クチン：Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　　ｖｕｌｇａｒｉｓ（小麦
胚；小麦胚凝集素）、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ　　ａｍｅ
ｒｉｃａｎａ（アメリカヤマゴボウ；ＰＷＭレクチン）
、Ｓｏｌａｎｕｍ　　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ
）。

【００４６】５）シアル酸結合レクチン：Ｌｉｍｕｌｕ
ｓ　　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ（カブトガニ）。

【００４７】本発明においては、このようなレクチンの
なかでも、上記２）が好ましく、特に、ヘアリーベッチ
またはヒママメから得られる血球凝集素が好ましい。

【００４８】また、レクチンの分子量は特に眼定されな
いが、１万〜５０万程度、特に５万〜２０万程度のもの
が好ましい。

【００４９】このようなレクチン、特に上記ヘアリーベ
ッチやヒママメ由来のものは、リンパ球の大半を占める
Ｔリンパ球、特にそのサブセットであるヘルパー／イン
デューサーＴリンパ球に対し高い親和性を有しており、
かつＮＫ細胞に対しては接着性が低いため、ＮＫ細胞を
効率良く濃縮することができる。

【００５０】なお、本発明における有機物は、上記植物
由来の多糖または糖タンパク質に限定されず、例えば、
動物や菌体由来の多糖または糖タンパク質、あるいは、
動植物由来の配糖体（例えばビタミンＰ）、単糖、オリ
ゴ糖等を使用することもできる。

【００５１】また、本発明における有機物は、リンパ球
のみならず、リンパ球以外の白血球、赤血球、血小板等
の細胞に対し親和性を有するものでもよい。

【００５２】このような有機物、特に植物由来の多糖ま
たは糖タンパク質の水不溶性固体物質への担持量は特に
限定されないが、１×１０−３〜５×１０２　　μｍｏ
ｌ／ｇであるのが好ましく、さらに好ましくは１×１０
−３〜１×１０２　　μｍｏｌ／ｇである。

【００５３】本発明において、このような有機物を固定
化する担体である水不溶性固体物質としては、親水性の
ものであっても、あるいは疎水性のものであってもよく
、具体的には例えば、アガロース系、デキストラン系、
キトサン系、セルロース系等の多糖類、ポリアクリルア
ミド系、ポリビニルアルコール系、ポリビニルピロリド
ン系、ポリアクリロニトリル系、スチレン−ジビニルベ
ンゼン共重合体、ポリスチレン系、アクリル酸エステル
系、メタクリル酸エステル系、ポリエチレン系、ポリプ
ロピレン系、ポリ４−フッ化エチレン系、エチレン−酢
酸ビニル共重合体系、ポリアミド系、ポリカーボネート
系、ポリフッ化ビニリデン系、ポリビニルホルマール系
、ポリアリレート系、ポリエーテルスルホン系などの有
機合成高分子、コラーゲン、キトサンのような生体由来
の天然有機高分子、ガラス系、チタン系、活性炭系、あ
るいはアルミナ、シリカ、ヒドロキシアパタイト等の各
種セラミックス系などの無機物などが挙げられるが、通
常、固定化酵素法、アフィニティークロマトグラフィー
などにおいて用いられる公知の担体は特別の限定なく使
用することができる。特に、このなかでも、細胞接着性
の高すぎないもの、すなわち、細胞−担体間の相互作用
が比較的穏やかであるものが好ましい。

【００５４】このような水不溶性固体物質の形態として
は、特に限定されず、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状
、あるいは平板状等の公知のいずれの形状のものも用い
ることができるが、被検液や洗浄液等の通液性、分離剤
調製時の取り扱い簡便性などの点から、粒子状のものが
好ましい。この場合、水不溶性固体物質の平均粒径は０
．０５〜５ｍｍ、特に０．１〜２ｍｍであるのが有効表
面積および通液性などの面から好ましい。

【００５５】すなわち、平均粒径が０．０５ｍｍ未満で
は通液性が低下し、また、５ｍｍを超えると十分な有効
表面積を確保し難くなる。

【００５６】なお、上記平均粒径は、ＪＩＳ−Ｚ−８８
０１に規定されるフルイを用いて分級した後、各級の上
限粒径と下限粒径の中間値を各級の粒径とし、その重量
平均として算出することができる。

【００５７】さらに、粒子形状（特に球形の粒子）は、
細胞に物理的な損傷を与えにくいこと、クダケ、カケな
どが生じにくいこと、均一な粒子を得易い等の点から好
ましい。

【００５８】また、このような水不溶性固体物質は、多
孔質あるいは緻密質のいずれであってもよい。

【００５９】多孔質の粒子としては、例えば、ジビニル
ベンゼンモノマー、グリシジルメタクリレートモノマー
および２−ヒドロキシエチルアクリレートオリゴマーの
三元共重合のごときアクリル系多孔質ビーズが好適に使
用される。

【００６０】本発明において水不溶性固体物質の表面に
前記有機物を固定化する方法としては、共有結合、イオ
ン結合、物理的吸着、疎水結合、生化学的特異結合など
の担体結合法、あるいは架橋法、包括法、複合法などあ
らゆる公知の方法を用いることができるが、体液ないし
は細胞懸濁液中での安定性の点から、共有結合または疎
水結合により固定することが好適である。

【００６１】前記有機物を水不溶性固体物質の表面に共
有結合するためには、両者の官能基に応じて、種々の方
法が用いられる。例えば、臭化シアン活性化法、カルボ
ジイミド試薬などを用いる縮合試薬法、酸アジド誘導体
法、ジアゾ法、アルキル化法、ジアルデヒドやビスエポ
キシド、ジイソシアネートなどを用いる担体架橋法、γ
−グリシドキシプロピルトリメトキシシランやβ−（３
，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシ
ランなどを用いるシランカップリング剤活性化法などが
使用される。

【００６２】また、必要に応じて、前記有機物と水不溶
性固体物質表面との間に任意の長さのスペーサー分子を
導入して使用することも可能である。このスペーサー分
子としては、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン類
、ヘキサメチレングリコールなどのジオール類などが好
ましいものとして挙げることができる。

【００６３】また、前記有機物を水不溶性固休物質表面
に疎水結合する方法としては、例えばポリスチレン、ポ
リプロピレンなどの疎水性重合体へ直接結合させる方法
、また上述の共有結合法により担体へ分子内に疎水基を
有するカップリング剤を結合させた後に疎水結合させる
方法などがある。分子内に疎水基を有するカップリング
剤としては、オクタデシルジメチル［３−（トリメトキ
シシリル）プロピル］アンモニウムクロライド、オクタ
デシルトリクロロシラン、フェニルトリクロロシランな
どがある。

【００６４】次に、本発明のＮＫ細胞濃縮方法について
説明する。

【００６５】前記有機物を水不溶性固体物質に固定化し
てなる本発明のＮＫ細胞濃縮剤を用いて、ＮＫ細胞の濃
縮を行なうには、これらのＮＫ細胞濃縮剤を被検液（例
えば、血液、血清、血漿、リンパ液、髄液、腹水のよう
な体液、またはその他細胞懸濁液等）に浸漬するなどに
より被検液と接触させて、ＮＫ細胞を回分式に採取する
ことも可能であるが、ＮＫ細胞以外の細胞の吸着に作用
する前記有機物の絶対量や十分な細胞吸着スペースを獲
保するという点から、ＮＫ細胞濃縮剤を充填してなる容
器（カラム）を有する本発明のＮＫ細胞濃縮装置を用い
て接触せさることが好ましい。

【００６６】すなわち、本発明のＮＫ細胞濃縮装置（以
下、単に濃縮装置という）は、前記有機物を前記水不溶
性固体物質へ固定化したＮＫ細胞濃縮剤を充填した容器
を有することを特徴とするものである。

【００６７】この濃縮装置において、容器を構成する材
質としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカー
ボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等
の合成樹脂、ガラス、ステンレス等の金属、各種セラミ
ックスなどが使用できるが、オートクレーブ滅菌が可能
で、取り扱いやすい材料であるポリプロピレンやポリカ
ーボネート等が特に好ましい。

【００６８】また、この濃縮装置の容器であるカラムの
出入口とＮＫ細胞濃縮剤を充填した濃縮剤層との間には
、被検液中の細胞成分は通過するがＮＫ細胞濃縮剤は通
過できない網目や細孔を有するフィルター部材を備えて
いることが好ましい。このフィルター部材としては、例
えばメッシュ、織布、不織布等が好適に使用され、その
構成材料は、生理学的に不活性で強度の高いものであれ
ばよく、特にポリエステルやポリアミドを用いるのが好
ましい。

【００６９】図１は、本発明のＮＫ細胞濃縮装置の構成
例を模式的に示す断面図である。同図に示す濃縮装置１
においては、流体導入口２および流体導出口３を備える
カラム容器４内に、好ましくは粒子状の不溶性固体物質
よりなる前記ＮＫ細胞濃縮剤５が充填されており、この
分離剤５は、流体導入口２および流体導出口３の近傍に
それぞれ設けられたフィルター６ａ、６ｂによってカラ
ム容器４内に保持されている。

【００７０】カラム容器４へのＮＫ細胞濃縮剤５の充填
量は特に限定されないが、０．１〜１０００ｇ程度、特
に０．５〜４００ｇ程度とするのが好ましい。

【００７１】また、本発明では、上記有機物のうち、異
なる２種以上のものをそれぞれ不溶固体物質に固定化し
たものを、カラム容器４内に充填（各種を混合または層
状に分離した状態で）してもよい。

【００７２】この濃縮装置１を用いて、患者に対して体
外循環療法を行うには、例えば図２に示すような回路中
にこの濃縮装置１を組み入れればよい。

【００７３】この図２に示す体外循環回路を用いた体外
循環療法を簡単に説明すると、患者から脱血された血液
は、該回路の血液導入口７より回路内に導入され、血液
ポンプ８、および圧力ゲージ１０ａを備えるチャンバー
９ａを通って、一定流速にて濃縮装置１内へ流体導入口
２より導入され、カラム容器４内を通過する際に該容器
内に収納されたＮＫ細胞濃縮剤５と接触する。

【００７４】ＮＫ細胞濃縮剤５が、例えば、Ｔリンパ球
を選択的に吸着しうるものであれば、ここで血液中のＴ
リンパ球がＮＫ細胞濃縮剤５に選択的に吸着され、その
結果、ＮＫ細胞が濃縮された血液を得ることができる。

【００７５】このような処理がなされた血液は、流体導
出口３より濃縮装置１外へ導出され、圧力ゲージ１０ｂ
を備えるチャンバー９ｂを通って、恒温槽１１で加温さ
れた後、気泡検知器１２を通って、回路の血液導出口１
３より患者の体内へ戻される。

【００７６】この体外循環療法を、例えば癌疾患の患者
に応用した場合、患者の血液中のＮＫ細胞を濃縮して返
血することにより、効率的な治療が期待できるものとな
る。

【００７７】また、他の方法として、本発明により濃縮
したＮＫ細胞を培養用バッグ等に回収した後、サイトカ
イン等の細胞増殖因子を添加して培養し、そしてキラー
活性を高めて患者へ戻すことにより、一層有効な冶療が
期待できるものとなる。

【００７８】なお、上記構成の濃縮装置１は、カラム容
器４の内部（血液と接触する部分）が、その使用前に湿
熱滅菌（オートクレーブ滅菌）、ガス滅菌（例えば、Ｅ
ＯＧ滅菌）または放射線滅菌（例えば、γ線滅菌）など
の滅菌法により滅菌処理がなされているのが好ましい。

【００７９】本発明の濃縮装置は、このような滅菌処理
をしても性能の低下は生じず、安定したＮＫ細胞濃縮能
を示すので、適正な診断、安全な治療を行なうことがで
きる。

【００８０】なお、本発明の濃縮装置における容器とし
ては、図示のごときカラム容器に限らず、例えばシリン
ジの外筒、チューブ、ボトル、袋等でもよい。

【００８１】＜実施例＞以下、本発明の具体的実施例に
ついて説明する。

【００８２】（実施例１）担体（水不溶性固体物質）と
してジビニルベンゼンモノマーとグリシジルメタクリレ
ートモノマーと２−ヒドロキシエチルアクリレートオリ
ゴマー（分子量２３０）との原料組成が重量比で２２．
８：４６．２：３１．０である三元共重合体の粒状物（
藤倉化成社製、平均粒径０．１５ｍｍ（以下、多孔性粒
子Ａと称する））５ｇに、サトイモのイモガラ抽出多糖
液（分子量２０万〜１００万、グルコース換算糖濃度０
．０５Ｍ、ｐＨ１０）１０ｍｌを加えて脱気した。そし
て、ブラッドミキサー（萱垣医理科工業社製ＢＭ−１０
１型）を用い、室温にて２日間撹拌した。

【００８３】次に、これを蒸留水２５０ｍｌで洗浄した
後、酢酸でｐＨ８に調整した１Ｍモノエタノールアミン
溶液を１０ｍｌ加えて脱気した。そして、ブラッドミキ
サーを用い、室温にて１日間攪拌した。

【００８４】このようにして調製したＮＫ細胞濃縮剤を
、蒸留水４００ｍｌ、０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１０）
１ｄｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）１ｄｌ、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｄｌの順で洗浄した。

【００８５】なお、サトイモの茎から多糖を分離する操
作は次の通りである。まず、芋柄を水にさらして濁りが
なくなるまでアク抜きした後、ミキサーで粉砕した。こ
の粉砕物を水に浸して、８５℃の湯せん中で２時間、攪
拌しながら抽出した。次に１００メッシュの濾布とＪＩ
Ｓ規格Ｎｏ．２の濾紙で固液分離を行ない、濾液を採取
して減圧濃縮した。芋柄（乾物）１ｋｇから水分６３％
の抽出物が約３４０ｇ採取された。

【００８６】このようにして得られたＮＫ細胞濃縮剤を
、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）に懸濁さ
せ、先端内部にポリエステル不織布を入れた容量２．５
ｍｌのディスポーザブルシリンジ（テルモ社製）に０．
４ｍｌ充填した。そして、このシリンジの先端に針管お
よび細胞回収容器を取り付け、ＮＫ細胞濃縮装置とした
。

【００８７】この濃縮装置を使用して、以下の細胞分離
実験を行なった。

【００８８】すなわち、濃縮装置を構成するシリンジの
上端開口部より、単核球分離管（ベクトン・ディッキン
ソン社製、商品名：リューコプレップ）を使用して得ら
れたヒト末梢血単核球懸濁液（ＰＢＭＣ）１００μｌを
添加し（白血球数６００×１０４個）、ＰＢＳ３２μｌ
で細胞をシリンジ内のＮＫ細胞濃縮剤層に沈めた後、室
温で３０分間静置した。

【００８９】次に、ＰＢＳ０．８ｍｌでＮＫ細胞濃縮剤
をリンスし、流出してきた細胞を回収した。

【００９０】そして、この回収液中の細胞数を多項目自
動血液分析装置（東亜医用電子製Ｓｙｓｍｅｘ　　ＮＥ
−６０００）で測定した後、フィコエリスリン（ＰＥ）
標識抗Ｌｅｕ−１９抗体（ベクトン・ディッキンソン社
製）で染色し、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏ　　Ａ
ｃｃ−１５０、日本分光社製）によって、ＮＫ細胞、リ
ンパ球の割合をそれぞれ求めた。そして、ＮＫ細胞濃縮
剤と接触する前の細胞数およびリンパ球、ＰＥ標識抗Ｌ
ｅｕ−１９抗体陽性細胞の割合と比較することによって
、各細胞の接着率を算出した。

【００９１】その結果を表１に示す。

【００９２】（実施例２）前記多孔性粒子Ａ１０ｇに、
ヘアリーベッチ（Ｖｉｃｉａ　　ｖｉｌｌｏｓａ）レク
チン（分子量：約１２万）の２ｗ／ｖ％溶液（ｐＨ１０
）２０ｍｌを加えて脱気した。

【００９３】以下は、実施例１と同様にしてＮＫ細胞濃
縮剤の調製および細胞分離実験を行なった。ただし、Ｎ
Ｋ細胞濃縮剤のシリンジへの充填量は１ｍｌとし、添加
する白血球数は、７５０×１０４個とした。

【００９４】その結果を表１に示す。

【００９５】（実施例３）前記多孔性粒子Ａ５ｇに、ヒ
ママメ（ＲｉｃｉｎｕｓＣｏｍｍｕｎｉｓ）レクチン（
分子量約１２万）の０．４５ｗ／ｖ％溶液（ｐＨ１０）
１０ｍｌを加えて脱気した。

【００９６】以下は、実施例１と同様にしてＮＫ細胞濃
縮剤の調製および細胞分離実験を行なった。ただし、Ｎ
Ｋ細胞濃縮剤のシリンジへの充填量は１ｍｌとし、添加
する白血球数は１５００×１０４個とした。

【００９７】その結果を表１に示す。

【００９８】（実施例４）前記多孔性粒子Ａ２０ｇに、
ビタミンＰの０．０５Ｍ溶液（ｐＨ１０）５０ｍｌを加
えて脱気した。

【００９９】以下は、実施例１と同様にしてＮＫ細胞濃
縮剤の調製および細胞分離実験を行なった。ただし、Ｎ
Ｋ細胞濃縮剤のシリンジへの充填量は１ｍｌとし、添加
する白血球数は、１５００×１０４個とした。

【０１００】その結果を表１に示す。

【０１０１】（実施例５）前記多孔性粒子Ａ５ｇに、シ
ジミから熱水抽出した糖タンパク質（分子量約１０万）
の０．０５Ｍ溶液（ｐＨ１０）１０ｍｌを加えて脱気し
た。

【０１０２】以下は、実施例１と同様にしてＮＫ細胞濃
縮剤の調製および細胞分離実験を行なった。ただし、Ｎ
Ｋ細胞濃縮剤のシリンジへの充填量は１ｍｌとし、添加
する白血球数は１５００×１０４個とした。

【０１０３】その結果を表１に示す。

【０１０４】（比較例）前記多孔性粒子ＡをそのままＮ
Ｋ細胞濃縮剤として使用した以外は、実施例１と同様に
して細胞分離実験を行なった。

【０１０５】ただし、ＮＫ細胞濃縮剤のシリンジへの充
填量は１ｍｌとし、添加する白血球数は１５００×１０
４個とした。

【０１０６】その結果を表１に示す。

【０１０７】

【表１】

【０１０８】なお、表１中の項目Ａ〜Ｆは、次の通りで
ある。

【０１０９】Ａ：結合した有機物 Ｂ：白血球の接着率（％） Ｃ：リンパ球の接着率（％） Ｄ：非リンパ球の接着率（％） Ｅ：ＮＫ細胞（Ｌｅｕ１９＋）の接着率（％）Ｆ：ＮＫ
細胞の陽性率（％）

【０１１０】表１に示す結果から明らかなように、実施
例１〜５、特に１〜３による本発明のＮＫ細胞濃縮剤で
は、いずれも、有機物を有していない比較例に比べ、Ｎ
Ｋ細胞の接着率が低く、ＮＫ細胞が効率良く濃縮されて
いる。

【０１１１】また、回収されたＮＫ細胞は、機能の低下
や形態の変化は生じていなかった。

【０１１２】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、細
胞の機能を損なうことなく、ＮＫ細胞を高収率、高純度
で、濃縮することができ、しかも、その操作は極めて簡
便かつ迅速である。

【０１１３】従って、例えば、免疫機能に関連したリン
パ球の機能解析等の基礎研究、各種臨床検査、免疫疾患
等の診断や治療において、より信頼性の高い結果、より
効果的な治療、あるいはより効率的な処理操作が期待で
きるものとなる。

【０１１４】また、本発明のＮＫ細胞濃縮装置および濃
縮方法によれば、上記のごとき特性を有するＮＫ細胞濃
縮剤と、被検液との接触をより効率よく行なうことがで
き、例えば癌疾患の体外循環療法に応用した場合、患者
の血液中のＮＫ細胞を濃縮して返血することにより、効
率的な治療が期待できるものとなる。

【０１１５】さらに、本発明ＮＫ細胞濃縮装置は、湿熱
滅菌、ガス滅菌または放射線滅菌等の滅菌処理を施して
も性能の低下はみられず、安定したＮＫ細胞濃縮能を示
すゆえに、正確な診断、安全な治療を行うことのできる
ものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＮＫ細胞濃縮装置の構成例を模式的に
示す縦断面図である。

【図２】本発明のＮＫ細胞濃縮装置を組み込んだ体外循
環回路の一例を示す概略構成図である。

【符号の説明】

１　　　　ＮＫ細胞濃縮装置 ２　　　　流体導入口 ３　　　　流体導出口 ４　　　　カラム容器 ５　　　　ＮＫ細胞濃縮剤 ６ａ、６ｂ　　　　フィルター ７　　　　血液導入口 ８　　　　血液ポンプ ９ａ、９ｂ　　　　チャンバー １０ａ、１０ｂ　　　　圧力ゲージ １１　　　　恒温槽 １２　　　　気泡検知器 １３　　　　血液導出口

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ナチュラルキラー細胞に対し低接着性
   であり、かつ被検液中の他の細胞の少なくとも１種に対
   し親和性を有する有機物を水不溶性固体物質に固定化し
   てなることを特徴とするナチュラルキラー細胞濃縮剤。
2. 【請求項２】　　前記有機物は、植物由来の多糖または
   糖タンパク質である請求項１に記載のナチュラルキラー
   細胞濃縮剤。
3. 【請求項３】　　前記植物由来の多糖は、サトイモの茎
   から分離した分子量２０万〜１００万の多糖である請求
   項２に記載のナチュラルキラー細胞濃縮剤。
4. 【請求項４】　　前記植物由来の糖タンパク質は、レク
   チンである請求項２に記載のナチュラルキラー細胞濃縮
   剤。
5. 【請求項５】　　請求項１〜４のいずれかに記載のナチ
   ュラルキラー細胞濃縮剤を充填した容器を有することを
   特徴とするナチュラルキラー細胞濃縮装置。
6. 【請求項６】　　請求項１〜４のいずれかに記載のナチ
   ュラルキラー細胞濃縮剤にナチュラルキラー細胞を含む
   被検液を接触させ、被検液中の前記他の細胞の少なくと
   も１種を前記ナチュラルキラー細胞濃縮剤に吸着させる
   ことにより被検液中のナチュラルキラー細胞を濃縮する
   ことを特徴とするナチュラルキラー細胞濃縮方法。
7. 【請求項７】　　請求項５に記載のナチュラルキラー細
   胞濃縮装置の容器内にナチュラルキラー細胞を含む被検
   液を通過させ、被検液中の前記他の細胞の少なくとも１
   種を前記ナチュラルキラー細胞濃縮剤に吸着させること
   により被検液中のナチュラルキラー細胞を濃縮すること
   を特徴とするナチュラルキラー細胞濃縮方法。