JPH0424660B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、乾燥系の化学（ドライ・ケミストリ
ー）を応用した、蛍光免疫分析素子を漏る各種抗
原または抗体の蛍光免疫定量法に関する。 流体（例えば体液）中に少量しか存在しない抗
体、抗原およびその他の物質の検出ならびに定量
については各種の分析法が開発されてきた。その
中で最も精度の高いものは、免疫化学的定量法で
あり、それは抗体と抗原とが特異的に結合する点
およびその反応Ab（抗体）＋Ag（抗原）Ag・
Ab（抗原・抗体複合体）が質量作用の法則に従う
ことを利用するものである。 免疫化学的定量法は、1958年にBersonと
Yallowが放射性ヨード（¹³¹Ｉ）で標識したイン
シユリンとの抗インシユリン抗体とを用いて血清
中のインシユリンを測定することに成功して以
来、放射免疫測定法（ラジオイムノアツセイ
RIA）が広く使われている。 しかしながらこのRIA法は高い感度は有する
が、放射性同位元素の使用に起因する種々の大き
な欠点、例えば、放射能による人体障害の危険
性、放射線の拡散防止のための特殊な施設を要す
ること、走査が複雑で、かつ測定に長時間を要す
ること、測定に必要なβ線およびγ線カウンター
は高価であること、半減期の短かい同位元素の場
合は、標識抗原（抗体）を長時間保存できない事
等の欠点を有し、検査数が増えているにもかかわ
らず、通常の臨床検査室では検査が行なえないこ
とが、大きなネツクとなつている。 このため臨床検査法としてより実用的な方法、
環境汚染につながらない方法が求められていた。 このため放射性同位元素を他の標識で置きかえ
た方法が注目されはじめた。その例としては標識
物質として、酵素、バクテリオフアージ、金属及
び有機金属の錯体、補酵素、酵素基質、酵素障害
物質、循環反応体、有機補欠分子族、化学発光性
反応体及び蛍光性分子等が挙げられる。これらの
中で現在実際に測定に使用されているものは酵素
を用いた酵素イムノアツセイ（EIA）、蛍光性分
子を用いた蛍光イムノアツセイ（FIA）等であ
る。しかしながら通用しているこれら前記の免疫
分析方法では、下記に示す種々の欠点を有してい
る。 １ 典型的には10乃至200μの流体試料を用い
る慣用の化学分析又は血液分析と比較して、比
較的多量（例えば、0.1乃至1.0ml）の流体試料
が必要である。 ２ 試験混合物の特異的結合反応に多大の時間
（例えば数時間乃至１晩）が必要である。 ３ 反応終了後に抗原−抗体結合複合体と未結合
体の物理的分離（Ｂ／Ｆ分離という）が必要で
ある。 ４ 免疫分析反応を完了させるためには多くの工
程が必要であり、又その工程は個々別々に行な
わねばならない。（例えば試料添加、インキユ
ベート、分離、ラベル（標識体）の定量等の工
程） ５ 自動化システムへの適合が困難である。 これらの欠点を克服することが可能な乾燥系の
化学（ドライ・ケミストリー）を用いる分析系が
特開昭55−90859号に開示されている。この方法
は、例えば可撓性プラスチツク支持体上に高分子
ビーズ重合体からなる構造層（レジストレーシヨ
ン層と称する）、抗体を不動化した着色高分子ビ
ーズ重合体からなる構造層を順次塗布した分析素
子に未ラベル抗原（被検流体）と一定量の蛍光ラ
ベル抗原を混合した試料を一定量適用することに
より未ラベル抗原とラベル抗原が抗体に対して競
合結合し、レジストレーシヨン層へ泳動した未反
応のラベル抗原量を測定することにより、流体試
料中の抗原を定量するものである。 しかしながらこの方法では、Ａ）レジストレー
シヨン層へ泳動した未結合ラベル抗原の検出（Ｆ
検出と称す）又は、Ｂ）不動化抗体への結合した
結合ラベル抗原の検出（Ｂ検出と称す）により流
体試料中の未ラベル抗原の量を決定するが、Ｆお
よびＢどちらか一方の検出により、未ラベル抗原
の量を決定するため、必然的に大きな誤差を含む
可能性があるという欠点を有している。これは特
に極微量しか存在しない成分を検出する際に著し
い。 即ち極微量成分の検出結果はラベル抗原量のバ
ラツキ、非特異的結合生成、塗布膜厚のバラツ
キ、あるいは蛍光測定条件変動（光源輝度の変動
による蛍光強度の変動等）に帰因する誤差を含む
という欠点を有し、定量値の信頼性を低くしてい
る。 本発明者らは、上記欠点を克服することを目的
として鋭意検討を重ねた結果、液体不浸透性、光
透過性の支持体上に、熱安定性であり且つ非検流
体に対して非膨潤性の有機高分子重合体粒子の接
合によつて形成される相互連絡空隙を有する粒子
結合体からなる検出層、遮蔽層及び不動化された
抗体（または抗原）を含有する抗原−抗体反応層
を有する蛍光免疫分析素子の前記抗原−抗体反応
層中の不動化された抗体（または抗原）に、蛍光
ラベルされた抗原（または蛍光ラベルされた抗
体）の共存下、分析すべき抗原（または抗体）を
含む被検流体を作用せしめた後、前記分析素子の
支持体側から蛍光強度を測定し、さらに前記抗原
−抗体反応層側からも蛍光強度を測定することに
より被検流体中の抗原量（または抗体量）を定量
することを特徴とする蛍光免疫定量法によつて該
目的を達することができた。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明は、免疫分析においてラベル抗原−抗体
複合体Ｂと未反応のラベル抗原Ｆとを同時に測定
し、未ラベル抗原量を決定するものである。 本発明に関する被検流体（以後検体と称す）は
測定対象物（抗原、抗体、ハブテン等免疫活性物
質）を含む流体であり、体液たとえば血液、血
清、尿などである。 第１図に本発明の実施態様の１例の断面図を示
す。 １は支持体、２は検出層、３は遮蔽層、また４
は抗原−抗体反応層である。検体は抗原−抗体反
応層４側から各層４、３及び１の相互連絡空隙の
流路によつて均一に浸透することができる。 遮蔽層３の存在と、支持体１が透明であること
から検出層２及び抗原−抗体反応層４の状況を各
別個に観察できる。 尚本発明に於ては、必要な補助層を設置しても
差支えない。 まず本発明の蛍光免疫分析素子を用いる測定原
理について説明する。 未知の抗原の分析をすべき検体をラベル抗原の
存在下で蛍光免疫分析素子と接触させる。ラベル
抗原は次のような、いくつかの方法の１つにより
蛍光免疫分析素子と協働させることができる。 即ち、検体（未ラベル抗原を含む）へラベル
抗原を直接添加し、次いでラベル抗原を含む検体
を分析のために蛍光免疫分析素子に適用する。
蛍光免疫分析素子へ、ラベル抗原及び検体を個別
的に添加する（たとえばイ検体添加の直前又は直
後のラベル抗原の添加並びにロラベル抗原を蛍光
免疫分析素子へ添加し、続いて乾燥し、そして検
体添加の際蛍光免疫分析素子を再湿潤させる）。
検体を単に適用することにより分析開始可能に
するようにラベル抗原を蛍光免疫分析素子に組み
入れる。たとえばラベル抗原を蛍光免疫分析素子
の遮蔽層及び検出層か、又は不動化抗体を含む蛍
光免疫分析素子の抗原−抗体反応層に組み入れる
ことが出来る。どの場合もラベル抗原を蛍光免疫
分析素子に組み入れる時は、ラベル抗原を不動化
抗体と離して保持し、ラベル抗原の抗体への時期
尚早の結合を回避するよう注意を払わねばならな
い。 前述のような協働ラベル抗原の存在下で検体を
蛍光免疫分析素子と接触させる時、ラベル抗原及
び未ラベル抗原（検体中に存在し、そして測定す
べき未知物である）は、該素子内の抗原−抗体反
応層に不動化して存在する抗体へ競合結合する。
その結果蛍光免疫分析素子の支持体側から蛍光測
定すれば未反応のラベル抗原量(F)を、抗原−抗体
反応層側から測定すれば反応したラベル抗原量(B)
（実際には未反応のラベル抗原、その他非特異的
結合生成物も存在するがＦの値から補正する事が
可能である。）を測定することができる。 以上のように本発明の蛍光免疫分析素子は同時
に前記のＦとＢを測定することができる。検体中
の未ラベル抗原の量は、測定値ＦとＢを用いて精
度良く決定することが可能である。 本発明の検出層、遮蔽層、抗原−抗体反応層を
形成する粒子の平均サイズは１〜350μmであり、
好ましくは５〜200μmである。それぞれの層で大
きさの違つた粒子を用いることもできるが、同一
サイズの粒子を用いるのが好ましい。又検出層、
抗原−抗体反応層には相互連絡空隙の流路径、蛍
光検出との兼ね合いによつて、0.1〜25重量％の
顔料（たとえばTiO₂又はBaSO₄等）のような非
常に反射性の成分を含ませることも可能である。
これによつて層内での光散乱が強化され、励起光
が有効に利用される。 又それぞれの層の膜層は20μm〜800μmであり、
好ましくは50μm〜500μmである。 本発明の粒子結合体の例として、特願昭55−
179613号及び同55−179614号各明細書に記載があ
るように、検体に対して非膨潤性、不浸透性且つ
熱安定性有機高分子の粒子を用い、該粒子単位表
面の反応性基により粒子同志の接触部分におい
て、直接化学結合或いは低分子化合物を介して化
学結合せしめる粒子結合体がある。 これらの粒子結合体は粒子の充填、整合によつ
て形成される相互連絡空隙を有しており、免疫反
応に係る巨大分子を容易に収納及び反応を起させ
る事ができる。 更に本発明の粒子結合体の他の例として例えば
特願昭56−155788号が挙げられる。上記の粒子結
合体は疎水性かつ流体試料に対して、不浸透性か
つ非膨潤性の有機高分子粒子を中心核とし、該中
心核をくるむ親水性高分子を殻とした、該殻二層
構造を有する粒子単位からなり、これら粒子単位
同志がその相互の接合部分において粘着により構
造を形成するものである。これらは、前述の粒子
結合体と同様に免疫反応を行なうに有効な相互連
絡空隙を有する事は自明である。 本発明の抗原−抗体反応層は、前述の粒子結合
体により形成されるが不動化された抗体または抗
原を含む層である。免疫活性を保持しながら本発
明に係る粒子結合体を形成する高分子重合体粒子
表面に抗体（または抗原）を不動化することが可
能であり、例えば物理吸着による担持方法があ
る。抗体の濃度、媒体のpHによつて広範囲の担
持量をとる事が可能であることはいうまでもな
い。更に別の方法として共有結合体として知られ
る方法を用いる事ができる。この方法は粒子表面
に抗体（または抗原）を共有結合により担持させ
る方法であり酵素等の蛋白を担体に固定化する為
に用いられている手法で、用いる反応試薬により
種々の方法を挙げることができる。これらの詳細
については石川栄治、河井忠、宮井潔編集「酵素
免疫測定法」p30〜60（講談社、東京 1978年）
を参照することができる。 該抗原−抗体反応層には非特異的結合を防止す
るために非特異性蛋白質を含ませることが望まし
い。又不動化された抗原−抗体複合体に結合して
いる蛍光ラベルの蛍光を測定する際の検出層とし
ての機能を持つている。 本発明に係る遮蔽層は、前述の粒子結合体によ
り形成されるが免疫測定において検出層側から測
定する場合においては抗原−抗体反応層中の不動
化抗原−抗体に結合している蛍光ラベルからの蛍
光をおおい隠し、抗原−抗体反応層側から測定す
る場合は、検出層中の未反応のラベル抗原からの
蛍光をおおい隠す機能をもつ層である。 このような機能はラベル抗原に標識されている
蛍光物質からの蛍光を吸収する顔料、染料等（蛍
光封止剤と称す）を含有させることにより達成さ
れる。 蛍光封止剤としては、ウオツトンレツドＢピグ
メント （EIデユポンドモアース社製）、パーマ
ネントパープル （GAF社製）、ソルフアースト
メチルバイオレツト （シヤーウインウイリアム
ス社製）、インドフアーストブルー （ハーモン
カラーズ社製）、リーガル300 （ガボツト社製）、
モノライトブルー （ICI社製）或はバリオフア
ーストブルー（BASF社製）のような無蛍光性の
顔料、染料が挙げられる。 又非特異的結合を防止するために非特異性蛋白
質を含めることが望ましい。 本発明に係る検出層は、前述の粒子結合体によ
り形成されるが、免疫測定において未反応の未ラ
ベル抗原を測定する際の場である。この層の粒子
結合体を形成するに際しては免疫反応によらない
非特異的吸着を防止するために非特異性蛋白質
（例えば牛血清アルブミン等）を含めることがで
きる。 本発明の蛍光免疫分析素子に係る支持体は、液
体不浸透性、光透過性であればその種類を問わな
いが、有用な支持体材料には、酢酸セルロース、
ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート
及びポリビニル化合物（例えばポリスチレン）の
ようなポリマー材料、ガラス等がある。 ある素子にとつて好ましい支持体とは、結果検
出の様式と相容れるものである。本発明の分析素
子の場合、素子内の蛍光発光が素子内から支持体
を通つて外部検出器へ伝達される蛍光測定検出法
であるので、励起光、蛍光に対して透明で、低程
度のバツクグラウンド発光しか示さない材料を支
持体材料として用いることが望ましい。 本発明に用いる粒子は分散液の液体キヤリヤー
を除去する際に該粒子に含まれる反応性基同志を
化学結合させる事であるいは低分子化合物を介し
て、及び粘着層により粒子結合体を製造するもの
であるが、化学結合を起させる触媒、たとえば酸
アルカリを分散液中に存在させる事は有用であ
る。特に酸触媒のうち揮発性酸触媒（例えば酢酸
等）その他を用いる事は有用である。又液体キヤ
リヤーを除去の操作は、有機高分子重合体粒子の
熱安定性温度以下である事が望ましいが、好まし
くは10乃至70℃の温度により実施する事ができ
る。 前記分散液の液体キヤリヤーは、水性液体を用
いることができる。しかしながら、該粒子がキヤ
リヤーに不溶性であり、従つて、それらの粒状特
性が保持されるという条件で種々の有機液体のよ
うな他の液体キヤリヤーも使用可能である。 水以外の代表的な液体キヤリヤーには、水混和
性有機溶媒、水と水混和性有機溶媒の水性混和物
及び適当な水不混和性有機溶媒がある。水混和性
有機溶媒には、低級アルコール（即ち、アルキル
基の炭素数１乃至４個のアルコール）、アセトン
及びテトラヒドロフランがある。水不混和性有機
溶媒には、酢酸エチルの如き低級アルキルエステ
ル、及びハロゲン化炭化水素（例えばクロロホル
ム塩化メチレン及び四塩化炭素等）の如きハロゲ
ン化有機溶媒がある。 本発明に係る粒子結合体からなる検出層、遮蔽
層、抗原−抗体反応層は、種々の方法を用いて製
造する事が可能である。好ましい方法の１つとし
て下記の工程を挙げる事ができる。 (1) 本発明に用いる反応性基を含む熱安定性有機
高分子重合体粒子を、該粒子を溶解しない液体
キヤリヤーに分散し安定な分散液を調製し (2) この安定な分散液を支持体に適用し、そして (3) 該有機高分子重合体粒子の熱安定性温度より
低い温度で、該粒子の反応性基同志の化学結合
を起させながら液体キヤリヤーを除去する。 “安定な分散液”とは、粒子同志が凝集塊を形
成する事なくキヤリヤー中に存在する事を意味す
る。粒子結合体層を製造するために有用な分散液
は、同分散液を支持体上に適用するに十分な時
間、安定である必要がある。 このような安定な分散液を製造するためには、
多くの方法を単独又は組合わせて用いる事が可能
である。例えば有用な方法の一つとして、界面活
性剤を液体キヤリヤーへ添加し粒子の分散液中に
おける分布及び安定化を促進する事ができる。 使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、
トライトン ×−100（ロームアンドハース社製オ
クチルフエノキシポリエトキシエタノール）サー
フアクタント10G （オリーン社製）ニルフエノ
キシポリグリシドール）等の非イオン性界面活性
剤がある。 上記界面活性剤は広範に選択された量を用いる
事が可能であるが、重合体粒子の重量に対して、
10重量パーセント乃至0.005重量パーセント好ま
しくは６重量パーセント乃至0.05重量パーセント
用いる事ができる。更に別の方法として該粒子と
液体キヤリヤーの音波処理、物理的混合、及び物
理的攪拌処理、PH調製がある。これらは前記の
方法と組合わせる事により、さらに有用である。 本発明の蛍光免疫分析素子製造において、個々
の層を別個に単独形成し、その後使用に先だつて
それらを積層しておくか、又は素子として流体接
触する時点で積層する形式の個別部材として保存
可能である。個別部材として形成する層は、層を
形成する分散液が延展可能であるならば合目的的
に延展し被膜形成することができる。前記個別に
形成する層を延展する面は、該層が乾燥時に物理
的にはがされうる特性の表面を選ぶ。しかしなが
ら隣接層が望まれる場合、何回ものはがし工程及
び積層工程を行なわねばならないという煩雑さを
回避するには個別層の表面か又は素子の支持体上
に分析素子の構成層を適当に割当てゝ被膜形成
し、それらを相互に密接して或は近接して積層さ
せる簡便法をとることができる。 本発明の粒子結合体層を有する分析素子は例え
ば浸漬塗布法、エアーナイフ法、カーテン塗布法
又は米国特許第2681294号明細書に記載の如きホ
ツパーを用いる押し出し塗布法等各種の塗布法で
塗布する事が可能であり、所望により、二層又は
それ以上の層を米国特許第2761791号及び米国特
許第837095号明細書に記載の方法で同時に塗布す
る事も出来る。 以下本発明を更に詳細に説明すべき実施例を示
すが、本発明はこれらにより何ら限定されるもの
ではない。 実施例 １ 平均粒径21μmのポリ（スチレン−コ−ｎ−ブ
チルメタクリレートーコーグリシジルメタクリレ
ート）（75：15：10重量％）の粒子10重量部を非
イオン性界面活性剤ゼオニルFSN（EIデユポン社
製）0.1重量部、牛血清アルブミン（和光純薬(株)）
0.1重量部を含む燐酸緩衝剤（PH7.6）溶液に懸
濁させ、懸濁液を低レベル蛍光しか示さない下引
き済みポリスチレン支持体（180μm）上に該粒子
に関し塗布量を1.4ｇ／ｄm²に制御して塗布し、
相互連絡空隙を有する検出層を設けた。この検出
層上に同様にして遮蔽層、抗原−抗体反応層を塗
布により形成し、ヒトα−フエトプロテイン測定
用の蛍光免疫分析素子(1)を作成した。 遮蔽層、抗原−抗体反応層は以下の通りであ
る。 遮蔽層 ウオツトン・レツドＢピグメント（EIデユポ
ンドモアース社製）を２％重量だけ分散含有する
ポリ（スチレン−コ−ｎ−ブチルメタクリレート
ーコーグリシジルメタクリレート）（75：15：10）
の平均粒径21μmの赤色粒子（塗布量0.7ｇ／ｄ
m²）。 抗原−抗体反応層 検出層に用いた粒子にウサギ抗ヒトα−フエト
プロテイン抗体（ダコ社製）を吸着させた粒子
（塗布量1.4ｇ／ｄm²）。 この分析素子(1)に正常成人血清から免疫吸着体
（イムノアドソルベント）を用いてα−フエトプ
ロテインを除いた血清10μに対してラベル抗原
としてFITCラベル（フルオレセインイソチトシ
アネート）α−フエトプロテイン１×10^-7Ｍ及び
未ラベル抗原として０〜１×10^-6モルに亘る種々
のα−フエトプロテインを含む試験血清を用意し
各々について分析素子(1)に適用し、37℃20分間イ
ンキユベートした。その後、485nmに励起フイル
タ、515nmに発光フイルタを有する反射蛍光光度
計を用いて、支持体側(F)、抗原−抗体反応層側(B)
から蛍光強度を測定し表−１に示す結果を得た。

【表】 表−１に示した如く、本発明に係る免疫分析容
器は試験血清中に含まれる様々の濃度の未ラベル
のα−フエトプロテインの検出が可能であり、ま
た迅速簡便で乾式の蛍光測定により迅速に免疫分
析することができた。 実施例 ２ 粒子結合体を有する抗原−抗体反応層の粒子が
異なる以外は実施例１と全く同一条件によつて分
析素子(2)を作成した。 上記分析素子の粒子は下記の通りである。 分析素子(2)抗原−抗体反応層 平均粒径21μmのポリ（スチレン−コ−ｎ−ブ
チルメタクリレートーコーグリシジルメタクリレ
ート）（75：15：10重量％）の粒子にウサギ抗ヒ
トイムノグロブリンＧ（γ鎖特異抗体 ダコ社製）
抗体を吸着させた粒子。 前記分析素子(2)にラベル抗原としてFITC（フ
ルオレセインイソチトシアネート）・ヒトイムノ
グロブリンＧ、１×10^-7Ｍ及び未ラベル抗原とし
て１×10^-7Ｍの未ラベルヒトムノグロブリンＧを
含む試験血清を適用し、実施例１と同様に蛍光強
度を測定した所、表−２に示す結果を得た。

【表】 Ｂ＋Ｆの項は本来同一になるはずであるが、こ
の実施例では一定になつていない。（光源の変動
によるものと思われる）そこで、Ｆ／Ｂ＋Ｆ、
Ｂ／Ｂ＋Ｆをそれぞれについて計算するとＦ／Ｂ
＋Ｆで変動係数3.4％、Ｂ／Ｂ＋Ｆで変動係数1.1
％が得られた。このように、Ｆのみ、Ｂのみを測
定すると誤差を含む可能性が大きくあり本発明に
係るＢとＦ両方を測定することによつて補正する
ことで再現性が高まることは明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る蛍光免疫分析素子の１
例の断面図である。 １は支持体、２は検出層、３は遮蔽層、４は抗
原−抗体反応層である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 液体不浸透性、光透過性の支持体上に、熱安
   定性であり且つ被検流体に対して非膨潤性の有機
   高分子重合体粒子の接合によつて形成される相互
   連絡空隙を有する粒子結合体からなる検出層、遮
   蔽層及び不動化された抗体（または抗原）を含有
   する抗原−抗体反応層を有する蛍光免疫分析素子
   の前記抗原−抗体反応層中の不動化された抗体
   （または抗原）に、蛍光ラベルされた抗原（また
   は蛍光ラベルされた抗体）の共存下、分析すべき
   抗原（または抗体）を含む被検流体を作用せしめ
   た後、前記分析素子の支持体側から蛍光強度を測
   定し、さらに前記抗原−抗体反応層側からも蛍光
   強度を測定することにより被検流体中の抗原量
   （または抗体量）を定量することを特徴とする蛍
   光免疫定量法。