JPH04252184A - プロウロキナーゼ誘導体 - Google Patents
プロウロキナーゼ誘導体Info
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- JPH04252184A JPH04252184A JP3190333A JP19033391A JPH04252184A JP H04252184 A JPH04252184 A JP H04252184A JP 3190333 A JP3190333 A JP 3190333A JP 19033391 A JP19033391 A JP 19033391A JP H04252184 A JPH04252184 A JP H04252184A
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- prourokinase
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】血液凝
固法又は止血法は非常に重要である。
固法又は止血法は非常に重要である。
【０００２】この点については、組織損傷後に凝塊が生
じることにより、過剰な血液損失が避けられ、それと同
時に潜在病原性微生物の侵入の可能性が減少する。
じることにより、過剰な血液損失が避けられ、それと同
時に潜在病原性微生物の侵入の可能性が減少する。
【０００３】出血が止まり、組織が修復されると、凝塊
はフィブリン溶解系の作用により自然に溶解される。こ
のフィブリン溶解系は、凝固系と同様に、一連の酵素及
びコファクターからなっている。これらの酵素及びコフ
ァクターは相互活性により、最終的にプラスミンを生成
し、このプラスミンは溶解性フラグメント内の凝塊の不
溶性構成フィブリン重量を低下させ得る（１）。
はフィブリン溶解系の作用により自然に溶解される。こ
のフィブリン溶解系は、凝固系と同様に、一連の酵素及
びコファクターからなっている。これらの酵素及びコフ
ァクターは相互活性により、最終的にプラスミンを生成
し、このプラスミンは溶解性フラグメント内の凝塊の不
溶性構成フィブリン重量を低下させ得る（１）。
【０００４】しかしながら、必ずしも出血プロセスを阻
止するためではなく、血管壁の形態機能変化により表さ
れる前凝固刺激（ｐｒｏ−ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｓ
ｔｉｍｕｌｕｓ）への応答として血管中で生成される凝
塊が、血管内腔を徐々に減少させる病理学的状況がある
。血栓症として定義されているこのような状況では、フ
ィブリン溶解系が不十分なので、血管中の血液流量が低
減し、関係組織で低酸素症又は無酸素症が生じ得る（２
）。
止するためではなく、血管壁の形態機能変化により表さ
れる前凝固刺激（ｐｒｏ−ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｓ
ｔｉｍｕｌｕｓ）への応答として血管中で生成される凝
塊が、血管内腔を徐々に減少させる病理学的状況がある
。血栓症として定義されているこのような状況では、フ
ィブリン溶解系が不十分なので、血管中の血液流量が低
減し、関係組織で低酸素症又は無酸素症が生じ得る（２
）。
【０００５】血栓塞栓症により生じる心臓不整脈、心筋
梗塞、狭心症、肺塞栓症、発作、深在静脈血栓症及び閉
塞性末梢動脈疾患は、血栓の発生のために１カ所以上の
血管が閉塞して生じるので、これらの疾患は閉塞系（ｍ
ｅｎｏｓｔａｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）及びフィブリン溶
解系の機能におけるこの変化の臨床的発現である。
梗塞、狭心症、肺塞栓症、発作、深在静脈血栓症及び閉
塞性末梢動脈疾患は、血栓の発生のために１カ所以上の
血管が閉塞して生じるので、これらの疾患は閉塞系（ｍ
ｅｎｏｓｔａｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）及びフィブリン溶
解系の機能におけるこの変化の臨床的発現である。
【０００６】これらの疾患は、工業国での最も重大な死
亡原因となっている。米国、日本、西ドイツ、英国、フ
ランス、イタリー及びスペインで実施された調査では、
人口の死者全体の４６．３％の死亡原因が血栓崩壊であ
ることが判明した。
亡原因となっている。米国、日本、西ドイツ、英国、フ
ランス、イタリー及びスペインで実施された調査では、
人口の死者全体の４６．３％の死亡原因が血栓崩壊であ
ることが判明した。
【０００７】血栓症の現象発生後の死亡率を下げるため
に、世界中の研究者及び製薬会社は、血栓溶解を促進し
得る薬剤の認定及び開発に向けて絶えず研究を行った。
に、世界中の研究者及び製薬会社は、血栓溶解を促進し
得る薬剤の認定及び開発に向けて絶えず研究を行った。
【０００８】これらの薬剤はフィブリン溶解剤、又はよ
り一般的には血栓融解剤として知られている。
り一般的には血栓融解剤として知られている。
【０００９】最初に市販された血栓融解剤はストレプト
キナーゼ（ＳＫ）及びウロキナーゼ（ＵＫ）であった（
３，４）。
キナーゼ（ＳＫ）及びウロキナーゼ（ＵＫ）であった（
３，４）。
【００１０】血栓塞栓症による疾患（深在静脈血栓症及
び肺塞栓症）の治療における抗凝血剤療法での上記薬剤
の有効性は、過去１０年間に実施された多数の臨床実験
により広く実証されている（３，５，６，７，８）。
び肺塞栓症）の治療における抗凝血剤療法での上記薬剤
の有効性は、過去１０年間に実施された多数の臨床実験
により広く実証されている（３，５，６，７，８）。
【００１１】これらの血栓融解剤は有効性があるにもか
かわらず、主に治療に関連して出血を伴う合併症が生じ
る危険性があるので、その臨床使用は常に小規模で、専
門家チームからなるセンターに限定されている。
かわらず、主に治療に関連して出血を伴う合併症が生じ
る危険性があるので、その臨床使用は常に小規模で、専
門家チームからなるセンターに限定されている。
【００１２】ＳＫ及びＵＫは今日、第１世代の血栓融解
剤として知られている。
剤として知られている。
【００１３】対照的に、共に天然タンパク質である組織
プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）（９）及
び更に最近のヒトプロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）（
１０）は循環するプラスミノーゲンの弱いアクチベータ
ーであるが、フィブリン凝塊に結合されるプラスミノー
ゲンの強いアクチベーターである。換言すれば、これら
の分子は凝固因子又はα２−アンチプラスミンの全身的
低下を引き起こさず、従ってこれらの分子の臨床使用は
それほど出血の危険性がない（１１，１２，１３）。
プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）（９）及
び更に最近のヒトプロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）（
１０）は循環するプラスミノーゲンの弱いアクチベータ
ーであるが、フィブリン凝塊に結合されるプラスミノー
ゲンの強いアクチベーターである。換言すれば、これら
の分子は凝固因子又はα２−アンチプラスミンの全身的
低下を引き起こさず、従ってこれらの分子の臨床使用は
それほど出血の危険性がない（１１，１２，１３）。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明はｐｒｏ−ＵＫよ
りも良好な酵素特性及びフィブリン溶解特性を有し、従
って血栓融解の代替治療の可能性を提供するプロウロキ
ナーゼ誘導体に関する。
りも良好な酵素特性及びフィブリン溶解特性を有し、従
って血栓融解の代替治療の可能性を提供するプロウロキ
ナーゼ誘導体に関する。
【００１５】ｐｒｏ−ＵＫは、４１１個のアミノ酸及び
１２個のジスルフィド架橋からなり、３０２位でグルコ
シル化され、分子量が５４Ｋｄの１本鎖構造のタンパク
質である（１４）。
１２個のジスルフィド架橋からなり、３０２位でグルコ
シル化され、分子量が５４Ｋｄの１本鎖構造のタンパク
質である（１４）。
【００１６】ｐｒｏ−ＵＫはｉｎ ｖｉｔｒｏではタ
ンパク分解に対して不活性であり、プラスミンによって
、アミノ酸ｌｙｓ１５８−ｉｌｅ１５９間のペプチド結
合を特異的に加水分解して、ジスルフィド架橋により結
合された２本鎖構造（ＵＫ）を生じる活性形態に変換さ
れ得る。
ンパク分解に対して不活性であり、プラスミンによって
、アミノ酸ｌｙｓ１５８−ｉｌｅ１５９間のペプチド結
合を特異的に加水分解して、ジスルフィド架橋により結
合された２本鎖構造（ＵＫ）を生じる活性形態に変換さ
れ得る。
【００１７】鎖Ａ（２０，０００ダルトン）は１５７個
のアミノ酸及びクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）として知
られているドメインを含んでいる。この鎖は更に、セル
レセプターへの結合を担うドメインを含んでいる（１５
）。
のアミノ酸及びクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）として知
られているドメインを含んでいる。この鎖は更に、セル
レセプターへの結合を担うドメインを含んでいる（１５
）。
【００１８】鎖Ｂ（３０，０００ダルトン）は２５３個
のアミノ酸からなり、また触媒ドメインを含んでいる。
のアミノ酸からなり、また触媒ドメインを含んでいる。
【００１９】プラスミンは更に、ｐｒｏ−ＵＫ分子中の
アミノ酸ｇｌｕ１４３−ｌｅｕ１４４間で加水分解を生
じて、生物活性のある低分子量分子を生じ得る（１６）
。
アミノ酸ｇｌｕ１４３−ｌｅｕ１４４間で加水分解を生
じて、生物活性のある低分子量分子を生じ得る（１６）
。
【００２０】この第２の切断部位は第１の切断部位より
もプラスミンに対する特異性が低い。
もプラスミンに対する特異性が低い。
【００２１】
【実施例】本発明を更に良く理解するために、これから
添付図面を参照する。
添付図面を参照する。
【００２２】ｐｒｏ−ＵＫ構造体（図１）は、３つのド
メイン、即ち： −フィンガー −クリングル −タンパク分解部 に区別され得る。
メイン、即ち： −フィンガー −クリングル −タンパク分解部 に区別され得る。
【００２３】フィンガー（ａａ． ｃｙｓ１１−ｓｅ
ｒ４７）は分子とＵＫ用特異セルレセプターとの相互作
用部位を含んでいる。
ｒ４７）は分子とＵＫ用特異セルレセプターとの相互作
用部位を含んでいる。
【００２４】クリングル（ａａ． ｌｙｓ４８−ｌｙ
ｓ１３５）はフィブリン結合に充当されるプラスミノー
ゲン及びｔ−ＰＡ分子のクリングルに非常に類似してい
る。しかしながら、プラスミノーゲン及びｔ−ＰＡ分子
のクリングルとは対照的に、ｐｒｏ−ＵＫのクリングル
はフィブリンに対して特異的な親和性を有さないように
思える。
ｓ１３５）はフィブリン結合に充当されるプラスミノー
ゲン及びｔ−ＰＡ分子のクリングルに非常に類似してい
る。しかしながら、プラスミノーゲン及びｔ−ＰＡ分子
のクリングルとは対照的に、ｐｒｏ−ＵＫのクリングル
はフィブリンに対して特異的な親和性を有さないように
思える。
【００２５】タンパク分解部（ａａ． ｌｙｓ１３６
−ｌｅｕ４１１）は、プラスミノーゲンとの相互作用部
位を含んでいる。
−ｌｅｕ４１１）は、プラスミノーゲンとの相互作用部
位を含んでいる。
【００２６】我々は、部位特異的突然変異誘発技術を使
用して、タンパク分解部内で種々のアミノ酸置換を実施
した。
用して、タンパク分解部内で種々のアミノ酸置換を実施
した。
【００２７】予想外なことに、負電荷を帯びたアミノ酸
残基を１３８位及び／又は１３９位及び／又は３０３位
のセリンの代りに導入し、次いで活性２本鎖形態に転換
された誘導体が、血漿性阻害剤（例えばＰＡＩ−１（プ
ラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１））による不活
性化に対してｐｒｏ−ＵＫより耐性があることが判明し
た。
残基を１３８位及び／又は１３９位及び／又は３０３位
のセリンの代りに導入し、次いで活性２本鎖形態に転換
された誘導体が、血漿性阻害剤（例えばＰＡＩ−１（プ
ラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１））による不活
性化に対してｐｒｏ−ＵＫより耐性があることが判明し
た。
【００２８】しかしながら、これらの誘導体はｐｒｏ−
ＵＫの酵素特性及びフィブリン溶解特性を保持し、従っ
てこれらの誘導体の各酵素活性が血漿性阻害剤による不
活性化に対してそれほど感受性がないために、フィブリ
ン溶解治療が改良され得る。
ＵＫの酵素特性及びフィブリン溶解特性を保持し、従っ
てこれらの誘導体の各酵素活性が血漿性阻害剤による不
活性化に対してそれほど感受性がないために、フィブリ
ン溶解治療が改良され得る。
【００２９】本発明はヒトフィブリン溶解性酵素のプロ
ウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）又はその類似物の誘導体
、及び組換えＤＮＡ技術によるこれらの誘導体の製造方
法に関する。
ウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）又はその類似物の誘導体
、及び組換えＤＮＡ技術によるこれらの誘導体の製造方
法に関する。
【００３０】本発明は更に、上記誘導体用構造コード化
遺伝子、この遺伝子を含んでいるプラスミドベクター及
びこれらのベクターにより形質転換される適切な細菌宿
主を包含している。
遺伝子、この遺伝子を含んでいるプラスミドベクター及
びこれらのベクターにより形質転換される適切な細菌宿
主を包含している。
【００３１】従って、本発明はまず、血漿性阻害剤（例
えばＰＡＩ−１（プラスミノーゲンアクチベーター阻害
剤））に対する親和性が小さく、また天然分子の酵素特
性及びフィブリン溶解特性を維持することを特徴とする
ヒトプロウロキナーゼ又はその類似物の誘導体を提供す
る。
えばＰＡＩ−１（プラスミノーゲンアクチベーター阻害
剤））に対する親和性が小さく、また天然分子の酵素特
性及びフィブリン溶解特性を維持することを特徴とする
ヒトプロウロキナーゼ又はその類似物の誘導体を提供す
る。
【００３２】ヒトプロウロキナーゼ類似物は例えば、ヒ
トプロウロキナーゼ、又はヒト以外の種（例えばウシ、
ヒツジ又は一般に哺乳動物）から得られるヒトプロウロ
キナーゼに相当する天然酵素又は合成酵素の欠損、挿入
又は逆位による突然変異体であり得る。
トプロウロキナーゼ、又はヒト以外の種（例えばウシ、
ヒツジ又は一般に哺乳動物）から得られるヒトプロウロ
キナーゼに相当する天然酵素又は合成酵素の欠損、挿入
又は逆位による突然変異体であり得る。
【００３３】特に、本発明は、タンパク質配列に存在す
る１〜３個のアミノ酸残基が負電荷を帯びた同等数のア
ミノ酸により置換されたヒトプロウロキナーゼ又はその
類似物の誘導体に関する。特に１３８位及び／又は１３
９位及び／又は３０３位のセリン残基は、アスパラギン
酸又はグルタミン酸、好ましくはグルタミン酸により置
換される。
る１〜３個のアミノ酸残基が負電荷を帯びた同等数のア
ミノ酸により置換されたヒトプロウロキナーゼ又はその
類似物の誘導体に関する。特に１３８位及び／又は１３
９位及び／又は３０３位のセリン残基は、アスパラギン
酸又はグルタミン酸、好ましくはグルタミン酸により置
換される。
【００３４】本発明は更に、組換えＤＮＡ技術による上
記誘導体の製造方法を提供する。
記誘導体の製造方法を提供する。
【００３５】プロウロキナーゼ又はその類似物用コード
化遺伝子の部位特異性突然変異を誘発し、次いで適切な
宿主微生物中での新規誘導体の合成を指向し得る適切な
発現ベクター内に突然変異体遺伝子を導入して、上記方
法に基づく誘導体を製造する。
化遺伝子の部位特異性突然変異を誘発し、次いで適切な
宿主微生物中での新規誘導体の合成を指向し得る適切な
発現ベクター内に突然変異体遺伝子を導入して、上記方
法に基づく誘導体を製造する。
【００３６】本発明は更に、化学合成ポリヌクレオチド
を含んでいる、前述したプロウロキナーゼ誘導体用コー
ド化遺伝子を提供する。
を含んでいる、前述したプロウロキナーゼ誘導体用コー
ド化遺伝子を提供する。
【００３７】本発明は更に、上記遺伝子を含み、上記誘
導体の合成を指向し得る組換え発現ベクターを提供する
。
導体の合成を指向し得る組換え発現ベクターを提供する
。
【００３８】本発明は更に、これらのベクターにより形
質転換され、従って上記誘導体を生じ得る宿主微生物を
提供する。
質転換され、従って上記誘導体を生じ得る宿主微生物を
提供する。
【００３９】最後に、本発明は上述したプロウロキナー
ゼ誘導体と、医薬として許容し得る１種以上の賦形剤及
び／又は希釈剤及び／又は担体とを含んでいる医薬組成
物を包含している。
ゼ誘導体と、医薬として許容し得る１種以上の賦形剤及
び／又は希釈剤及び／又は担体とを含んでいる医薬組成
物を包含している。
【００４０】これらの医薬組成物は、従来の方法及び成
分を使用して従来通りに製造することができる。
分を使用して従来通りに製造することができる。
【００４１】特に本発明のプロウロキナーゼ誘導体は、
抗血栓症療法中に非経口投与することができる。治療に
使用する酵素の用量としては例えば、丸塊の形態で合計
１０〜１００ｍｇの量を１回で投与するか、又は連続静
脈内注入の形態で合計約１０〜１００ｍｇ／時の量を約
１２時間投与することができる。
抗血栓症療法中に非経口投与することができる。治療に
使用する酵素の用量としては例えば、丸塊の形態で合計
１０〜１００ｍｇの量を１回で投与するか、又は連続静
脈内注入の形態で合計約１０〜１００ｍｇ／時の量を約
１２時間投与することができる。
【００４２】本発明の実施例として、セリンをグルタミ
ン酸残基で置換するプロウロキナーゼ誘導体を製造した
。
ン酸残基で置換するプロウロキナーゼ誘導体を製造した
。
【００４３】特定例としては、
１）１３８位のセリンをグルタミン酸で置換するヒトプ
ロウロキナーゼ誘導体（ｐｒｏＵＫ−１３８−Ｇｌｕと
称するこの誘導体を組換え大腸菌細胞内で製造した）、
２）１３９位のセリンをグルタミン酸で置換するヒトプ
ロウロキナーゼ誘導体（ｐｒｏＵＫ−１３９−Ｇｌｕと
称するこの誘導体も組換え大腸菌細胞内で製造した）、
及び ３）３０３位のセリンをグルタミン酸で置換するヒトプ
ロウロキナーゼ誘導体（ｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕと
称するこの誘導体も組換え大腸菌細胞内で製造した）が
挙げられる。
ロウロキナーゼ誘導体（ｐｒｏＵＫ−１３８−Ｇｌｕと
称するこの誘導体を組換え大腸菌細胞内で製造した）、
２）１３９位のセリンをグルタミン酸で置換するヒトプ
ロウロキナーゼ誘導体（ｐｒｏＵＫ−１３９−Ｇｌｕと
称するこの誘導体も組換え大腸菌細胞内で製造した）、
及び ３）３０３位のセリンをグルタミン酸で置換するヒトプ
ロウロキナーゼ誘導体（ｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕと
称するこの誘導体も組換え大腸菌細胞内で製造した）が
挙げられる。
【００４４】１３８位及び１３９位又は３０３位に他の
負電荷又はより大きな負電荷を有する他のヒトプロウロ
キナーゼ誘導体、又はこれらの可能な組み合わせも本発
明で意図するものである。ヒトプロウロキナーゼのその
ままの分子ばかりでなく、他の誘導体又は突然変異体に
もこのような一時変異をおこすことができる。ヒト以外
（ウシ、ヒツジ等）のプロウロキナーゼを一時変異させ
ることもできる。
負電荷又はより大きな負電荷を有する他のヒトプロウロ
キナーゼ誘導体、又はこれらの可能な組み合わせも本発
明で意図するものである。ヒトプロウロキナーゼのその
ままの分子ばかりでなく、他の誘導体又は突然変異体に
もこのような一時変異をおこすことができる。ヒト以外
（ウシ、ヒツジ等）のプロウロキナーゼを一時変異させ
ることもできる。
【００４５】酵素Ｔａｑポリメラーゼを使用して遺伝子
増幅技術により新規ヒトプロウロキナーゼ誘導体を製造
した（１７）。この技術は酵素の熱安定性に基づいてい
る。この技術では、一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ熱変性、
再生及び延長サイクルにより、鋳型ＤＮＡ及び２つの特
異プライマーを出発材料として、特異ＤＮＡフラグメン
トを増幅させることができる。
増幅技術により新規ヒトプロウロキナーゼ誘導体を製造
した（１７）。この技術は酵素の熱安定性に基づいてい
る。この技術では、一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ熱変性、
再生及び延長サイクルにより、鋳型ＤＮＡ及び２つの特
異プライマーを出発材料として、特異ＤＮＡフラグメン
トを増幅させることができる。
【００４６】２つのプライマーのうち一方のプライマー
の配列内に適切な変異を導入して、種々の部位特異性一
時変異体を製造した。使用した鋳型はヒトプロウロキナ
ーゼベクターｐＦＣ１６（１８）（図２）であった。こ
のプラスミドでは、ヒトプロウロキナーゼ遺伝子を大腸
菌での発現を促進し得る調節配列の制御下に置いた。
の配列内に適切な変異を導入して、種々の部位特異性一
時変異体を製造した。使用した鋳型はヒトプロウロキナ
ーゼベクターｐＦＣ１６（１８）（図２）であった。こ
のプラスミドでは、ヒトプロウロキナーゼ遺伝子を大腸
菌での発現を促進し得る調節配列の制御下に置いた。
【００４７】このプラスミド及びその特徴については先
に出願した特許明細書（１８）で既に説明されている。
に出願した特許明細書（１８）で既に説明されている。
【００４８】増幅方法により、プライマーレベルで予め
導入された如き突然変異の場合を除いて、鋳型と相同な
ＤＮＡフラグメントが得られる。
導入された如き突然変異の場合を除いて、鋳型と相同な
ＤＮＡフラグメントが得られる。
【００４９】突然変異をおこしていない同様のフラグメ
ントの代わりとしてオリジナルプラスミド内に新規フラ
グメントを挿入することにより、大腸菌株で新規誘導体
の製造を促進し得る、ｐＦＣ１６と同質遺伝子的な新規
発現プラスミドを直接製造する。これらの新規プラスミ
ドの製造の詳細を、図３及び図４の説明の項、並びに以
下の“突然変異誘発”及び“突然変異体遺伝子の発現”
での材料・方法の説明の項に記載する。
ントの代わりとしてオリジナルプラスミド内に新規フラ
グメントを挿入することにより、大腸菌株で新規誘導体
の製造を促進し得る、ｐＦＣ１６と同質遺伝子的な新規
発現プラスミドを直接製造する。これらの新規プラスミ
ドの製造の詳細を、図３及び図４の説明の項、並びに以
下の“突然変異誘発”及び“突然変異体遺伝子の発現”
での材料・方法の説明の項に記載する。
【００５０】突然変異誘発： 本特許明細書に特定的
に記載した３つのヒトプロウロキナーゼ誘導体を、酵素
Ｔａｑポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝
子増幅により、ヒトプロウロキナーゼを含んでいるプラ
スミドｐＦＣ１６から製造した。図３は、プライマーと
して使用するオリゴヌクレオチドの製造に使用する方法
を概略的に示している。突然変異体ｐｒｏＵＫ−１３８
−Ｇｌｕ及びｐｒｏＵＫ−１３９−Ｇｌｕの場合、その
後のサブクローニングの問題のために、接合点に新規Ｍ
ｒｏＩ制限部位を導入して２つの別々のフラグメントを
増殖させる必要があった（図３参照）。この部位は遺伝
子ヌクレオチド配列レベルに変異を生じるが、ヒトプロ
ウロキナーゼのアミノ酸配列を決して変えない。
に記載した３つのヒトプロウロキナーゼ誘導体を、酵素
Ｔａｑポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝
子増幅により、ヒトプロウロキナーゼを含んでいるプラ
スミドｐＦＣ１６から製造した。図３は、プライマーと
して使用するオリゴヌクレオチドの製造に使用する方法
を概略的に示している。突然変異体ｐｒｏＵＫ−１３８
−Ｇｌｕ及びｐｒｏＵＫ−１３９−Ｇｌｕの場合、その
後のサブクローニングの問題のために、接合点に新規Ｍ
ｒｏＩ制限部位を導入して２つの別々のフラグメントを
増殖させる必要があった（図３参照）。この部位は遺伝
子ヌクレオチド配列レベルに変異を生じるが、ヒトプロ
ウロキナーゼのアミノ酸配列を決して変えない。
【００５１】供給業者の提案する条件に従って、Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＣｅｔｕｓのＴａｑポリメラ
ーゼを使用して、増幅プロセスを実施した。とりわけ、
１ｎｇのＤＮＡ鋳型（ｐＦＣ１６）と、８ｎｇ／μｌの
各プライマーと、０．２ｍＭのｄＮＴＰと、５０ｍＭの
ＫＣｌと、１０ｍＭのトリスｐＨ８．３と、１０ｍＭの
ＭｇＣｌ２と、０．０１％ゼラチンと、２単位のＴａｑ
ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔ
ｕｓ）とを含んでいる混合物１００μｌを、９２℃で１
分３０秒、７２℃で２分３０秒の熱サイクルに３０回か
けた。
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＣｅｔｕｓのＴａｑポリメラ
ーゼを使用して、増幅プロセスを実施した。とりわけ、
１ｎｇのＤＮＡ鋳型（ｐＦＣ１６）と、８ｎｇ／μｌの
各プライマーと、０．２ｍＭのｄＮＴＰと、５０ｍＭの
ＫＣｌと、１０ｍＭのトリスｐＨ８．３と、１０ｍＭの
ＭｇＣｌ２と、０．０１％ゼラチンと、２単位のＴａｑ
ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔ
ｕｓ）とを含んでいる混合物１００μｌを、９２℃で１
分３０秒、７２℃で２分３０秒の熱サイクルに３０回か
けた。
【００５２】増幅プロセスが終了すると、種々の増幅フ
ラグメントを適切な制限酵素（図４）でダイジェストし
て、ｐＦＣ１６のベクター部分ＢｇＩＩＩ−ＭｒｏＩで
サブクローニングした。このようにして３つの新規発現
ベクターが得られ、それぞれｐＦＣ１４６、ｐＦＣ１４
７及びｐＦＣ１４８として分類した。
ラグメントを適切な制限酵素（図４）でダイジェストし
て、ｐＦＣ１６のベクター部分ＢｇＩＩＩ−ＭｒｏＩで
サブクローニングした。このようにして３つの新規発現
ベクターが得られ、それぞれｐＦＣ１４６、ｐＦＣ１４
７及びｐＦＣ１４８として分類した。
【００５３】全ての遺伝操作をＭａｎｉａｔｉｓ及び彼
の協力者が記載する如く実施した（１９）。
の協力者が記載する如く実施した（１９）。
【００５４】次いで、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＩＩシステム
（米国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）を使用して、各プラスミドの直接配列について種
々の突然変異体をチェックした。
（米国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）を使用して、各プラスミドの直接配列について種
々の突然変異体をチェックした。
【００５５】突然変異体遺伝子の発現：３種のプラスミ
ドｐＦＣ１４６、ｐＦＣ１４７及びｐＦＣ１４８はｐＦ
Ｃ１６と同様に、促進剤トリプトファン（Ｐｔｒｐ）及
びバクテリオファージＭＳ−２（ＭＳ−２ ＲＢＳ）
の“Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ”の制御下で、対
応するヒトプロウロキナーゼ誘導体用コード化遺伝子を
有する。組換え突然変異体の発現が、Ｂ型大腸菌株内に
種々のプラスミドを挿入して得られた（Ｐａｓｔｅｕｒ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
Ｎｏ． ５４１２５−パリ）。形質転換、組換え体株
培養、発現誘発及び発現レベル分析の条件は本質的にｐ
ＦＣ１６について既に説明した条件と同様である（１８
）。
ドｐＦＣ１４６、ｐＦＣ１４７及びｐＦＣ１４８はｐＦ
Ｃ１６と同様に、促進剤トリプトファン（Ｐｔｒｐ）及
びバクテリオファージＭＳ−２（ＭＳ−２ ＲＢＳ）
の“Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ”の制御下で、対
応するヒトプロウロキナーゼ誘導体用コード化遺伝子を
有する。組換え突然変異体の発現が、Ｂ型大腸菌株内に
種々のプラスミドを挿入して得られた（Ｐａｓｔｅｕｒ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
Ｎｏ． ５４１２５−パリ）。形質転換、組換え体株
培養、発現誘発及び発現レベル分析の条件は本質的にｐ
ＦＣ１６について既に説明した条件と同様である（１８
）。
【００５６】以下で説明する実験は、本発明の代表的な
ｐｒｏ−ＵＫ誘導体、即ちｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕ
について、ＰＡＩ−１血漿性阻害剤による不活性化に対
する耐性がそのままの型の組換え体ｐｒｏ−ＵＫ（ｒｅ
ｃ ｐｒｏ−ＵＫ）よりも優れていることを示してい
る。
ｐｒｏ−ＵＫ誘導体、即ちｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕ
について、ＰＡＩ−１血漿性阻害剤による不活性化に対
する耐性がそのままの型の組換え体ｐｒｏ−ＵＫ（ｒｅ
ｃ ｐｒｏ−ＵＫ）よりも優れていることを示してい
る。
【００５７】同量（１００μｌ）の組換え体ｐｒｏ−Ｕ
Ｋ及びｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕ突然変異体を、プラ
スミノーゲン／プラスミンセファロースが１：１の懸濁
液１００μｌで、３７℃にて３時間インキュベートした
。次いで、１本鎖から２本鎖ｕＰＡへの転化率を、還元
条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、ｔが９０％を
上回ることが判明した。
Ｋ及びｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕ突然変異体を、プラ
スミノーゲン／プラスミンセファロースが１：１の懸濁
液１００μｌで、３７℃にて３時間インキュベートした
。次いで、１本鎖から２本鎖ｕＰＡへの転化率を、還元
条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、ｔが９０％を
上回ることが判明した。
【００５８】１μＭプラスミノーゲン及び合成基質Ｓ
２３９０を使用して、２ｎｇのそのままの型及び２ｎ
ｇの３０３突然変異体の酵素活性を間接反応により試験
した。
２３９０を使用して、２ｎｇのそのままの型及び２ｎ
ｇの３０３突然変異体の酵素活性を間接反応により試験
した。
【００５９】両方とも任意の時点でほぼ同量のＳ ２
３９０を転化し、我々は相対的ＰＡＩ−１感受性につい
て評価することができた。
３９０を転化し、我々は相対的ＰＡＩ−１感受性につい
て評価することができた。
【００６０】２ｎｇのｒｅｃ ｐｒｏ−ＵＫ及びｒｅ
ｃ ｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕを、１ｍｇ／ｍｌの
ＢＳＡを添加した１００ｍＭのヘルペス緩衝液ｐＨ７．
５中で、２５℃にて１時間、図５ａ及び図５ｂに示す濃
度のＰＡＩ−１でインキュベートした。
ｃ ｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕを、１ｍｇ／ｍｌの
ＢＳＡを添加した１００ｍＭのヘルペス緩衝液ｐＨ７．
５中で、２５℃にて１時間、図５ａ及び図５ｂに示す濃
度のＰＡＩ−１でインキュベートした。
【００６１】インキュベートした後に、残留酵素活性を
前述した如く試験し、バックグラウンドを引いて、速度
をＯＤ４００１３Ｏ分−Ｄ４００３分として計算した。 阻害剤で予めインキュベートした試料の残留酵素活性を
、阻害剤を含まない試料の酵素活性の％として図５ａ及
び図５ｂに示す。
前述した如く試験し、バックグラウンドを引いて、速度
をＯＤ４００１３Ｏ分−Ｄ４００３分として計算した。 阻害剤で予めインキュベートした試料の残留酵素活性を
、阻害剤を含まない試料の酵素活性の％として図５ａ及
び図５ｂに示す。
【００６２】図５ａ及び図５ｂは、ＰＡＩ−１の濃度（
ｎｇ）に対して、ｒｅｃｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕの
残留活性がそのままの型のｒｅｃ ｐｒｏ−ＵＫの対
応する残留活性より高いことを示している。
ｎｇ）に対して、ｒｅｃｐｒｏＵＫ−３０３−Ｇｌｕの
残留活性がそのままの型のｒｅｃ ｐｒｏ−ＵＫの対
応する残留活性より高いことを示している。
【００６３】本明細書の以上の部分で（）内の番号で引
用した参考文献は以下の通りである。
用した参考文献は以下の通りである。
【００６４】（１）Ｃｏｌｌｅｎ Ｄ． 及び
Ｌｉｊｎｅｎ Ｈ．Ｒ．Ｔｈｅｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔ
ｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｍａｎ．ＣＲＣ
Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎ
ｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ４， Ｎ
ｏ． ３， ２４９， １９８６； （２）Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ
ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， 編集
者 Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ．，
Ｎｅｉｎｈｕｉｓ Ａ． Ｗ．， Ｌｅｄｅ
ｒ Ｐ．， Ｍａｊｅｒｕｓ Ｐ． Ｗ．１９
８７ Ｗ．Ｂ． Ｓｏｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ； （３）Ｓａｍａｍａ Ｍ． 及び Ｋｅｈｒ
Ａ．， Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ Ａ
ｎｔｉｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ
Ｓｅｍ． Ｈｏｐ． Ｐａｒｉｓ， ６１，
Ｎｏ． ２０， １４２３， １９８５； （４）Ｚａｍａｒｒｏｎ Ｃ．， Ｌｉｊｎｅｎ
Ｈ．Ｒ．， Ｖａｎ Ｈｏｅｆ Ｂ． 及び
Ｃｏｌｌｅｎ Ｄ．， ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ ａｎ
ｄ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍ
ａｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ．Ｉ． Ｆｉｂｒｉｎｏ
ｌｙｔｉｃ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙ
ｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ
ｐｌａｓｍａ ｉｎ ｖｉｔｒｏｏｆｕｒｏｋｉ
ｎａｓｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍ
ａｎ ｕｒｉｎｅ ｏｒ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．
Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔａｓ． ５２，
１９， １９８４；（５）Ｍａｉｚｅｌ Ａ．Ｓ
． 及び Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ Ｊ．Ｊ．，
Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ， ｕｒｏｋｉｎａｓｅ
ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅ
ｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ： Ｐｈａｒｍｏ−ｋｉｎ
ｅｔｉｃｓ， ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｄｖａｎｔａ
ｇｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍ
ａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｃｏ
ｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｏｆ ｌｙｓｉｓ； Ｃａ
ｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ． Ｒａ
ｄｉｏｌ．， ９， ２３６， １９８６； （６）Ｂｅｌｌ Ｗ．Ｒ．， ｓｔｒｅｐｔｏｋｉ
ｎａｓｅ ａｎｄ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｕｌｍ
ｏｎａｒｙｅｍｂｏｌｉ； Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓ．， ３５， ５７，１９７６； （７）Ａｃａｒ Ｊ．， Ｖａｈａｎｉａｎ Ａ
．， Ｍｉｃｈｅｌ Ｐ．Ｌ．， Ｓｌａｍａ
Ｍ．， Ｃｒｏｍｉｅｒ Ｂ． 及び Ｒｏ
ｇｅｒ Ｖ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ Ｍｙｏｃａｒ
ｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ； ｓｅｍｉｎａ
ｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ． ａｎｄ Ｈａｅ
ｍｏｓｔ． １３， Ｎｏ． ２， １８６，
１９８７； （８）Ｇｒｕｐｐｏ Ｉｔａｌｉａｎｏ Ｐｅｒ
Ｌｏ Ｓｔｕｄｉｏ Ｄｅｌｌａ Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｈｉｎａｓｉ Ｎｅｌｌ’Ｉｎｆａｒｔｏ
Ｍｉｏｃａｒｄｉｏ（ＧＩＳＳＩ）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ
ｎｅｓｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｔｈ
ｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ
ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃ
ｔｉｏｎ， Ｌａｎｃｅｔ， １， ３９７，
１９８６； （９）Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ Ｍ．， Ｒｙｋｅｎ
Ｄ．Ｃ．， ＬｉｊｎｅｎＨ．Ｒ． 及び Ｃ
ｏｌｌｅｎ Ｄ．， Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏ
ｇｅｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｐｌａ
ｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ： ｒｏｌ
ｅ ｏｆ ｆｉｂｒｉｎ； Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２５７， Ｎｏ． ６， ２
９１２，１９８２； （１０）Ｈｕｓａｉｎ Ｓ．Ｓ． 及び Ｇｕｒ
ｅｗｉｃｈ Ｖ．， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈ
ａｉｎ， ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇ
ｈｔ ｆｏｒｍ ｏｆ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ
ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎｅ； Ａｒｃｈ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２２０，
３１，１９８３； （１１）Ｃｏｌｌｅｎ， Ｄ． 及び Ｌｉｊｎ
ｅｎ Ｈ．Ｒ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｌａｓｍｉ
ｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ； Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｒ
ｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ； Ｈ
ａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １６， Ｎｏ． ３，
２５， １９８６；（１２）Ｐａｎｎｅｌｌ Ｒ
．， 及び Ｇｕｒｅｗｉｃｈ Ｖ．， Ｐｒ
ｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓｅ． Ａ ｓｔｕｄｙ ｏ
ｆ ｉｔｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎ ｐｌａｓ
ｍａ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉ
ｓｍ ｏｆ ｉｔｓｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｉｂ
ｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ； Ｂｌｏｏｄ
， ６７， １２１５， １９８６； （１３）Ｇｕｒｅｗｉｃｈ Ｖ． 及び Ｐａｎ
ｎｅｌｌ Ｒ．， Ｆｉｂｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎ
ｇ ａｎｄ，ｚｙｍｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｕ
ｒｏｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏ−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）；Ｓ
ｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ． ａｎｄ
Ｈａｅｍｏｓｔ．１３， Ｎｏ． ２， １
４６， １９８７；（１４）Ｈｏｍｅｓ Ｗ．Ｅ．
， Ｐｅｎｎｉｃａ Ｄ．， Ｂｌａｂｅｒ
Ｍ．， Ｒｅｙ Ｍ．Ｗ．， Ｇｕｎｚｌｅｒ
Ｗ．Ａ．， ＳｔｅｆｆｅｎｓＧ．Ｊ． 及び
Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ Ｈ．Ｌ．， ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｒｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓ
ｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３， ９２３，
１９８５；（１５）Ａｐｐｅｌｌａ Ｅ．，
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｅ．Ａ．， Ｕｌｌｒｉｃｈ
Ｓ．Ｊ．， Ｓｔｏｐｐｅｌｌｉ Ｍ．Ｐ．，
Ｃｏｒｔｉ Ａ．， Ｃａｓｓａｎｉ Ｇ．
及び Ｂｌａｓｉ Ｆ．， Ｔｈｅ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏ
ｆ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ； Ｈ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ２６２， Ｎｏ． １０，
４４３７， １９８７； （１６）Ｓｔｅｆｅｎｓ Ｇ．Ｊ．， Ｇｕｎｚｌ
ｅｒ Ｗ．Ａ．， Ｏｔｔｉｎｇ Ｆ．， Ｆ
ｒａｎｋｅｎｓ Ｅ． 及び Ｆｌｏｈｅ Ｌ
．， Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａ
ｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｌｏｗｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ
ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎｅ； Ｈｏ
ｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．ｃｈｅｍ． ３６３， １０４３， １９８
２；（１７）ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； 編
集者 Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ．Ａ．，１９８９ Ｓｔ
ｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ； （１８）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．３６５，８９４；（１９）
Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ
，Ｆ． 及び Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ １９８２．
Ｌｉｊｎｅｎ Ｈ．Ｒ．Ｔｈｅｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔ
ｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｍａｎ．ＣＲＣ
Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎ
ｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ４， Ｎ
ｏ． ３， ２４９， １９８６； （２）Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ
ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， 編集
者 Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ．，
Ｎｅｉｎｈｕｉｓ Ａ． Ｗ．， Ｌｅｄｅ
ｒ Ｐ．， Ｍａｊｅｒｕｓ Ｐ． Ｗ．１９
８７ Ｗ．Ｂ． Ｓｏｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ； （３）Ｓａｍａｍａ Ｍ． 及び Ｋｅｈｒ
Ａ．， Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ Ａ
ｎｔｉｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ
Ｓｅｍ． Ｈｏｐ． Ｐａｒｉｓ， ６１，
Ｎｏ． ２０， １４２３， １９８５； （４）Ｚａｍａｒｒｏｎ Ｃ．， Ｌｉｊｎｅｎ
Ｈ．Ｒ．， Ｖａｎ Ｈｏｅｆ Ｂ． 及び
Ｃｏｌｌｅｎ Ｄ．， ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ ａｎ
ｄ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍ
ａｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ．Ｉ． Ｆｉｂｒｉｎｏ
ｌｙｔｉｃ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙ
ｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ
ｐｌａｓｍａ ｉｎ ｖｉｔｒｏｏｆｕｒｏｋｉ
ｎａｓｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍ
ａｎ ｕｒｉｎｅ ｏｒ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．
Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔａｓ． ５２，
１９， １９８４；（５）Ｍａｉｚｅｌ Ａ．Ｓ
． 及び Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ Ｊ．Ｊ．，
Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ， ｕｒｏｋｉｎａｓｅ
ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅ
ｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ： Ｐｈａｒｍｏ−ｋｉｎ
ｅｔｉｃｓ， ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｄｖａｎｔａ
ｇｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍ
ａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｃｏ
ｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｏｆ ｌｙｓｉｓ； Ｃａ
ｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ． Ｒａ
ｄｉｏｌ．， ９， ２３６， １９８６； （６）Ｂｅｌｌ Ｗ．Ｒ．， ｓｔｒｅｐｔｏｋｉ
ｎａｓｅ ａｎｄ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｕｌｍ
ｏｎａｒｙｅｍｂｏｌｉ； Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａ
ｅｍｏｓｔａｓ．， ３５， ５７，１９７６； （７）Ａｃａｒ Ｊ．， Ｖａｈａｎｉａｎ Ａ
．， Ｍｉｃｈｅｌ Ｐ．Ｌ．， Ｓｌａｍａ
Ｍ．， Ｃｒｏｍｉｅｒ Ｂ． 及び Ｒｏ
ｇｅｒ Ｖ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ Ｍｙｏｃａｒ
ｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ； ｓｅｍｉｎａ
ｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ． ａｎｄ Ｈａｅ
ｍｏｓｔ． １３， Ｎｏ． ２， １８６，
１９８７； （８）Ｇｒｕｐｐｏ Ｉｔａｌｉａｎｏ Ｐｅｒ
Ｌｏ Ｓｔｕｄｉｏ Ｄｅｌｌａ Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｈｉｎａｓｉ Ｎｅｌｌ’Ｉｎｆａｒｔｏ
Ｍｉｏｃａｒｄｉｏ（ＧＩＳＳＩ）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ
ｎｅｓｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｔｈ
ｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ
ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃ
ｔｉｏｎ， Ｌａｎｃｅｔ， １， ３９７，
１９８６； （９）Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ Ｍ．， Ｒｙｋｅｎ
Ｄ．Ｃ．， ＬｉｊｎｅｎＨ．Ｒ． 及び Ｃ
ｏｌｌｅｎ Ｄ．， Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏ
ｇｅｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｐｌａ
ｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ： ｒｏｌ
ｅ ｏｆ ｆｉｂｒｉｎ； Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２５７， Ｎｏ． ６， ２
９１２，１９８２； （１０）Ｈｕｓａｉｎ Ｓ．Ｓ． 及び Ｇｕｒ
ｅｗｉｃｈ Ｖ．， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈ
ａｉｎ， ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇ
ｈｔ ｆｏｒｍ ｏｆ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ
ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎｅ； Ａｒｃｈ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２２０，
３１，１９８３； （１１）Ｃｏｌｌｅｎ， Ｄ． 及び Ｌｉｊｎ
ｅｎ Ｈ．Ｒ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｌａｓｍｉ
ｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ； Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｒ
ｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ； Ｈ
ａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １６， Ｎｏ． ３，
２５， １９８６；（１２）Ｐａｎｎｅｌｌ Ｒ
．， 及び Ｇｕｒｅｗｉｃｈ Ｖ．， Ｐｒ
ｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓｅ． Ａ ｓｔｕｄｙ ｏ
ｆ ｉｔｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎ ｐｌａｓ
ｍａ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉ
ｓｍ ｏｆ ｉｔｓｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｉｂ
ｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ； Ｂｌｏｏｄ
， ６７， １２１５， １９８６； （１３）Ｇｕｒｅｗｉｃｈ Ｖ． 及び Ｐａｎ
ｎｅｌｌ Ｒ．， Ｆｉｂｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎ
ｇ ａｎｄ，ｚｙｍｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｕ
ｒｏｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏ−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）；Ｓ
ｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ． ａｎｄ
Ｈａｅｍｏｓｔ．１３， Ｎｏ． ２， １
４６， １９８７；（１４）Ｈｏｍｅｓ Ｗ．Ｅ．
， Ｐｅｎｎｉｃａ Ｄ．， Ｂｌａｂｅｒ
Ｍ．， Ｒｅｙ Ｍ．Ｗ．， Ｇｕｎｚｌｅｒ
Ｗ．Ａ．， ＳｔｅｆｆｅｎｓＧ．Ｊ． 及び
Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ Ｈ．Ｌ．， ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｐｒｏ−ｕｒｏｋｉｎａｓ
ｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３， ９２３，
１９８５；（１５）Ａｐｐｅｌｌａ Ｅ．，
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｅ．Ａ．， Ｕｌｌｒｉｃｈ
Ｓ．Ｊ．， Ｓｔｏｐｐｅｌｌｉ Ｍ．Ｐ．，
Ｃｏｒｔｉ Ａ．， Ｃａｓｓａｎｉ Ｇ．
及び Ｂｌａｓｉ Ｆ．， Ｔｈｅ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏ
ｆ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ； Ｈ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ２６２， Ｎｏ． １０，
４４３７， １９８７； （１６）Ｓｔｅｆｅｎｓ Ｇ．Ｊ．， Ｇｕｎｚｌ
ｅｒ Ｗ．Ａ．， Ｏｔｔｉｎｇ Ｆ．， Ｆ
ｒａｎｋｅｎｓ Ｅ． 及び Ｆｌｏｈｅ Ｌ
．， Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａ
ｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｌｏｗｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ
ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎｅ； Ｈｏ
ｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．ｃｈｅｍ． ３６３， １０４３， １９８
２；（１７）ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； 編
集者 Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ．Ａ．，１９８９ Ｓｔ
ｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ； （１８）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．３６５，８９４；（１９）
Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ
，Ｆ． 及び Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ １９８２．
【図１】ヒトプロウロキナーゼ及びその可能なジスルフ
ィド架橋の概略図である。他のセリンプロテアーゼとの
相同により二次元構造が得られる。矢印は高分子量及び
低分子量の２本鎖ウロキナーゼへの切断点を示している
。
ィド架橋の概略図である。他のセリンプロテアーゼとの
相同により二次元構造が得られる。矢印は高分子量及び
低分子量の２本鎖ウロキナーゼへの切断点を示している
。
【図２】大腸菌でのヒトプロウロキナーゼ用コード化遺
伝子の発現のために使用するプラスミドｐＦＣ１６の概
略図である。ヒトプロウロキナーゼ誘導体を厳密に同一
の遺伝子からなるプラスミドで製造した。
伝子の発現のために使用するプラスミドｐＦＣ１６の概
略図である。ヒトプロウロキナーゼ誘導体を厳密に同一
の遺伝子からなるプラスミドで製造した。
【図３】ヒトプロウロキナーゼ誘導体用コード化遺伝子
の分離のために使用する突然変異誘発アプローチの概略
図である。６種のプライマーを合成した。これらの中で
、０２，０３，０６は所望の一時変異、即ちそれぞれ１
３８−Ｇｌｕ，１３９−Ｇｌｕ，３０３−Ｇｌｕを含ん
でいる。０２，０３，０４は更に、ＭｒｏＩ制限部位を
生じる他の一時変異を有する。しかしながら、この制限
部位はヒトプロウロキナーゼのアミノ酸配列を変えない
。
の分離のために使用する突然変異誘発アプローチの概略
図である。６種のプライマーを合成した。これらの中で
、０２，０３，０６は所望の一時変異、即ちそれぞれ１
３８−Ｇｌｕ，１３９−Ｇｌｕ，３０３−Ｇｌｕを含ん
でいる。０２，０３，０４は更に、ＭｒｏＩ制限部位を
生じる他の一時変異を有する。しかしながら、この制限
部位はヒトプロウロキナーゼのアミノ酸配列を変えない
。
【図４】プラスミドｐＦＣ１４６，ｐＦＣ１４７，ｐＦ
Ｃ１４８の分離に伴う遺伝操作の概略図である。
Ｃ１４８の分離に伴う遺伝操作の概略図である。
【図５ａ】ＰＡＩ−１阻害剤の異なる濃度（ｎｇ）（横
軸）に対するｒｅｃ ｐｒｏ−ＵＫの残留活性のパー
センテージ（縦軸）を示すグラフである。
軸）に対するｒｅｃ ｐｒｏ−ＵＫの残留活性のパー
センテージ（縦軸）を示すグラフである。
【図５ｂ】ＰＡＩ−１阻害剤の異なる濃度（ｎｇ）（横
軸）に対する本発明の突然変異体ｐｒｏ−ＵＫ−３０３
−Ｇｌｕの残留活性のパーセンテージ（縦軸）を示すグ
ラフである。
軸）に対する本発明の突然変異体ｐｒｏ−ＵＫ−３０３
−Ｇｌｕの残留活性のパーセンテージ（縦軸）を示すグ
ラフである。
Claims (23)
- 【請求項１】 血漿性阻害剤に対する親和性がより小
さいことを特徴とするヒトプロウロキナーゼ又はその類
似物の誘導体。 - 【請求項２】 前記類似物が、ヒトプロウロキナーゼ
の欠損、挿入又は逆位による突然変異体からなることを
特徴とする請求項１に記載の誘導体。 - 【請求項３】 前記類似物が、ヒト以外の種から得ら
れるプロウロキナーゼからなることを特徴とする請求項
１に記載の誘導体。 - 【請求項４】 プロウロキナーゼが哺乳動物から得ら
れることを特徴とする請求項３に記載の誘導体。 - 【請求項５】 ヒトプロウロキナーゼ又はその類似物
の配列に存在する１〜３個のアミノ酸残基を、負電荷を
帯びた同等数のアミノ酸と置換することを特徴とする請
求項１に記載の誘導体。 - 【請求項６】 前記残基が１３８位、１３９位及び３
０３位のセリンであり、負電荷を帯びた前記アミノ酸が
グルタミン酸又はアスパラギン酸であることを特徴とす
る請求項５に記載の誘導体。 - 【請求項７】 請求項１から６のいずれか一項に記載
のプロウロキナーゼ誘導体の組換えＤＮＡ技術による製
造方法。 - 【請求項８】 ヒトプロウロキナーゼ又はその類似物
用コード化遺伝子の部位特異性突然変異を誘発し、その
後適切な宿主微生物中で新規誘導体の合成を指向し得る
適切な発現ベクター内に突然変異体遺伝子を導入して前
記誘導体を製造することを特徴とする請求項７に記載の
方法。 - 【請求項９】 発現ベクターがプラスミドｐＦＣ１４
６であり、宿主微生物が大腸菌であることを特徴とする
請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 発現ベクターがプラスミドｐＦＣ１
４７であり、宿主微生物が大腸菌であることを特徴とす
る請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 発現ベクターがプラスミドｐＦＣ１
４８であり、宿主微生物が大腸菌であることを特徴とす
る請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】 化学合成ポリヌクレオチドを含み、
請求項１から６のいずれか一項に記載のプロウロキナー
ゼ誘導体をコード化する遺伝子。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載の遺伝子を含み、
請求項６に記載のプロウロキナーゼ誘導体の合成を指向
し得る組換え発現ベクター。 - 【請求項１４】 発現ベクターがｐＦＣ１４６である
ことを特徴とする請求項１３に記載の発現ベクター。 - 【請求項１５】 発現ベクターがｐＦＣ１４７である
ことを特徴とする請求項１３に記載の発現ベクター。 - 【請求項１６】 発現ベクターがｐＦＣ１４８である
ことを特徴とする請求項１３に記載の発現ベクター。 - 【請求項１７】 請求項１６に記載の発現ベクターに
より形質転換される宿主微生物。 - 【請求項１８】 発現ベクターｐＦＣ１４６により形
質転換される大腸菌Ｂ型株。 - 【請求項１９】 発現ベクターｐＦＣ１４７により形
質転換される大腸菌Ｂ型株。 - 【請求項２０】 発現ベクターｐＦＣ１４８により形
質転換される大腸菌Ｂ型株。 - 【請求項２１】 請求項１２に記載の遺伝子の発現用
促進剤Ｐｔｒｐの大腸菌Ｂ型株内での使用。 - 【請求項２２】 請求項１２に記載の遺伝子の大腸菌
Ｂ株内での発現のためにＭＳ−２ファージのＳｈｉｎｅ
−Ｄａｌｇａｒｎｏの使用。 - 【請求項２３】 医薬として許容し得る希釈剤及び／
又は担体と共に、請求項１から６のいずれか一項に記載
のプロウロキナーゼ誘導体を含んでいる医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT21178A/90 | 1990-08-02 | ||
| IT02117890A IT1243774B (it) | 1990-08-02 | 1990-08-02 | Derivati della prourochinasi |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04252184A true JPH04252184A (ja) | 1992-09-08 |
Family
ID=11177958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3190333A Pending JPH04252184A (ja) | 1990-08-02 | 1991-07-30 | プロウロキナーゼ誘導体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04252184A (ja) |
| DE (1) | DE4125193A1 (ja) |
| GB (1) | GB2247022A (ja) |
| IT (1) | IT1243774B (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2426115A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-10-18 | Victor Gurewich | Methods, devices, and compositions for lysis of occlusive blood clots while sparing wound sealing clots |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU605124B2 (en) * | 1985-12-23 | 1991-01-10 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Novel peptide plasminogen activators |
| JPS63105675A (ja) * | 1986-10-23 | 1988-05-10 | Green Cross Corp:The | ヒトウロキナ−ゼの製造方法 |
| EP0336508A1 (en) * | 1988-04-06 | 1989-10-11 | K.U. Leuven Research & Development | Recombinant human single-chain urokinase-type plasminogen activator mutant produced by site-specific mutagenesis of lysine 158 to histidine 158 |
-
1990
- 1990-08-02 IT IT02117890A patent/IT1243774B/it active IP Right Grant
-
1991
- 1991-07-30 JP JP3190333A patent/JPH04252184A/ja active Pending
- 1991-07-30 GB GB9116457A patent/GB2247022A/en not_active Withdrawn
- 1991-07-30 DE DE4125193A patent/DE4125193A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT9021178A0 (it) | 1990-08-02 |
| DE4125193A1 (de) | 1992-02-06 |
| IT9021178A1 (it) | 1992-02-02 |
| GB2247022A (en) | 1992-02-19 |
| IT1243774B (it) | 1994-06-28 |
| GB9116457D0 (en) | 1991-09-11 |
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