JPH03500724A - 組織プラスミノーゲン活性化因子の誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組織プラスミノーゲン活性化因子の誘導体本発明は、新規なｔ−ＰＡ誘導体、該 新規なｔ−ＰＡ誘導体をコードしているＤＮＡ配列、該ｔ−ＰＡ誘導体をコード しているＤＮＡ配列を含有する発現プラスミド、ならびにこのようなプラスミド の製造方法、該ｔ−ＰＡ誘導体の産生方法、および該ｔ−ＰＡ誘導体を含有する 血餅溶解用薬物に関する。

凝固した血液は、タンパクマトリックスの主成分である高分子フイおけると同様 の反応カスケード中のフィブリン溶解システムによって生理学的条件下で溶解さ れる。このカスケードの中心的な反応は、プラスミノーゲンのプラスミンへの活 性化であり、これは、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子ｔ−ＰＡによって 媒介される。次に、プラスミンは、凝固した血液のタンパクマトリックスの主成 分であるフィブリンを溶解する。天然ｔ−ＰＡまたは遺伝子工学によつて真核生 物から得られたｔ−ＰＡの酵素活性、すなわちプラスミノーゲンのプラスミンへ の触媒活性化は、フィブリンまたはフィブリノーゲン開裂生成物の非存在下では 非常に低いが、これらのタンパクの存在下では実質的に、すなわち１０倍以上も 増大し得る。

ｔ−ＰＡは、血液中に存在するプロテアーゼによってＡ−鎖およびＢ−鎖に開裂 される。両鎖の一部は、システィン架橋を介して結合したままである。ｔ−ＰＡ の活性を刺激する能力は、他の公知のプラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウ ロキナーゼまたはストレプトキナーゼ［例えば、ニーム・ホイレルッ（Ｍ、　Ｈ ｏｙｌａｅｒｔｓ）ら、ジで−ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ 　、　Ｂ　ｉｏｎ、　Ｃｈｅｍ、）２５７　（１９８２）、２９１２−２９１９ 　；ダブリニ・ノイヴエンホイツェン（Ｗ。

Ｎ　ｉ　ｅｕｖｅｎｈｕ　１ｚｅｎ）ら、ビオヒエミ力・エト・ビオフィジ力・ アクタ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａ　ｃｔａ）、７５５　（ １９８３）、５３１−５３３］に比べて有意に優れている。

ｉｎ　ｖｉｖｏでのｔ−ＰＡの作用のメカニズムは、例えば、コルニゲル（Ｋ　 ｏｒｎ　ｉｇｅｒ）およびコレン（Ｃｏｌｌｅｎ）、スロンボウシス・アンド・ ヘモステイシス（Ｔｈｒｏｍｂ、　）（ｊｉｍｏｓｔａｓｉｓ）　４６　（１９ ８１）、５６１−５６５に開示されている。このフィブリン表面上での酵素活性 が、それを病的脈管閉塞（例えば、心筋梗塞）の治療に適した薬物にしており、 これは臨床的な試行によって広範に確認された［コレン（Ｃｏｌｌｅｎ）　’） 　、サーキユレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）　７０　（１９８４）、１ ０１２　；サーキュＬ／　’／　５ン７３　（１９８６）、５１１］。

しかしながら、ｔ−ＰＡの欠点は、その血漿濃度が迅速に減少することである（ クリアランス）。その結果、血栓の有効な溶解を行うためには比較的多量のｔ− ＰＡが必要である。他方、多量の治療量によって、例えば出血のような副作用が 生じる。

ｔ−ＰＡの自然分解産物は、欧州特許ＥＰ　Ｏ１９６９２０に開示されており、 これは、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）　ＩＩおよびプロテアーゼドメインを含 有しているだけであり、そのＮ−末端は、アラニン１６０で始まる［ネイチ＋− （Ｎａｔｕｒｅ）　３０１　（１９８３）、２１４−２２１においてペン二カ（ Ｐｅｎｎｉｃａ）らによって挙げられたアミノ酸配列のエニュメレイションシス テム］。

しかしながら、このｔ−ＰＡ分解産物のクリアランス速度は、天然ｔ−ＰＡＯも のとは有意には異なっていない。保護基の結合を介して触媒ドメインの化学的修 飾によって改良され得るだけである。

したがって、本発明の目的は、得られた誘導体のクリアランス速度が非常に減少 し、その結果、血漿の半減期が一層長くなるようにｔ−ＦＡを修飾することであ る。この方法において、血栓を溶解する能力およびフィブリンによって刺激され る能力は維持されるべきである。

本発明は、グリコジル化されておらず、アミ７基末端、すなわち、アミノ酸Ｎｏ 、１＝ＳにおいてＭにより延長されることのできる下記アミノ酸配列： （Ｍｌ １　５ＹＱＣ１（ＳＤＣＹｒ　Ｃ’ＮＣ５ＡＹＲＣτＨ５ＬτＥＳに人ｓＣＬ　 ＦｌｊＮＳＭＩＬＩＣにｖｙτ人ＱＮＰＳ＾ｑ５１　ＡＬＣＬＩ：Ｋ）ＩＮＹＣ ＲＮＰＤＣＤＡＸＦＩＪ　Ｃ１（ＶＬＩＧ＋”ＲＲＬＴ　ＶＥＹＣＤＶＰＳＣ５ τＣにＬＲＱＹＳＱＰ１０１　ＱＦ′ＲＩＫＣＣＩＪ人　ＤＸＡＳＨＦすｑ入＾ 　ＩＦ人にＨ那ＰＣＬλｒｔｃｃｃＩｔ工　ＳＳＣυＩＬＳ八＾Ｈ１５１へ　Ｃ １ＥＪＬｒＰ！’）ｒＨＬＴＶＩＬＩＩ：ｌＬｍ　ＶＷＣＥＥＥＱＫｒ　ＥＶＥ ＫＹＩＶ’）ＩＸＥ　ＦＤＤＤＴＹＤＮＤＩ２０１　ＡＬＬＱＬＫＳＤＳ５　Ｒ ＣＡＱＥＳＳＶＶｌ’Ｌ　τＶＣＬ１’ＰＡＤＬＱ　ＬＰＤＶ’ｒｔＣＥＬＳ　 σＹＣＫＨＥＡＬｔ？２５１　ＦＹＳＥＩにΣ人Ｈ■ＬＹＰＳＳＲＣτ　ＳＱＨ ｕＭ丁Ｖτ　ＤＮＭＬＣＡＣＤＴＲ５ＣＣＰＱＡＪＩひＤ３０１　ＡＣＱＣＯ５ ＣＣ，ＴＬ　ＶＣＬＮＯＣＲ）（ＴＬ　ＶＣ？ＭＳＩＸ；ＬＣＣ（：ＱＩＣＤｖ ＰＣｖＹτ　ＫＶＴＮＹＬＤすＩλコ５１　Ｄドにλ？ を含むことを特徴とする組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ誘導体）を 提供することである。

驚くべきことに、天然ｔ−ＰＡに存在する他のドメインの欠失は、タンパクの血 栓崩壊性効力への影響がなく、突然変異タンパクのフィブリン依存性刺激力は天 然ｔ−ＰＡのものに匹敵することが確認された。本発明のｔ−ＰＡ誘導体がフィ ブリンに結合する特性を欠いていることが測定されたが、しかしながら、驚くべ きことに、天然ｔ−ＰＡＯものと比較して非常に改良されたｉｎ　ｖｉｖｏでの 血栓崩壊性効力を呈した。同様に、驚くべきことに、効果的な血栓崩壊に充分な 投与量を投与すると、全身のフィブリン溶解はほとんど影響されないままである という事実がある。したがって、生理学的条件下で、本発明のｔ−ＰＡ誘導体が フィブリン特異性という代表的なｔ−ＰＡ特性を示すことが証明された。これら の結果は、本発明のｔ−ＰＡ誘導体の薬理学的研究から得られた（実施例６およ び７参照）。さらに、本発明のタンパクは、非常に高い比活性を有している。上 記復元方法を用いることによって、５００〜８００ｋＵ／ａ９の活性が既に測定 されている。

さらに、本発明は、本発明のｔ−ＰＡ誘導体をフードし、かつ下記配列： を含むＤＮＡ配列を提供するものである。

本発明のＤＮＡ配列は、発現プラスミド上に存在させて、本発明のｔ−ＰＡ誘導 体を発現させるために用いられる。この種の発現プラスミドも、本発明の他の態 様であり、本発明のｔ−ＰＡ誘導体をコードしている他のＤＮＡ配列を有する発 現プラスミドも同様であ目的に適している。

ｔ−ＰＡ誘導体をコードしている該配列のほかに、該発現プラスミドは、好まし くは、調節され得るプロモーター構造（例えば、ｔａｃ）、有効なターミネータ −（例えば、ｆｄ）、選択マーカー（例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子）および 複製起源を含んでいる。

また、本発明は、プラスミドｐＡ　２７．３を提供するものである。

このプラスミドの製造方法は実施例１に記載する；該プラスミドは本発明のｔ− ＰＡ誘導体をコードしているＤＮＡ配列を含んでいる。

さらに、本発明は、本発明のｔ−ＰＡタンパクをコードしているＤＮＡ配列、ま たは該ｔ−ＰＡタンパクの別の領域ならびにクリングル■およびプロテアーゼド メインを含んでいるその誘導体を、プラスミド中に組込み、本発明のｔ−ＰＡ誘 導体中に存在しないアミノ酸をコードしているこれらのドメインを位置特異的突 然変異誘発によって欠失させることを特徴とする本発明の発現プラスミドのうち の１つの構築方法を提供するものでもある。

本発明のｔ−ＰＡ誘導体をコードしているＤＮＡ配列を組込ませようとするプラ スミドの選択は、後に該誘導体を発現するのに用いる宿主細胞に依存する。適当 なプラスミドおよびこのようなプラスミドについて最小限の必要とするもの（例 えば、複製起源、制限部位）は、当業者に公知である。本発明の範囲内では、プ ラスミドの代わりに、コスミド、ファージの複製２本鎖型（λ、Ｍ２Ｓ）、およ び当業者に公知の他のベクターを使用することができる。位置特異的突然変異誘 発の方法は、モリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）らによってバイオテクノロジー（Ｂ 　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　２１、（１９８４）、６３４に開示されており 、実質的に開示のとおりに行われる。

また、本発明は、本発明のプラスミドのうちの１つを適切な宿主細胞中で発現さ せ、必要な場合は宿主細胞の溶解の後に、培養培地から産生物を単離することを 特徴とする本発明のｔ−ＰＡ誘導体の産生方法を提供するものでもある。本発明 のｔ−ＰＡ誘導体を産生するための宿主細胞として原核細胞を使用するのが好ま しい。これに関して、まず、この工程の間゛に可溶性細胞粒子から形成される、 いわゆる「封入体」（不溶性タンパク凝集物）を分離し、還元条件下でのグアニ ジン・塩酸塩による処理によってｔ−ＰＡを含有する封入体を可溶化し、次いで 、Ｇ５５Ｇ（酸化型グルタチオン）によって誘導し、最後にＬ−アルギニンおよ びＧＳＨ（還元型グルタチオン）の添加によってｔ−ＰＡ誘導体を復元すること が特に好ましい。例えば、欧州特許出願明細書ＥＰ−Ａ　Ｏ２１９８７４および ＥＰ−Ａ　Ｏ２４１０２２には、「封入体」由来のｔ−ＰＡの活性化に関する厳 密な指示が開示されている。しかしながら、本発明の、封入体から活性タンパク の単離に関する他の方法を同様に用いることもできる。

本発明の方法は、Ｋ２Ｐの精製に関して、特に１０〜１０００ミリモル／Ｑの濃 度のし一アルギニンの存在下で行うのが好ましい。

アフィニティークロマトグラフィーによる本発明の異種タンパクの除去は、ＥＴ Ｉ（エリトリナ・トリプシン阻害薬）吸着カラムによつて行うのが好ましい。こ れに関して、ＥＴＩは、例えばセファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）のような 担体物質（吸着剤）上に固定される。ＥＴ！吸着カラムによる精製は、０．８モ ル／２Ｑアルギニンのような高’ｔｌＡ度のアルギニンの存在下でさえ、濃縮さ れた復元調製物をＥＴＩ吸着カラム物質に直接負荷することができるという長所 を有している。

この方法では、１０ミリモル／１２以下の低いアルギニン濃度で生じ得るに２Ｐ の凝集が回避される。したがって、０．６〜０．８モル／Ｑアルギニンの存在下 、ＥＴｉ吸着カラムによってに２Ｐの精製を行うのが特に好ましい。この方法で は、Ｋ２Ｐを含有している溶液は、好ましくはｐＨ７以上、特に好ましくはｐＨ ７，５〜８．６である。

ＥＴＩカラムからの溶離は、Ｋ２Ｐを良好に溶解させる条件下、アルギニンの存 在下および非存在下でｐＨを低下させることによって行われる。溶離の間のｐＨ 値は、酸性領域であるのが好ましく、特に好ましくは３〜５．５の範囲である。

本発明によって産生されたに２Ｐは、５５００００±２０００００１Ｕ／ｘ９の ｔ−ＰＡ比活性および９５％以上、好ましくは９９％以上の純度を有している。

したがって、本発明のｔ−ＰＡ誘導体は、クリアランス速度の減少によって有意 に長い血漿半減期を有するｔ−ＰＡ誘導体を提供するものである。しかしながら 、本発明の該誘導体は、それを動脈血栓および静脈血栓の血栓崩壊治療薬物とし て好適にすると思われる特性を全く失っていない。それどころか、Ｋ２Ｐによる 血栓崩壊治療に必要な投与量は、天然ｔ−ＰＡの通常の投与量の少なくとも４分 の１まで減少し得る。Ｋ２Ｐおよび天然ｔ−ＰＡの等能投与量を用いると、凝固 システムは天然ｔ−ＰＡによるよりもに２Ｐによる方が影響されず、出血時間は 、Ｋ２Ｐによる治療において生じる出血の合併症ができる限り減少され得る程に 天然ｔ−ＰＡに対照して有意に延期される。

したがって、本発明のｔ−ＰＡ誘導体は、本発明の他の態様である薬物における 使用に特に適している。本発明のｔ−ＰＡを薬物として使用する場合、ＣＨＯに おいて産生される天然ｔ−ＰＡの場合よりも有意に少量の投与量を投与すること が必要なだけである。

以下の実施例および添付した図面によって、本発明をさらに詳しく説明する。

第１図は、プラスミドｐＡ２７．３の構築を示す模式図である。

第２図は、本発明のｔ−ＰＡ誘導体のフィブリン結合（曲線１）と、ＣＨ○細胞 において発現した天然ｔ−ＰＡのフィブリン結合（生理学的開裂部位Ａｒｇ２７ ５−Ｔｌｅ２７６で開裂した、ＣＨＯ細胞由来の二本鎖ｔ−ＰＡ、曲線２）およ びＣＨＯ細胞由来の一本鎖ｔ−ＰＡのフィブリン結合（曲線３）との比較を示す グラフである。

第３図および第４図はく本発明のｔ−ＰＡ誘導体と市販の入手可能なｔ−ＰＡ調 製物［アクティリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＲ）］のｔ−ＰＡ活性の薬物動力学と を比較したグラフである［曲線１：に２Ｐ、投与量２０００００　Ｕ／に９＝　 ０．２５ｘ９７に９．３０分間の静脈内注射、研究した動物（ウサギ）の数：４ ；曲線２：アクテイリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＲ）、投与Ｒ２０００００Ｕ／に ？、３０分間の静脈内注射、研究した動物（ウサギ）の数二６コ。

第５図は、本発明のｔ−ＰＡ誘導体とアクテイリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＲ）と に関する血栓崩壊性について投与量一応答曲線（ウサギについて）を比較したグ ラフである［平均値＋ＳＥＭを示した、１ｋＵ’１Ｏ００１Ｕ、曲線１　：　Ｋ ２Ｐ　；曲線２：アクテイリセ（ＡｃｔｉｌｙｓｅＲ）］。

第６図は、麻酔したイヌにおけるプラシーボまたは増加投与量のアクティリセ（ Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＩ′）の静脈内ポーラス注射の前および後のシンプレート（ Ｓ　ｉｍｐｌａｔｅ）出血時間（Ｂ　Ｔ）の経時変化を示すグラフである。

第７図は、麻酔したイヌにおけるプラシーボまたは増加投与量のに２Ｐの静脈内 ポーラス注射の前および後のシンプレート（Ｓ　ｉｍｐｌａｔｅ）出血時間（Ｂ 、Ｔ）の経時変化を示すグラフである。

実施例１ プラスミドｐＡ２７．３の構築 ヨーロッパ特許出願明細書ＥＰ−Ａ　Ｏ２４２８３６に開示されている出発プラ スミドＩ）ＲＥＭ７６８５は、以下の成分：　ｔａｃ−プロモーター、ＡＴＧ− 開始コトンを有するＩａｃ−オペレーター領域、ｔ−ＰＡ誘導体ＦＫ２Ｐをフー ドしている領域、ｐＫＫ２２３−３由来の転写ターミネータ−１β−ラクタマー ゼ遺伝子、カナマイシン−耐性遺伝子およびプラスミドｐＡｃＹｃ１７７の源を 含有しており、該プラスミドは、少しのフビー数の細胞中に存在している。

ｔ−ＰＡ誘導体ＦＫ２Ｐの配列は、ヌクレオチド１９０−３３６（Ｆ−ドメイン ）、７１５−１８０９（Ｋ２−ドメイン、プロテアーゼ、３°ＵＴの小さい部分 ）およびＡＴＧ−開始コトンからなっている。

ヌクレオチド位置は、ペン二カ（Ｐｅｎｎｉｃａ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ ｅ＞３０１　（１９８３）　２１４−２２１によって開示されている配列に従っ て引用される。

、プラスミドｐＲＥＭ７６８５におけるＦＫ２Ｐ構築物からＦ−ドメインを欠失 させることに関して、本質的にはモリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）ら、バイオテク ノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　２１　（１９８４）、６３４の方法 を用いた。ヘテロ二本鎖形成に関して、ｐＲＥＭ７６８５から２つのフラグメン トを単離した。フラグメントＡ：ｐＲＥＭ７６８５を制限酵素ＥｃｏＲＩで開裂 した。開裂生成物をゲル電気泳動によって分離し、該ゲルから最も大きいＥｃｏ Ｒ［フラグメントを溶離した。

フラグメントＢニブラスミドｐＲＥＭ７６８５を制限酵素Ｘｈｏｌで線形化した 。ゲル電気泳動によって予備的に該線形化プラスミドを得た。突然変異誘発のた めに下記オリゴヌクレオチド：５’　ＴＧ　ＴＣＴ　ＴＡＣＣＡＡ　ＧＧＡ　Ａ ＡＣＡＧＴ　ＧＡ　３’を合成的に調製した。

ヘテロ二本鎖を形成するために、フラグメントＡ１フラグメントＢ（各々、４５ ０フ工ムトモル）およびオリゴヌクレオチド（７５ピコモル）を混合し、まず５ ０ミリモル／ρＮａＣρ、１０ミリモル／ｐトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、ｐＨ ７，５および１０ミリモル／Ｉ２Ｍｇ５Ｏ。

の存在下、１００°Ｃで３分間インキュベートし、次いで、すぐに氷上に移した 。６０℃で３０分間、ＤＮＡの復元を行った。修複合成のためにヘテロ二本鎖に 以下のものを添加した：デオキシヌクレオチド・三リン酸塩（０，２５ミリモル ＩＱ＞、ＡＴＰ（１ミリモル／１２）、ＮａＣＱ（１００ミリモル／の、トリス −ＨＣＱ、ｐＨ７，５（６，５ミリモル／Ｑ）、ＭｇＣ１２ｔ（８ミリモル／Ｑ ）、β−メルカプトエタノール（１ミリモル／Ｑ）、イー・フリ（Ｅ、ｃｏｌｉ ）由来のＤ　Ｎ　Ａ〜ポリメラーゼのフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）−フラグメント （０，１２５Ｕ／μＱ反応混合物）およびＴ４−リガーゼ（０，Ｉ　Ｕ／μＱ反 応混合物）。１．６°Ｃで４時間、修複合成を行った。次いで、この調製物を、 ＩａｃＩｑ−プラスミドを用いてイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）１８胞（ＲＭ８２ 、ＤＳＭ　３８８９）中に形質転換し、培養培地に２５μｇ／ｘ（ｌカナマイシ ンを添加することによって、該形質転換細胞を選択した。

本発明のｔ−ＰＡ誘導体に２ＰをコードしているプラスミドｐＡ２７．３を含有 するこれらのクローンを、プローブとして上記突然変異誘発オリゴヌクレオチド を用いて、コロニーハイブリッド形成法によって選択した。このプラスミドは、 とりわけＰｓｔＩまたは５ｓｐＩ開裂部位が存在していない点で出発プラスミド ｐＲＥＭ７６８５とは異なる。これら両開製部位は、Ｆ−ドメインをコードして いる出発プラスミドの領域に含まれる。プラスミドｐＡ２７．３の構築を第１図 に模式的に示す。

実施例２ イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来の活性ｔ−ＰＡ誘導体に２Ｐの調製細胞溶解お よび封入体（ＴＢ’ｓ）の調製湿重量１．６＆９の細胞（イー・コ１バＥ　、　 ｃｏｌ　ｉ）、ＤＳＭ　３６８９、プラスミドｐＡ　２７．３によって形質転換 された）を、４°Ｃで、０．１モル／ρ　トリス−ＨＣｆ２．２０ミリモル／Ｑ ＥＤＴ”Ａ（ｐＨ６，５）１０＆に懸濁させた。これにリゾチーム２．５９を添 加し、４°Ｃで３０分間インキュベートシ；その後、高圧分散によって完全な細 胞溶解を行った。０．１−ｆ：に／Ｑ　）リス−ＨＣ（１，２０ミリ−Ｅニル／ （ｌＥＤＴＡ、６％トリトン（Ｔｒｉｔｏｒｒ）　Ｘ　１００および１．５モル ／ＱＮａＣＱ（ｐＨ６，５）５（２を該溶解産物溶液と混合し、４°Ｃでさらに ３０分間インキュベートした。この後、封入体（ＩＢ’ｓ）を、パッドバーブ（ Ｐ　ａｄｂｅｒｇ）遠心分離器中、遠心分離によって分離した。

該ペレットを０．１モル／１２トリスーＨＣＱ、２０ミリモル／ＱＥＤＴＡ（ｐ Ｈ６，５）１０Ｑに懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＴＢ −ｇ吸物を遠心分離によって単離した。

０．１モル／Ｃ）リスーＨ０ｆｆ、６モル／Ｑグアニジン・ＨＣｆ２゜０．２モ ル／Ｑ　ＤＴＥ（１，４−ジチオエリトリトール）、１ミリモル／Ｑ　Ｅ　ＤＴ 　Ａ（ｐＨ８，６）４５０ｘＱにＩ　Ｂ’ｓ　１００９（１重量）を懸濁させ、 ２５°Ｃで２．５時間撹拌した。

ＨＣｆ２（２５％）でｐＨをｐＨ３に調節した後、該溶液を１０ミリモル／ＱＨ ＣＱに対して透析した（３　Ｘ　５０１２．２４時間、４℃）。

誘導 １０ミリモル／ｐＨＣρで上記透析物を最終的に希釈した後、グアニジン−ＨＣ ＱｉｌＡ度が６モル／Ｑであるような量のグアニジン・Ｈ，Ｃｄ（固体）を添加 した。

該調製物を２５℃で１．５時間ブレインキュベートし、その後、酸化型グルタチ オン（Ｇ　Ｓ　Ｓ　Ｇ）濃度を０．１モル／Ｑに、そしてトリス−ＨＣ＆濃度を ０．０５モル／ｇに調節し、５モル／ＣＮａＯＨでｐ）（をｐＨ９，３に滴定し た。該調製物を２５°Ｃで３．５時間撹拌した。

ＨＣｆｆ（２５％）でｐＨをｐＨ３に調節した後、該溶液をｌＯミリモル／ＱＨ Ｃ（ｌに対して透析した（３Ｘ１００１２．４８時間、４°Ｃ）。透析の後、該 調製物を遠心分離し、透明な上澄み液をさらに処理した。

復元 １０ｉ２ノ反応容器に、Ｑ、　１　’Ｅ−ル／Ｑ　）リス−ＨＣ０，０，８モル 、ＱＬ−アルギニン、２ミリモル／ｌ２ＧｓＨ（グルタチオン、還元型）、１ミ リモル／Ｑ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，５を入れた。誘導体（混合したジスルフィド、 上記参照）Ｉｏｏｘ（７を、２０℃で２４時間おきに３回添加することによって 復元を行った。

復元の後、１５００〜１ｏ０００　■Ｕ／Ｒ９の比活性を有する調製物を得た〈 実施例４ｂでの測定を参照）。単位ＩＵは、ＷＨＯ、ナショナル・インスティチ ュート・フォー・バイオロジカル・スタンダーズ・アンド・コントロール（Ｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒＢ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓ　ｔ ａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）の定義に従った活性度の単必要に応 じて、復元調製物を血液透析器によって濃縮した。

実施例３ イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来に２Ｐの精製１、予め濃縮した後のＥＴＩ−セ ファロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによるイー・フリ（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）由来に２Ｐの精製ａ）クエン酸による溶離 復元調製物を、血液透析器［アサヒ（Ａｓａｈｉ）　ＡＭ　３００］、によって １：２３に濃縮し、０．５モル／ＱＮａＣＱを補足した。再酸化調製物の濃縮物 ５５０Ｒ（！を、０．１モル／Ｑｌ−リスーＨＣｆ２（ｐＨ７，５）、Ｑ、　８ モに／（１７／Ｉ／ギニン、０．５モル／　（２Ｎ　ａＣ（２テ平衡にしたＥＴ Ｉ（工ＩＪトリナートリブシンー阻害剤）−セファロースカラム（Ｖ＝５０ｘ１ ２）に入れ［１０力ラム容量／時、１０ＣＶ／ｈ］、２８０ｎｍの溶離液吸光度 が緩衝液のブランク値に達するまで平衡緩衝液で洗浄した。結合物を２０ミリモ ル／ａクエン酸、ｐＨ３，２で溶離した。

ロ比活性二着色試験（実施例４ｂを参照）における活性を試料のタンパク含有量 で割った。

ｂ）０．３モル／Ｑアルギニン、ｐＨ４，５による溶離復元調製物を実施例３． １．ａ）の方法で濃縮した。該濃縮物８００ｔｓＱを０．１モル／ＱトリスーＨ ＣＱ、ｐＨ７，５，０，８モル／Ｑアルギニン、０．５モル／ＱＮａＣＱで平衡 化したＥＴＩ−−１１！フアロース力ラム（２５ｉに　１２ＣＶ／ｈ）に入れ、 ２８０ｎｍの溶出液の吸光度が緩衝液のブランク値に達するまで平衡緩衝液で洗 浄した。該結合物を０．３モル／Ｑアルギニン、ｐＨ４，５で溶離した。

２、予め濃縮しないＥＴＩ−セファロース上でのアフィニティークロマトグラフ ィーによるイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来に２Ｐの精製再酸化調製物１２Ｑを 、Ｑ、　ｌ　モル／（ｌ　ｌ−リス−ＨＣＱ、ｐＨ７，５，０，８モル／ａアル ギニン、０．５モル／（ｌＮａＣ（ｌで平衡化したＥＴＩ−セファロースカラム （Ｖ＝１０３！（りに入れ、溶出液の吸光度が緩衝液の吸光度に達するまで平衡 緩衝液で洗浄した。該結合物をＯ６８モル／ρアルギニン、ｐＨ５でｍｍＬ、、 た。

ｌｉｐ、フィブリンによる刺激＝フィブリンの存在下での活性をフィブリンなし の活性で割った。

実施例４ 精製されたイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来に２Ｐの特性ＥＴＩ−セファロース 上でアフィニティークロマトグラフィーによって精製された調製物の等質性（ｈ ｏｍｏｇｅｎｅｉｔのを５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ ）によって証明した。相対的移動から原核生物由来に２Ｐの分子量を３８５００ ＋２０００　Ｄａと算出した。比重分析によると該調製物の純度は〉９５％であ った。

ＲＰ−ＨＰＬＣは、疎水性マトリックスを有するタンパクの種々の相互作用に基 づいている。この特性を、純度を定量化する分析方法として用いた。

精製したイー・コ１バＥ、ｃｏｌｉ）由来に２Ｐの分析は、トリフルオロ酢酸／ アセトニトリル勾配液（緩衝液Ａ：Ｈ，０１０００ｉ（中トリフルオロ酢酸１． ２Ｊ！；緩衝液Ｂ　：　ＨｔＯ３００ｒｉＱ、　７　セ）　＝　）リル７００ｘ ｆｆ、トリフルオロ酢酸１村；０〜１００％）を用いて、ヌクレオジル（Ｎ　ｕ ｃｌｅｏｓｉｌ）　３００分離カラム［ナウアー（Ｋ　ｎａｕｅｒ）］上で行っ た。クロマトグラフ分析の積分によって純度〉９５％が得標準プログラムおよび オンラインＰＴＨ検出を有するＡＢＴ　４７０シークエンサーを用いてＮ−末端 アミノ酸配列を決定した。決定した配列Ｓ　１−Ｙ２−Ｇ３−Ｇ４−Ｎ５−Ｓ　 ６−Ｄ７−Ｃ８−Ｙ９は、ＤＮＡ配列から誘導された予想配列と一致した。

ｂ）活性測定 「ツァイトシュリフト・フユール・ジー・ゲサムテ・インネレ・メディツィン（ Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆｔ１ｒ　ｄｉｅ　ｇｅｓａｍｔｅ　１ｎｎｅｒｅ　 ＭｅｄｉｚｉｎＪ（Ｚ　Ｇ　Ｉ　ＭＡ　Ｌ）　４２　（１７）　４７８−４８６ 　（１９８７）ニおける試験指示に従って、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来に ２Ｐのｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性を測定した。

比活性は５５００００　１Ｕ／ｍｇ±２０００００　１Ｕ／ｘｇであった。

ＢｒＣＮ−フィブリノーゲンフラグメントによるこの試験システムに、おけるイ ー・コ１バＥ　、　ｃｏｌ　ｉ）由来に２Ｐの刺激力（フィブリノーゲンフラグ メント存在下の活性をフィブリノーゲンフラグメント非存在下の活性で割った） は、〉２５であった。

Ｃ）フィブリンとのインビトロ結合 ヒギンズおよびベハー「ディー・エル・ヒギンズ（Ｄ、　Ｌ、　Ｈ１ｇｇ１ｎｓ ）およびジー・ニー・ベハー（Ｇ、　Ａ、　Ｖｅｈａｒ）、バイオケミストリー て、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来に２Ｐとフィブリンとのｉｎ　ｖｉｔｒｏ 結合を測定した。

第２図から、ＣＨＯ由来ｔ−ＰＡまたはイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来ｔ−Ｐ Ａと比較してイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来に２Ｐがフィブリンへの有意な結 合を示さないことが分かった。

実施例５ 発現産生物の収量を増すために、Ｋ２Ｐ−遺伝子をフードしている配列を高いコ ピー数のプラスミド中でサブクローンした。このために、西ドイツ特許出願ＤＥ 　３８　３８　３７８．０に開示されているプラスミドｐｅＰａ１２６．１を用 いた。このプラスミドは、主に、ベクターｐＫＫ２２３−３および欧州特許出願 ＥＰ−Ａ　Ｏ２４２８３５に開示されているｔ−ＰＡ暗号配列からなっている。

ｆｄ−ターミネータ−配列を、まず、このプラスミド中に組込んだ。

このために、該プラスミドｐｅＰａ１２６．１を制限酵素ＨｉｎｄｎＩで線形化 した。この方法で開裂したプラスミドをゲル電気泳動によって分離し、予備的に 単離した。プラスミドｐＬＢＵ１［ベック（Ｂｅｃｋ）ら、（１９７ｇ）、Ｎ　 ｕｃｌ、　Ａ　ａｉｄｓ、　Ｒｅｓ、、５．４４９５−４５０３　：ゲンッ（Ｇ ｅｎｔｚ）ら、（１９８１）　ＰＮＡＳ　７ｇ　（８）　：　４９６３］を旧ｎ ｄ　ＩＩＩで開裂し、ｆｄ−夕−ミ不一ターを含有する約３６０ｂｐのＨｉｎｄ ＩＩｌフラグメントをゲル電気泳動およびゲル溶離によって予め単離した。線形 化プラスミドｐｅＰＡ　１２６．１およびｐＬＢＵ１由来３６０ｂｐ　Ｈｉｎｄ 　Ｉ［［フラグメントをライゲートした。イー・フリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ ２１０２において、西ドイツ特許出願ＤＥ　３８　３８　３７８．０に開示され ているプラスミドｐｕＢｓ　５００でライゲーション調製物を同時形質転換した 。該クローンから、第２のＨｉｎｄｎｌ開裂部位を含有する点で出発プラスミド ｐｅＰＡ１２６．１とは異なる所望のプラスミドｐｅＰＡ　１２６　ｆｄを含有 するものを選択した。

該プラスミドｐｅＰＡ　１２６　ｆｄから２つのフラグメントを単離した：３． ４ｋｂの大きさのＢａｍＨＩ／ＰｖｕＩ−フラグメントおよび１゜３ｋｂの大き さのＰｖｕｌ／Ｘ…ａＩフラグメント。これら両フラグメントをプラスミドｐＡ ２７．３由来の約１　、３　ｋｂのＢａａ＋ＨＩ／ＸｍａＩフラグメントでライ ゲートし、プラスミドｐＵＢＳ　５００でイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に形質 転換した。得られたプラスミドをｐＡ２７ｆｄと命名し、ＥｃｏＲＴによる制限 消化において、長さ約６１０ｂｐのｐｅＰＡ　１２６　ｆｄ由来の第２の最小Ｅ ｃｏＲＩフ２グメントがｐＡ２７ｆｄにおいては短い方の約５１５ｂｐである点 でｐｅＰＡＩ２６　ｆｄとは区別することができる。

実施例６ 原核生物中で発現したｔ−ＰＡＡ導体に２Ｐの薬理学的効果１、ウサギにおける に２Ｐの薬物動力学ニューシーラント白ウサギにおいて、Ｋ２Ｐの薬物動力学特 性をアクティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓｅｌｌ）のものと比較した。両フィブリン溶 解薬物を２０００００　ＴＵ／ｋｇ体重の投与量で３０分間注射した。該注射の 前、間および後の所定時間に血漿試料を採取した。ジェイ・エイチ・フェルハイ エン（Ｊ　、　Ｈ、Ｖ　ｅｒｈｅｉｊｅｎ）ら［スロンボウシス・アンド・ヘモ ステイシス（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、）、赳、２６６．１９８２ ］の分光光度試験を、エイチ・リル（Ｈ，Ｌｉ１ｌ）（Ｚ、ｇｅｓ、　ｒ　ｎｎ 、Ｍｅｄ。

エイチ・ライ・ファンク（Ｈ，Ｙ、　Ｈｕａｎｇ）［ニーローアストロナラティ クス−レポート（Ａ　ｅｒｏ　−Ａ　５ｔｒｏｎａｕｔｉｃｓ　−Ｒｅｐｏｒｔ ）　６４、ライス・ユニバーシテ！　（Ｒｉｃｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、１ −３０．１９６９コに従って変えた非線形回帰用のコンピュータープログラムを 用いて、薬物動力学パラメーターを計算した。二指数の薬物動力学モデルを用い て、該パラメーターを別々に算出した。

Ｋ２Ｐは、アクティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓｅ”）　［）−メ・カンパニー（Ｔｈ ｏｍａｅ　ｃｏｍｐａｎｙ）のｔ−ＰＡ調調製物上りも５倍長い半減期を呈する （ｔ　１／２α＝１０．３分、血漿中の濃度の低下）（第１表、第５図および第 ６図）。Ｋ２Ｐ７Ｐｒｏによる注射の最後に（３０分後）、１９８６ＩＵ／ｘＱ のｔ−ＰＡ活性の血漿濃度（ｃ　ｔｎｒ）を測定した結果、アクティリセ（Ａｃ ｔｉｌｙｓｅｌｌ）によって得られるものよりも６倍高かった。中心成分の分配 量（ＶＣ）は、アクティリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＲ）に関して７３．７ｉり／ ｋｔｔであるのに比べてに２Ｐに関しては４６．　Ｂｘρ／に９であった。Ｋ２ Ｏ−Ｐｒｏの合計血漿クリアランス（Ｃ１，。、）は、アクティリセ（Ａｃｔｉ ｌｙｓｅＩＩＸＣＩｔ、＋＝　２２．２杼／分／ｋｇ）と比較して、１／７（Ｃ １，。、＝３．２ｆｆ１２／分／に９）に減少した。ポーラス注射としてフィブ リン溶解薬物を投与すると、［曲線下面積Ｊ（ＡＵＧ）によって主な血漿濃度の 経時変化を比較できるので、これは特に興味深い。

Ｋ２Ｐは、アクティリセ（ＡｃｔＮｙｓｅＲ）（１３３，３１Ｕ／ｘρｘｈ）よ りも８倍高イＡＵｃ（１０６４Ｉ　Ｕ／ｘｃＸｈ）を有する。

Ｋ２Ｐは、概して、現在市販の入手可能な唯一の組換えｔ−ＰＡ−タンパクであ るアクティリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＲ）と比較して同一投与量で５倍〜８倍良 好な薬物動力学プロフィルを示す。

２、ウサギにおけるに２Ｐの薬理学 ディー・コレン（Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ）ら［ジャーナル・オブ・クリニカル・イン ベスティグーション（Ｊ　、　ＣＩｉｎ、　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、　）、■、３６８ ．１９８３コによって確立された頚静脈モデルを用いて、血栓崩壊性効果を実験 した。Ｋ２Ｐとアクティリセ（ＡｃｔｉｌｙｓｅＲ）を、各々、３種類の投与レ ベルで試験した。フィブリン溶解薬物を４時間注入し、その後、血栓崩壊率を測 定した（第２表、第５図）。

線形回帰線によって、血栓崩壊率５０％の投与ｆｉ（ＥＤ、。）がに２Ｐについ ては１２４０００　Ｉ　Ｕ／に９体重であり、アクテイリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓ ｅ）については５２００００　ＩＵ／ｋｇ体重であると計算された。すなわち、 Ｋ２Ｐは、アクティリセよりも４倍高い血栓崩壊活性を示す。

Ｋ２Ｐは、アクティリセ（ＡｃｔｉｌｙｓｅＲ）と比較して４倍低い投与量でｔ −ＰＡ活性の投与量−依存性血漿濃度を達成した。８００　ＫＵアクティリセ（ Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅり／　ｋｇ体重に匹敵する血栓崩壊活性を有する２００　Ｋ Ｕ　Ｋ２Ｐ／に９体重の投与量は、凝固パラメーター、すなわちフィブリノーゲ ン（プラスミノーゲンおよびα、−抗プラプラスＰはｔ−ＰＡ突然変異タンパク であり、投与量がアクテイリセ（Ａｃｔｉｌｙｓｅ″）投与量の４分の１に減少 すると、血栓崩壊性薬物の４時間注入においてウサギの頚静脈血栓モデルにおい てアクテイリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅ′ａ）と同一の血栓崩壊活性を有する。こ の減少した投与量でに２Ｐは、凝固系への効果およびｔ−ＰＡ活性の血漿濃度に おいてアクティリセ（ＡｃｔｉｌｙｓｅＲ）と相異しない。

第１表 ｔ−ＰＡ−活性に基づ＜ｔ−ＰＡ血漿濃度一時間データのコンピュータに２Ｐ、 アクティリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＲ）および溶媒の血栓崩壊性、ｔ−ＰＡ血漿 活性のレベル（４時間注射の後）、および止血バラメー平均値士標準誤差平均（ ＳＥＭ）：ｋＵ＝１０００　１０゜止血−パラメーター（基本線に関する％）実 施例７ 冠状動脈血栓に関するイヌモデルにおけるイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来に２ Ｐの薬理学的特性 動脈血栓へのイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来に２Ｐの血栓崩壊性効果を試験す るための例として、動物における急性心筋梗塞に関する実験モデルを選択した。

動物種としてイヌを選択した。冠状動脈血栓の形成方法は、ロンソン（Ｒｏｍｓ ｏｎ）ら［スロンボウシス・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、）　１７．８ ４１．１９８０］の技術の変形であった。人工的に呼吸している麻酔されたイヌ の開放された胸郭において、左回旋冠状動脈（ＬＣＸ）のラムス技の内膜面を電 気的に刺激しく１５０μＡ）、これによって血栓を生起させた。実験的狭窄によ る反応性充血を除去するために、予め、血栓症に対して遠位的にスクリューを適 用した。再潅流を測定することができるように、冠状動脈血栓症に対して近位的 に、ＬＣＸに電磁流測定ヘッドを装着した。

投与量を決定するための研究において、４種類の投与量における原核生物ｔ−Ｐ Ａ［アルテプラーセ（Ａ　１ｔｅｐｌａｓｅ）、アクテイリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙ ｓｅ”）、ドクター・カール・トーメ・ゲゼルシャフト・ミント・ベシニレンク テル・ハフラング（Ｄｒ、　Ｋａｒｌ　Ｔｈｏｍａｅ　ＧｍｂＨ）、ビベラッハ 、ドイツ連邦共和国］およびプラシーボを有する８Ｍ０６．０２２を、ヘパリン 化したイヌに、１分間かけて最初の単一静脈内ボーラスとして注射した；６匹の 動物に、各投与量で注射した。注射前および注射後の指定された時間に血漿試料 を採取し、ｔ−ＰＡ活性ならびにフィブリノーゲン、プラスミノーゲンおよびα 、−抗ブラスミンの血漿濃度、さらに、全血中の栓球の数を測定した。フィブリ ノーゲンは、クラウス（Ｃ１ａｕｓｓ）　［アクタ・ヘマトロジ力（Ａｃｔａ　 ｈａｅｍａｔ、）　１７．２３７．１９５７コに従って凝固分析的に測定し、プ ラスミノーゲンおよびα、−抗ブラスミンは、コレン（Ｃｏｌｌｅｎ）ら［ジャ ーナル・オブ・クリニカル・インベステイグーション（Ｊ、Ｃ１１ｎ、　Ｉ　ｎ ｖｅｓｔ、）　７１．３６８．１９８３］に開示されているように分光分析的に 測定した。さらに、「シンプレート出血時間（Ｓ　ｉｍｐｌａｔｅ　ｂｌｅｅｄ ｉｒ＋ｇ　ｔｉｍｅ）Ｊは、４０ｘｘＨｇの静脈うっ血の間にランセット［シン プレート（Ｓ　ｉｍｐｌａｔｅＲ）　Ｉ　、オルガノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎ ｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ）、エソベルハイム、ドイツ連邦共和国］を用いてイヌの 後ろ脚で測定した［ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（Ｊ、Ｓｕｒｇ、 Ｒｅｓ、）　２７．２４４．１９７９］　。注射後の測定値と注射前の対照値と の統計学的な比較を、１組の相異点について、ウイルコクシン・テスト（Ｗｉｌ ｃｏｘｏｎ　Ｔｅ５ｔ）を用いて行った。

血栓崩壊性効果を説明するために、投与グループ当たりの再濯流化動物の数（− 再潅流率）および再潅流までの時間（＝再潅流時間）を挙げた。さらに、注射の ２時間後にまだ存在している残留血栓の湿重量を測定し、再潅流後に再閉塞を有 する動物の数（＝再閉塞率）を測定した。投与量−効果（再潅流率）関係の半対 数回帰分析によって、再潅流率５０％のための有効投与量（＝ＥＤ、。）を各物 質について測定した。無関係の任意の試料について、ウイルコクソンーマンーホ イットニー・テスト（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｔｅｓ、 ｔ）を用いて、残留血栓の重量の統計学的比較を行った。

ｔ−ＰＡ活性の血漿濃度は、ヘルハイエン（Ｖ　ｅｒｈｅ　ｉ　ｊｅｎ）ら［ス ロンポウシス・アンド・ヘマステイシス（Ｔｈｒｏｉｂ、’Ｈａｅｍｏｓｔ、） 　４ｇ、２６６．１９８２］に従って、リル（Ｌｉｌｌ）　［Ｚ、ｇｅｓａｍｔ ｅ　Ｉ　ｎｎ、Ｍｅｄ、　４２．４７８．１９８７］に従って変形した分光分析 試験で測定した。エイチ・ライ・ファンク（Ｈ，Ｙ、　Ｈｕａｎｇ）　［エーロ ルアストロナラティクス−リポ−）　（Ａｅｒｏ−Ａｓｔｒｏｎａｕｔｉｃｓ− Ｒｅｐｏｒｔ）　６４１．ライス・ユニバージティー（Ｒｉｃｅ　Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ）、アメリカ合衆国、■−３０，１９６９］に従って変形した非線形回 帰に関する計算プログラムを用いて、薬物動力学パラメーターを算出した。該パ ラメーターは、得られた測定値からｔＴＰＡ活性の内因性基本レベルを引いた後 、二指数の薬物動力学モデルを用いて別々に算出した。

以下の結果を得た： １、イヌにおける薬理学 に２Ｐによって、静脈内注射後の投与量−依存性再潅流を得た。

２００ｋＵ／ｂ体重の注射の後、最大効果（再潅流率１００％）が達成された。

アクティリセ（ＡｃｔｉｌｙｓｅＲ）による再潅流において成功率ｉｏｏ％の投 与量：よ、１６００　ｋＵ／に９体重であった。ＥＤ、。値の比較の結果、アク ティリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅｌｌ）（Ｅ　Ｄ　ｓｏ＝　９６１　ｋＵ／　ｋｇ 体重）よりもに２Ｐ（ＥＤ５゜＝８３ｋＵ１ｋｇ体重）のほうが１１．５倍低イ 値であった。ブラシーボの投与の結果、再潅流は得られなかった。ブラシーボ動 物における残留血栓の重量は、９，６±１．６３＋９（平均±ＳＥＭ）であり； 　Ｋ２Ｐならびにアクティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓｅりは、ブラシーボ対照と比較 して、投与量の増加に伴って、残留血栓の重量を統計学的に有意に減少させた。

全動物にわたる平均として、Ｋ２Ｐについては２５．９±３．５分後、またはア クティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓｅりについては２４．２±６．２分後、両フィブリ ン溶解剤で潅流が生じた。Ｋ２Ｐまたはアクティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓｅｌｌ） で処置したイヌのほとんどが、再潅流後に再閉塞した（第３表）。

２、盃ヱμ声ける薬物動力学 ２００　ｋＵ／に９に２Ｐまたはアクティリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＲ）の静脈 内注射の後、ｔ１２．αで表した血漿濃度の減少の急速な相は、アクティリセ（ ＡｃｔｉｌｙｓｅＲ）の１．６±０．２分よりもに２Ｐの７．２±１．１分の方 が４．５倍長い因子についてであったことがわかった（第４表）。

注射の終了直後に測定したに２Ｐの血漿濃度は、アクティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓ ｅ”）の約２倍の高さであった。血漿からのに２Ｐのクリアランス（血漿クリア ランス＝Ｃ１，。１）は、アクティリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＲ）よりも９倍遅 かった。同様に、Ｋ２Ｐの血漿濃度一時間曲線下面積は、アクティリセ（Ａｃｔ ｉｌｙｓｅＲ）よりも約９．５倍大きかった。

３、イヌにおけるフィブリン特異性 に２Ｐの注射の２時間後、最も高い投与量（２００ｋＵ／に９体重）でフィブリ ノーゲンの残留濃度において８１±１０％までの投与量−依存性の僅かな減少が あった。対照的に、フィブリノーゲン濃度は、アクティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓｅ ”Ｘｌ　６００　ｋＵ／に９体重）の最大投与量の投与後、３ｔ０％までほとん ど完全に減少した（第５表）。投与量−副作用（フィブリノーゲン減少）関係の 半対数回帰分析を行い、血栓崩壊性効果に関するＥＤ、。に対応するフィブリノ ーゲンの残留濃度を測定すると、等能投与量に関し、フィブリノーゲンの残留含 有率がアクティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓｅｌｌ）の３８．６％と比較してに２Ｐは ９２．５％であった。注射の２時間後のプラスミノーゲンおよびα。

−抗プラスミンの残留含有率の投与量−依存性低下もあり、Ｋ２Ｐによるよりも アクテイリセ（ＡｃｔｉｌｙｓｅＲ）による方がより多く断言される。血小板の 濃度だけは、２つの物質によって実質的には影響さに２Ｐの静脈内注射の結果、 研究した４種類の全ての投与量で注射する前の対照・ｌと比較して出血時間の統 計学的に有意な増加は得られなかった。反対に、アクティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓ ｅ”）は、１１３０および１６００　ｋＵ／ｋｇ体重の投与量で統計学的に有意 な出血時間を増加させた（第６図および第７図）。

５、全体的な評価 イヌにおける冠状動脈血栓について記載したモデルにおいて、Ｋ２Ｐは、フィブ リノーゲン濃度への大きい影響を伴わずに、そして、出血時間の有意な増加を伴 わずに１００％の再潅流率を達成することができる血栓崩壊性薬物であることが 証明された。Ｋ２Ｐは従来技術のアクティリセ（ＡｃｔｉｌｙｓｅＲ）と比較し て静脈内ポーラス注射後の血栓崩壊力において明らかに優れていた（１１．５の ファクター）。

さらに、Ｋ２Ｐの薬物動力学的プロフィルの研究によって、アクティリセ（Ａ　 ｃｔ　ｉ　ＩｙｓｅＲ）と比較して、Ｋ２Ｐのクリアランスが血漿からの遅いク リアランスの発現の９倍遅いことがわかった。

第３表 ブラシーポまたは増加投与量のアクティリセ（Ａ　ｃｔｉｌｙｓｅＲ）もしくは に２Ｐの静脈内ポーラス注射（１分間かけて）後のイヌにおける冠状平均±ＳＥ Ｍ 第４表 アクティリセ（ＡｃｔｉｌｙｓｅＲ）またはに２Ｐ　２０ＱＯＯＯＴＵ／に９体 重の静脈内ポーラス注射後の麻酔したイヌにおけるｔ−ＰＡ活性に基づく血漿濃 度一時間データのコンピューター計算から導かれた薬物動力学ノツ平均上標準偏 差 Ｃ１，。、　−合計血漿クリアランス。

Ａ　Ｕ　Ｃａｘｔｒａｐ。□　＝「曲線下面積」；血漿濃度一時間曲線の下の補 性面積。

第５表 イヌにおける冠状動脈血栓症に関するモデルにおけるブラシーボまたは増加投与 量のアクティリセ（Ａｃｔｉｌｙｓｅｌｌ）もしくはに２Ｐの静脈内ポーラ平均 ±ＳＥＭ 凝固に関する値および栓球数は、注射前の初期値の％とじて表す。

ｆ’；”’テアーゼドメインＣＰ＞ を士　ム ７口　口 ＩＵ／ｍ１ Ｔｌｌ／ｍｌ ＦＩＧ、５ 溶解 投与量ｉｋＵ／ｋｇｌ 田粉蝉査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）グリコシル化されておらず、アミノ基末端においてＭにより延長されるこ とのできる下記アミノ酸配列：（Ｍ） 【配列があります】 を含むことを特徴とする組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）の誘導体 。 （２）請求項（１）記載のｔ−ＰＡ誘導体をコードしている、下記配列： 【配列があります】 を含むことを特徴とするＤＮＡ配列。 （３）請求項（２）記載のＤＮＡ配列または請求項（１）記載のタンパクをコー ドしている遺伝暗号の縮重の範囲内の異なるＤＮＡ配列を含むことを特徴とする 発現プラスミド。 （４）プラスミドｐＡ２７．３。 （５）プラスミドｐＡ２７ｆｄ。 （６）全ｔ−ＰＡタンパクまたはｔ−ＰＡタンパクの他の領域ならびにクリング ルＩＩおよびプロテアーゼドメインを含有するその誘導体をコードしているＤＮ Ａ配列をプラスミドに組込み、請求項（１）記載のｔ−ＰＡ誘導体中に存在しな いアミノ酸をコードしているこれらのドメインを指定部位突然変異によって欠失 させることを特徴とする請求項（３）〜（５）のうちの１つに記載のプラスミド を構築する方法。 （７）ｔ−ＰＡタンパクまたはその誘導体に関するＤＮＡ配列として、対応する ｃＤＮＡを使用する請求項（６）記載の方法。 （８）プラスミドｐＡ２７．３およびプラスミドｐＡ２７ｆｄを使用する請求項 （６）または（７）記載の方法。 （９）請求項（３）〜（５）のうちの１つに記載のプラスミドを適当な宿主細胞 に形質転換し、培養培地から、または宿主細胞の溶解後に、発現産生物を単離す ることを特徴とする請求項（１）記載のｔ−ＰＡ誘導体を産生する方法。 （１０）宿主細胞として、原核細胞、特にイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用す る請求項（９）記載の方法。 （１１）形成される「封入体」を単離し、グアニジン・塩酸塩で処理して溶解し 、次いで酸化型グルタチオンで誘導し、最後にＬ−アルギニンおよびＧＳＨの添 加によってｔ−ＰＡ誘導体を復元することによって活性タンパクの収量を増加さ せる請求項（１０）記載の方法。 （１２）復元の後、Ｋ２Ｐを復元調製物中で濃縮し、次いで、アフィニティーク ロマトグラフィーによってクロマトグラフィー精製を行う請求項（１１）記載の 方法。 （１３）１０〜１０００ミリモル／ｌＬ−アルギニンの存在下で行う請求項（１ ２）記載の方法。 （１４）１０〜１０００ミリモル／ｌ、好ましくは６００〜８００ミリモル／ｌ Ｌ−アルギニンを含有する復元調製物の濃縮物を用いるクロマトグラフィー精製 をＥＴＩ吸着カラムによって行う請求項（３）記載の方法。 （１５）クロマトグラフィー精製に使用する濃縮物をｐＨ７．５〜８．６に調節 する請求項（１４）記載の方法。 （１６）ｐＨ３〜５．５で溶離を行う請求項（１４）または（１５）記載の方法 。 （１７）請求項（１）記載のｔ−ＰＡ誘導体を含有するフィブリン溶解治療用薬 物。