JPH04252197A - カテコール、カテコール生成物質、またはカテコールの生成を触媒する酵素をアッセイするための分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臨床分析に関するもので
あり、特に、カテコール、カテコール生成物質、例えば
サリチレートおよびカテコールの生成を触媒する酵素を
アッセイするための方法ならびにその要素に関する。

【０００２】

【従来の技術】カテコール生成物質（生物学的流体、例
えばヒト血清中のサリチレート）の測定は、診断上有意
義である。アセチルサリチル酸（アスピリン）は、鎮痛
薬としてならびに関節炎の抗炎症薬として使用される。 アセチルサリチル酸は治療効果を有するサリチル酸へ容
易に加水分解する。鎮痛薬としての治療濃度は２０ｍｇ
／ｄｌまでである。関節炎に対する濃度は３０ｍｇ／ｄ
ｌまでである。より高いサリチレート濃度では、酸−塩
基濃度の不均衡による結果として、頭痛、耳鳴、潮紅お
よび過呼吸のような問題が生ずる。６０ｍｇ／ｄｌを越
えるサリチレート濃度は死に致らしめることができる。

【０００３】あるサリチレートアッセイ方法は、ＮＡＤ
Ｈから　ＮＡＤ＋　への転化を伴うサリチレートヒドロ
キシラーゼにより触媒されるサリチレートからカテコー
ルへの酵素的転化を用いる。　３４０ｎｍでの光学濃度
の変化に反映されるＮＡＤＨの消失とサリチレートの濃
度の間には、量的な相関がある（ＹｏｕおよびＢｉｔｔ
ｉｋｏｆｅｒ，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．，　３０：１
５４９，　１９８４）　。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】課題は、低いｐＨでＮ
ＡＤＨが不安定であることおよびＮＡＤＨの低い吸光係
数により、長時間保管される乾式フォーマットへ組み込
むのに、この方法は適当ではないことである。

【０００５】サリチレートの測定に用いる既存方法の他
の課題としては、ＮＡＤＨ法の低感度、通常血清中に存
在するフェノール系およびケト酸、塩化第二鉄に由来す
る妨害、時間のかかる手順、サリチレートが結合したタ
ンパク質が測定不可能であること（遊離サリチレートの
みイオン選択性電極で測定）、もしくは乾式フォーマッ
トに不適当であることが挙げられる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、カテコール生
成物質、例えばサリチレートを含めた、カテコールおよ
びカテコールの生成を触媒する酵素の比色的定量アッセ
イ方法を提供する。上記方法は、 ａ）カテコール、カテコール生成物質、例えばサリチレ
ートもしくはカテコールの生成を触媒する酵素を含むこ
とが推測される試料を提供する工程；ならびにｂ）この
試料をＮＡＤＨ、チロシナーゼ、および無色ロイコ染料
と混合する工程；またはｉ）ｂ）の混合物を、酵素、例
えばサリチレートヒドロキシラーゼ（カテコール生成物
質からカテコールへの転化を触媒するのに選ばれる）を
混合する工程；もしくはｉｉ）　ｂ）の混合物を、カテ
コールを生成する酵素基質と混合する工程；ｃ）カテコ
ール、カテコール生成物質、例えばサリチレート、もし
くは酵素基質よりカテコールの生成を触媒する酵素の試
料中に存在する量を比色的に測定する工程；を含んでな
る。

【０００７】また、本発明は、いずれかのカテコール生
成物質、例えばサリチレートを包含する、カテコールも
しくはカテコール生成物質（酵素基質）よりカテコール
の生成を触媒する酵素をアッセイするための分析要素も
提供する。上記要素は、チロシナーゼを含む層およびＮ
ＡＤＨを含む別の層ならびにどちらかの層に無色状ロイ
コ染料を含んでなる。

【０００８】上記アッセイがそのようなカテコール生成
物質に向けられる場合、ＮＡＤＨを含まない層は、ＮＡ
ＤＨを用いる反応によりカテコールの生成を触媒するの
に選択される酵素を含む。また、アッセイの目的が特定
の酵素である場合には、上記要素は特定の酵素に対する
基質を含む。サリチレートヒドロキシラーゼの基質、サ
リチレートのアッセイには、サリチレートヒドロキシラ
ーゼを要素中へ包含することが、本発明のこの観点の好
ましい態様である。

【０００９】さらに、本発明は、 ａ）ＮＡＤＨを含む層、ならびに ｂ）チロシナーゼおよび無色ロイコ染料を含む別の層、
の少なくとも２層を担持する支持体を含んでなる、サリ
チレートを定量的にアッセイするための乾式多層分析要
素も提供する。また、アッセイしようとする試料にサリ
チレートヒドロキシラーゼを添加する工程を省略するこ
とによりアッセイが実施される場合、この要素はサリチ
レートヒドロキシラーゼを含む。

【００１０】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
は、サリチレート、カテコールおよび他のカテコール生
成物質をアッセイする方法およびその分析要素を提供す
る。上記方法および要素は一連の酵素的転化に基づいて
いる。関係する化学反応はサリチレートを用いて具体的
に説明される。しかしながらこの一連の反応はカテコー
ルの分析に対する本明細書の教示に、それらの反応に使
用されるいずれか他のカテコール生成物質および酵素触
媒を容易に適用できることがすべての分析化学者に明ら
かであろう。

【００１１】ＮＡＤＨの存在下で、サリチレートヒドロ
キシラーゼはサリチレートをピロカテコールへ転化し（
反応式１）、ピロカテコールはチロシナーゼの存在下で
酸素によりＯ−キノンへ酸化される（反応式２）。次い
で、Ｏ−キノンは適当なロイコ染料の酸化により、また
は顕色剤およびカプリング剤の酸化的カプリングにより
色素を生じることで定量的に測定される（反応式３）。

【００１２】

【化１】

【００１３】カテコールのアッセイ要素の様式において
は、上記アッセイは、要素上への試料の簡単なスポット
により実施される。カテコール生成物質、例えばサリチ
レートをアッセイするための様式においては、酵素を要
素中に含んでもよく、または分析される試料に添加して
もよい。酵素をアッセイするための様式においては、酵
素基質を試料または要素に添加してもよい。上記アッセ
イは、動物もしくはヒトの、しかし好ましくはヒトの生
物学的流体において、定性的にも定量的にも実施できる
。限定されるものではないが、このような流体としては
、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊髄液、痰
および汗など、ならびに便分泌物が挙げられる。また、
ヒトの組織もしくは動物の組織、例えば骨格筋、心臓、
腎臓、肺、脳、骨髄および皮膚などの流体調製物もアッ
セイすることができる。

【００１４】サリチレート以外のカテコール生成物質の
具体例は既知である。例えば、Ｏ−ヒドロキシフェニル
ホスフェートはアルカリ性ホスファターゼもしくは酸性
ホスファターゼにより加水分解されてカテコールになる
。チロシンＯ−ホスフェートは前立腺の酸性ホスファタ
ーゼにより加水分解されうる。これらの加水分解により
、各々、Ｏ−ヒドロキシフェニルホスフェートおよびチ
ロシンを含む試料を定量的にアッセイできる。実際に、
酸性ホスファターゼは単一工程でアッセイできる。

【００１５】上記方法および要素で使用される種々の試
薬は市販されている。また、チロシナーゼも市販されて
いる。

【００１６】無色から測定可能な色へ変化するロイコ染
料はいずれも本発明で有用であろう。このような染料と
しては、トリアリールイミダゾール化合物およびトリア
リールメタン化合物が挙げられる。Ｏ−キノンおよびＯ
−キノン生成物質、例えばカテコールおよびサリチレー
トを検出するのに有用な色素を同定する方法は、米国特
許第　４，０８９，７４７号明細書に公表されている。 また、有用なロイコ染料が後者の特許に開示されている
。従って、目的の試験および実施容易な試験に使用する
上で、本発明に対して有用な物質として選択できるロイ
コ染料は、分析技術分野で周知である。特に有用な染料
はトリアリールイミダゾール類、トリアリールメタン類
および還元型インドフェノール類である。

【００１７】本発明の要素類は、いずれか所望の幅の延
伸テープ類、シート類、スライド類もしくはチップ類を
含む、種々の形の形状でありうる。

【００１８】要素は手動または自動化されたアッセイ技
術で使用できる。一般的に、要素の使用に際し、供給ロ
ール、チップパケットもしくは他の供給源から要素を取
り、そして要素を試験する液体（例えば、　２００μｌ
まで）試料と物理的に接触せしめることにより、上記試
料と試薬類が要素内で混合されて連続的に相互作用する
結果、アッセイが行われる。このような接触は、いずれ
かの適当な方法、例えば、要素を試料中へ浸漬するかま
たは浸すことにより、また好ましくは、手動もしくは機
械により適当な分配手段で一滴の試料を要素にスポット
することにより達成できる。

【００１９】試料の塗布後、発色を促進するためにその
要素は５分間以内インキュベーションされる。インキュ
ベーションとは、本発明者らは色調測定を行う前５分間
以内、試薬類を相互に接触した状態に維持することを単
に意味する。

【００２０】本発明の乾式分析要素は多層である。少な
くとも一層は、機能が当該技術分野で既知であるような
展開能を有する。これらの層には、本発明の方法で使用
される試薬類を含む。試薬類は、２つの異なる層にもし
くは２つの異なる区画に存在する。ＮＡＤＨは、どちら
の区画もしくは層にでも存在できるロイコ染料を除いて
、他の試薬類から隔てた区画もしくは層に存在する。前
述の層のすべてが支持体上に塗布される。一般に、これ
らの層は流体中で相互に接触しており、これは、流体、
試薬および反応生成物（例えば、着色色素）が、隣接区
画の重なった層の間を通過ならびに輸送できることを意
味する。換言すれば、要素を水性流体と接触せしめる場
合、本発明の分析組成物のすべての試薬類が前述のよう
に連続的に混合され、そして組成物のように要素中を容
易に移動できる。各層が分離しているか、または２つ以
上の区画が要素の単一層中で別々の領域にあってもよい
。また、上述に言及したものの他に、適当な要素成分は
、例えば、米国特許第　４，０４２，３３５号、同　４
，１３２，５２８号および同　４，１４４，３０６号明
細書にも記載されている。

【００２１】有用な展開層は、米国特許第　４，２９２
，２７２号明細書に記載されるような適当なバインダー
物質と混合したまたは織物として織られた繊維物質、ポ
リマー組成物もしくは粒状物質、米国特許第　３，９９
２，１５８号明細書に公表されるようなブラッシングポ
リマー、米国特許第　４，２５８，００１号および同　
４，４３０，４３６号明細書ならびに特開昭５７（１９
８２）−１０１７６０号公報に記載されるようなバイン
ディング接着剤と結合されているかもしくは結合されて
いないビーズを用いて製造できる。特に有用な展開層は
、硫酸バリウムもしくは二酸化チタンを含んでなる。一
般に試料を直接展開層に塗布するので、展開層は等方性
の多孔質であることが望ましく、これは、粒子間、繊維
間もしくはポリマー鎖間の相互に連結した空間もしくは
空隙により生ずる細孔が、層の各方向で同一であること
を意味する。

【００２２】それぞれの層は、透明な支持体、例えばポ
リエチレンテレフタレート上に塗布できる。他の支持体
は、当該技術分野において周知である。また、本発明の
要素は、一般に種々の製造上もしくは操作上有利に要素
へ添加される１種以上の別の添加剤を含むこともできる
。このような添加剤としては、界面活性剤、緩衝剤、溶
剤、硬化剤および当該技術分野に既知の他の物質が挙げ
られる。

【００２３】本発明の具体的な態様を請求項１および請
求項２との関係で以下に列挙する。

【００２４】３．上記アッセイが、カテコール生成物質
に対するものであって、工程ｂ）が、カテコール生成物
質からカテコールへの転化を触媒するのに選ばれる酵素
を含んでなり、そして工程ｃ）が、カテコール生成物質
の比色的測定である請求項２記載の方法。

【００２５】４．上記カテコール生成物質が、Ｏ−ヒド
ロキシフェニルホスフェートもしくはチロシンＯ−ホス
フェートからなる群より選ばれる請求項３記載の方法。

【００２６】５．ａ）サリチレートを含むことが推測さ
れる試料を供給する工程； ｂ）試料をＮＡＤＨ、サリチレートヒドロキシラーゼ、
チロシナーゼおよび無色ロイコ染料と混合する工程；な
らびに ｃ）比色的測定により試料中に存在するサリチレートの
量を測定する工程；を含んでなるサリチレートの比色的
定量アッセイ方法。

【００２７】６．列挙された化学薬品のそれぞれが、ａ
）ＮＡＤＨおよびサリチレートヒドロキシラーゼ；ｂ）
チロシナーゼ；次いで ｃ）無色状ロイコ染料；の順序で試料へ添加される請求
項５記載の方法。

【００２８】７．工程ｂ）の列挙された化学薬品が、ａ
）１〜２．０ｍＭ／ｍｌ　　ＮＡＤＨ；ｂ）２０〜３０
０　Ｕ／ｍｌサリチレートヒドロキシラーゼ；ｃ）５０
〜１０００Ｕ／ｍｌチロシナーゼ；およびｄ）０．２〜
１０μｇ／ｍｌ無色ロイコ染料；の濃度で試料と混合さ
れる請求項５もしくは請求項６記載の方法。

【００２９】８．ＮＡＤＨおよびサリチレートヒドロキ
シラーゼが、１：１の割合で試料へ混合される請求項５
もしくは請求項６記載の方法。

【００３０】９．上記無色ロイコ染料が、トリアリール
イミダゾール類、還元型トリアリールメタン類および還
元型インドフェノール類からなる群より選ばれる請求項
１もしくは請求項２記載の方法。

【００３１】１０．　上記無色ロイコ染料が、２−（４
−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５
−ビス−（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾール
である請求項５もしくは請求項６記載の方法。

【００３２】１１．　上記アッセイが、ｐＨ６〜８．５
の範囲内で実施される請求項５もしくは請求項６記載の
方法。

【００３３】１２．　ａ）ＮＡＤＨを含む層、ならびに
ｂ）チロシナーゼおよび無色ロイコ染料を含む別の層、
の少なくとも２層を担持する支持体を含んでなるサリチ
レートを定量的にアッセイするための乾式多層分析要素
。

【００３４】１３．　また、ｂ）の別の層もサリチレー
トヒドロキシラーゼを含んでなる請求項１２の乾式多層
分析要素。

【００３５】１４．　上記アッセイが、カテコール生成
物質よりカテコールの生成を触媒する酵素に向けられ；
工程ｂ）の混合物を酵素に対する酵素基質と混合し、そ
して工程ｃ）で比色的に酵素の活性を測定する請求項２
記載の方法。

【００３６】

【実施例】以下の例は本発明の改良された特徴を明らか
に立証するものである。下記の例で用いられる界面活性
剤、ＴＸ−１００　、ＴＸ−４０５　、１０Ｇ、アルカ
ール（Ａｌｋａｎｏｌ）ＸＣおよびゾニル（Ｚｏｎｙｌ
）ＦＳＮおよび酵素、チロシナーゼならびに他の化学薬
品は、すべて市販されている。 トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ＴＸ−１００）
およびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−４０５（ＴＸ−４
０５）はロームアンドハス、（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａ
ａｓ）　から市販され；ペルオキシダーゼおよびチロシ
ナーゼは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）　から市販されている
。使用したロイコ染料は、２−（４−ヒドロキシ−４，
５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジメチ
ルアミノフェニル）イミダゾールであった。特にことわ
らない限り、すべての他の物質は、イーストマン　　コ
ダック　　カンパニー（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　
Ｃｏｍｐａｎｙ）　で調製されたか、またはそこから得
られたものである。

【００３７】例１：本発明の要素上のサリチレート濃度
の測定 本例で使用した要素は下記の配置および試薬含有量を有
した。

【００３８】

【表１】

【００３９】１，２，４，６および１０ｍＭ／リットル
のサリチル酸ならびにＮＡＤＨを含む一連の個別溶液を
、容量比１：１で組み合わせた。得られたものは、表Ａ
に示される０．５，１．０，　２．０，３．０および５
．０ｍＭ／ｍｌのサリチル酸ならびにＮＡＤＨを含む一
連の試験溶液であった。カラムＡに記載された溶液を、
各々　１００Ｕ／ｍｌのサリチレートヒドロキシラーゼ
を含む溶液１．０ｍｌと組み合わせた。得られた溶液を
、各々前述の配置および試薬含有量を有する個別の乾式
分析要素上にスポットした。６７０ｎｍ　における各々
の溶液の反射率濃度を表Ａに示す。

【００４０】

【表２】

【００４１】上記反射率濃度は、本発明の方法および要
素が、水性流体中のサリチレートをアッセイするのに非
常に適することを示す。この同一の要素を用いて実施さ
れる他の例は、要素が、カテコール生成物質を包含する
、カテコールをアッセイするのにすべて非常に適するこ
とを示す。

【００４２】例２：本発明の方法を具体化する別の要素
の実施態様を下記に示す。

【００４３】

【表３】

【００４４】一連の溶液を０．２，１．４，２．９，　
４．３，５．８および７．２ｍＭ／リットルのサリチル
酸（ナトリウム塩）を含有するように調製した。溶液を
、各々前述の配置および試薬含有量を有する個別の乾式
分析要素上にスポットした。　６７０ｎｍでの各溶液の
反射率濃度を表Ｂに示す。

【００４５】

【表４】

【００４６】再度、反射率濃度は本発明の方法および要
素が水性流体中のサリチレートをアッセイするのに非常
に適することを示す。

【００４７】

【発明の効果】色素の測定が行われるので、本発明の方
法および要素はＮＡＤＨの消失を測定することに付随す
る課題を取り除く。従って、　３４０ｎｍでのＮＡＤＨ
の不安定性および低い吸光度係数は、アッセイ制限要因
としては取り除かれる。さらに、上述した多くの他の課
題は改良または完全に取り除かれる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　チロシナーゼを含む層およびＮＡＤＨ
   を含む別の層ならびにどちらかの層に無色状ロイコ染料
   を含んでなる、いずれかのカテコール生成物質を包含す
   るカテコールをアッセイするための分析要素。
2. 【請求項２】　　ａ）いずれかのカテコール生成物質を
   包含する、カテコールを含むことが推測される試料を供
   給する工程 ｂ）試料をＮＡＤＨ、チロシナーゼ、および無色ロイコ
   染料と混合する工程；ならびに ｃ）比色的測定により試料中に存在するカテコールの量
   を測定する工程；を含んでなる、いずれかのカテコール
   生成物質を包含する、カテコールの比色的定量アッセイ
   方法。