JPH0425763A - グルタチオンS―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬 - Google Patents
グルタチオンS―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬Info
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- JPH0425763A JPH0425763A JP13104690A JP13104690A JPH0425763A JP H0425763 A JPH0425763 A JP H0425763A JP 13104690 A JP13104690 A JP 13104690A JP 13104690 A JP13104690 A JP 13104690A JP H0425763 A JPH0425763 A JP H0425763A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は改良定量方法ならびに臨床診断用試薬の分野に
関する。
関する。
従来技術と解決課題
グルタチオンS−トランスフェラーゼ(以下、GSTと
いう)は、体外より生体に侵入する各種の物質または生
体内で生ずる各種の物質と還元型グルタチオンとの抱合
反応を触媒する酵素として知られている。
いう)は、体外より生体に侵入する各種の物質または生
体内で生ずる各種の物質と還元型グルタチオンとの抱合
反応を触媒する酵素として知られている。
GSTは肝臓、WIl臓、腎臓、胎盤、小腸、膵臓など
に多く含まれており、そのほか赤血球、白血球、血小板
などにも微量存在している。GSTのアイソザイムとし
ては酸性GST、中性GSTおよび塩基性GSTが知ら
れている。酸性GSTのなかでも胎盤由来のものはGS
T−πと命名されている。
に多く含まれており、そのほか赤血球、白血球、血小板
などにも微量存在している。GSTのアイソザイムとし
ては酸性GST、中性GSTおよび塩基性GSTが知ら
れている。酸性GSTのなかでも胎盤由来のものはGS
T−πと命名されている。
ヒト血清などの体液中のGST−πのレベルを検知する
ことは肝ガンや胃ガンなどの診断に育用であるとされて
いる(特開平2−57977 、WO87/3377
、) 、 Lかし、ヒト血清中のGST−πレベルが腎
細胞ガンや尿路上皮II瘍などの泌尿器系ガンのマーカ
ーとして任用なことは知られていない。
ことは肝ガンや胃ガンなどの診断に育用であるとされて
いる(特開平2−57977 、WO87/3377
、) 、 Lかし、ヒト血清中のGST−πレベルが腎
細胞ガンや尿路上皮II瘍などの泌尿器系ガンのマーカ
ーとして任用なことは知られていない。
GST−πの定量方法としては、放射性免疫学的定量法
(RI A)や酵素免疫学的定量法(EIA)が報告さ
れている。
(RI A)や酵素免疫学的定量法(EIA)が報告さ
れている。
ところで、本発明者らは健常者の血清GSTπレベルを
定量していたところ、あるグループでは正常な定量値が
得られるのに、別なグループではみかけ上、高い定量値
となることをしばしば経験した。本発明者らは更に検討
したところヒト血清を被検体とするときは血液凝固の際
に血球、特に血小板が破壊され酸性GSTが漏出し、血
漿を被検体とするときは低温での長期保存や凍結融解に
より血球、特に血小板が破壊され酸性GSTが流出し、
これらが原因して定量値がみかけ上、高い値になるので
はないかとの新しい知見を得た。
定量していたところ、あるグループでは正常な定量値が
得られるのに、別なグループではみかけ上、高い定量値
となることをしばしば経験した。本発明者らは更に検討
したところヒト血清を被検体とするときは血液凝固の際
に血球、特に血小板が破壊され酸性GSTが漏出し、血
漿を被検体とするときは低温での長期保存や凍結融解に
より血球、特に血小板が破壊され酸性GSTが流出し、
これらが原因して定量値がみかけ上、高い値になるので
はないかとの新しい知見を得た。
そこで本発明者らは種々検討した結果、ヒト血液につい
て極めて簡単な前処理を施すことにより定量値のみかけ
の異常高値を除くことに成功し、まり、血液中のGST
−πのレベルが泌尿器系ガンの診断マーカーとして任用
であることを初めて見い出し、本発明を完成した。
て極めて簡単な前処理を施すことにより定量値のみかけ
の異常高値を除くことに成功し、まり、血液中のGST
−πのレベルが泌尿器系ガンの診断マーカーとして任用
であることを初めて見い出し、本発明を完成した。
発明の構成
第一の本発明は、GST−πの免疫学的定量方法におい
て、ヒト血液を少なくとも2回の遠心分離操作に付して
得た上清を被検体とすることを特徴とするGST−πの
定量方法に関するものである。
て、ヒト血液を少なくとも2回の遠心分離操作に付して
得た上清を被検体とすることを特徴とするGST−πの
定量方法に関するものである。
ここにおける遠心分離操作は少なくとも2回行われる。
遠心は300〜2000X gで3〜25分間、好まし
くは500〜1600X gで5〜20分間、特に好ま
しくは約500 X gで20分間前後または約ll0
0X gで10〜20分間もしくは約1600X gで
5〜!0分間にわたって、室温ないし冷却下に行われる
。遠心分離操作に先きだって、血液の凝固を阻止するた
めにヘパリンナトリウムやEDTA2Naの如き抗凝固
剤を添加するのが好ましい。かくして、被検体中のGS
T−π含量は長期にわたって安定化される。
くは500〜1600X gで5〜20分間、特に好ま
しくは約500 X gで20分間前後または約ll0
0X gで10〜20分間もしくは約1600X gで
5〜!0分間にわたって、室温ないし冷却下に行われる
。遠心分離操作に先きだって、血液の凝固を阻止するた
めにヘパリンナトリウムやEDTA2Naの如き抗凝固
剤を添加するのが好ましい。かくして、被検体中のGS
T−π含量は長期にわたって安定化される。
前処理された被検体中のGST−πは、通常の免疫学的
定量方法により定量される。免疫学的定量方法としては
、各種の標識物で標識された抗原および/または抗体を
用いる方法がいずれも適用できる。標識物としては、例
えばペルオキシダーゼ、アルカリボスフ7ターゼ、β−
ガラクトシダゼの如き酵素類 1257のような放射性
物質、フルオレブセインインチオシアネートのような蛍
光物質などが挙げられる。免疫学的定量方法としては、
標識物質が酵素であるEIA法、特にサンドイッチEI
A法が好ましい方法として挙げられる。サントイフチE
IA方法では、抗体は使用目的を異にする2種の試薬と
して用いられる。すなわち、2種の内の一方は酵素と結
合した酵素標識抗体として、また、他の一方はポリスチ
レンビーズのような不溶性キャリヤーと結合した不溶性
抗体として用いられる。2種の内の一方がモノクローナ
ル抗体であり他方がポリクローナル抗体であってもよい
し、両方がモノクローナル抗体かポリクローナル抗体の
いずれかであったり、あるいは抗体の7ラグメ/トであ
ってもよい。両方がモノクローナル抗体であるときは、
それぞれの抗原決定基は異なることが多い。均一な品質
のものか継続的に供給できる面においては、両者ともモ
ノクローナル抗体である組合せが好しい。モノクロナル
抗体はミルシュタインの細胞融合法により製造できる。
定量方法により定量される。免疫学的定量方法としては
、各種の標識物で標識された抗原および/または抗体を
用いる方法がいずれも適用できる。標識物としては、例
えばペルオキシダーゼ、アルカリボスフ7ターゼ、β−
ガラクトシダゼの如き酵素類 1257のような放射性
物質、フルオレブセインインチオシアネートのような蛍
光物質などが挙げられる。免疫学的定量方法としては、
標識物質が酵素であるEIA法、特にサンドイッチEI
A法が好ましい方法として挙げられる。サントイフチE
IA方法では、抗体は使用目的を異にする2種の試薬と
して用いられる。すなわち、2種の内の一方は酵素と結
合した酵素標識抗体として、また、他の一方はポリスチ
レンビーズのような不溶性キャリヤーと結合した不溶性
抗体として用いられる。2種の内の一方がモノクローナ
ル抗体であり他方がポリクローナル抗体であってもよい
し、両方がモノクローナル抗体かポリクローナル抗体の
いずれかであったり、あるいは抗体の7ラグメ/トであ
ってもよい。両方がモノクローナル抗体であるときは、
それぞれの抗原決定基は異なることが多い。均一な品質
のものか継続的に供給できる面においては、両者ともモ
ノクローナル抗体である組合せが好しい。モノクロナル
抗体はミルシュタインの細胞融合法により製造できる。
す/ドイッチETA法は上記した酵素標識抗体と不溶性
抗体との間に抗原、すなわちGST−πが入り込んだす
/ドイツチ型の抗原抗体複合物を形成せしめ、これに酵
素基質を作用させて酵素反応を行い、その酵素活性を指
標として抗原量を定量するものであり、常法に従って実
施できる。
抗体との間に抗原、すなわちGST−πが入り込んだす
/ドイツチ型の抗原抗体複合物を形成せしめ、これに酵
素基質を作用させて酵素反応を行い、その酵素活性を指
標として抗原量を定量するものであり、常法に従って実
施できる。
第二の本発明は、少なくとも不溶性抗GSTπ抗体およ
び/または標識抗GST−π抗体から構成される泌尿器
系ガンの診断のための試薬に関するものである。
び/または標識抗GST−π抗体から構成される泌尿器
系ガンの診断のための試薬に関するものである。
本発明の試薬はヒト血清などの体液中のGST−πレベ
ルを検知することにより泌尿器系ガン患者を発見したり
、治療経過やガンの進行杖況をモ二ターするためのもの
である。なお、すでに述べたように肝ガンや胃ガンのマ
ーカーたるGSTπは知られているか、泌尿器系ガンの
マーカーたるGST−πは知られていない。
ルを検知することにより泌尿器系ガン患者を発見したり
、治療経過やガンの進行杖況をモ二ターするためのもの
である。なお、すでに述べたように肝ガンや胃ガンのマ
ーカーたるGSTπは知られているか、泌尿器系ガンの
マーカーたるGST−πは知られていない。
本発明の試薬は、先に述べた免疫学的定量方法における
試薬と実質的に同一である。例えばGST−πレベルを
サントイフチEIA法で検知するときの本発明の試薬は
、少なくとも、 ■ 不溶性抗GST−π抗体 ■ 酵素標識抗GST−π抗体 から構成され、ほかに ■ 標識酵素に対する基質 ■ 標準GST−π ■ 緩衝化剤 ■ 洗浄液 ■ 酵素反応停止剤 などの試薬が必要に応じて用いられる。
試薬と実質的に同一である。例えばGST−πレベルを
サントイフチEIA法で検知するときの本発明の試薬は
、少なくとも、 ■ 不溶性抗GST−π抗体 ■ 酵素標識抗GST−π抗体 から構成され、ほかに ■ 標識酵素に対する基質 ■ 標準GST−π ■ 緩衝化剤 ■ 洗浄液 ■ 酵素反応停止剤 などの試薬が必要に応じて用いられる。
ヒト血液中のGST−πレベルが健常者よりも高い場合
には、腎細胞ガン、上部尿路Wi瘍、膀胱厘瘍、前立腺
ガンなどの秘尿器系疾患が疑われる。
には、腎細胞ガン、上部尿路Wi瘍、膀胱厘瘍、前立腺
ガンなどの秘尿器系疾患が疑われる。
具体例
次に参考例ならびに実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明する。
説明する。
参考例 1 モノクローナル抗体GST−πで2
.5ケ月間にわたって免疫したBALB/Cマウスのl
ll1!臓細胞とマウスミエローマ細胞(XEi3^g
8.lli、5.3 ’)とをミルシュタインの方法に
従って細胞融合を行い、クローニングをして、次の共通
特性を存するが、抗原決定基を異にする抗体を生産する
2種のハイブリドーマAおよびBを樹立した。
.5ケ月間にわたって免疫したBALB/Cマウスのl
ll1!臓細胞とマウスミエローマ細胞(XEi3^g
8.lli、5.3 ’)とをミルシュタインの方法に
従って細胞融合を行い、クローニングをして、次の共通
特性を存するが、抗原決定基を異にする抗体を生産する
2種のハイブリドーマAおよびBを樹立した。
抗GST−π抗体の共通特性
■ GST−πを認識する
■ 酸性GSTの一部と交差反応する
O 中性、塩基性GSTと交差反応しない参考例 2
不溶性抗体 参考例1で得たハイブリドーマAをin vfvoで
培養し目的の抗GST−πモノクローナル抗体Aを得る
。
不溶性抗体 参考例1で得たハイブリドーマAをin vfvoで
培養し目的の抗GST−πモノクローナル抗体Aを得る
。
直径(i、5mmのポリスチレンビーズ(清水化学)を
スキャト20X−PF (ナカライテスク社)で洗浄し
た後、精製水を加えて洗浄し、これに100 m gの
モノクローナル抗体Aを含仔する溶液を加え、4℃で2
4時間放置する。ポリスチレンビーズを0.1%牛血清
アルブミン−0,1MIJ:/@緩衝液(f)H7,0
)で洗浄し、不溶性抗体を得る。
スキャト20X−PF (ナカライテスク社)で洗浄し
た後、精製水を加えて洗浄し、これに100 m gの
モノクローナル抗体Aを含仔する溶液を加え、4℃で2
4時間放置する。ポリスチレンビーズを0.1%牛血清
アルブミン−0,1MIJ:/@緩衝液(f)H7,0
)で洗浄し、不溶性抗体を得る。
参考例 3 酵素標識抗体
参考例1で得たハイブリドーマBをin ViVOで
培養し目的の抗GST−πモノクローナル抗体Bを得る
。
培養し目的の抗GST−πモノクローナル抗体Bを得る
。
ペルオキシダーゼ40m gを1,25%グルタルアル
デヒド水溶液に溶解し、セファデックスG−25(1,
IX90cm)によるゲル濾過を行う。ペルオキシダー
ゼ分画液6mlに20m gのモノクローナル抗体Bを
含存する水溶液およびIM炭@緩衝液(pH9,5)の
0.4 rn lを加え、4℃で24時間放[[セファ
クリルS−300HRカラムにてゲル濾過を行い酵素活
性分画(酵素標識抗体)を得る。この溶液0.4m l
に19.6m lの0.5%ゼラチン−0,1%牛血清
アルブミン−18,79Aウマ血清−0,01%トリド
アX−4050,3MNaCI−10mMリンW1緩衝
液(pH7,0)を加えたものを酵素標識抗体溶液とし
て後記実施例1で用いた。
デヒド水溶液に溶解し、セファデックスG−25(1,
IX90cm)によるゲル濾過を行う。ペルオキシダー
ゼ分画液6mlに20m gのモノクローナル抗体Bを
含存する水溶液およびIM炭@緩衝液(pH9,5)の
0.4 rn lを加え、4℃で24時間放[[セファ
クリルS−300HRカラムにてゲル濾過を行い酵素活
性分画(酵素標識抗体)を得る。この溶液0.4m l
に19.6m lの0.5%ゼラチン−0,1%牛血清
アルブミン−18,79Aウマ血清−0,01%トリド
アX−4050,3MNaCI−10mMリンW1緩衝
液(pH7,0)を加えたものを酵素標識抗体溶液とし
て後記実施例1で用いた。
実施例 1 サ/ドイッチEIA標準GST−π
溶液または被検体50μlに参考例2で得たポリスチレ
ンビーズ(不溶性抗体)1個および参考例3で得た酵素
標識抗体溶液0.3mlを加え、37℃で静置する。6
0分後にポリスチレンビーズを2mlのO,15M N
aC10,01Mリン酸緩衝液(pH7,0)で2回洗
浄した後、ポリスチレンビーズを別の試験管に移す。0
.5 m lの酵素基質溶液[0,3%O−フェニレン
ジアミンー0.02%過酸化水素−20mMクエン酸緩
衝液(p H6,5>を加えて室温で30分間静置する
。、6N硫酸2mlを加えて反応を停止し、波長492
nmにおける吸光度を測定する。
溶液または被検体50μlに参考例2で得たポリスチレ
ンビーズ(不溶性抗体)1個および参考例3で得た酵素
標識抗体溶液0.3mlを加え、37℃で静置する。6
0分後にポリスチレンビーズを2mlのO,15M N
aC10,01Mリン酸緩衝液(pH7,0)で2回洗
浄した後、ポリスチレンビーズを別の試験管に移す。0
.5 m lの酵素基質溶液[0,3%O−フェニレン
ジアミンー0.02%過酸化水素−20mMクエン酸緩
衝液(p H6,5>を加えて室温で30分間静置する
。、6N硫酸2mlを加えて反応を停止し、波長492
nmにおける吸光度を測定する。
第1図は定量標準曲線である。
実施例 2被検体の前処理とGST−πの定量ヒト血液
にヘパリンナトリウムを加えて4℃で保存し、6時間後
、4℃において、l100x gで10分間遠心し、そ
の上清を再度、同条件で遠心して上清を得る。各上滑を
室温で溶液のまま、または凍結して保存したものについ
て、実施例1に準じてGST−π含量を定量し、次の結
果を得た。
にヘパリンナトリウムを加えて4℃で保存し、6時間後
、4℃において、l100x gで10分間遠心し、そ
の上清を再度、同条件で遠心して上清を得る。各上滑を
室温で溶液のまま、または凍結して保存したものについ
て、実施例1に準じてGST−π含量を定量し、次の結
果を得た。
第1表
前表に示すように2回の遠心分離操作により安定した定
量値が得られた。
量値が得られた。
実施例 3被検体の前処理とGST−πの定量ヒト血液
にヘパリンナトリウムを加えて室温で保存し、、5時間
後、室温において、500 X gで20分間遠心し、
その上清を再度、同条件で遠心して上滑を得る。各上清
を室温で溶液のまま、または凍結して保存したものにつ
いて、実施例1に準じてGST−π含量を定量し、 次の結果を得た。
にヘパリンナトリウムを加えて室温で保存し、、5時間
後、室温において、500 X gで20分間遠心し、
その上清を再度、同条件で遠心して上滑を得る。各上清
を室温で溶液のまま、または凍結して保存したものにつ
いて、実施例1に準じてGST−π含量を定量し、 次の結果を得た。
第2表
前表に示すように2回の遠心分離操作により安定した定
量値が得られた。
量値が得られた。
実施例 4 患者血清のGST−πレベル健常者(8
8例)および詔尿器系ガン患者(67例)の血液を採取
し、これを実施例2と同様な前処理をなし、実施例1と
同様にしてGST−πレベルを測定し次の結果を得た。
8例)および詔尿器系ガン患者(67例)の血液を採取
し、これを実施例2と同様な前処理をなし、実施例1と
同様にしてGST−πレベルを測定し次の結果を得た。
(以下、余白)
第3表
前表から血清中のGST−πレベルは秘尿器系ガン疾患
の有用なマーカーであることがわかる。
の有用なマーカーであることがわかる。
第1図はサンドイッチEIA法における定量標準曲線で
ある。
ある。
Claims (4)
- (1)グルタチオンS−トランスフェラーゼπ(以下、
GST−πという)の免疫学的定量方法において、ヒト
血液を少なくとも2回の遠心分離操作に付して得た上清
を被検体とすることを特徴とするGST−πの定量方法
。 - (2)遠心分離を300〜2000Xgで3〜25分間
にわたって行う請求項1記載の定量方法。 - (3)少なくとも不溶性抗GST−π抗体および/また
は標識抗GST−π抗体から構成される泌尿器系ガンの
診断のための試薬。 - (4)不溶性抗GST−π抗体および酵素標識抗GST
−π抗体の双方、および該標識酵素に対する基質からな
り、両抗体は抗原決定基を異にするモノクローナル抗体
である請求項3記載の試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13104690A JPH0425763A (ja) | 1990-05-21 | 1990-05-21 | グルタチオンS―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13104690A JPH0425763A (ja) | 1990-05-21 | 1990-05-21 | グルタチオンS―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0425763A true JPH0425763A (ja) | 1992-01-29 |
Family
ID=15048753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13104690A Pending JPH0425763A (ja) | 1990-05-21 | 1990-05-21 | グルタチオンS―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0425763A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996002674A1 (en) * | 1994-07-19 | 1996-02-01 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Genetic diagnosis of prostate cancer |
| WO1997028449A1 (en) * | 1996-02-02 | 1997-08-07 | Biotrin Intellectual Properties Limited | Method of determining the hepatic status of an individual, including a liver transplant recipient |
| AU690144B2 (en) * | 1994-10-17 | 1998-04-23 | Argutus Intellectual Properties Limited | Stabilising medium for alphaGST in urine for use in an enzyme immunoassay |
-
1990
- 1990-05-21 JP JP13104690A patent/JPH0425763A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996002674A1 (en) * | 1994-07-19 | 1996-02-01 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Genetic diagnosis of prostate cancer |
| AU690144B2 (en) * | 1994-10-17 | 1998-04-23 | Argutus Intellectual Properties Limited | Stabilising medium for alphaGST in urine for use in an enzyme immunoassay |
| US6071706A (en) * | 1994-10-17 | 2000-06-06 | Biotrin Intellectual Properties Limited | Stabilising medium for alphagst in urine for use in an enzyme immunoassay |
| WO1997028449A1 (en) * | 1996-02-02 | 1997-08-07 | Biotrin Intellectual Properties Limited | Method of determining the hepatic status of an individual, including a liver transplant recipient |
| US6183977B1 (en) | 1996-02-02 | 2001-02-06 | Biotrin Intellectual Properties, Ltd. | Determining hepatic status of a liver transplant recipient by measuring PI glutathione S-transferase |
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