JPH0425763A - グルタチオンS―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬 - Google Patents

グルタチオンS―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬

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JPH0425763A
JPH0425763A JP13104690A JP13104690A JPH0425763A JP H0425763 A JPH0425763 A JP H0425763A JP 13104690 A JP13104690 A JP 13104690A JP 13104690 A JP13104690 A JP 13104690A JP H0425763 A JPH0425763 A JP H0425763A
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JP
Japan
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gst
antibody
minutes
enzyme
specimen
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Pending
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JP13104690A
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English (en)
Inventor
Yukimichi Kawada
河田 幸道
Manabu Kuriyama
学 栗山
Kenji Kato
憲二 加藤
Shinobu Hayakawa
忍 早川
Tomoyuki Katsuzaki
勝崎 智之
Noriyuki Tatemichi
憲幸 立道
Noriyuki Sunahara
砂原 憲之
Shinzo Nishimura
西村 信三
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Maruko Pharmaceutical Co Ltd
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Maruko Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は改良定量方法ならびに臨床診断用試薬の分野に
関する。
従来技術と解決課題 グルタチオンS−トランスフェラーゼ(以下、GSTと
いう)は、体外より生体に侵入する各種の物質または生
体内で生ずる各種の物質と還元型グルタチオンとの抱合
反応を触媒する酵素として知られている。
GSTは肝臓、WIl臓、腎臓、胎盤、小腸、膵臓など
に多く含まれており、そのほか赤血球、白血球、血小板
などにも微量存在している。GSTのアイソザイムとし
ては酸性GST、中性GSTおよび塩基性GSTが知ら
れている。酸性GSTのなかでも胎盤由来のものはGS
T−πと命名されている。
ヒト血清などの体液中のGST−πのレベルを検知する
ことは肝ガンや胃ガンなどの診断に育用であるとされて
いる(特開平2−57977 、WO87/3377 
、) 、 Lかし、ヒト血清中のGST−πレベルが腎
細胞ガンや尿路上皮II瘍などの泌尿器系ガンのマーカ
ーとして任用なことは知られていない。
GST−πの定量方法としては、放射性免疫学的定量法
(RI A)や酵素免疫学的定量法(EIA)が報告さ
れている。
ところで、本発明者らは健常者の血清GSTπレベルを
定量していたところ、あるグループでは正常な定量値が
得られるのに、別なグループではみかけ上、高い定量値
となることをしばしば経験した。本発明者らは更に検討
したところヒト血清を被検体とするときは血液凝固の際
に血球、特に血小板が破壊され酸性GSTが漏出し、血
漿を被検体とするときは低温での長期保存や凍結融解に
より血球、特に血小板が破壊され酸性GSTが流出し、
これらが原因して定量値がみかけ上、高い値になるので
はないかとの新しい知見を得た。
そこで本発明者らは種々検討した結果、ヒト血液につい
て極めて簡単な前処理を施すことにより定量値のみかけ
の異常高値を除くことに成功し、まり、血液中のGST
−πのレベルが泌尿器系ガンの診断マーカーとして任用
であることを初めて見い出し、本発明を完成した。
発明の構成 第一の本発明は、GST−πの免疫学的定量方法におい
て、ヒト血液を少なくとも2回の遠心分離操作に付して
得た上清を被検体とすることを特徴とするGST−πの
定量方法に関するものである。
ここにおける遠心分離操作は少なくとも2回行われる。
遠心は300〜2000X gで3〜25分間、好まし
くは500〜1600X gで5〜20分間、特に好ま
しくは約500 X gで20分間前後または約ll0
0X gで10〜20分間もしくは約1600X gで
5〜!0分間にわたって、室温ないし冷却下に行われる
。遠心分離操作に先きだって、血液の凝固を阻止するた
めにヘパリンナトリウムやEDTA2Naの如き抗凝固
剤を添加するのが好ましい。かくして、被検体中のGS
T−π含量は長期にわたって安定化される。
前処理された被検体中のGST−πは、通常の免疫学的
定量方法により定量される。免疫学的定量方法としては
、各種の標識物で標識された抗原および/または抗体を
用いる方法がいずれも適用できる。標識物としては、例
えばペルオキシダーゼ、アルカリボスフ7ターゼ、β−
ガラクトシダゼの如き酵素類 1257のような放射性
物質、フルオレブセインインチオシアネートのような蛍
光物質などが挙げられる。免疫学的定量方法としては、
標識物質が酵素であるEIA法、特にサンドイッチEI
A法が好ましい方法として挙げられる。サントイフチE
IA方法では、抗体は使用目的を異にする2種の試薬と
して用いられる。すなわち、2種の内の一方は酵素と結
合した酵素標識抗体として、また、他の一方はポリスチ
レンビーズのような不溶性キャリヤーと結合した不溶性
抗体として用いられる。2種の内の一方がモノクローナ
ル抗体であり他方がポリクローナル抗体であってもよい
し、両方がモノクローナル抗体かポリクローナル抗体の
いずれかであったり、あるいは抗体の7ラグメ/トであ
ってもよい。両方がモノクローナル抗体であるときは、
それぞれの抗原決定基は異なることが多い。均一な品質
のものか継続的に供給できる面においては、両者ともモ
ノクローナル抗体である組合せが好しい。モノクロナル
抗体はミルシュタインの細胞融合法により製造できる。
す/ドイッチETA法は上記した酵素標識抗体と不溶性
抗体との間に抗原、すなわちGST−πが入り込んだす
/ドイツチ型の抗原抗体複合物を形成せしめ、これに酵
素基質を作用させて酵素反応を行い、その酵素活性を指
標として抗原量を定量するものであり、常法に従って実
施できる。
第二の本発明は、少なくとも不溶性抗GSTπ抗体およ
び/または標識抗GST−π抗体から構成される泌尿器
系ガンの診断のための試薬に関するものである。
本発明の試薬はヒト血清などの体液中のGST−πレベ
ルを検知することにより泌尿器系ガン患者を発見したり
、治療経過やガンの進行杖況をモ二ターするためのもの
である。なお、すでに述べたように肝ガンや胃ガンのマ
ーカーたるGSTπは知られているか、泌尿器系ガンの
マーカーたるGST−πは知られていない。
本発明の試薬は、先に述べた免疫学的定量方法における
試薬と実質的に同一である。例えばGST−πレベルを
サントイフチEIA法で検知するときの本発明の試薬は
、少なくとも、 ■ 不溶性抗GST−π抗体 ■ 酵素標識抗GST−π抗体 から構成され、ほかに ■ 標識酵素に対する基質 ■ 標準GST−π ■ 緩衝化剤 ■ 洗浄液 ■ 酵素反応停止剤 などの試薬が必要に応じて用いられる。
ヒト血液中のGST−πレベルが健常者よりも高い場合
には、腎細胞ガン、上部尿路Wi瘍、膀胱厘瘍、前立腺
ガンなどの秘尿器系疾患が疑われる。
具体例 次に参考例ならびに実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明する。
参考例 1    モノクローナル抗体GST−πで2
.5ケ月間にわたって免疫したBALB/Cマウスのl
ll1!臓細胞とマウスミエローマ細胞(XEi3^g
8.lli、5.3 ’)とをミルシュタインの方法に
従って細胞融合を行い、クローニングをして、次の共通
特性を存するが、抗原決定基を異にする抗体を生産する
2種のハイブリドーマAおよびBを樹立した。
抗GST−π抗体の共通特性 ■ GST−πを認識する ■ 酸性GSTの一部と交差反応する O 中性、塩基性GSTと交差反応しない参考例 2 
     不溶性抗体 参考例1で得たハイブリドーマAをin  vfvoで
培養し目的の抗GST−πモノクローナル抗体Aを得る
直径(i、5mmのポリスチレンビーズ(清水化学)を
スキャト20X−PF (ナカライテスク社)で洗浄し
た後、精製水を加えて洗浄し、これに100 m gの
モノクローナル抗体Aを含仔する溶液を加え、4℃で2
4時間放置する。ポリスチレンビーズを0.1%牛血清
アルブミン−0,1MIJ:/@緩衝液(f)H7,0
)で洗浄し、不溶性抗体を得る。
参考例 3     酵素標識抗体 参考例1で得たハイブリドーマBをin  ViVOで
培養し目的の抗GST−πモノクローナル抗体Bを得る
ペルオキシダーゼ40m gを1,25%グルタルアル
デヒド水溶液に溶解し、セファデックスG−25(1,
IX90cm)によるゲル濾過を行う。ペルオキシダー
ゼ分画液6mlに20m gのモノクローナル抗体Bを
含存する水溶液およびIM炭@緩衝液(pH9,5)の
0.4 rn lを加え、4℃で24時間放[[セファ
クリルS−300HRカラムにてゲル濾過を行い酵素活
性分画(酵素標識抗体)を得る。この溶液0.4m l
に19.6m lの0.5%ゼラチン−0,1%牛血清
アルブミン−18,79Aウマ血清−0,01%トリド
アX−4050,3MNaCI−10mMリンW1緩衝
液(pH7,0)を加えたものを酵素標識抗体溶液とし
て後記実施例1で用いた。
実施例 1    サ/ドイッチEIA標準GST−π
溶液または被検体50μlに参考例2で得たポリスチレ
ンビーズ(不溶性抗体)1個および参考例3で得た酵素
標識抗体溶液0.3mlを加え、37℃で静置する。6
0分後にポリスチレンビーズを2mlのO,15M N
aC10,01Mリン酸緩衝液(pH7,0)で2回洗
浄した後、ポリスチレンビーズを別の試験管に移す。0
.5 m lの酵素基質溶液[0,3%O−フェニレン
ジアミンー0.02%過酸化水素−20mMクエン酸緩
衝液(p H6,5>を加えて室温で30分間静置する
。、6N硫酸2mlを加えて反応を停止し、波長492
nmにおける吸光度を測定する。
第1図は定量標準曲線である。
実施例 2被検体の前処理とGST−πの定量ヒト血液
にヘパリンナトリウムを加えて4℃で保存し、6時間後
、4℃において、l100x gで10分間遠心し、そ
の上清を再度、同条件で遠心して上清を得る。各上滑を
室温で溶液のまま、または凍結して保存したものについ
て、実施例1に準じてGST−π含量を定量し、次の結
果を得た。
第1表 前表に示すように2回の遠心分離操作により安定した定
量値が得られた。
実施例 3被検体の前処理とGST−πの定量ヒト血液
にヘパリンナトリウムを加えて室温で保存し、、5時間
後、室温において、500 X gで20分間遠心し、
その上清を再度、同条件で遠心して上滑を得る。各上清
を室温で溶液のまま、または凍結して保存したものにつ
いて、実施例1に準じてGST−π含量を定量し、 次の結果を得た。
第2表 前表に示すように2回の遠心分離操作により安定した定
量値が得られた。
実施例 4  患者血清のGST−πレベル健常者(8
8例)および詔尿器系ガン患者(67例)の血液を採取
し、これを実施例2と同様な前処理をなし、実施例1と
同様にしてGST−πレベルを測定し次の結果を得た。
(以下、余白) 第3表 前表から血清中のGST−πレベルは秘尿器系ガン疾患
の有用なマーカーであることがわかる。
【図面の簡単な説明】
第1図はサンドイッチEIA法における定量標準曲線で
ある。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)グルタチオンS−トランスフェラーゼπ(以下、
    GST−πという)の免疫学的定量方法において、ヒト
    血液を少なくとも2回の遠心分離操作に付して得た上清
    を被検体とすることを特徴とするGST−πの定量方法
  2. (2)遠心分離を300〜2000Xgで3〜25分間
    にわたって行う請求項1記載の定量方法。
  3. (3)少なくとも不溶性抗GST−π抗体および/また
    は標識抗GST−π抗体から構成される泌尿器系ガンの
    診断のための試薬。
  4. (4)不溶性抗GST−π抗体および酵素標識抗GST
    −π抗体の双方、および該標識酵素に対する基質からな
    り、両抗体は抗原決定基を異にするモノクローナル抗体
    である請求項3記載の試薬。
JP13104690A 1990-05-21 1990-05-21 グルタチオンS―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬 Pending JPH0425763A (ja)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996002674A1 (en) * 1994-07-19 1996-02-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Genetic diagnosis of prostate cancer
WO1997028449A1 (en) * 1996-02-02 1997-08-07 Biotrin Intellectual Properties Limited Method of determining the hepatic status of an individual, including a liver transplant recipient
AU690144B2 (en) * 1994-10-17 1998-04-23 Argutus Intellectual Properties Limited Stabilising medium for alphaGST in urine for use in an enzyme immunoassay

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